专利名称：一种提取与富集雪莲总黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取与富集雪莲总黄酮的方法背景技术传统对雪莲有效成分的提取都是直接用溶剂提取，溶剂提取存在溶剂用量大，需要多次长时间提取，由于提取条件有限，不能得到易挥发，易热分解成分，深层有效成分浸出困难，对药材利用率差。
本发明提供的对雪莲黄酮的提取方法，先对雪莲粉碎后进行超临界CO2萃取，得到其中的易挥发，以及热不稳成分，然后再用常规溶剂提取。经过超临界萃取后的雪莲黄酮成分更容易从植物体内释放出来，其原理是超临界萃取后的减压放气过程存在着气爆破壁作用，大大降低了第二步提取时的传质阻力；低极性挥发性组分的脱除有利于第二步乙醇水溶液与植物组分的相互渗透过程。经过实验证明，经超临界处理过的雪莲同样条件下一次对雪莲黄酮的提取率比雪莲直接溶剂萃取提取量高25％-120％(总黄酮的检测)。
以往超临界CO2在植物有效成分萃取方面的应用只限于直接萃取低极性成分，而事实上由于有效成分极性的差异，和植物材质的不同，即使同样的成分在不同的植物体内萃取出的难易程度也有很大的差异，比如雪莲黄酮直接超临界萃取，或夹带剂情况下的萃取效果都不理想，本发明2步提取能高效的提取出雪莲黄酮成分，扩宽了超临界技术在药用植物化学中的应用。
发明内容
本发明涉及一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，该方法先对雪莲进行超临界CO2萃取，得到其中的易挥发以及热不稳成分，然后再用常规溶剂提取。经过超临界萃取后的雪莲黄酮成分更容易从植物体内释放出来。原理是超临界萃取后的减压放气过程存在着气爆破壁作用，大大降低了第二步提取时的传质阻力；低极性挥发性组分的脱除有利于第二步乙醇水溶液与植物组分的相互渗透过程。经过实验证明，经超临界处理过的雪莲同样条件下一次对雪莲黄酮的提取率比雪莲直接溶剂萃取提取量高25％-120％(总黄酮的检测)。
本发明所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，按下列步骤进行a、将雪莲干燥并粉碎至40-200目后置入超临界萃取釜中，用超临界CO2或CO2夹带乙醇进行预处理，动态萃取，控制萃取釜压力12-40MPa，萃取温度30-65℃，分离压力4-12MPa，分离温度20-60℃，时间为30-180分钟后停止；b、减压卸料后萃取釜内余渣用常规溶剂法提取，经1-2次乙醇水溶液提取，提取温度为25-100℃，提取时间为30-150min，即制得雪莲黄酮提取溶液；c、将得到的雪莲黄酮提取液减压浓缩至乙醇浓度为0％-15％体积比，进行大孔吸附树脂柱吸附；d、将吸附黄酮后的树脂依次用0％-95％乙醇洗脱，收集30％-50％洗脱液，浓缩后即得黄酮固含量为40-50％的雪莲提取物。
步骤a中超临界流体是单独CO2或CO2挟带70％-95％浓度的乙醇。
步骤b中提取所用的溶剂为50％-95％质量百分比浓度的乙醇水溶液。
步骤b中乙醇水溶液的用量为雪莲余渣重量的7-30倍质量比，每次提取时间为1-6小时。
步骤b中雪莲余渣用乙醇水溶液提取1-2次，合并提取液浓缩到乙醇浓度为0％-15％体积比，供大孔吸附树脂柱吸附。
步骤c中所用的大孔吸附树脂为HPD700或HPD400或HPD500。
步骤c中所述大孔树脂依次以2-8BV/h的流速用0-95％的乙醇溶液洗脱。
步骤d中吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得40％-50％雪莲总黄酮提取物。
本发明所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，该方法与现有技术的比较药材以及预处理新疆雪莲(Saussures involucrate)又名雪荷花，为菊科，风毛菊属多年生草本植物。浆干燥的雪莲全草粉碎至40-200目，然后装入超临界二氧化碳萃取装置进行萃取，萃取条件为20MP，45℃，2.5h。萃取后的余渣用作下一步溶剂法提取总黄酮。
本发明提取工艺并与常规提取法比较乙醇提取条件的优化与超临界二氧化碳萃取前后样品提取比较以提取的总黄酮量为指标，正交实验考察萃取液乙醇浓度(50％，70％，95％)、萃取温度(45，65，95℃)、液料比(10，15，20ml/g)、萃取时间(1.5，2.5，4.0h)四个因素的影响。
表1两种工艺的正交条件下测量结果
根据正交结果方法2中各个条件下都比方法1提取率要高出10.07％-128％，在提取温度为65℃时相对提取率差别最大，方法1和2的最佳条件均为95℃，4小时，20倍液料比，70％乙醇。影响因素大小依次为提取温度，乙醇浓度，液料比，提取时间。耦合提取法(方法2)在65℃，1.5小时的提取率(2.91％)与常规法(方法1)95℃，2.5小时提取率(2.98％)相当。
