专利名称：：肽-补体缀合物的制作方法肽-补体缀合物本发明报道了抗融合肽与补体因子Clq球形头衍生多肽的缀合物。
背景技术：
：HIV病毒对细胞的感染受到这样过程的影响，其中待被感染细胞的膜与病毒的膜融合。提出了用于该过程的一般图解病毒包膜糖蛋白复合体(gpl20/gp41)与位于待被感染细胞的膜上的细胞表面受体相互作用。gpl20结合例如CD4受体与共受体如CCR-5或CXCR-4组合引起gpl20/gp41复合体构象的改变。该构象改变的结果是gp41蛋白能够插入靶细胞的膜中。该插入是膜融合过程的开始。已知因天然存在的多态性，gp41蛋白的氨基酸序列在不同的HIV毒林中不同。但是可以精确地识别相同的结构域结构融合信号、两个七残基重复结构域(HR1，HR2)和跨膜结构域(以N末端到C末端的方向)。据提示，融合(或融合的)结构域参与插入细胞膜及细胞膜解体。HR区由多段组成，每一段包含7个氨基酸("七残基")(参阅例如Shu，W.，等，Biochemistry38(1999)5378-5385)。除七残基外，还存在一个或更多个亮氨酸拉链样基序。该组成解释了gp41蛋白巻曲螺旋结构的形成，也正好解释了来自这些结构域的肽的巻曲螺旋结构形成。巻曲螺旋一般而言是由两个或更多个相互作用的螺旋组成的寡聚体。具有从gp41的HR1或HR2结构域推导的氨基酸序列的肽是HIV进入细胞有效的体外及体内抑制剂(例如，肽参阅例如US5，464，933、US5,656,480、US6,258,782、US6,348,568或US6，656，卯6)。例如，T20(也称为DP178，Fuzeon⑧，HR2肽)和T651(US6,479,055)是HIV感染的非常有效的抑制剂。已经尝试利用例如氨基酸替换或化学交来增强HR2衍生肽的功效(Sia，S.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(2002)14664-14669;Otaka，A"等，Angew.Chem.Int.Ed.41(2002)2937-2940)。人的先天免疫包含补体途径。该途径通过Cl补体因子的识别亚基Clq结合免疫靶标而被激活。全长Clq分子是异数分子，其包含六个拷贝的三个单体结构单元(其命名为ClqA、ClqB和ClqC)中的每一个结构单元。每一单体单元包含N末端区(3到9个残基)、胶原样结构域(横跨大约81个残基)和球形结构域(球形头部；横跨大约135个残基)(Sellar，G.C.，等Biochem.J.274(1991)481-490)。Moir等报道了HIV-1通过补体途径的激活感染B细胞(Moir，S.,等，J.Exp.Med.192(2000)637-646)。人补体途径的激活源自gp41的免疫显性区(gpl60的5卯-620位；根据Ratner,L.，等，Nature313(1985)277-284的编号)与补体因子ciq的结合(Ebenbichler,C.F.，J.Exp.Med.174(1991)1417-1424)。Thielens等报道了人Cl的Clq亚成分与HIV-1的跨膜包膜糖蛋白gp41在gpl60的590-613位氨基酸区内相互作用。该相互作用可,皮包含gpl60笫601-613位氨基酸的肽(具有连接Cys605和Cys611的二硫键)抑制(Thielens,N.M.，等，J.Immunol.151(1993)6583-6592)。发明简述本发明包含多肽缀合物，所迷多肽缀合物包含选自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽和选自抗融合肽的第二多肽。在一个实施方案中，本发明的缀合物以选自以下顺序的顺序包含第一和第二多肽N末端-第一多肽-第二多肽-C末端，N末端-笫二多肽-第一多肽-C末端。在另一实施方案中，本发明的缀合物包含第一和第二多肽之间的接头多肽。本发明还报道了多肽缀合物，其包含a)选自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的笫一多肽(1stpp),b)选自抗融合肽的笫二多肽(2ndpp)，c)选自抗原结合性抗CCR5抗体链、抗原结合性抗CD4抗体链、中和抗HIV-1抗体链及其片段的任选第三多肽(3rdpp)，d)连接所述第一、第二和/或第三多肽的任选接头多肽(linkpp)。