专利名称：：生物催化制备s-布洛芬及s-布洛芬酯的方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及制备s-布洛芬和s-布洛芬酯的方法，更具体而言，涉及利用脂肪酶催化拆分外消旋布洛芬，制得高光学纯度的S-布洛芬和s-布洛芬酯的方法。
背景技术：
：非甾体抗炎药(nonsteroidalantiinflammatorydrugs,NSAIDs)是一类具有解热、镇痛、且多数还有抗炎、抗风湿作用的药物，临床上广泛应用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎及其他风湿性疾病，为数以亿计的风湿病患者解除痛苦。这类药物主要包括外消旋布洛芬(外消旋-2-(4-异丁基苯基)丙酸)、氟比洛芬(外消旋-2-((3-氟-4-苯基)苯基)丙酸、非诺洛芬(外消旋-2-(3-苯氧基苯基)丙酸)、舒洛芬(夕卜消旋-2-(4(2-噻吩基氧代)苯基)丙酸)、卡洛芬(外消旋-2-(6-氯-9H-呼唑基)丙酸)、萘普生(外消旋-2-(6-曱氧基-2-萘基)丙酸)、酮洛芬(外消旋-a-曱基-3-苯甲酰基-苯乙酸)等。这些药的药理活性在于它们可以通过阻止环氧化酶从花生四烯酸的C-13夺取氢原子，进而阻止了花生四烯酸的C-11及C-15位置过氧化，最终阻碍了它向炎症的前列腺素以及凝血烷A2的生物转化。外消旋布洛芬是萘普生、酮洛芬等ll种非甾体消炎药物毒副作用最小的一种，绝大部分西方发达国家都将其作为非处方药。外消旋布洛芬之所以具有较高的活性是由于它连接环氧化酶的亲和力与天然底物花生四烯酸类似。研究表明，外消旋布洛芬的两种异构体S-布洛芬和R布洛芬在药理动力学和生物转化作用方面不同，S-布洛芬具有明显较高的临床效果(Adamsetal.,J.Pharm.Pharakol,28,257和Jamalietal.，Pharmac.Res.1988,5,44)。与外消旋的化合物相比，S-异构体可以快速在血液中达到治疗浓度。外消旋布洛芬作为抗炎镇痛药已被广大患者所接受，但外消旋布洛芬作为治疗风湿及类风湿性关节炎等慢性疾病的有效药物，长期频繁大剂量用药会增加胃肠道的副反应，甚至引起胃肠出血，对肾脏有一定损害，使其临床应用受到了极大的限制。为解决外消布洛芬给药存在的剂量、毒性和药代动力学问题，制备单一手性s-布洛芬显得格外重要。目前s-布洛芬制备方法可分为立体选择性化学合成和外消旋体拆分两大类，外消旋体拆分主要包括利用化学拆分剂拆分和生物技术拆分两种，其中立体选择性化学合成涉及昂贵的手性助剂或催化剂，或者涉及复杂的制备工艺和繁多的化学品，化学拆分剂也较为昂贵，因此在工业生产上成本高。生物技术拆分主要是利用生物酶进行拆分，生物技术拆分由于其工艺简单、生产成本低而受到青睐，具有良好的工业应用前景。目前用于外》'肖旋布洛芬对映体拆分的酶有来自及/r/zo附MCOf附/e/re/,Cfl///rfflr"gosfl、CVm力V/flflw似r"/cfl(7Vovflz戸e435)、爿s/^w7/ms1w/ger^4C-5卓和T7^r附o附j;c^/flwwgZ/i仍fl等的脂肪酶，但是这些酶的催化转化率以及立体选择'ti均较寸氐，不令人满意(参见FabianoJaresContesiniandPatn'ciadeOliveiraCarvalho*Esterificationof(RS)-Ibuprofenbynativeandcommerciallipasesinatwo-phasesystemcontainingionicliquidsTetrahedron:Asymmetry17(2006)2069-2073)。
发明内容本发明在一方面提供了一种新的通过酶催化拆分而制备S-布洛芬酯的方法。更具体的说，本发明提供了一种利用来自亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)的细胞外脂肪酶催化拆分外消旋布洛芬来制备多种S-布洛芬酯的方法，包括利用来自亚罗解脂酵母的细胞外脂肪酶催化促进外消旋布洛芬和醇的酯化反应，然后从反应混合物中分离获得S-布洛芬酯。本发明进一步提供了制备S-布洛芬的方法，其中包括对按照本发明制备的S-布洛芬酯进行水解的步骤。酯水解成酸的反应为本领域技术人员所公知的技术。图l显示了不同反应温度下，外消旋布洛芬的转化率C和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E的变化曲线。