专利名称：：卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术的制作方法
技术领域：
：本发明涉及卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，是专用于卵黄中油脂和水溶性组分的分离工艺，属于生物技术制药中卵黄免疫球蛋白制备
技术领域：
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背景技术：
：鸡卵黄免疫球蛋白又称IgY(YolkImmunoglobulin),是存在于免疫后母鸡的卵黄中的一种抗体，它是由母鸡血清中的免疫球蛋白转移而来。IgY具有稳定性较好、取材方便、产量高等优点。卵黄抗体可以应用于多种抗原的多克隆抗体制备并应用于临床疾病治疗，如鸡传染性法氏囊炎、新城疫、鸭瘟、小鹅瘟、猪瘟等等。用禽卵大量制备多克隆抗体在近年来抗体制备技术已经逐渐兴起，并且已经制备了针对不同抗原的IgY，如服V、流感病毒大肠杆菌、链球菌、梭状芽抱孢杆菌、人胰岛素、人红细胞、人血清免疫球蛋白、蛇毒和蝎毒等。卵黄是由约48.7%的水、16.6%蛋白质和32.6%的脂类及其他组分组成，卵黄可以被看成是一个油包水的高度乳化体，IgY的开发和利用首先要将卵黄中油脂和水溶性组分进行分离，即将卵黄脱脂，所以卵黄脱脂技术一直是IgY开发的起点。高效、简单、成本低廉的脱脂方法一直是科研工作者的追求目标。卵黄脱脂研究国外起步较早，并且已经形成了许多成熟的方法，如Poison的PEG法及其改进方法(1980和1985)、Bade和Stegemann的氯仿一PEG法(1984)、Jensenius的硫酸葡聚糖法(1981)以及Nakai和Schwarzkopf的水稀释法等等。国内对卵黄脱脂研究相对较晚，许多方法是在以上方法基础上进行改进。以上这些脱脂方法虽然能保证IgY的回收率，但是应用于大批量生产却都存在一定缺陷。首先，这些方法都需要使用大量试剂甚至有毒有机溶剂，脱脂后去除这些试剂或有机溶剂必然要增加卵黄抗体的成本；其次，这些方法都需要使用冷冻离心机和冰箱，这将大大限制卵黄脱脂的批生产量，并且也增加成本。所以，卵黄脱脂技术仍需要继续的探索。这些年来，我国科研工作者为卵黄脱脂大规模生产也进行了很多研究，并取得了一定的成果。如山东农业大学柴家前的发明专利一种提取卵黄中抗体的新方法(申请号95110458.6)中公开的甲醛脱脂法是将卵黄用缓冲液稀释后添加0.31.2Q^甲醛溶液，然后再冷冻快速溶解得到的液体即为抗体溶液。1998年山东农业大学常韦山的发明专利精制卵黄抗体的制备工艺(ZL专利号98110215.8)中公开的苯酚脱脂法是使用含23%的化学纯苯酚溶液与卵黄35:1混合均匀，室温静置10分钟，离心后可使卵黄液分为含脂类物质的沉淀和含抗体的上清液。福州大学王辉龙在2001年发表了"聚乙二醇一步沉淀提取卵黄抗体"方法，该法是使用缓冲液稀释后再超滤达到卵黄脱脂目的。另外还有江南大学杨严俊的发明专利一种高生物活性卵黄抗体的制备方法(申请号200610040414.2)中利用天然高分子胶结合超滤技术，实现了工业化规模从蛋黄中分离提取高生物活性卵黄抗体的目的。以上专利以柴家前教授的方法最为有效、简单、成本低廉，但是甲醛的残留毒害却是该方法的致命缺点，同时使用大容量低温冰箱也影响该方法的生产量。以上这些方法都必须使用大量无机或有机试剂、离心机或超滤设备以及都需要经过多个步骤才能达到卵黄脱脂的目的。其中许多试剂是有毒、有害的，在IgY液中残留后很难去除；仪器或设备的使用也增加了脱脂成本，同时也约束了脱脂工艺的批生产量。
发明内容本发明的目的是，在保证卵黄中IgY活性和回收率的基础上，研究一种采用剂量少、安全、无毒的脱脂试剂，与卵黄作用后可以使卵黄中油脂与蛋白质分离，且不使用离心仪器即能自然凝集沉淀，而达到一步脱脂的方法。为实现上述目的，本发明所用的技术方案是使用聚乙二醇(PEG,分子量为100020000)或其溶液与卵黄原液或卵黄稀释液直接混合，通过机械搅拌和PEG的强吸水能力打破卵黄的乳化状态，使卵黄中油脂颗粒与蛋白质分离，然后通过静置，使卵黄油脂发生相互凝集而自然沉淀，从而达到卵黄脱脂的目的。本发明的具体方法如下在一5'C50'C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；先将卵黄原液加水做n倍稀释成卵黄稀释液，然后将聚乙二醇用卵黄原液m倍体积的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后将卵黄稀释液和聚乙二醇溶液充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0〈n<20，0<m<20，且(Xn+m《20。本发明的另一种具体方法是:在一5'C5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；先将卵黄原液加水做n倍稀释成卵黄稀释液，然后添加聚乙二醇充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0<n《20。