专利名称：甘露糖蛋白溶液及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘露糖蛋白溶液。本发明还涉及该溶液的生产方法及其在葡萄酒稳定中的用途。此外，本发明还涉及生产稳定的葡萄酒的方法。
背景技术：
导致葡萄酒不稳定的重要原因之一是存在酒石酸盐、酒石酸氢钾(KHT)和酒石酸钙(CaT)。
酒石酸是葡萄浆果在其发育过程中产生的主要的有机酸。它在浆果的加工过程中以钾盐和钙盐的形式溶于葡萄汁中。在发酵过程中，酒石酸盐的溶解度随着(由于糖发酵而产生的)乙醇浓度的提高而降低。
在未成熟的葡萄酒中，酒石酸氢钾(KHT)总是以过饱和浓度存在并自发结晶。在葡萄酒装瓶后，KHT不稳定性可能由于无法预计的结晶特征而成为一个商业上的问题。此外，消费者经常认为瓶中存在晶体是葡萄酒品质低劣的标志。可以在葡萄酒装瓶之前进行物理处理以防止酒石酸盐结晶。这些处理包括通过将葡萄酒冷却至-4℃来促进结晶以及其后通过过滤除去钾离子和酒石酸根离子，或者通过电透析或使用离子交换树脂来除去。然而，这些消耗时间和能量的方法被认为会改变葡萄酒的胶体平衡。
葡萄酒物理处理的替代方案是使用防止KHT晶体成核和/或生长的添加剂。
羧甲基纤维素和偏酒石酸属于干扰KHT结晶的添加剂的组。然而，羧甲基纤维素在目前的法令中未被批准作为葡萄酒添加剂。另一方面，偏酒石酸在葡萄酒的pH和储存葡萄酒的温度下不稳定。随着时间的流逝，偏酒石酸会水解，其保护作用将消失。因此，其用途仅限于用于快速消费的葡萄酒中。另一个缺点是，在理想的情况下，添加剂应该是葡萄酒的天然成分。而对于偏酒石酸和羧甲基纤维素而言，显然并非如此。
对KHT晶体的成核和生长率均具有活性的天然添加剂与化学添加剂相比是优选的。
天然添加剂的一个实例是甘露糖蛋白。甘露糖蛋白和葡聚糖一起是酵母细胞壁的主要成分(Lipke P.N.等，J.Bacteriol.(1998)180(15)3735-3740)。主要通过两类方法从酵母细胞中获得甘露糖蛋白物理方法和酶促方法。获得甘露糖蛋白最常用的物理方法是Peat S.等，J.Chem.Soc.London(1961)28-35中描述的方法，其中通过在中性pH下对酵母细胞进行热提取来获得甘露糖蛋白。从酵母中获得甘露糖蛋白的一种酶促方法被描述于例如WO 96/13571中。该方法包括用β-葡聚糖酶制剂处理分离的酵母细胞壁并通过超滤来分离产物。
甘露糖蛋白可能具有的缺点是，它在加入葡萄酒中之后产生不期望的混浊，在一些情况下产生副产物的沉淀。
EP-A-1094117描述了产生可溶性甘露糖蛋白粉剂的方法，其中减轻了甘露糖蛋白制剂中存在的副产物导致混浊的问题。在该方法中，在自溶后分离酵母细胞壁，其后在95-100℃下进行选择性水解15-30小时，或在β-糖苷酶的作用下进行水解。在这两种情况下，甘露糖蛋白和其它杂质都是溶解的。需要一些步骤来纯化溶解的甘露糖蛋白。
甘露糖蛋白可以以粉末形式或溶液形式加入葡萄酒或葡萄汁中。使用粉末制剂形式的甘露糖蛋白具有这样的优点，即这些制剂在时间上在微生物方面是稳定的。然而，为了向葡萄酒中正确地加入甘露糖蛋白粉末制剂的量，优选将甘露糖蛋白溶于水或葡萄酒中。为了避免在加入甘露糖蛋白溶液后葡萄酒或葡萄汁过度稀释，所述溶液应具有约200-300g/l的甘露糖蛋白浓度。然而，由于甘露糖蛋白的溶解度低，由粉末制备这种浓度的溶液需要将溶液持续搅拌1-2小时，因此这对于葡萄酒生产者来说是十分麻烦的。此外，在产生溶液的过程中存在微生物污染的风险，这当然是不希望的。
由于上述原因，葡萄酒生产者会优选使用即用型的甘露糖蛋白溶液来稳定葡萄酒。然而，即用型甘露糖蛋白液体制剂的产生中还存在一些问题。即用型甘露糖蛋白溶液在使用浓度(即100-300g/l)下应该是透明的液体制剂。此外，液体制剂应该是稳定的。特别地，甘露糖蛋白溶液作为防止葡萄酒中酒石酸盐沉淀的葡萄酒稳定剂的活性应该在甘露糖蛋白生产商生产该溶液与葡萄酒生产者使用它们之间的时间段内得以保留。本发明的一个目的是提供对上述问题的解决方案。