在该多肽缀合物中，组成多肽从N到C末端具有[lstppla-[linkppm一[2ndppb-[linkppn-[3rdppc一[linkpp]o-[1stppd-[linkppp_2ndppe-[linkppq-[3rdpplf-linkppr-[lstppg的顺序，其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r均为整数0或l，并且a+d+g=l，b+e=l,c+f-0或1，m、n、o、p、q、r彼jt匕《虫立地是0或1。数值O表示在相应位置上缺少相应多肽，数值l表示在多肽缀合物中相应位置上存在相应多肽。在一个实施方案中，所述任选的第三多肽选自抗原结合性抗CCR5抗体链及其片段。在另一实施方案中是选自抗原结合性抗CD4抗体链及其片段的所述任选的第三多肽。在另一抗HIV-1实施方案中是选自抗原结合性抗HIV-1抗体链及其片段的所述任选的第三多肽。在一个实施方案中是选自包含SEQIDNO:20到SEQIDNO:48的多肽的所述接头多肽。在另一实施方案中是选自包含SEQIDNO:08到SEQIDNO:19的抗融合肽的所述第二多肽。本发明的另一方面是编码本发明多肽缀合物的核酸和包含本发明核酸的真核细胞。本发明还包括用于制备本发明多肽缀合物的方法，其包括以下步骤a)在适合于表达多肽缀合物的条件下培养细胞，所述细胞包含编码本发明多肽缀合物的核酸，和b)从细胞或培养基中回收所述多肽缀合物。本发明还包含药物组合物，其含有本发明的多肽缀合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的赋形剂或载体。本发明还包括的是本发明多肽缀合物在用于制备治疗病毒感染，优选HIV感染的药物中的用途。发明详述本发明包含多肽缀合物，所迷多肽缀合物包含选自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽，和选自抗融合肽的第二多肽。本发明还包含多肽缀合物，所述多肽缀合物包含选自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽(lstpp),选自抗融合肽的第二多肽(2ndpp)，选自包含抗CCR5抗体的抗原结合片段、抗HIV-l抗体的中和片段和抗CD4抗体的抗原结合片段的任选第三多肽(3rdpp)和连接所述第一、第二和/或第三多肽的任选接头多肽(linkpp)，由此在该多肽缀合物中各多肽从N到C末端具有以下顺序3GNN(SEQIDNO:24)、LSLSPGK(SEQIDNO:20)、LSPNRGEC(SEQIDNO:21)、LSLSGG(SEQIDNO:45)、LSLSPGG(SEQIDNO:46)、[G3SIS，(SEQID隐47—G3S5GGG，(SEQIDNO:48)。所有的接头多肽均可由核酸分子编码并因此可以进4亍重组表达。因为所述接头多肽本身是肽，所以连接多肽接头的多肽通过两个氨基酸之间形成的肽键进行连接。因而，本发明的多肽缀合物可通过蛋白质的表达重組产生。在另一实施方案中，本发明包含多肽缀合物，其中除了第一和第二多肽，还缀合额外的第三多肽。所述第一多肽是人补体因子Clq的A亚基或其片段，如上所述。所述第二多肽是选自抗融合肽的多肽，如上所述。所述第三多肽是抗CCR5抗体或抗CD4抗体或抗HIV-l抗体的抗原结合片段。如本申请中所用，术语"抗原结合"表示结合其抗原的抗体或其片段。在抗CCR5抗体的情况下，所述结合针对CCR5受体，在抗CD4抗体的情况下，所述结合针对CD4受体，在抗HIV-1抗体的情况下，所述结合针对HIVgp120。以Ko-值给出的结合亲合力为10-5mol/l或更低(例如l(T8mo1/1)的Kn-值，l(T7mo1/1或更低的Ko-值，或10'9mo1/1或更低的Ko-值。用标准结合测定，如表面等离振子共振技术(BIAcore⑧)来测定结合亲和力。该结合亲和力值不必视为精确值；其仅仅是参考值。其用于确定和/或选择例如抗CCR5抗体或其片段，所述抗体或其片段对CCR5受体抗原显示免疫球蛋白典型的特异靶向结合，并因此具有治疗活性。这也同样应用于抗CD4抗体和抗HIV-1抗体。如本申请中所用，术语"抗CCR5抗体的抗原结合片段群"表示抗CCR5抗体的任何片段，其已经保留抗原结合能力。此类片段通常包含抗CCR5抗体轻链或重链可变结构域的至少一部分。该片段可以是例如单条重链或轻链、Fv-、Fab-和F(ab)2-片段，以及单链抗体(scFv)。在表3中列出了通过杂交瘤细胞系表达的优选抗CCR5抗体，其片段用于本发明的缀合物中，所述细胞系已经在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)，德国)保藏。