图2显示了在各种摩尔比例的酸(即外消旋布洛芬)醇、或醇酸下，外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E的变化曲线。具体实施例方式在本发明中，可以采用任何外消旋布洛芬作为拆分原料来制备S-布洛芬酯或S-布洛芬。外消旋布洛芬早在20世纪60年代即已由英国Boots公司制备成功。作为本发明原料的外消旋布洛芬可以通过本领域中已知的技术制备，或可以在市场上购得。在本发明中，可以采用来自亚罗解脂酵母的细胞外脂肪酶对外消旋布洛芬进行拆分，从而制备S-布洛芬酯或S-布洛芬。所述酶可以通过市场购得，并且也可实验室自制。一种这样的制备方法包括在合适的培养基中在适当的温度下培养亚罗解脂酵母适当的时间，然后从培养基中分离纯化所述脂肪酶。脂肪酶的发酵可参考TanTW，ZhangM，WangBW，YingCH,DengL.ScreeningofhighlipaseproducingCandidasp.andproductionoflipasebyfermentation.ProcessBiochem2003;39(4):459—65中'>开的方法，其^I^IUL进一步的纯化可参考MingruiYu,ShaoweiQin,TianweiTan,Purificationandcharacterizationoftheextracellularlipase.Lip2fromYarrowialipolytica.ProcessBiochemistry42(2007)384-391。亚罗解脂酵母属于非常规酵母，FDA认证为安全级酵母(GRAS),该菌林被大规模用于生产柠檬酸、单细胞蛋白，工业生产中积累了大量的经验。在本发明中可用的脂肪酶可以来自或衍生自任何亚罗解脂酵母，包括例如CN200510112638.5中公开的亚罗解脂酵母，其以保藏编号CGMCCNo.1470保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，邮编100080)。一种从亚罗解脂酵母大规模生产脂肪酶的方法可参见Destain等人(1997)。可用于本发明的亚罗解脂酵母胞外脂肪酶还可以通过基因工程方法制备。这样的方法在Fignede等人(2000)以及CN200510112638.5中均有教导。普通技术人员根据现有技术中的教导，也完全熟知基因工程化生产亚罗解脂酵母脂肪酶的方法，包括例如将编码所述脂肪酶的核酸序列插入到合适的表达载体中，并引入适当的宿主细胞中进行表达，然后从培养基中或细胞内分离该目的脂肪酶。或者，用于本发明的脂肪酶还可通过化学合成途径制得。这样的方法在现有技术中有充分的教导。在本发明中，所述脂肪酶可以游离的粗酶形式使用，即该酶可经简单处理或未处理而使用，例如粗酶粉，甚至可以直接用发酵液(因为本发明使用的酶是胞外酶)。本发明的酶还可以固定化酶和修饰酶等的形式使用，包括用同种载体不同的固定方法和不同载体相同或不同的固定方法制得的酶。对酶进行固定的方法是现有技术中熟知的.在一个实施方式中，所述的固定化脂肪酶包含上述脂肪酶、载体和共固定剂。固定化载体先用一定组成和配比的共固定剂活化。将固定化载体和共固定剂按1:11:3(W:V)比例混合，干燥。脂肪酶用去离子水溶解，按1000-30000单位/克载体的比例与活化后的固定化载体混合，晾干待用。在本发明脂肪酶的固定化中，所述载体可以是固体颗粒，如硅胶、硅藻土。或者，所述载体可以是膜状纺织品，例如天然纤维织物如棉布或化学纤维织物如涤纶，尤其是膜状纺织品，其具有表面积大、吸附性强、价格便宜、稳定性好以及可以重复利用的特点。在另一个优选的实施方案中，所述共固定剂选自(包括)高分子化合物、表面活性剂、蛋白质、无机盐中的至少一种。在一个进一步的优选实施方案中，所述共固定剂选自PEG6000、椰子油、吐温80、明胶、卵磷脂和硫酸镁中的至少一种，优选所述共固定剂中各组分的质量比为明胶卵磷脂PEG6000:吐温80:硫酸镁椰子油=5:1:1:2:1:1。本发明固定化酶的制备可参见本申请人的共同待审中国发明专利申请No.200510112638.5。