发明详述 在第一个方面中，本发明提供了甘露糖蛋白溶液，该溶液在200g/l的甘露糖蛋白浓度和pH 4至pH 8的pH下通过浊度法测得的浊度低于70NTU，优选低于60NTU，更优选低于50NTU，最优选低于40NTU。在本发明的上下文中，“甘露糖蛋白”根据OIV(Organisation Internationalede Ia Vigne et du Vin)的RESOLUTION OENO 26/2004定义为可以通过物理化学方法或酶促方法从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞和/或酵母细胞壁中提取的产物。甘露糖蛋白根据其分子量、其糖基化程度和类型及其载荷大小而具有不同的结构。
本申请人出乎意料地发现，甚至在200-300g/l的浓度下也可产生非常澄清的甘露糖蛋白溶液，它比现有技术中描述的任何甘露糖蛋白溶液更为澄清。这种甘露糖蛋白溶液特别适合在葡萄酒中用于对其进行稳定以防止发生酒石酸盐沉淀，因为它可以高浓度加入葡萄酒中而不将葡萄酒过度稀释。此外，此第一个方面中的甘露糖蛋白溶液在加入葡萄酒中之后不引起混浊。由于甘露糖蛋白溶液的浊度取决于浓度和pH，因此在200g/l的溶液浓度下测量浊度值。然而，这不应解释为表示本发明的溶液具有200g/l的固定浓度，而是表示其浊度在200g/l下测定。因此，根据其起始浓度，甘露糖蛋白溶液可以在测量浊度之前稀释或浓缩至200g/l。在5.5的pH下，这第一个方面中的甘露糖蛋白溶液以200g/l甘露糖蛋白浓度通过比浊法测得的浊度优选为100NTU或更低，更优选50NTU或更低，甚至更优选40NTU或更低，最优选30NTU或更低。
蛋白酶和β-葡聚糖酶是可用于从酵母或酵母细胞壁中产生甘露糖蛋白并在已知方法产生的甘露糖蛋白中(通常)作为杂质存在的酶。在甘露糖蛋白作为粉末分离时，这些杂质的存在不成为问题。相反，在溶液中即便存在极少量的蛋白酶活性和任选的β-葡聚糖酶活性也会导致甘露糖蛋白溶液在稳定葡萄酒以防止发生酒石酸盐沉淀方面的活性迅速降低。
本申请人出乎意料地发现，当甘露糖蛋白溶液中不含蛋白酶活性(例如碱性蛋白酶活性)并任选地不含β-葡聚糖酶活性时，该溶液的保质期及其作为防止酒石酸盐沉淀的葡萄酒稳定剂的活性都延长了。相反，在甘露糖蛋白溶液中即便存在极少量的蛋白酶活性和任选的β-葡聚糖酶活性也会导致该溶液在稳定葡萄酒以防止发生酒石酸盐沉淀方面的活性迅速降低。
在一个优选的实施方案中，第一个方面的甘露糖蛋白溶液中不含蛋白酶活性并任选地不含β-葡聚糖酶活性。
“蛋白酶活性”在本文中指由内切蛋白酶(EC 3.4.21-24)产生的酶活性。不含蛋白酶活性是指甘露糖蛋白溶液中的蛋白酶活性将低于使用测量蛋白酶活性的方法可检测到的最低活性。取决于预计存在于溶液中的蛋白酶类型，可以使用测量蛋白酶的特定方法并定义特定的蛋白酶单位。这些方法为本领域技术人员公知。在“材料和方法”中给出了本发明中用于测定蛋白酶活性的方法和定义的蛋白酶活性单位。
“β-葡聚糖酶”活性在本文中指由β-1，3、β-1，4和/或β-1，6内切葡聚糖酶所产生的总体酶活性。β-葡聚糖酶活性可根据“材料和方法”中所述的方法来测定。不含β-葡聚糖酶活性是指溶液中的β-葡聚糖酶活性水平低于使用测量β-葡聚糖酶活性的适当方法(如“材料和方法”中所述方法)可检测到的最低水平。
第一方面中的甘露糖蛋白溶液优选用于稳定葡萄酒或葡萄汁。因此，很重要的是该溶液中不存在任何有害微生物。此外，任何活微生物的存在都可能影响该溶液的贮存稳定性，并影响其作为葡萄酒稳定剂的活性的保留。因此，在本发明的一个实施方案中，第一方面的甘露糖蛋白溶液在该溶液中存在的活微生物总量(以菌落形成单位(CFU)/ml衡量)低于10，优选低于5，更优选地，该甘露糖蛋白溶液是无菌的。
措辞“活微生物总量”指溶液中存在的需氧及厌氧嗜冷微生物+需氧及厌氧嗜温微生物+需氧及厌氧嗜热微生物的总量。以菌落形成单位(CFU)/ml为单位测量的溶液中存在的活微生物总量在“材料和方法”中定义，并且通过总平板计数(TPC)的测定来确定，所述总平板计数是本领域技术人员公知的方法，并且在“材料和方法”中对其有简短描述。最优选地，甘露糖蛋白溶液是无菌的，例如溶液中存在的活微生物总量以溶液的菌落形成单位(CFU)/ml为单位测量为0。甘露糖蛋白溶液优选地被包装在被气密闭合的无菌容器中。
