专利名称：：抑制肿瘤和白血病细胞VEGF表达和增殖的siRNA及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学与生物医药
技术领域：
，具体为抑制VEGF蛋白表达和增殖的siRNA序列及应用。
背景技术：
：RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，在此情况下启动子是活跃的，靶基因能被转录，但不能正常积累mRNA。各种体内外实验证实21-23个nt的短双链RNA，即siRNA(shortinterferenceRNA，siRNA)，可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用，其结构稳定，无须象反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至极低水平甚至完全"敲除"，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂有很重要的药理作用。已证明，siRNA技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病，如病毒感染、脊髓延髓肌肉萎縮症(SBMA)，还可用于治疗肿瘤。血管内皮生长因子(VEGF)通过促进内皮细胞的增殖、生存和迁移而剌激血管的生成，在胚胎生成、骨骼的生长以及生殖活动中是一种生理性血管生成的关键调节因子，在肿瘤的血管生成中发挥着关键作用。在各种肿瘤和白血病细胞中，都已经发现VEGF表达上调，而且它与肿瘤和白血病的进展和预后差密切相关。肝癌作为实体瘤，其发生、发展与肿瘤血管生成有着密切的联系。VEGF在肝癌中高表达，与肝癌的分期、分级以及预后密切相关。将VEGF作为RNA干扰的耙标，利用VEGFsiRNA阻断VEGF及其受体的信号转导途径，从而阻断VEGF促血管形成，达到抑制肝癌细胞增殖的目的。因此，通过干扰VEGFmRNA，阻断血管形成，抑制肿瘤的生长、复发和转移已经成为肿瘤治疗的一种新策略。
发明内容本发明的目的在于提供能在细胞和蛋白水平上抑制肝癌和白血病细胞株VEGF表达的siRNA以及提供该siRNA在制药中的应用。为达上述目的，发明人采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA序列，通过实验筛选以下9条高效VEGFsiRNA序列(见表l):表l9条高效VEGFsiRNA序列靶标位置正义链序列反义链序列名称(Target)Sense(5'-3')Antisense(3'-5')VEGFsiRNAl106-126UCAUCACGAAGUGGUGAAGUUUUAGUAGUGCUUCACCACUUCVEGFsiRNA2386-楊UGCAGACCAAAGAAAGAUAUUUUACGUCUGGUUUCUUUCUAUVEGFsiRNA3539-559GAUCCGCAGACGUGUAAAUUUUUCUAGGCGUCUGCACAUUUAVEGFsiRNA4337-357GGCCAGCACAUAGGAGAGAUUUUCCGGUCGUGUAUCCUCUCUVEGFsiRNA5588-608GGCGAGGCAGCUUGAGUUAUUUUCCGCUCCGUCGAACUCAAUVEGFsiRNA6615-635CGUACUUGCAGAUGUGACAUUUUGCAUGAACGUCUACACUGUVEGFsiRNA7401-421GAUAGAGCAAGACAAGAAAUUUUCUAUCUCGUUCUGUUCUUUVEGFsiRNA8610-630CGAACGUACUUGCAGAUGUUUUUGCUUGCAUGAACGUCUACAVEGFsiRNA9423-443UCAGUUCGAGGAAAGGGAAUUUUAGUCAAGCUCCUUUCCCUU上述任一条VEGFsiRNA可用于制备抗肿瘤、抗肝癌或抗白血病的药物。RNA干扰技术是将一段双链的siRNA导入细胞，使具有同源序列的基因表达受到抑制，是肿瘤基因治疗的新领域。本发明的siRNA序列的长度均为19bp，这些siRNAs既足够长诱导基因特异性抑制，又足够短，逃避宿主干扰素反应。本发明将上述针对VEGFmRNA编码区不同位置的9条VEGFsiRNA序列分另导入肝癌7721细胞和白血病细胞HL60，结果显示肝癌细胞和白血病细胞的增殖受到抑制，同时VEGF蛋白的表达量降低。虽然针对同一耙基因，但位置不同，效果不同。本发明从细胞的增殖和靶基因蛋白的表达得到的结果是一致的。9条VEGFsiRNA序列均能抑制肝癌细胞和白血病细胞的生长和增殖，以VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6和VEGFsiRNA9的效果好，且均优于反义寡核苷酸对照组。ELISA法检测，与空白对照组相比，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9组细胞VEGF蛋白的表达水平明显地降低，VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7抑制靶基因表达的效果最好。可见，RNA干扰在肿瘤和白血病的基因治疗方面的效果优于与反义技术。