优化后条件与文献其他方法对比用正交优化后的条件分别按照方法1，方法2(本发明方法)，以及方法3(直接超声辅助提取法，50倍量乙醇液超声提取30min，然后加40倍乙醇液继续超声45min)萃取雪莲，其后分别按照1.4测定提取液中的总黄酮，结果见表2表2优化后条件与超声提取比较结果 从表知以总黄酮提取率为指标，超临界耦合常规溶剂法提取雪莲总黄酮比常规溶剂法提取率高25.90％，比超声辅助溶剂法条件高35.21％，并减少有机溶剂用量。
不同方法的HPLC图谱及结合标准品的对照指认对常规溶剂法和超临界耦合法最佳条件下的提取液做HPLC分析，结果见图，从指纹图谱可知，两种方法提取物在试验条件下组分成分的差异很小。结合正交分析结果，超临界耦合法和传统提取法提取液中其主要成分只存在含量的差异。
雪莲总黄酮的大孔树脂法富集，纯化树脂静态吸附，解析量的考察以及树脂的优选，根据文献以及树脂物性参数，选择河北沧州宝思公司的HPD系列5种树脂(HPD100A，HPD400，HPD500，HPD600，HPD700)考察静态吸附量。分别量取各种树脂10ml，用已知黄酮浓度为5.58mg/ml的雪莲黄酮水溶液50ml，装入锥形瓶后放置在30℃度恒温振荡箱内充分吸附24h，过滤，滤液定容250ml容量瓶，测吸光度，换算为黄酮浓度。
充分吸附后的树脂用100ml浓度为95％的乙醇洗脱30℃恒温振荡箱里充分解吸附24h。过滤，称重，滤液定容250ml容量瓶测吸光度，换算为黄酮浓度。浓缩后测固重，数据见表表3几种树脂对雪莲总黄酮的静态吸附，静态解析参数
综合树脂克吸附量，洗脱物黄酮百分含量，黄酮回收率结果，选择HPD700为最优，较好的还有HPD400，HPD500。
HPD700大孔树脂的动态吸附，动态解析行为考察取处理后的HPD700树脂10.0g(30.67ml)装柱(径高比1.25)，取黄酮含量为5.58mg/ml的水溶液上样，固定柱子流速为2BV/h(约1ml/min)，透过液每15ml一份，测试其固重；黄酮固含量。数据见表4表4 HPD700大孔树脂对雪莲总黄酮的动态饱和吸附
根据表4可知HPD700树脂动态饱和吸附量约为7.3BV(15×7/30.67)，黄酮吸附量为19.1mg/ml，与动态饱和吸附量相当。
吸附后的树脂乙醇梯度洗脱浓度考察用不同浓度的乙醇溶液各100ml，流速不变(2BV/h)梯度洗脱表5 HPD700大孔树脂动态梯度解析参数
单一洗脱树脂5份2.5ml(0.8149g)，分别饱和上样后，先用50ml水洗脱，然后分别用不同浓度的乙醇50ml洗脱，检测洗脱物重量和黄酮含量，结果见表6表6 HPD700大孔树脂醇解析浓度参数考察
本发明所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，该方法具有(1)、超临界CO2处理条件较温和，可以使雪莲中易挥发易分解成分无损失，实现对植物有效成分的初级分离，提高雪莲黄酮的提取率，能得到挥发油成分，原料利用率高；(2)、扩宽了超临界技术在植物有效成分提取中的应用，操作简单，安全不需要气爆罐装置，全过程只用到乙醇溶剂，且用量比常规方法降低；(3)、此耦合法提取雪莲总黄酮比单独超临界，或单独溶剂提取法都要高，总黄酮提取率比常规方法高25％以上，此法得到的浸膏便于富集浓缩黄酮，经过大孔树脂富集后，可以得到黄酮固含量为45％的雪莲提取物等特点。
图1为本发明优化后常规法提取液(方法1)的HPLC图谱图2为本发明优化后耦合法(方法2)的HPLC图谱
具体实施例方式
实施例1取干燥后的雪莲全草100g粉碎至40目后装入超临界萃取釜，启动超临界二氧化碳泵，用超临界CO2进行预处理，设定萃取温度30℃，先用少量的CO2排尽系统内残留空气，然后加压萃取釜为12MP，分离釜温度30℃，调节分离釜压力为4MP，动态萃取30分钟；减压卸料后萃取釜内余渣用常规溶剂法提取，将余渣用7倍量的50％的乙醇溶液在30℃提取1次，每次1小时，过滤后合并滤液，滤液浓缩后得到浸膏含黄酮3.15g；大孔吸附树脂的预处理HPD型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用1M的盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；将得到雪莲乙醇提取物5g，分散在100ml热水中，以1BV/h的流速通过100ml处理好的HPD400大孔树脂，然后依次用200ml水，0％，10％，40％乙醇水溶液冲洗柱子，监测透过液黄酮含量，黄酮浓度大于0.01mg/ml停止上样，收集40％浓度的乙醇洗脱液，合并浓缩即得黄酮固含量为44.7％的雪莲提取物。