表3:表达抗CCR5抗体的杂交瘤细胞系。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>优选抗HIV-1抗体(其片段用于本发明的缀合物)是B12和4KG5。优选抗CD4抗体描述于US5,871,732，Reimann，K.A,，等，AidsRes.HumanRetrovir.13(1997)933-943和WO91/009966中。在包含第一、第二和第三多肽的多肽缀合物中，六种不同的N末端(N末端表示为NH2)到C末端(C末端表示为COOH)顺序是可能的。该顺序组包含(1)NH2—第一多肽-第二多肽一第三多肽-COOH,(2)NH2-第一多肽一第三多肽-第二多肽—COOH,(3)NH2—第二多肽-第一多肽一第三多肽—COOH,(4)NH2—第二多肽一第三多肽一第一多肽-COOH，(5)NH2—第三多肽一第一多肽-第二多肽—COOH，(6)NH2—第三多肽一第二多肽一第一多肽—COOH。在每一缀合多肽之间任选地可能包括接头多肽。在该情况下，包括一个接头多肽的顺序(l)还包含四种不同的顺序(1)NH2-第一多肽一第二多肽-第三多肽-COOH，(la)NH2-第一多肽-接头多肽-第二多肽一第三多肽-COOH,(lb)NH2-第一多肽-第二多肽4头多肽—第三多肽-COOH,(lc)NH2-第一多肽-接头多肽-第二多肽-接头多肽-第三多肽—COOH。因此，在存在所有任选接头多肽的情况下，24种不同的顺序是可能的。本发明的多肽缀合物包含每一多肽最多一次，除了包含高达三次的接头多肽之外。因而，本发明包含多肽缀合物，其包含a)选自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的笫一多肽(lstpp)，b)选自抗融合肽的第二多肽(2ndpp)，c)选自抗CCR5抗体的抗原结合片段或抗CD4抗体的抗原结合片段的任选第三多肽(3rdpp),d)连接所述第一、第二和/或第三多肽的任选的接头多肽(linkpp),由此所述多肽从N到C末端具有以下顺序n-3rdpp〗c-[linkpp0-[1stppla-[linkppjp-[2ndppe—[linkppq-[3rdppf—[linkpp]r-[1stPPlg其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r均为整数0或l，并且a+d+g=l，b+e=l，c+f=0或1，26m、n、o、p、q、r彼此独立地是O或l,其中O表示在所述缀合物的特定位置上缺少相应多肽，1表示在所述缀合物的特定位置上存在相应多肽。在优选的实施方案中，所述多肽从N到C末端具有顺序[3rdppc-[linkpp。-1stppd_[linkppp_[2ndppe-[linkppq-[1stpplg，其中c、d、e、g、o、p、q均为整数O或l,并且c二ld+g=l,e=l，o、p、q彼此独立地为O或l，0表示在所述缀合物的相应位置上缺少相应多肽，1表示在所述缀合物的相应位置上存在相应多肽。本发明还包含编码本发明多肽缀合物的核酸。本发明的另一方面是包含编码本发明多肽缀合物的核酸的细胞系。本发明还包含用于产生本发明多肽缀合物的方法，所述方法包括步骤a)在适合于表达多肽缀合物的条件下培养包含编码本发明多肽缀合物的核酸的宿主细胞，并b)从细胞或培养基中回收所述多肽缀合物。术语"在适合于表达多肽缀合物的条件下"表示用于培养表达异源多肽的细胞并为本领域技术人员已知或容易地确定的条件。本领域技术人员也常在20°C到40°C的温度下培养细胞，并培养足够的时间以允许有效产生多肽缀合物，例如4到28天。在一个实施方案中所述宿主细胞是哺乳动物本发明还包含药物组合物，其含有本发明的多肽缀合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的赋形剂或载体。如此处所用，"药学上可接受的载体"包括任何和所有的生理学上相容的溶剂、M介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延迟剂等。优选地，所述载体适合于注射或输注。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂。这种介质和试剂用于药学上有活性物质的用途为本领域所知。除了水，所述载体例如可以是等渗緩沖盐溶液。