VEGFsiRNA因其序列的特异性，可以特异地降解VEGFmRNA，从而降低VEGF蛋白的表达水平；VEGFsiRNA具有双链结构，比反义寡核苷酸更易抵御细胞内核酶的降解；VEGFsiRNA不需要化学修饰，可以避免反义寡核苷酸全硫代修饰引起的细胞毒性。因此，VEGFsiRNA可成为肿瘤和白血病基因治疗的重要工具。图l是各实验组分别作用于SMMC7721细胞后MTT法测得各组细胞的存活率比较图。*表示有统计学意义。图2是各实验组分别作用于SMMC7721细胞后CCK8法测得各组细胞的存活率比较图。*表示有统计学意义。图3是各实验组分别作用于SMMC7721细胞后ELISA法测得各组细胞VEGF蛋白表达水平比较图。*表示有统计学意义。图4是各实验组分别作用于HL60细胞后MTT法测得各组细胞的存活率比较图。具体实施方式实施例一VEGFsiRNA的设计与合成。从Genbank获得VEGFmRNA全序列，采用以下原则设计siRNA序列①在mRNA的起始密码子AUG的下游50100nt处开始设计；②以AA(N19)为模式；③G/C的百分比为30%70%;④一行中不要有4个以上的A或T;⑤一行中不要有4个及以上的G;⑥一行中不要有7个连续的GC链延伸；⑦完成序列比对(BLAST),以保证特异性；⑧结合RNAstructure3.7软件，计算总自由能overallAG37。表2显示，设计VEGFsiRNA序列9条，同时设计反义寡核苷酸对照(中国专利申请号03139788.3)，阳性对照(针对GAPDH基因)。siRNA模板和反义药物(全硫代修饰)由上海生工生物工程有限公司合成，使用Ambion公司的siRNA构建试剂盒合成VEGFsiRNA。表2设计的VEGFsiRNA及反义对照、阳性对照名称靶标位置正义链序列反义链序列总自能TargetSense(5'-3')Antisense(3'-5')Overall△G37VEGFsiRNA1106-126UCAUCACGAAGUGGUGAAGUUUUAGUAGUGCUUCACCACUUC-12.7VEGFsiRNA2386-406UGCAGACCAAAGAAAGAUAUUUUACGUCUGGUUUCUUUCUAU-15.9VEGFsiRNA3539-559GAUCCGCAGACGUGUAAAUUUUUCUAGGCGUCUGCACAUUUA-9.9VEGFsiRNA4337-357GGCCAGCACAUAGGAGAGAUUUUCCGGUCGUGUAUCCUCUCU-5.3VEGFsiRNA5588-608GGCGAGGCAGCUUGAGUUAUUUUCCGCUCCGUCGAACUCAAU-0.8VEGFsiRNA6615-635CGUACUUGCAGAUGUGACAUUUUGCAUGAACGUCUACACUGU-17.2VEGFsiRNA7401-421GAUAGAGCAAGACAAGAAAUUUUCUAUCUCGUUCUGUUCUUU-14.3VEGFsiRNA8610-630CGAACGUACUUGCAGAUGUUUUUGCUUGCAUGAACGUCUACA-17.8VEGFsiRNA9423-443UCAGUUCGAGGAAAGGGAAUUUUAGUCAAGCUCCUUUCCCUU-12.8VEGF反义81-100GGGTGCAGCCTGGGACCACT阳性对照GAPDH模板由ambion公司试剂盒提供实施例二MTT法分析各实验组对SMMC7721细胞增殖的抑制效果。人的肝癌SMMC7721细胞培养于RPMI1640培养液中(含10%小牛血清、青霉素和链霉素的终浓度为100U/毫升)，置于37'C、含5%(:02温箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取对数生长期的SMMC7721细胞，配制2.0xlO"mL起始浓度细胞，每孔加100^L到96孔培养板内(Coming,美国)，设空白对照组、脂质体对照组(Invitrogen公司)、阳性对照组(针对GAPDH基因)、反义组(25nmol/L)及siRNAl-9组(25nmol/L)。每组5孔，接种24h后弃去上清，转染siRNA1-9和对照组，置37。C，饱和湿度，5%C02培养箱中无血清继续培养4h，再各补加无双抗含10%胎牛血清的1640100pL，72h后加入MTT20pL/孔，孵箱内孵育4h后弃上清，加入DMSO150nL/孔，在570nm的波长的酶标仪下检测各组的吸光度。MTT实验中通过方差分析发现各个组别之间的差异有统计学意义(F=20.21，PO.Ol)。VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9组与空白对照组之间均有显著差异，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9对细胞增殖的抑制效果均好于反义药物组。结果见图1和表3。表3MTT法分析各实验组对SMMC7721细胞增殖的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与空白对照组相比，*表示？<0.05，"表示PO.Ol与反义药物组相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol实施例三CCk8法检测各实验组siRNA抑制肝癌SMMC7721细胞增殖的效果。