根据第一方面的甘露糖蛋白溶液优选地是水性溶液。
本发明第一方面的溶液尤其适合被添加进葡萄酒或葡萄汁(wine must)中用于将其稳定。为了避免添加甘露糖蛋白溶液后葡萄酒或葡萄汁被过度稀释，溶液中甘露糖蛋白的浓度优选地在50g/l和500g/l之间，更优选地在100g/l和300g/l之间，最优选地为200g/l。
溶液的pH优选地使得甘露糖蛋白的稳定性得以随时间保持，例如得以避免溶液的混浊。因此，甘露糖蛋白溶液的pH优选地在3和8之间，更优选地在4和7之间，最优选地在5和6之间。
第一方面的溶液优选地是随时间微生物稳定的。因此在一个优选的实施方案中，至少向甘露糖蛋白溶液中添加稳定添加剂。更优选地，所述稳定添加剂是二氧化硫。更优选地，可以以亚硫酸氢盐的形式、更优选地以亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾(K2S2O5)的形式向溶液中添加二氧化硫。除了维持甘露糖蛋白溶液是微生物稳定的以外，二氧化硫的添加具有另一个优点。甘露糖蛋白溶液具有可从浅黄变为棕色的颜色。然而，使用棕色溶液稳定葡萄酒对葡萄酒制作商(winemaker)而言不是非常有吸引力的。因此，要在葡萄酒或葡萄汁中使用的甘露糖蛋白溶液应当优选地仅轻微有色。已发现向甘露糖蛋白溶液中添加二氧化硫能够将其颜色从棕色减轻为淡黄。因此，要添加进溶液中的二氧化硫的量优选地在1到20g/l的范围内(作为添加的K2S2O5量测量)。
溶于葡萄酒中的根据本发明第一方面的甘露糖蛋白应当是透明和稳定的。具体地，在制造者生产溶液和造酒者使用溶液之间的时间段内，溶解的甘露糖蛋白溶液作为抵挡酒石酸盐沉淀的葡萄酒稳定剂的活性应当保持。因此在一个优选的实施方案中，根据本发明第一方面的甘露糖蛋白溶液 ·以1g/l的浓度(以干重为基础)溶于水中时，在3.5的pH下测量时，其具有4NTU或更少的浊度，优选地具有2NTU或更少的浊度，更优选地具有1NTU或更少的浊度，和/或 ·以1g/l的浓度(以干重为基础)溶于12％v/v乙醇水溶液中时，在3.5的pH下测量时其具有20NTU或更少的浊度，优选地具有10NTU或更少的浊度，进一步更优选地具有5NTU或更少的浊度，最优选地具有1NTU或更少的浊度，和/或 ·以0.2g/l的浓度(以干重为基础)溶于白葡萄酒中，其具有≤10NTU的浊度，优选地具有≤5NTU的浊度，进一步更优选地具有≤2NTU的浊度，最优选地具有≤1NTU的浊度。
可以通过本发明第二方面的方法获得根据第一方面的甘露糖蛋白溶液。甘露糖蛋白溶液的特征优选地是以甘露糖蛋白干物质为基础，甘露糖蛋白中至少有50％w/w的碳水化合物含量，其中以总碳水化合物含量为基础至少70％w/w由甘露糖寡聚物或多聚物形式的甘露糖残基组成。优选地，可以通过本发明的方法获得的甘露糖蛋白溶液的特征是甘露糖蛋白中磷(作为P2O5测量)的量以干物质为基础低于1％w/w，更优选地低于0.8％w/w或更低，进一步更优选地低于0.7％w/w或更低。通常磷的量以干物质为基础可以低至0.4％w/w。甘露糖蛋白中磷的量可根据公知的AES-ICP方法测量(借助于Inductive Coupled Plasma的Atomic EmissionSpectroscopy)。
根据本发明第一方面的甘露糖蛋白溶液可与一种或多种其它葡萄酒添加剂组合。葡萄酒添加剂的例子包括羧甲基纤维素、偏酒石酸和阿拉伯胶。在一个优选的实施方案中，甘露糖蛋白溶液与阿拉伯胶组合。
在第二方面，本发明提供了生产根据第一方面的甘露糖蛋白溶液的方法，包括a)对酵母细胞的悬浮液进行酶水解，优选地在外源酶的作用下和失活天然酵母酶后进行，从而所述酵母细胞被降解，从被降解的酵母细胞中溶解和释放甘露糖蛋白和其它酵母组分；b)将回收溶解的甘露糖蛋白作为溶液回收，优选地使用膜过滤回收。