另夕卜，在下列文献中也教导了在本发明中使用的粗酶、固定化酶、修饰酶以及酶的发酵液等的制备TanTW,ZhangM，WangBW,YingCH，DengL.ScreeningofhighlipaseproducingCandidasp.andproductionoflipasebyfermentation.ProcessBiochem2003,39(4):459—65;MingruiYu,Shaowei(Jin,TianweiTan,PurificationandcharacterizationoftheextracellularlipaseLip2fromYarrowialipolytica,ProcessBiochemistry42(2007)384-391;KailiNie，FengXie，FangWang,TianweiTan,Lipasecatalyzedmethanolysistoproducebiodiesel:Optimizationofthebiodieselproduction.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic43(2006)142-147;以及中国发明专利申请号02117614.0，其乂〉开号为CN1456674;MingruiYu,StefanLange,SvenRichter,TianweiTan,RolfD.SchmidHigh~levelexpressionofextracellularlipaseLip2fromYarrowialipolyticainPichiapastorisanditspurificationandcharacterization.ProteinExpressionandPurification53(2007)255~263。上述文件的内容均通过引用全文并入本文。此外，本领域技术人员将理解，酶的发酵、改造及固定化并不局限于上述文献提供的方法，普通技术人员根据本领域中的一般性知识，可以十分容易地确定合适的酶生产制备方法。在一个实施方案中，用于本发明的酶是来自亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNo.1470的细胞外脂肪酶，其一级氨基酸序列如下HFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASK(JIYLVIRGTHSLEDVITDVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGIGNHLQYFVTEGVCGI(SEQIDNO;1)所述亚罗解脂酵母已于2005年9月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员^"f通微生物中心(地址北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，邮编100080),保藏编号为CGMCCNo.1470。在本发明中，除了上述脂肪酶之外，还可以使用它们的氨基酸序列变体、类似物、衍生物等。普通技术人员完全知晓，对蛋白质中的氨基酸序列进行修饰之后，所获得的蛋白质很可能仍保留了原来的生物学活性，因而能够用于本发明之中.这种蛋白质的制备和活性测定方法是现有技术中所已知的。在本发明中，来自亚罗解脂酵母的细胞外脂肪酶对外消旋混合物起到立体选择性催化作用，本领域技术人员可以根据现有技术中的一般性知识容易地确定其在本发明方法中的有效用量。一般而言，以反应体系的总体积计，粗酶粉用量为0.001mg/ml~100mg/ml,优选0.01mg/ml~50mg/ml,更优选0.05mg/ml~10mg/ml,尤其优选0.1~5mg/ml，最优选0.2~lmg/ml;固定化酶其用量为5mg/ml~500mg/ml，更优选10~50mg/ml，尤其优选20~30mg/ml。根据本发明，用于制备布洛芬酯的醇可以是C120醇，例如一元伯醇，所述醇可以是饱和的，如甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、十二醇、十八醇等，也可以是不饱和的，如2丙烯醇，或者其任意混合物。优选地，所述醇是曱醇、乙醇、正丙醇或者其任意混合物。更优选地，所述醇是乙醇。在本发明的拆分方法中，外消旋布洛芬与所用醇的用量之比可以任意地确定。一般而言，外消旋布洛芬与醇的用量摩尔比在1:55:1之间，优选为1:33:1，更优选为1:22:1，最优选为1:2。当然，普通技术人员完全能够了解，也可以采用此范围外的用量比，只是应该适当地调整酯化反应中的其它参数，包括例如反应温度、时间和溶剂等。根据本发明，所述外消旋布洛芬和醇的酯化反应在有机溶液中进行。在一个实施方案中，所述有机溶剂可以选自Logp不小于3的溶剂例如烷烃、卤代烷烃等，其实例有石油醚、正戊烷、环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、正壬烷、正癸烷、四氯化碳等，但并不局限于此。