不管所选的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将可以合适的水合形式使用的本发明化合物，和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效达到对特定患者、组合物和施用方式的想要治疗反应而对患者没有毒性的活性成分的量。所选剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，其包括本发明所用的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、年龄、性别、体重、状况、一般健康和被治疗患者的先前医疗史和医学领域所熟知的其它因素。本发明还包含本发明多肽缀合物用于制备治疗病毒感染的药物的用途。优选地，所述病毒感染是HIV感染。本发明还包含本发明多肽缀合物用于治疗需要抗病毒治疗的患者的用途。本发明还包含本发明缀合物用于治疗患有免疫缺陷综合征如AIDS的患者的用途。提供以下实施例、序列表和图来帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中得以阐明。应理解可在所述方法中进行修改而不背离本发明的精神。附图简述图1pQE80—ClqA的注释质粒图。图2pQE80—Rob1(融合蛋白T1357-ClqA)的注释质粒图。图3pQE80—Rob2(融合蛋白ClqA-T1357)的注释质粒图。图4纯化蛋白质的16%TricineSDS-PAGEal)未还原的，a2)还原的28II，泳道3洗涤RobI，泳道4洗涤RobII，泳道5BiomassRobI，泳道6BiomassRobII);b)泳道7、8和9还原的IB-制剂ClqA，泳道10和12还原的BiomassClqA，泳道13、14和15未还原的IB-制剂ClqA)。图5包含gp41氨基酸593-621位的肽的Western印迹。图6融合抑制测定中ROBII和T-1249的活性分析。实施例1材料与方法在Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)中给出了关于人免疫球蛋白轻链和重链核苷酸序列的一般信息。抗体链的氨基酸根据EU编号进行编号(Edelman，G.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85;Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD,(1991))。重組DNA技术如在Sambrook，J.等,Molecularcloning:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中描述，使用标准方法操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。基因合成通过化学合成从寡核苷酸制备想要的基因片段。通过包括PCR扩增在内的寡核苷酸退火和连接来装配100-600bp长的基因片段(其侧翼是单个限制性内切酶切割位点)并随后经EcoRI/Hindlll限制酶位点将其克隆至pQE80L载体(Qiagen，Hilden，德国)。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。蛋白质测定通过测定在280nm处的光密度(OD)并使用根据M酸序列计算的摩尔消光系数来测定缀合物的蛋白质浓度。实施例2表达质粒的构建基于T5RNA聚合酶的细菌pQE80表达载体购自Qiagen(Hilden，德国)。EcoRI和HindIII限制性位点用于插入编码ClqA(SEQIDNO:6)的核断列以生成表达质粒pQE80_ClqA(注释质粒图镨见图1)。EcoRI和HindIII限制性位点用于插入编码在N末端至C末端方向包含抗融合肽T-1357和ClqA(SEQIDNO:49、50)的缀合物的序列以生成表达质粒pQE80—Rob1(注释质粒图语见图2)。EcoRI和HindIII限制性位点用于插入编码在N末端至C末端方向包含ClqA和T-1357(SEQIDNO:51)的缀合物的序列以生成表达质粒pQE8(^Rob2(注释质粒图镨见图3)。实施例3多肽缀合物的产生和纯化用实施例2中获得的表达质粒转化大肠杆菌细胞。通过氨节青霉素抗性选择转化的细菌。接种OD为0.1OD/mL的起始培养物。培养物在37。