在步骤a)中，通过对酵母细胞的悬浮液进行酶促水解从酵母细胞的水性悬浮液中提取甘露糖蛋白，其中所述酵母细胞被降解，并且甘露糖蛋白和其它酵母组分从被降解的酵母细胞中溶解和释放。
在本发明的方法中可以使用任何类型的酵母。具体地，可适当地使用属于Saccharomyces、Kluyveromyces或Candida属的酵母菌株。优选属于Saccharomyces属的酵母菌株，例如菌株Saccharomyces cerevisiae。
本发明的方法可以从酵母细胞在水性液体中的悬浮液开始，例如从所用的酵母细胞的发酵液开始。产生酵母细胞悬浮液的合适发酵方法是本领域已知的。在一些情况下在本发明方法中使用前可例如通过离心或过滤来浓缩发酵液。例如，可以使用膏状酵母(被浓缩至15-27％w/w干物质含量的面包酵母)。
在步骤a)中，可以通过对酵母细胞悬浮液进行天然酵母酶和/或添加的外源酶的作用，进行对所述悬浮液的酶促水解。
用于进行酶促水解的条件取决于使用的酶类型，并且可由本领域技术人员容易地确定。通常在4和10之间的pH和40℃与70℃之间的温度下进行酶水解。通常，酶水解会进行1到24小时之间的时间。
在本发明的一个优选的实施方案中，首先将天然的酵母酶失活，随后向悬浮液中添加外源酶。本领域技术人员知道如何使天然酵母酶失活。可例如通过pH处理或热激达成失活，优选后一方法。可通过将酵母细胞悬浮液在80-97℃的温度下处理5到19分钟，适当地进行热激。一旦天然酵母酶被失活，则可向酵母细胞悬浮液中添加外源酶，从而进行酶水解。优选地使用蛋白酶，更优选地使用内切蛋白酶用于该目的。优选地，用于进行酶水解的外源酶包含将RNA降解为核糖核苷酸的酶。为此可使用任何RNase，例如5′-Fdase(5′-磷酸二酯酶)。用于将RNA降解成核糖核苷酸的酶可与上述酶处理一起添加或者在之后添加，例如与蛋白酶的处理一起或在之后添加。任选地，还与上述酶处理一起或在之后使用脱氨酶，例如腺苷脱氨酶。
在步骤b)之前，可例如通过使用如上所述的方法，使步骤a)中使用的酶失活。
在方法的步骤b)中，将甘露糖蛋白作为溶液回收，优选地使用膜过滤回收。任选地将溶液浓缩至想要的终浓度。
优选地，在步骤b)中回收甘露糖蛋白之前去除不溶材料，例如衍生自酵母细胞壁的不溶材料，通常通过固体-液体分离方法，优选地通过离心或过滤来实现。可以通过任何合适的方法回收甘露糖蛋白。
在一个优选的实施方案中，在步骤b)中使用膜过滤，优选地使用超滤(UF)或渗滤将甘露糖蛋白作为溶液回收。膜过滤方法，尤其是超滤或渗滤，是本领域技术人员已知的。优选地，通过超滤(UF)或渗滤回收甘露糖蛋白。在使用UF或渗滤回收甘露糖蛋白的情况下，可使用分子量界限为100kDa或更低，优选地从3到50kDa，更优选地从3到10kDa的滤器。甘露糖蛋白级分保留在从超滤或渗滤步骤中获得的渗余物中。在超滤或渗滤之前不去除不溶材料时，包含甘露糖蛋白和不溶材料的渗余物可以被重悬(于溶液中)，并优选地去除不溶材料，例如使用如上所述的常见固体-液体分离技术来实现。
优选地，将甘露糖蛋白作为溶液回收后，可以在第二方面方法的步骤c)中，在足以将回收的甘露糖蛋白溶液中存在的RNA残基转化为核糖核苷酸的条件下，用RNase例如Fdase(磷酸二酯酶)处理所回收的甘露糖蛋白。处理可使用本领域已知的方法进行。该处理之后任选地进行一个或多个膜过滤步骤，例如超滤或渗滤(本发明第二方面方法的步骤d))，从而使用如上所述的膜去除低分子量的杂质。在渗余物中回收甘露糖蛋白溶液。
可以使用本领域技术人员已知的方法，在生产过程中的任何合适的步骤中对甘露糖蛋白溶液进行pH调节和/或浓缩。
在一个实施方案中，第一方面的甘露糖蛋白溶液不含蛋白酶活性，并且任选地不含β-葡聚糖酶活性。当第二方面还包括下述步骤e)时可实现后一结果，所述步骤e)为对步骤b)、c)或d)后获得的甘露糖蛋白溶液进行适合使蛋白酶失活并任选地使β-葡聚糖酶失活的处理，优选地通过在70℃或更高的温度下，优选地在80℃和140℃之间的温度下对溶液进行热处理来实现，其中所述热处理优选地进行2秒和60分钟之间的时间。优选地，将在步骤d)之后或灭菌后进行步骤e)，例如在下文所述的过滤灭菌后进行。