其中p为有机溶剂的疏水常数。当然，也可以使用上述有机溶剂的混合物。在本发明中，酯化反应可以在任何合适的温度范围内进行。普通技术人员根据现有技术中的教导可以合理地确定这样的温度范围。通常酯化反应在1550'C下进行，优选在2045'C的温度下进行，尤其优选2540'C,最优选约40。C的温度。酯化反应的持续时间依多种因素而定，本领域技术人员可以通过常规实验来确定合适的反应时间，例如通过对取自反应液中小量样品用装配有手性柱液相色谱来监测反应过程。所述手性柱可以是例如CHIRALCELOBH,0.46cm0xl50，DAICELCHEMICALINDUSTRIES,LID,Jap,所采用的流动相可以是例如正己烷异丙醇三氟乙酸=98:2:0.1。优选地，反应持续到S-布洛芬和R布洛芬转化为酯的比率为3:1以上，更优选地4:1，进一步优选地5:1，尤其优选9:1，最优选98:2。具体地，反应时间通常为12~120小时，优选15~80小时，更优选20~60小时，最优选24~48小时。反应达到所需的程度后，可以合适方式终止反应，包括例如热灭活亚罗解脂酵母胞外脂肪酶的酶活性，或直接进行布洛芬酯与反应底物的分离。可以在酯化反应中加适量的适当添加剂，如诸如18-冠-6、二苯18冠-6的冠醚、环糊精、甘油、甲酰胺等。不希望受限于理论，我们认为适当添加剂使酶更易于与底物作用，从而提高酶的活性，提高酶的手性选择性。在酯化反应结束后，可以通过本领域的常规分离技术例如萃取、层析、蒸发等来分离生成的布洛芬酯和未反应的布洛芬。例如，可以利用强碱溶液来分离处理反应混合物。优选地，所述强碱溶液的pH值的下限为12、12.5、13、13.5、13.6、13.7、13.8或13.9,上限为该强碱溶液的饱和溶液的pH值或者比该饱和溶液pH值低0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25或1.3等。更优选地，利用pH为1314的强碱溶液进行分离，最优选利用pH为14的强碱溶液。在一个实施方式中，该强碱溶液可以是氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，或者其混合物。当然其它的强碱溶液也涵盖在内。在强碱溶液处理之后，在一定真空度下对有机相减压蒸馏，获得布洛芬酯，其中主要是S-布洛芬酯，也包括少量的R-布洛芬酯。由于亚罗解脂酵母对S-布洛芬的强烈选择性，R-布洛芬酯在最后产品中的含量很低。在获得S-布洛芬酯之后，可以采用常规方法对酯进行水解，从而制得S-布洛芬，达到拆分外消旋布洛芬的目的。普通技术人员十分清楚如何选择合适的酯水解条件。其中所述水解可以通过常规的化学法进行，也可以通过酶法进行。优选酶法，其中利用例如脂肪酶或酯酶，比如来自或衍生自亚罗解月旨酵母》CVi/ftV/"rag仍fl或CVmAV/flcW"dmcefl等的酶。它们可通过发酵或基因工程方法制备，或者从市场上购得。在一个实施方案中，采用酶法在合适pH值、例如pl^710、优选pH=8的緩沖液例如磷酸緩冲液中水解所述布洛芬酯。所述磷酸緩冲液的浓度可以是例如0.05mol/L~0.5mol/L，更优选0.1mol/L~0.2mol/L。本发明的方法催化转化率高、立体选择性强，制得的S-布洛芬和S-布洛芬酯纯度高，且S-布洛芬酯的种类多，为医药提供了重要的中间体；其制备过程简单、可行，成本低，易产业化。下面将通过本发明的具体实施例的详细描述来进一步说明本发明，但这些实施例仅是进行示例性说明，并不构成对本发明的限制。实施例1在100ml的具塞三角瓶中，依次加入浓度为0.03mol/L的外消旋布洛芬(购自Sigma公司，下文同)的正己烷溶液lOml、0.3mmo1的乙醇、0.2g固定化酶。固定化酶是参考本申请人的共同待审中国发明专利申请No.200510112638.5以及TanTW,ZhangM,WangBW,YingCH，DengL.ScreeningofhighlipaseproducingCandidasp.andproductionoflipasebyfermentation.ProcessBiochem2003;39(4):459-65中的方法制备的，下文中相同。将反应混合物置于40'C下的摇床，在180转/分的转速下振荡保温反应24小时，获得含有外消旋布洛芬、S-布洛芬乙酯、R-布洛芬乙酯的混合物。