人的肝癌SMMC7721细胞培养于RPMI1640培养液中(含10%小牛血清、青霉素和链霉素的终浓度为100U/毫升)，置于37"C、含5%(:02温箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取对数生长期的7721细胞，配制1.0xl0VmL起始浓度细胞，接种96孔板，每孔100ul，置37。C,饱和湿度，5%C02培养箱内培养。于72h每孔加入10ul的CCK8试剂，然后把培养板放在C02培养箱内继续培养2小时，在450nm波长处测定吸光度，参考波长为655nm。细胞存活率=实验组吸光度/对照组吸光度xlOOM。使用CCK8试剂盒测定各个药物组别。经过方差分析，各个实验组之间有统计学差异(F-17.46,PO.Ol)，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9组与空白对照组之间均有显著差异(PO.01);两两比较分析发现VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFs腦A8、VEGFsiRNA9的效果均好于反义药物组，而VEGFsiRNAl、VEGFsiRNA3、VEGFsiRNA5与反义药物组没有差异。结果见图2和表4。表4CCK8法分析各实验组对SMMC7721细胞增殖的抑制效果组别xs(OD值)细胞存活率％VEGFsiRNAl0.9390.129**46.30VEGFsiRNA20.7260.052**AA35.76VEGFsiRNA3l遍0.084**49.59VEGFsiRNA40.7630.070**AA37.60VEGFsiRNA51.0490.245**51.67VEGFsiRNA60.7890.094**AA38.91VEGFsiRNA70.7320.163**AA36.08VEGFsiRNA80.7810.184**AA38.50VEGFsiRNA90.7360.174**AA36.26阳性对照组1.2960.30263.84脂质体对照组1.4240.32170.19反义药物组1.1750.19857.89空白对照组2.0290.132100.00与空白对照组相比，f表示P0.05，^"表示PO.Ol与反义药物组相比，A表示P0.05，AA表示P"C0.01实施例四VEGFsiRNA抑制肝癌SMMC7721细胞VEGF蛋白表达的测定。人的肝癌SMMC7721细胞培养于RPMI1640培养液中(含10%小牛血清、青霉素和链霉素的终浓度为100U/毫升)，置于37。C、含5%(:02温箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。将对数生长期的SMMC7721细胞接种96孔板，每孔100ul，置37。C，饱和湿度，5%C02培养箱内培养。SiRNAl-9组和反义寡核苷酸药物组按25nm分别转染细胞，72h后离心收取上清夜，VEGF蛋白测定按人VEGFELISA试剂盒说明书操作(晶美生物工程有限公司)，加入终止液混匀后即刻用酶标仪(BIO-RID公司)测定OD45o值，标准品和样品孔的OD值减去空白孔的OD值。以标准品的OD值为纵坐标，标准品的浓度(pg/ml)为横坐标，绘制标准曲线并求出标准曲线方程。通过样品的OD值在标准曲线方程内求出样品VEGF浓度。结果见图3和表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与空白对照组相比，*表示？<0.05，"表示PO.Ol与反义药物组相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol实施例五CCK8法检测各实验组siRNA抑制白血病HL60细胞增殖的效果。分别用25nM，50nM，100nM的VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7和反义药物组作用HL60细胞，结果转染24小时，采用嵌套设计资料的方差分析发现，同一药物的不同浓度之间无统计学差异，而不同组别之间差异显著(F-4.231,P=0.016),其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7与空白对照组有差异，而反义药物组与空白对照组无统计学差异。结果见图4和表6。表6转染药物24小时后的细胞生长状况<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例六VEGFsiRNA在制备抗肝癌和白血病药物中的应用。取实施例一合成的VEGFsiRNAl9中任一条序列，配制成浓度为25nmo1/1的抗肝癌或抗白血病药品，临床上可以通过静脉注射或者直接将siRNA药物直接注射到瘤体内进行治疗。实施例七VEGFsiRNA在制备抗肝癌和白血病药物中的应用。取实施例一合成的VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7，混合配制成浓度为25nmol/l的抗肝癌或抗白血病药品，临床上可以通过静脉注射或者直接将siRNA药物直接注射到瘤体内进行治疗。