实施例2取干燥后的雪莲全草100g粉碎至80目后装入超临界萃取釜，启动超临界二氧化碳泵，用超临界CO2夹代乙醇进行预处理，设定萃取温度40℃，先用少量的CO2排尽系统内残留空气，然后加压萃取釜为20MP，分离釜温度40℃，调节分离釜压力为6MP，动态萃取60分钟，
减压卸料后萃取釜内得到超临界二氧化碳雪莲萃取物2.35g，超临界萃取后的余渣用10倍量的70％的乙醇溶液在60℃提取2次，每次2小时，过滤后合并滤液，滤液浓缩后得到浸膏含黄酮2.35g；而同样批次的100g雪莲粉碎后直接用用7倍量95％的乙醇在65℃提取6小时，得到浸膏含黄酮只有1.35g；大孔吸附树脂的预处理HPD型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用1M的盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；将得到雪莲乙醇提取物5g，分散在100ml热水中，以3BV/h的流速通过100ml处理好的HPD700大孔树脂，然后依次用200ml水，0％，10％，40％乙醇水溶液冲洗柱子，监测透过液黄酮含量，黄酮浓度大于0.01mg/ml停止上样，收集40％浓度的乙醇洗脱液，合并浓缩即得黄酮固含量为44.7％的雪莲提取物。
实施例3取干燥后的雪莲全草100g粉碎至100目后装入超临界萃取釜，启动超临界二氧化碳泵，用超临界CO2进行预处理，设定萃取温度45℃，先用少量的CO2排尽系统内残留空气，然后加压萃取釜为25MP，分离釜温度30℃，调节分离釜压力为4MP，动态萃取150分钟；减压卸料后，从分离釜得到超临界二氧化碳雪莲萃取物2.41g，超临界萃取后的余渣用7倍量70％的乙醇在55℃提取2次，每次3小时，过滤后合并滤液，滤液浓缩后得到浸膏含黄酮2.49g；而同样批次的100g雪莲粉碎后直接用7倍量70％的乙醇在55℃提取3小时，得到浸膏含黄酮只有1.95g；大孔吸附树脂的预处理HPD型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用1M的盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；将得到雪莲乙醇提取物5g，分散在100ml热水中，以4BV/h的流速通过100ml处理好的HPD500大孔树脂，然后依次用200ml水，0％，10％，40％乙醇水溶液冲洗柱子，监测透过液黄酮含量，黄酮浓度大于0.01mg/ml停止上样，收集40％浓度的乙醇洗脱液，合并浓缩可得黄酮固含量为42.9％的雪莲提取物。
实施例4取干燥后的雪莲全草100g粉碎至120目后装入超临界萃取釜，启动超临界二氧化碳泵，用超临界CO2夹带乙醇进行预处理，设定萃取温度50℃，先用少量的CO2排尽系统内残留空气，然后加压萃取釜为35MP，分离釜温度50℃，调节分离釜压力为8MP，动态萃取120分钟；减压卸料后，从分离釜得到超临界二氧化碳雪莲萃取物2.51g，超临界萃取后的余渣用15倍量80％的乙醇在75℃提取1次，时间2.5小时，过滤后合并滤液，滤液浓缩后得到浸膏含黄酮2.91g；而同样批次的100g雪莲粉碎后直接用15倍量70％的乙醇在65℃提取2.5小时，得到浸膏含黄酮只有1.48g大孔吸附树脂的预处理HPD型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用1M的盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；将得到雪莲乙醇提取物5g，分散在100ml热水中，以1～5BV/h的流速通过100ml处理好的HPD400大孔树脂，然后依次用200ml水，0％，10％，40％乙醇水溶液冲洗柱子，监测透过液黄酮含量，黄酮浓度大于0.01mg/ml停止上样，收集40％浓度的乙醇洗脱液，合并浓缩即得黄酮固含量为44.7％的雪莲提取物。
实施例5取干燥后的雪莲全草100g粉碎至150目后装入超临界萃取釜，启动超临界二氧化碳泵，用95％乙醇为夹带剂进行预处理，设定萃取温度60℃，先用少量的CO2排尽系统内残留空气，然后加压萃取釜为35MP，分离釜温度50℃，调节分离釜压力为10MP，动态萃取150分钟；减压卸料后，从分离釜得到超临界二氧化碳雪莲萃取物3.52g，超临界萃取后的余渣用20倍量95％的乙醇在85℃提取2次，每次5小时，过滤后合并滤液，滤液浓缩后得到浸膏含黄酮2.33g；而同样批次的100g雪莲粉碎后直接用7倍量95％的乙醇在85℃提取5小时，得到浸膏含黄酮只有1.02g；大孔吸附树脂的预处理HPD型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用1M的盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；