取上述混合物20微升进行分析，分析方法如下通过高效液相色镨检测(手性柱CHIRALCELOBH，15cmx4.6mm，DAICELCHEMICALINDUSTRIES,LID，Jap;流动相正己烷异丙醇三氟乙酸=98:2:0.1)对上述样品进行分析，结果如下转化率c为0.366，底物对映体的过量值ees=0.546，酶的立体选择性E=62.25(酶的最优选择性是S型)，E由下面公式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(R>S)其中，c为转化率，R为反应t时间后未反应的R-布洛芬的量，S为反应t时间后未反应的S-布洛芬的量。加入10亳升pH为14的氢氧化钠水溶液来处理上述反应混合物，通过室温搅拌,静止分层，获得含有有机溶剂和S-布洛芬乙酯的溶液，然后利用常规的旋转蒸发进行处理，获得S-布洛芬乙酯。为了将获得的S-布洛芬乙酯进一步水解生成S-布洛芬，采用按照前述方法制备用于酯水解的微生物来源脂肪酶的固定化形式在PH=8的O.lmol/L磷酸緩冲液中水解。实施例2在100ml的具塞三角瓶中，依次加入浓度为0.03mol/L的外消旋布洛芬的正己烷溶液10ml、0.6mmol的乙醇、0.2g固定化酶。在与实施例l相同的条件下反应、检测、分离和7JC解，结果如下转化率c为0.396，底物对映体的过量值ees=0.606,酶的立体选择性E=47.22(酶的最优选择性是S型)。实施例3除酯化反应在30lC而不是40t:下进行之外，重复实施例1，结果如下转化率c为0.342，底物对映体的过量值ees=0.492,酶的立体选择性E=59.55(酶的最优选择性是S型)。实施例4除酯化反应在四氯化碳溶液中而不是在正己烷溶液中进行之外，重复实施例1，结果如下转化率c为0.374，底物对映体的过量值ees-0.566,酶的立体选择性E-65.55(酶的最优选择性是S型)。实施例5在100ml的具塞三角瓶中，依次加入浓度为0.03mol/L的外消旋布洛芬正己烷溶液10ml、0.3mmo1的正庚醇、50mg粗酶粉。粗酶粉是参照MingruiYu，ShaoweiQin，TianweiTan，Purificationandcharacterizationoftheextracellularlipase.Lip2fromYarrowialipolytica，ProcessBiochemistry42(2007)384-391中记载的方法制备的，下文中相同。将反应混合物置于40。C摇床，在180转/分的转速下振荡保温反应24小时。在与实施例l相同的条件下检测、分离，结果如下转化率c为0.325,底物对映体的过量值ees=0.460,酶的立体选择性E=69.13(酶的最优选择性是S型)，得到S-布洛芬正庚酯。采用与实施例1相同的方法经酶法进一步水解该酯获得S-布洛芬。实施例6在100ml的具塞三角瓶中，依次加入浓度为0.03mol/L的外消旋布洛芬正己烷溶液10ml、0.3mmol的正癸醇和50mg粗酶粉。置于40匸摇床，在转速180转/分的转速下振荡反应保温16小时。在与实施例1相同的条件下检测、分离，结果如下转化率c为0.401,底物对映体的过量值ees=0.629，酶的立体选择性E=61.31(酶的最优选择性是S型)，获得S-布洛芬正癸酯。采用与实施例1相同的方法进一步水解此酯获得S-布洛芬。实施例7除了加入20mgl8冠6作为添加剂之外，重复实施例5，结果如下转化率c为0.504，底物对映体的过量值ees=0.942，酶的立体选择性E=94.87(酶的最优选择性是S型)，获得S-布洛芬正癸酯。采用与实施例1相同的方法进一步水解该酯获得S-布洛芬。实施例8在100ml的具塞三角瓶中，依次加入浓度为0.03mol/L的外消旋布洛芬正己烷溶液10ml、0.3mmol的丙烯醇、0.2g固定化酶，置于40'C摇床，在转速180转/分的转速下振荡保温反应24小时。在与实施例1相同的条件下检测、分离，结果如下转化率c为0.408,底物对映体的过量值ees=0.632,酶的立体选择性E=44.80(酶的最优选择性是S型)，获得S-布洛芬丙烯酯。采用与实施例l相同的方法进一步水解该酯获得S-布洛芬。实施例9在100ml的具塞三角瓶中，依次加入浓度为0.03mol/L的外消旋布洛芬正己烷溶液10ml、0.6mmo1的十八醇和0.2g固定化酶。置于40。C摇床，在转速180转/分的转速下振荡保温反应24小时。在与实施例1相同的条件下检测、分离，结果如下转化率c为0.375，底物对映体的过量值ees=0.594，酶的立体选择性E=364(酶的最优选择性是S型)，获得S-布洛芬十八酯。