C下添加有0.5pg/ml氨千青霉素的SB培养基(32g蛋白胨、20g酵母提取物、5gNaCl和5mL1MNaOH加1L水)中生长。OD600nm高于0.8-1.0后完成培养。将培养液离心并在含有12.11g/1TRIS羟基曱基氨基甲烷(TRIS)、1mMMgS04、用25%(w/v)HC1调整pH值至7.0的緩冲液中用高压破碎沉淀物中的细胞。每100mg生物量使用500ml緩冲液。细胞破碎后离心悬浮液。用含200ml/130%(Wv)Brij、1.5MNaCl和60mMEDTA,pH值调整为7.0的溶液洗涤沉淀物。在第二次离心步骤之后，用100mMTRIS、20mMEDTA、pH6.5洗涤IB。经过最后的离心步骤后，将IB离心并储存于-20。C。用SDS-PAGE确认样品的同质性。无需额外30的纯化步骤。室温下通过在pH值为11.5-12.0的30mMKOH中搅拌30分钟来溶解IB。当样品完全溶解后，通过在50mMpH值为8.5的硼酸盐緩冲液中对溶解物脉沖进行复性，至最大浓度为0.3mg/ml。实施例4使用SDS-PAGE的表达分析根据Schagger，H.，和vonJagow，G.，AnalBiochem.166(1997)368-379通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)处理复性的缀合物。SDS-PAGELDS样品緩冲液，四倍浓缩液(4x):4g甘油、0.682gTRIS-Base、0.666gTRIS盐酸盐、0.8gLDS(十二烷基石充酸锂)、0.006gEDTA(乙二胺四乙酸)、按质量(w/w)计0.75ml的1%ServaBlueG250水溶液、按质量(w/w)计0.75ml的1%酚红溶液，加水至总体积为10ml。将复性的多肽缀合物离心以去除残渣。澄清上清液的等分试样与1/4体积(v/v)的4xLDS样品緩冲液和1/10体积(v/v)的0.5M1，4-二硫苏糖醇(DTT)混合。随后样品在70。C温育10分钟并通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据制造商说明书使用NuPAGEPre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。具体而言，使用10%NuPAGENovexBis画TRISPre-Cast凝胶(pH6.4)和NuPAGEMOPS电泳緩冲液。实施例5表达质粒的构建基于T5RNA聚合酶的细菌pQE80表达栽体购自Qiagen(Hilden，德国)。EcoRI和HindIII限制性位点用于插入编码抗CCR5抗体轻链ClqA-T-1249缀合物的核酸序列以生成表达质粒pQE80—Rob3。实施例6细胞-细胞融合试验描述了用于评估1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中和作用的基于细胞系的测定。该测定基于CEM.NKR细胞，其被转染来表达HIV-1共同受体CCR5以补充CD4和CXCR4共同受体的内源表达。获得的CEM.NKR-CCR5细胞有效地复制了R5和X4表型的原代HIV-1分离林。在使用来自HIV-1感染个体的血清或特异性抗HIV-1单克隆抗体的中和测定中，CEM.NKR-CCR5细胞与含有促分裂原激活的外周血液单核细胞(PBMC)的比较表明HIV-1中和作用的灵敏性在两种细胞类型中是相似的。第1天，将表达gpl60的HeLa细胞(2x104细胞/50jd/孔)接种到白色96孔微量滴定板上补充10%FCS和2jig/ml多西环素的DMEM培养基中。第2天，在透明96孔微量滴定板中每孔加入100nl上清液样品或抗体对照。随后加入100pl含8xl04CEM-NKr-Luc悬浮细胞的培养基并在37。C温育30分钟。将HeLa细胞培养基从96孔板中吸出，加入200jil抗体/CEM-NKr-Luc混合物中的100pl并在37。C温育过夜。第3天，按100jul/孔加入Bright-Glo荄光素酶测定底物(1，4-二硫苏糖醇和连二亚硫酸钠；PromegaCorp.，美国)并且在室温最少温育15分钟后测定发光。材料在含营养物和10%FCS以及400照/mlG418和200照/ml潮霉素B的DMEM培养基中培养HeLa-R5-16细胞(在多西环素诱导下表达HIVgpl60的细胞系)。