将得到雪莲乙醇提取物5g，分散在100ml热水中，以1～5BV/h的流速通过100ml处理好的HPD700大孔树脂，然后依次用200ml水，0％，10％，40％乙醇水溶液冲洗柱子，监测透过液黄酮含量，黄酮浓度大于0.01mg/ml停止上样，收集40％浓度的乙醇洗脱液，浓缩可得黄酮固含量为45.3％的雪莲提取物。
实施例6取干燥后的雪莲全草100g粉碎至200目后装入超临界萃取釜，启动超临界二氧化碳泵，用超临界CO2进行预处理，设定萃取温度65℃，先用少量的CO2排尽系统内残留空气，然后加压萃取釜为40MP，分离釜温度60℃，调节分离釜压力为12MP，动态萃取180分钟；减压卸料后，从分离釜得到超临界二氧化碳雪莲萃取物2.35g，超临界萃取后的余渣用30倍量95％的乙醇在100℃提取1次，时间4小时，过滤后合并滤液，滤液浓缩后得到浸膏含黄酮3.18g；而同样批次的100g雪莲粉碎后直接用30倍量95％的乙醇在100℃提取4小时，得到浸膏含黄酮只有2.32g；大孔吸附树脂的预处理HPD型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用1M的盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；将得到雪莲乙醇提取物5g，分散在100ml热水中，以1～5BV/h的流速通过100ml处理好的HPD400大孔树脂，然后依次用200ml水，0％，10％，40％乙醇水溶液冲洗柱子，监测透过液黄酮含量，黄酮浓度大于0.01mg/ml停止上样，收集40％浓度的乙醇洗脱液，合并浓缩即得黄酮固含量为44.7％的雪莲提取物。
权利要求
1.一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于按下列步骤进行a、将雪莲干燥并粉碎至40-200目后置入超临界萃取釜中，用超临界CO2或CO2夹带乙醇进行预处理，动态萃取，控制萃取釜压力12-40MPa，萃取温度30-65℃，分离压力4-12MPa，分离温度20-60℃，时间为30-180分钟后停止；b、减压卸料后萃取釜内余渣用常规溶剂法提取，将余渣经1-2次乙醇水溶液提取，提取温度为25-100℃，提取时间为30-150min，即制得雪莲黄酮提取溶液；c、将得到的雪莲黄酮提取液减压浓缩至乙醇浓度为0％-15％体积比，进行大孔吸附树脂柱吸附；d、将吸附黄酮后的树脂依次用0％-95％乙醇洗脱，收集30％-50％洗脱液，浓缩后即得黄酮固含量为40-50％的雪莲提取物。
2.根据权利要求1所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤a中超临界流体是单独CO2或CO2挟带70％-95％浓度的乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤b中提取所用的溶剂为50％-95％质量百分比浓度的乙醇水溶液。
4.根据权利要求1或3所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤b中乙醇水溶液的用量为雪莲余渣重量的7-30倍质量比，每次提取时间为1-6小时。
5.根据权利要求1所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤b中雪莲余渣用乙醇水溶液提取1-2次，合并提取液浓缩到乙醇浓度为0％-15％体积比，供大孔吸附树脂柱吸附。
6.根据权利要求1所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤c中所用的大孔吸附树脂为HPD700或HPD400或HPD500。
7.根据权利要求1所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤c中所述大孔树脂依次以2-8BV/h的流速用0-95％的乙醇溶液洗脱。
8.根据权利要求1所述的一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，其特征在于步骤d中吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得40％-50％雪莲总黄酮提取物。
全文摘要
本发明涉及一种提取与富集雪莲总黄酮的方法，该方法先对雪莲进行超临界CO
文档编号C07H17/07GK101041653SQ200710102748
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月21日 优先权日2007年4月21日
发明者赵文军, 张富昌, 刘明灯, 高林 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所