采用与实施例l相同的方法进一步水解该酯获得S-布洛芬。实施例10:有机溶剂对外消旋布洛芬酯化的影响按照实施例1的方法，采用0.311111101布洛芬，0.311111101异丁醇，0.2g固定化的脂肪酶LIP2，以及10ml各种溶剂，在40X:,180rpm搅拌下反应24小时。反应结束后测定c、ees和E。表l有机溶剂对外消旋布洛芬酯化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>说明/表示未测定从上述表l中的结果可看出，上述有机溶剂均能有效地用于外消旋布洛芬与醇的酯化反应。实施例11:各种不同来源的脂肪酶对外消旋布洛芬酯化的对映体选择性本实施例中比较了不同来源的脂肪酶对外消旋布洛芬酯化的不同选择性，具体测试条件如下表中所述。从中可以看出，源自亚罗解脂酵母的胞外脂肪酶对S-布洛芬有非常好的选择性，明显优于其它来源的脂肪酶。表2各种不同微生物来源的脂肪酶对外消旋布洛芬酯化的对映体选择性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>a反应条件(RS)画布洛芬(0.3mmol)，l國丙醇(0.3mmol)，月旨肪酶(Cflrf/rf"a"to/rricfl，100mg;其它脂肪酶，200mg)，溶剂为正己烷(10ml),40C，180rpm，24小时(/:未测定)；b反应条件(RS)布洛芬(4mM)，l-丙醇(12mM)，脂肪酶(5.0%w/v),溶剂为异辛烷(IOml),35t:，300rpm，48小时.[结果来自FabianoJaresContesiniandPatn'ciadeOliveiraCarvalho*Esterificationof(RS)Ibuprofenbynativeandcommerciallipasesinatwo-phasesystemcontainingionicliquids.Tetrahedron:Asymmetry17(2006)2069-2073；c反应条件无脂肪酶，反应108小时后测定，其它条件同以上a所述。实施例12:采用不同底物醇的合适反应时间按照实施例1中的方法测定不同醇用于酯化外消旋布洛芬以拆分S-布洛芬的最佳反应时间。结果表明，采用不同的醇，其反应速率不一样，其中异丁醇的反应速率较快，酯化反应24小时较合适，而十八醇反应速率较慢，48小时较合适，并且随着反应时间的延长，R-型开始转化，到72小时，R-型已转化一半，到108小时，达平衡状态，不再转化，转化率达94%。实施例13:外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E与反应温度的关系为测试反应温度对外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E的影响，按照实施例1的方法进行了如下系列实验在不同反应温度下，采用LIP2200mg，外消旋布洛芬0.3mmol,异丁醇0.3mmol，以及溶剂为正己烷10ml，在180rpm下反应24小时。取样测试布洛芬转化情况，并按照实施例1中的方法计算外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E。将计算结果对反应温度作图，结果如图l所示。实施例14:外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E与反应原料布洛芬醇摩尔比例的关系为测试反应原料布洛芬醇摩尔比(即酸/醇摩尔比)对外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E的影响，进行了如下系列实验建立如下反应体系0.03mol/L底物，LIP2200mg,10ml正己烷，在40。C以180rpm反应24小时。取洋测试布洛芬转化情况，并按照实施例1中的方法计算外消旋布洛芬的转化率c和亚罗解脂酵母脂肪酶的立体选择性E。将计算结果对酸/醇摩尔比(或醇/酸摩尔比)作图，结果如图2所示。虽然已用数个实施例来说明本发明，但是可以在不偏离由所附权利要求所限定的本发明精神和范围内做出各种变化和修改，这对本领域技术人员而言是显而易见的。权利要求1.一种制备S-布洛芬酯的方法，包括如下步骤(1)利用来自或衍生自亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)的细胞外脂肪酶催化外消旋布洛芬和醇的酯化反应，和(2)对反应后的混合物进行分离处理，获得S-布洛芬酯。