CEM.NKR國CCR5画Luc(目录号5198，从NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgramMcKessonBioServicesCorporationGermantown，MD20874，美国可获得的T细胞系)。细月包类型转染(电穿孔)CEM.NKR-CCR5(Cat.#4376)以在HIV-2LTR的转录调控下表达荧光素酶基因并且在含10。/。胎牛血清、4mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素(100U/mL青霉素、100pg/mL链霉素)和0.8mg/ml遗传霉素硫酸盐(G418)的RPMI1640中进行繁殖。生长特征圆形淋巴样细胞，形态变化不大。细胞以单细胞在悬浮液中生长，其可形成小团块。每周两次按1:10分传培养。特殊特征HIV-2LTR转活后表达荧光素酶活性。适合用原代HIV分离林感染、中和作用和药物敏感性测定(Spenlehauer，C.，等，Virology280(2001)292-300;Trkola，A.，等，J.Virol.73(1999)8966—8974)。通过NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram,NIAID，NIHfromDrs.JohnMooreandCatherineSpenlehauer获得细胞系。Bright-GloTM萤光素酶测定緩冲液(PromegaCorp.USA,PartNoE2264B)、Bright-GIoTM、萤光素酶测定底物(PromegaCorp.USA,partNoEE26B)。实施例7多肽结合亲和力的测定在25。C使用BIAcore3000仪器(Pharmacia,Uppsala,瑞典)通过表面等离振子共振(SPR)测定基于HIV-1gp41蛋白质的HR1-HR2相互作用(HR,七残基重复1和2区)的多肽的结合亲和力。很好地建立了用于研究分子相互作用的BIAcore⑧体系。其允许连续实时监测配体/分析物结合并因此测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kj和平衡常数(KD)。SPR技术基于测定金包被的生物传感器芯片表面附近的折射指数。折射指数的改变表明由固定化的配体与溶液中注入的分析物间的相互作用引起的表面上质量的改变。如果分子结合表面上固定化的配体，则质量增加，在解离的情况下则质量减少。结合测定通过用50mMNaOH中的1MNaCl三次连续1分钟注射来预洗涤SensorChipSA(SA,Streptavidin)。随后将生物素化的HR1肽Biotin-T-2324(SEQIDNO:52)固定在SA包被的传感器芯片上。为了避免质量转移限制，将溶于HBS-P緩沖液(10mMHEPES、pH7.4、150mMNaCl、0.005%(v/v)SurfactantP20)中的最小可能值(约200RU,ResonanceUnits)的HR1肽装载到SA芯片上。测定开始之前，笫一次用0.5%(w/v)十二烷基石克酸钠(SDS)以50pL/分钟的流速进^f亍一分钟脉沖使芯片再生。待分析的多肽缀合物首先以约1mg/mL的浓度溶解于pH值为9的50mMNaHC03中，并随后在HPS-P緩冲液中稀释至25到1.95nM的多个浓度。样品接触时间为5分钟(结合相)。此后用HBS-P洗涤芯片表面5分钟(分离相)。在精确的25。C下(标准温度)进行所有相互作用。在测定周期内，样品储存于12。C。以每秒一个信号的检测速率检测信号。将样品以逐渐增加的浓度，50nL/分钟的流速注入偶联HRl的生物传感器元件。用0.5%(w/v)SDS溶液以50nL/分钟的流速将表面再生1分钟。通过使用BIAevaluation4.1软件包分析由几种不同浓度获得的sensorgram曲线来测定定义为ka/kd的平衡常数(KD)。通过从HR2-HR1相互作用的值中减去包含HR2的多肽与游离链霉抗生素蛋白表面相互作用的反应值来校正非特异性结合。数据的拟合按照1:1Langmuir结合模型。表5:与HR1区结合的BIAcore⑧分析样品名ka[1/mslkdl/slKA[固lKDMlT-12496.4x1058.45xl(T47.56x1081.32x10-9Robl8.8x1044.76xl(T41.85x1085.41x109Rob23.5x1043.11xl(T51.13xlO98.88x1010实施例8Western印迹分析以下样品(每份15pi=1-5照)在还原条件下转移至10%Bis-TRISNuPAGE陽Gel:泳道1-多个分子量标准泳道2-硼酸盐緩沖液泳道3-T-1249(约5kDa)泳道4-RobI(26kDa)泳道5-RobII(25kDa)泳道6-ClqA(28kDa)泳道7-空泳道8-奇异标记(magicmark)转移緩沖液192mM甘氨酸、25mMTRIS、20%甲醇(v/v)。