SEQUENCELISTING<110>暨南大学<120>抑制肿瘤和白血病细胞VEGF表达和增殖的siRNA及应用<130>1<160>18<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNAl序列正义链<400>1ucaucacgaaguggugaaguu21<210>2<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNAl序列反义链<400>2uuaguagugcuucaccacuuc21<210>3<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA2序列正义链<400>3ugcagaccaaagaaagauauu21<210>4<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA2序列反义链<400>4uuacgucugguuucuuucuau21<210>5<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA3序列正义链<400>5gauccgcagacguguaaauuu21<210>6<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNAS序列反义链<400>6uucuaggcgucugcaca皿ua21<210>7<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA4序列正义链<400>7ggccageacauaggagagauu21<210>8<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA4序列反义链<400>8uuccggucguguauccucucu21<210>9<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA5序列正义链<400>9ggcgaggcagcuugaguuauu21<210>10<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA5序列反义链<400>10uuccgcuccgucgaacucaau21<210>11<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA6序列正义链<400>11cguacuugcagaugugacauu21<210>12<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA6序列反义链<400>12uugcaugaacgucuacacugu21<210>13<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA7序列正义链<400>13gauagagcaagacaagaaauu21<210>14<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA7序列反义链<400>14uucuaucucguucuguucuuu21<210>15<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>釆用sHlNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA8序列正义链<400>15cgaacguacuugcagauguuu21<210>16<211>21<212>RKA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA8序列反义链<400>16uugcuugcaugaacgucuaca21<210>17<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA9序列正义链<400>17ucaguucgaggaaagggaauu21<210>18<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA设计法则并结合RNAstructure3.7软件辅助设计VEGFsiRNA9序列反义链<400>18uuagucaagcuccuuucccuu2权利要求1、一种抑制肿瘤和白血病细胞VEGF表达和增殖的siRNA，其特征在于所述siRNA序列如下VEGFsiRNA7正义链GAUAGAGCAAGACAAGAAAUU，反义链UUCUAUCUCGUUCUGUUCUUU。2、权利要求l所述的siRNA序列用于制备抗肿瘤的药物。3、权利要求l所述的siRNA序列用于制备抗肝癌的药物。4、权利要求l所述的siRNA序列用于制备抗白血病的药物。全文摘要本发明属于分子生物学与生物医药
技术领域：
，具体为9条抑制VEGF蛋白表达的增殖的siRNA序列。经过MTT和CCK8法检测，9条VEGFsiRNA改变SMMC7721细胞的生物学特性，抑制肿瘤和白血病细胞的生长和增殖，ELISA检测9条VEGFsiRNA序列均可下调VEGF蛋白的表达。形态学观察，VEGFsiRNA能引起肿瘤和白血病细胞发生形态变化。因此，VEGFsiRNA可用于制备抗肿瘤和白血病的药物。文档编号C07H21/00GK101113439SQ20071013724公开日2008年1月30日申请日期2005年6月3日优先权日2005年6月3日发明者洹张,荆春霞申请人:暨南大学