2.根据权利要求l所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述酯化反应在有机溶液中进行，所述有机溶剂优选选自Logp不小于3的有机溶剂例如烷烃、卣代烷烃等，更优选选自石油醚、正戊烷、环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、正壬烷、正癸烷、四氯化碳或其混合物。3.根据权利要求1或2所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述外消旋布洛芬和所述醇的摩尔比为1:5~5:1，优选为1:33:1，更优选为1:22:1，最优选为1:2。4.根据权利要求l所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述酯化反应温度为15~50°C，优选2045'C,更优选2540'C,最优选约40。C。5.根据权利要求l所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述醇为C1~C20醇，例如一元伯醇，所述醇是饱和的，如甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、十二醇、十八醇等，或者是不饱和的，如2丙烯醇，或者其任意混合物，优选所述醇是甲醇、乙醇、正丙醇或者其任意混合物，更优选所述醇是乙醇。6.根据权利要求1所述的S-布洛芬酯的制备方法，其中在所述酯化反应中还加入添加剂，优选所述添加剂选自18-冠-6、二苯18冠-6、环糊精、甘油、曱酰胺或者其任意混合物。7.根据权利要求l所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述分离处理在强碱反应条件下进行，优选包括利用强碱溶液处理反应混合物，所述强碱溶液的pH值的下限为12、12.5、13、13.5、13.6、13.7、13.8或13.9，上限为该强碱溶液的饱和溶液的pH值或者比该饱和溶液pH值低0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25或1.3等，更优选其pH值为1314,尤其是14,所述强碱溶液可以选自氢氧化钠、氢氧化钾等的溶液或者其任意混合物。8.根据权利要求1所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述亚罗解脂酵母细胞外脂肪酶是固定化酶，优选其用量为5mg/ml500mg/ml，更优选10~50mg/ml，尤其优选2030mg/ml,或者其是粗1|#，用量为0.001mg/ml~100mg/ml，优选0.01mg/ml50mg/ml，更优选0.05mg/ml~10mg/ml,尤其优选0.1~5mg/ml,最优选0.2~lmg/ml。9.根据权利要求8所述的S-布洛芬酯的制备方法，其特征在于，所述亚罗解脂酵母细胞外脂肪酶被固定在硅胶、硅藻土或膜状纺织品，包括天然纤维织物如棉布和化学纤维织物如涤纶，尤其是膜状纺织品上。10.根据权利要求1所述的S-布洛芬酯的制备方法，其中所述酯化反应持续到S-布洛芬和R布洛芬转化为酯的比率为3:1以上，更优选地4:1，进一步优选地5:1，尤其优选9:1，最优选98:2，更具体地，酯化反应时间通常为12-120小时，优选15~80小时，更优选20-60小时，最优选24~48小时.11.一种制备S-布洛芬的方法，包括将根据前述权利要求中任一项所获得的S-布洛芬酯进一步水解获得S-布洛芬的步骤。12.根据权利要求ll的方法，其中所述水解采用常规的化学法或者酶法进行，优选采用脂肪酶或酯酶进行，更优选所述脂肪酶来自或衍生自亚罗解月旨酵母》Cflw淑fl和CVm&V/a等。全文摘要本发明提供了一种催化制备S-布洛芬及多种S-布洛芬酯的新型方法，包括利用衍生自亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)的细胞外脂肪酶将外消旋布洛芬和醇一起酯化，获得S-布洛芬酯。本发明进一步涉及将制得的S-布洛芬酯水解制成S-布洛芬的方法。文档编号C07C51/09GK101104861SQ20071009723公开日2008年1月16日申请日期2007年4月28日优先权日2007年4月28日发明者英刘,芳王,谭天伟申请人:北京化工大学