为此可使用适合使蛋白酶活性失活并任选地使β-葡聚糖酶活性失活的任何处理。更优选地，使用加热步骤使酶活性失活。热处理中使用的温度优选地为70℃或更高，优选地所述温度在80℃和140℃之间。热处理的持续时间应当是优选地能从甘露糖蛋白溶液中去除所有酶活性的时间。热处理的持续时间将取决于使用的温度。例如，更低的温度会需要更长的热处理持续时间，而更高的温度仅需要较短时间。因此，在80℃下处理30分钟以及在130℃下处理7秒都将落入权利要求的范围内。优选地通过使用UHT处理进行热处理，所述UHT处理使用食品工业或饮料工业中常用的条件。UHT处理典型地可通过130-145℃下2-10秒的持续时间来实现。在130℃或更高下进行足够时间的热处理，例如在130℃下热处理7秒后，会获得不含蛋白酶和β-葡聚糖酶活性并且通常不含任何酶活性的溶液。
通过使用加热步骤，通常甘露糖蛋白溶液中存在的至少部分微生物会被失活或杀死。优选地，热处理是如上所述的UHT处理，因为在后一情况下溶液中可能存在的所有微生物或微生物孢子会被杀死或失活。
本发明的方法可包括对步骤b)、c)、d)或e)后获得的甘露糖蛋白进行灭菌，优选地进行过滤灭菌(步骤f)，从而去除溶液中存在的所有微生物。后者可通过使用本领域技术人员已知的特定滤器来实现。优选地，在步骤d)或e)后进行过滤灭菌。
在使酶活性失活的处理之前或之后，优选地在该处理之后但是在过滤灭菌之前，可以以期望的量向甘露糖蛋白溶液中添加二氧化硫。通常会通过添加第一方面中所示的合适盐来进行添加。本领域技术人员知道如何进行所述添加。可以在生产过程期间的任何合适步骤中向甘露糖蛋白溶液添加其它稳定添加剂，通常在步骤b)之后和无菌过滤之前的任何步骤中添加。
在生产过程结束时，可根据本领域技术人员已知的方法无菌包装甘露糖蛋白溶液。可以使用的无菌容器可以由若干材料生产。合适的容器可以是卡纸板盒子内的无菌袋。可以提供具有盖子的袋子，所述盖子可以被旋转式接头(screw-on tap)穿破。
本领域技术人员应当明白，本发明的方法可包括下述步骤，其中通过本领域技术人员已知的方法(例如通过冷冻干燥或喷雾干燥)来干燥甘露糖蛋白溶液，得到固体形式(例如粉末或颗粒形式)的甘露糖蛋白。所述固体形式的甘露糖蛋白也包括在本发明内。
在第三方面，本发明提供了根据第一方面的甘露糖蛋白溶液的用途。优选地，本发明提供了根据第一方面的甘露糖蛋白溶液在稳定葡萄酒中的用途。
具体地，本发明第四方面提供了通过预防和/或延迟酒石酸盐结晶来稳定葡萄酒的方法，其中向葡萄酒或要用于生产葡萄酒的葡萄汁中添加根据第一方面的甘露糖蛋白溶液。优选地在熟化(ageing)期间向葡萄酒中添加组合物，例如在发酵后但是装瓶前添加。本发明特别适合白葡萄酒和桃红葡萄酒(roséwine)，但是也适合红葡萄酒或起泡葡萄酒(sparkling wine)。
以能达到稳定作用的有效量添加甘露糖蛋白溶液。通常，可以以每升葡萄酒10-2000mg之间的浓度向葡萄酒中添加。通过向葡萄酒中添加溶液到多至每升葡萄酒10到400mg甘露糖蛋白的终浓度，已经获得了良好的结果。技术人员应当理解，所添加的量还取决于例如其它葡萄酒稳定剂(例如羧甲基纤维素、偏酒石酸或阿拉伯胶)的添加或存在，以及取决于添加前葡萄酒KHT的过饱和程度。
可以通过以下方法测量和定量葡萄酒中KHT的成核和晶体生长(Moutounet等.InActualités CEnologiques 1999 Vieme SymposiumInternational d′Oenologie de Bordeaux(Lonvaud-Funel ed.))。
指示晶体成核的第一种方法测量储存于-4℃时葡萄酒中晶体出现的时间。每天进行视觉检查，并且将检测到晶体出现所需的时间(Tcrys)以天数表示。
指示晶体生长的第二种方法测量葡萄酒的酒石酸不稳定程度(DTI)。为此，将葡萄酒在-4℃下搅拌并测量初始导电率。随后添加经校准的(calibrated)KHT晶体，然后在达到稳定数值后测量导电率。DTI被定义为初始导电率的降低百分比。