本发明的又一种具体方法是:在一5'C50'C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；然后将聚乙二醇用卵黄原液m倍体积的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后将卵黄原液和聚乙二醇溶液充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0〈m《20。本发明的又一种具体方法是:在一5'C5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液并添加聚乙二醇，然后向卵黄一聚乙二醇混合物中添加卵黄体积x倍的水，搅拌使聚乙二醇溶解完全后静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0〈x《20。本发明方法中聚乙二醇与卵黄原液的用量比(w/v)为1%10%。本发明中用的PEG为高分子聚合物，它超强的吸水性，可以破坏水溶液中蛋白质和脂类水化膜的作用。卵黄作为一种高浓度油包水的乳剂，在PEG溶液稀释并搅拌的状态下，油脂和蛋白质的乳化状态被打破，两者分离开来，悬浮于水溶液中的油脂颗粒易发生碰撞而凝集，由于卵黄中油脂密度大于水，在静置过程中，卵黄油脂便沉淀于底部，从而达到卵黄脱脂的作用。当PEG用量低于卵黄的1%(w/v)时，PEG不能充分破坏卵黄的乳化状态，不能发生明显的沉降作用；当PEG用量达到卵黄的10%(w/v)或更高时，PEG对IgY水化膜的破坏作用增强，IgY和油脂都会发生沉淀而严重影响IgY的回收率。本发明中PEG用量直接决定着卵黄的脱脂速度和效果，脱脂效果的好坏直接体现在脱脂后上清液的澄清度、颜色以及IgY损失上。随着PEG用量的增大，上清液的澄清度越来越高，颜色越来越淡(直至无色)，但是达到无色后IgY损失率也升高较快。另外PEG用量增大，沉降速度也随之减慢，但是沉淀物却非常结实。PEG用量与沉降速度、上清液澄清度和颜色的关系见表1;PEG的用量与IgY损失情况见表2(以鸡传染性法氏囊炎卵黄抗体效价的琼脂扩散实验结果为例)。表lPEG用量与脱脂后上清液澄清度、颜色记录PEG浓度(w/v)2.4%3.2%4.0%4.8%5.6%6.4%7.2%0%沉降速度不沉淀65ml66ml60ml35ml20ml20ml不沉淀上清液澄清度浑浊微浊澄清澄清澄清澄清澄清浑浊上清液颜色黄色黄色淡黄色微黄色微黄色无色无色黄色注沉降速度采用测量沉降后上清液体积的方法进行比较，此表数据为沉降30分钟后的上清液体积表2PEG用量与IgY损失记录<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1、该结果为鸡传染性法氏囊炎高免卵黄脱脂后上清液琼脂扩散法测定抗体效价的实验数据。2、该表数据为两次平行试验结果的平均值。本发明与现有技术相比较有以下优点1、低毒、无害本发明使用的试剂PEG为无毒、无害的试剂，可在许多注射剂、口服液以及食品中大量使用，IgY中残留的PEG毒性和危害性可以忽略不计，同时PEG也是IgY进一步纯化的常用试剂。2、简单、易于操作该脱脂方法不使用任何仪器，直接用PEG水溶液与卵黄原液或卵黄稀释液混合搅拌，一步便可使卵黄油脂自然沉淀，所以该方法最为简便，易于操作。3、满足大规模生产需求由于该专利不使用任何仪器，所以批生产量不受到限制，因而适合于大规模生产。4、脱脂速度快采用本方法脱脂，不同反应量的混合液一般0.55小时后，沉淀过程就完全结束，沉淀物形成粘稠膏状物，搅拌也无法使其再次混悬。5、成本低廉本发明中使用的PEG量较少，同时PEG价格又很低，再加上不使用任何仪器，所以本发明方法成本非常低廉。具体实施方式具体实施实例1在ot:5'c环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，然后精确量取卵黄原液100ml，置500ml烧杯中。精确称取1.5g聚乙二醇6000溶于300ml蒸馏水中，搅拌至完全溶解，然后将PEG液倒入卵黄原液中搅拌5分钟，再将混合液静置沉淀24小时。沉淀后的卵黄液分为两层，底部为粘稠膏状卵黄油脂，上清液为澄清透明的卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液。具体实施实例2在2(TC25"C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，然后精确量取卵黄原液100ml，置500ml烧杯中，然后添加100ml蒸馏水稀释，搅拌均匀。精确称取5.6g聚乙二醇4000溶于500ml蒸馏水中，搅拌至完全溶解。然后将PEG液倒入卵黄稀释液中搅拌5分钟，然后将混合液静置沉淀2小时。沉淀后的卵黄液分为两层，底部为粘稠膏状卵黄油脂，上清液为澄清透明的卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液。