在SDS-PAGE后根据Burnette(Burnette，W.N"Anal.Biochem.112(1981)195-203)的"Semidry-Blotting-Method"将分离的缀合物电泳转移(25V、1小时)至PVDF滤膜(孔径0.45pm、InvitrogenCorp.)。印迹后将膜浸入TBST(1110mMTRIS緩沖液，补充有150mMNaCl、lmlTween20，调节pH值为7.5)中的5%的膜封闭剂(AmershamBiosciences)中，在室温振荡约30分钟并随后在4。C过夜。封闭步骤完成后用TBST将膜洗涤三次。为了检测，将封闭后的膜与生物素标记的肽HIV-gp41P2(593-621)-Bi以及5pg/mlTBST、0.15mMCaCl2和12mMMgCl2振荡下温育3小时。显色步骤结束后用TBST洗涤膜并与Lumi-LightPLUSWestern-Blotting底物温育，并随后显影(SDS凝胶见图4且Western印迹见图5)。权利要求1.多肽缀合物，其特征在于所述缀合物包含a)选自包含SEQIDNO01的多肽及其片段的第一多肽，b)选自抗融合肽的第二多肽。2.根据权利要求l的缀合物，其特征在于所述第一多肽和所述第二多肽具有选自以下顺序的顺序N-末端—第一多肽—第二多肽-C-末端，或N-末端—第二多肽—第一多肽-C-末端。3.根据前述^5L利要求任何一项的缀合物，其特征在于所述缀合物在所述第一多肽和所述笫二多肽之间包含接头多肽。4.多肽缀合物，其特征在于所述缀合物包含a)选自包含SEQIDNO:01的多肽及其片段的第一多肽(lstpp),b)选自抗融合肽的第二多肽(2ndpp)，c)选自抗CCR5抗体的抗原结合片段，或抗HIV-1抗体的抗原结合片段，或抗CD4抗体的抗原结合片段的任选的第三多肽(3rdpp)，d)连接所述第一、第二和/或第三多肽的任选的接头多肽(linkpp)，其中所述多肽缀合物的多肽从N到C末端具有顺序[1stppa-[linkpp]m-2ndppb-[linkppn-[3rdppjc—[linkpp0-1stppd_[linkppp-[2ndppe-[linkppq-[3rdppf一[linkppr一[1stPPg其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r均为整数0或l，并且a+d+g=1,b+e=1，c+f-0或1,m、n、o、p、q、r彼此独立地是O或l,其中O表示在所述缀合物的相应位置上缺少相应多肽，1表示在所述缀合物的相应位置上存在相应多肽。5.根据权利要求3或4的缀合物，其特征在于所述接头多肽选自包含SEQIDNO:20到SEQIDNO:48的多肽。6.根据前迷权利要求任何一项的缀合物，其特征在于所述第二多肽选自包含SEQIDNO:08到SEQIDNO:19的抗融合肽。7.用于产生根据权利要求1或4的多肽缀合物的方法，其特征在于所述方法包才舌a)在适合表达所述多肽缀合物的条件下培养包含编码权利要求1或4的多肽缀合物的核酸的宿主细胞，并b)从所述细胞或培养基中回收所述多肽缀合物。8.药物组合物，其含有根据权利要求1到6中任何一项的多肽缀合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂或载体。9.根据权利要求1到6中任何一项的多肽缀合物用于制备治疗病毒感染的药物的用途。10.根据权利要求9的用途，其特征在于所述病毒感染是HIV感染。11.根据权利要求1到6中任何一项的多肽缀合物用于治疗需要抗病毒治疗的患者的用途。全文摘要本发明报道了多肽缀合物，其中所述多肽缀合物包含选自包含SEQIDNO01的多肽及其片段的第一多肽和选自抗融合肽的第二多肽。文档编号C07K14/16GK101616929SQ200880005253公开日2009年12月30日申请日期2008年3月11日优先权日2007年3月13日发明者H·迪费尔,I·莱恩,R·施穆克,R·法尔肯施泰因,W·蒂舍尔申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司