第三种方法测量真实的、溶解的酒石酸浓度。将精确体积的葡萄酒转移进玻璃瓶中，并与含有精确已知马来酸浓度的相同精确体积的D2O混合。在完全弛豫条件下运行1H NMR光谱，并将内标(马来酸)的积分与酒石酸的积分比较。藉此可以以非常高的精确度和准确度测定溶解的酒石酸浓度。
通常，在酒石酸盐结晶方面不稳定的葡萄酒具有可在0.5天和6天之间变化的Tcrys。根据本发明的第五方面针对酒石酸盐结晶进行稳定化的葡萄酒可以如下获得以适合预防和/或延迟酒石酸盐结晶的浓度，向葡萄酒或发酵生产葡萄酒中要使用的葡萄汁中添加第一方面的甘露糖蛋白溶液。所述经稳定的葡萄酒的特征是根据方法1测量的Tcrys经稳定的葡萄酒/Tcrys不稳定的葡萄酒至少为2，优选地至少为5，更优选地至少为10，进一步更优选地在10和60之间。
葡萄酒生产的特征在于本领域技术人员公知的以下步骤a)从葡萄中提取葡萄汁；b)在酵母的作用下对葡萄汁进行发酵得到葡萄酒，随后将所述葡萄酒与固体残余物分离；c)任选地对葡萄酒进行熟化，和d)将葡萄酒装瓶或包装。在将葡萄酒与发酵后存在的固体残余物分离后，在随后的葡萄酒生产步骤中，葡萄酒中通常形成其它不溶物(例如由于酒石酸盐沉淀的产生固体，例如当葡萄酒经历冷却稳定化时产生的)。因此，葡萄酒生产，特别是大规模进行的葡萄酒生产经常包括下述步骤恰好在将葡萄酒装瓶或包装之前过滤葡萄酒，从而去除形成的上述不溶化合物。根据要生产的葡萄酒，葡萄酒制造可包括除上述以外的额外步骤。所有这些步骤都是本领域技术人员已知的。
在包括通过添加葡萄酒稳定剂(例如甘露糖蛋白)来稳定葡萄酒的步骤的(工业)葡萄酒制造方法中，所述甘露糖蛋白可以被添加进葡萄汁中或葡萄酒中。其一般应当被添加进葡萄酒中，通常在熟化期间和在过滤与装瓶之前添加。在甘露糖蛋白的添加发生于熟化期间和过滤与装瓶之前的情况下，我们惊讶地发现过滤葡萄酒后甘露糖蛋白作为抵抗酒石酸盐沉淀的稳定剂的活性降低。因此，应当添加更高剂量的甘露糖蛋白，从而在瓶装葡萄酒中达到期望的稳定。因此该问题的一个解决方案是在装瓶前葡萄酒所经历的最后一次过滤步骤之后，以溶液的形式添加甘露糖蛋白。
因此，本发明第六方面提供了生产针对酒石酸盐结晶而言稳定的葡萄糖的方法，所述方法包括过滤葡萄酒并将经过滤的葡萄酒装瓶的步骤，其中在过滤后向葡萄酒中添加甘露糖蛋白溶液。
可以在即将添加至葡萄酒之前通过将甘露糖蛋白与水或葡萄酒混合，形成在过滤后向葡萄酒添加的甘露糖蛋白溶液，或者所述甘露糖蛋白溶液可以是即用型甘露糖蛋白溶液。优选地，使用下述甘露糖蛋白生产甘露糖蛋白溶液，所述甘露糖蛋白非常易溶于水和葡萄酒，并且在添加至葡萄酒中时不引起任何混浊。更优选地，稳定葡萄酒的方法中使用的甘露糖蛋白溶液是根据本发明第一方面的(即用型)溶液。其可与一种或多种其它葡萄酒添加剂或稳定剂(例如羧甲基纤维素、偏酒石酸和阿拉伯胶)组合。在一个优选的实施方案中，甘露糖蛋白溶液与阿拉伯胶组合。
可以以适用于针对酒石酸盐沉淀来稳定葡萄酒的适当量，向葡萄酒中添加溶液。向葡萄酒中的添加可以通过在装瓶前将溶液与葡萄酒混合来实现，或者可以在将葡萄酒装瓶之前将溶液直接添加进瓶(或包装)中。
本发明还包括生产针对酒石酸盐结晶和/或针对蛋白质混浊而言稳定的葡萄酒的方法。该方法包括过滤葡萄酒和将经过滤的葡萄酒装瓶或包装的步骤，其中在过滤后向葡萄酒中添加葡萄酒稳定剂溶液。葡萄酒稳定剂溶液可包含一种或多种稳定剂，例如羧甲基纤维素、偏酒石酸和阿拉伯胶。
适当时，本发明一方面优选的特性等同地适用于另一方面。
接着将通过一些实施例阐述本发明，但是所述实施例并非旨在限制。
实施例 材料和方法 分子量的GPC测定 通过带有TSKGel G2000SWxl柱7.8x300mm(Tosoh Bioscience，日本)的GPC测定肽的分子量，其中使用的缓冲液20mM NaH2PO4·H2O、100mM NaCl(pH 6.0)作为流动相，使用0.5ml/分钟的流速并在214nm下检测。样品注射体积为25μl。用来自Bio-Rad美国的4种标准球状蛋白质来校准柱甲状腺球蛋白670kDa、y-球蛋白158kDa、卵清蛋白44kDa和维生素B12 1350Da。针对滞留时间拟合log(MW)校准线，并使用该校准线测定级分的平均分子量。使用UV3000 Thermo Finnigan(美国)进行检测。