具体实施实例3在4(TC45'C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，然后精确量取卵黄原液100ml，再称取8.Og聚乙二醇12000加到卵黄原液中，再添加1500ml水搅拌至PEG完全溶解，然后将混合液静置沉淀过夜。沉淀后的卵黄液分为两层，底部为粘稠膏状卵黄油脂，上清液为澄清透明的卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液。具体实施实例4在KTC15'C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，然后精确量取卵黄原液100ml，置1000ml烧杯中，然后添加500ml蒸馏水稀释再添加4.8g聚乙二醇6000后搅拌至完全溶解。然后将混合液静置沉淀3小时。沉淀后的卵黄液分为两层，底部为粘稠膏状卵黄油脂，上清液为澄清透明的卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液。权利要求1.卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，其特征在于，将聚乙二醇(PEG，分子量为1000～20000)或其溶液与卵黄原液或卵黄稀释液直接混合充分搅拌，然后静置，卵黄油脂发生相互凝集而自然沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液。2、根据权利要求1所述的卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，其特征在于，在一5"C50'C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；先将卵黄原液加水做n倍稀释成卵黄稀释液，然后将聚乙二醇用卵黄原液m倍体积的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后将卵黄稀释液和聚乙二醇溶液充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0〈n〈20，0<m<20，且0<n+m《20。3、根据权利要求1所述的卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，其特征在于，在一5'C5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；先将卵黄原液加水做n倍稀释成卵黄稀释液，然后添加聚乙二醇充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即lgY与其他蛋白的混合溶液；其中0<n《20。4、根据权利要求1所述的卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，其特征在于，在一5'C5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液；然后将聚乙二醇用卵黄原液m倍体积的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后将卵黄原液和聚乙二醇溶液充分搅拌混匀，静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0<m《20。5、根据权利要求1所述的卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，其特征在于，在一5'C5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，搅拌打破卵黄膜，取卵黄原液并添加聚乙二醇，然后向卵黄一聚乙二醇混合物中添加卵黄体积x倍的水，搅拌使聚乙二醇溶解完全后静置沉淀，沉淀后的底部即为卵黄油脂，上清液为卵黄水溶性组分，即IgY与其他蛋白的混合溶液；其中0〈x《20。6、根据权利要求2或3或4或5所述的卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，其特征在于，聚乙二醇与卵黄原液的用量比(w/v)为1%10%。全文摘要本发明公开了卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，是专用于卵黄中油脂和水溶性组分的分离工艺，属于生物技术制药中卵黄免疫球蛋白制备
技术领域：
。本发明所用的技术方案是使用PEG或其溶液与卵黄原液或卵黄稀释液直接混合，通过机械搅拌和PEG的强吸水能力打破卵黄的乳化状态，使卵黄中油脂颗粒与蛋白质分离，然后通过静置，使卵黄油脂发生相互凝集而自然沉淀，从而达到卵黄脱脂的目的。本方法与现有脱脂方法相比较具有使用试剂少、安全、无毒，操作简便以及不使用大型仪器等优点，并且能进行大规模生产。文档编号C07K1/00GK101225103SQ20081001451公开日2008年7月23日申请日期2008年2月1日优先权日2008年2月1日发明者剑付,何元龙,静吴,杨英阁,阎佩佩申请人:山东省农业科学院家禽研究所