浊度测定 在200℃的温度下，用装备有钨丝灯(400-600nm)的HACH 2100N浊度计(Hach-Lange，
德国)测定浊度。
总平板计数 在分析之前将三种甘露糖蛋白溶液样品储存于下文所述的特定条件下，并使用总平板计数(TPC)方法分析能够在需氧和厌氧气氛下生长的嗜冷、嗜温和嗜热微生物的可能存在。通过将约15ml PCA琼脂(PlateCount Agar，Oxoid，英国)倾倒在Petri培养皿中存在的1ml甘露糖蛋白溶液上，进行TPC的测定。在下述6种条件之一下进行TPC孵育。对每种条件而言一式两份地进行分析。针对每种甘露糖蛋白样品总计制备12个Petri培养皿，其中6个需氧孵育，其它6个厌氧孵育。
用于测定需氧和厌氧嗜冷菌的条件 样品储存8℃下30天 分析在PCA平板上的TPC 孵育8℃下需氧或厌氧7天 用于测定需氧和厌氧嗜温菌的条件 储存样品30℃下10天 分析PCA平板上的TPC 孵育30℃下需氧或厌氧3天 用于测定需氧和厌氧嗜热菌的条件 储存样品55℃下10天 分析PCA平板上TPC 孵育55℃下需氧或厌氧3天 适当的孵育时间后，分析每个Petri培养皿以测定每个培养皿中形成的菌落量。每个培养皿中的菌落量针对特定类型的微生物给出了相对每毫升溶液的菌落形成单位(CFU)。通过CFU/ml(厌氧嗜冷菌)+CFU/ml(需氧嗜冷菌)+CFU/ml(厌氧温菌)+CFU/ml(需氧嗜温菌)+CFU/ml(厌氧嗜热菌)+CFU/ml(需氧嗜热菌)给出了本专利申请中定义的、作为相对于每毫升甘露糖蛋白溶液的CFU测量的甘露糖蛋白溶液的活微生物总量。
蛋白酶活性的测量 蛋白酶对N，N-二甲基酪蛋白作用后解离的游离氨基与三硝基苯磺酸反应，产生可以在405nm处用分光光度计测量的黄颜色。使用含有碱性蛋白酶的酶标准用于校准。制备活性从10-60U/ml的五种标准溶液。(一个U被定义为在pH 8.5(0.1M TRIS)和37℃下，每分钟从琥珀酰-L-丙胺酰-L-丙胺酰-L-丙基-L-苯胺-对-硝基苯胺(2.18mg/ml)释放7.59μmol对-硝基苯胺所需要的酶的量)。将2ml N，N-二甲基酪蛋白溶液(1.68g/l，溶于含10g/l四硼酸二钠并用8.5％磷酸调节至pH 8.5的硼砂(borax)缓冲液中)与200μl标准溶液或样品溶液混合，并在37℃下孵育15分钟。随后添加1.2ml三硝基苯磺酸溶液(12mM HCl中4mM)。在37℃下孵育5分钟后，测量405nm处的吸光度。通过使用校准线，可以计算未知样品的活性。甘露糖蛋白基质中测试的定量界限是600U/ml。
对β-葡聚糖酶活性的测量 使用Grabner坠落球粘度计测量β-葡聚糖酶引起的pH4.7温度45℃的大麦β-葡聚糖P-BGBM(Megazyme，英国)溶液粘度的降低。充满基质的毛细管中铁球的坠落时间是粘度的度量。粘度的降低(坠落时间的减小)被用于计算活性。含有β-葡聚糖酶的酶标准被用于校准。制备活性从0.2-1.2U/ml的五种标准溶液(一个单位是引起基质粘度以给出每分钟0.147斜率的速度改变的每ml反应混合物的酶量，其中所述基质是pH 4.7和45℃的大麦β-葡聚糖溶液)。在持续搅拌的同时，向40ml水中添加1.1gβ-葡聚糖。添加1ml 1M NaOH并将溶液搅拌15分钟。随后将溶液在沸水浴中孵育15分钟。然后，在持续的搅拌下，将混合物在室温下冷却30分钟。分别添加1ml 1M HCl和50ml 100％乙酸。用水将体积补足至100ml。该溶液的pH应当是4.70+/-0.05。在45℃下，将1ml样品(在还含有0.5g/l BSA级分V的NaCl溶液10g/l中稀释)与5mlβ-葡聚糖基质混合并孵育30分钟。孵育30分钟后，通过使用Grabner粘度计测量粘度。通过使用校准线，可以计算未知样品的活性。甘露糖蛋白基质中测试的定量界限为2U/ml。
实施例1 从酵母生产甘露糖蛋白 将2升来自Saccharomyces cerevisiae的膏状酵母(cream yeast)在95℃下加热10分钟，使酵母自身的酶失活。在pH 6.0、60℃下用Pescalase(可商业获得的丝氨酸蛋白酶，来自DSM Food Specialties，荷兰)对悬浮液处理6小时。接着在pH 5.0、60℃下将混合物用Fdase RP-1G(可商业获得的Fdase制剂，来自Amano，日本)孵育15小时，从而将酵母RNA水解为核苷酸。通过离心将酵母提取物与不溶的细胞壁分离。通过微孔过滤来过滤离心液，以去除所有残余的不溶物。接着将澄清的滤液加热至62℃并在聚醚砜膜(PESH，4kDa，NADIR，Microdyn-Nadir，德国)上通过超滤浓缩。添加FDase以确保所有残余的RNA被水解。接着通过在62℃下膜渗滤并洗涤6次(washing factor of 6)，将渗余物进一步纯化。将渗余物浓缩质200g/l甘露糖蛋白的终浓度，并通过在Seitz EKS滤垫上进行过滤灭菌，去除不溶物。在130℃下将溶液UHT处理7秒。溶液的pH为5.3。甘露糖蛋白溶液不含蛋白酶和β-葡聚糖酶活性。将甘露糖蛋白溶液无菌包装。通过浊度法测量溶液的浊度，其为27.3NTU。使用材料和方法中所示的总平板计数，针对活微生物的存在测试甘露糖蛋白溶液。在测试条件下未检测到微生物菌落，因此，甘露糖蛋白溶液的CFU/ml为0。
实施例2 该实施例证明了省略用于破坏甘露糖蛋白样品中的任何蛋白酶活性的UHT处理时所发生的情况。
材料和方法 将甘露糖蛋白的12.5％w/v无菌溶液在40℃下保持11个月，该温度是蛋白酶活性的典型温度。将样品的冻干版本在室温下保持相同的时间段。
首先将液体产物冻干，然后将两种产物的储存溶液制备为10mg/ml。向两种葡萄酒(2006年的桃红和2005年的霞多丽)中添加小量体积，达到50、100、150、200和250mg/l的终浓度。将样品储存于-4℃下，并且照常视觉监测晶体形成。表1给出检测到KHT晶体出现所需的时间(天)。
这些结果显示如果甘露糖蛋白样品储存于40℃下则晶体更早出现，换言之，甘露糖蛋白被储存于对蛋白酶活性而言典型的40℃下时，甘露糖蛋白的活性被显著降低。
实施例3 该实施例展示了酶活性对甘露糖蛋白性能的影响。
向20ml实施例1中获得的并且不含蛋白酶和β-葡聚糖酶活性的甘露糖蛋白液体(20％d.m.)中，添加100μl
溶液(Sigma Aldrich，含有来自Bacillus licheniformis的蛋白酶)。将该溶液在pH 5.3和40℃下孵育48小时。类似地，向20ml甘露糖蛋白中添加12.5mg
(Sigma Aldrich，含来自Trichoderma harzianum的β-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和甲壳酶活性)，并在相同条件下进行孵育。将实施例1中获得的、没有酶活性的甘露糖蛋白溶液在40℃下孵育，并将相同的溶液储存于4℃下。在KHT中过饱和(酒石酸浓度超出饱和26％)的白葡萄酒中测试甘露糖蛋白溶液。制备10mg/ml的稀释剂，并向葡萄酒中添加等分试样，从而达成50、75和100mg/l的甘露糖蛋白。以每天为基础监测晶体的形成。表2给出了检测到KHT晶体所需的时间(天)。
表2
表2显示，甘露糖蛋白的活性被蛋白酶(
)的作用显著降低，被β-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶或甲壳酶的活性显著降低，或被这些活性中两种或更多的组合显著降低。
如“材料和方法”章节中所述记录样品A-D的凝胶渗透色谱(GelPermeation Chromatogram)。表3显示肽峰顶部的MW。
表3通过GPC测定的肽峰顶部的MW
表3清楚地显示了酶活性对甘露糖蛋白样品分子量的影响。
实施例4 通过亚硫酸盐减轻颜色 制备100mg/ml焦亚硫酸钾K2S2O5的储存溶液。向5ml实施例1中获得的甘露糖蛋白溶液中，添加递增体积的亚硫酸盐溶液，获得0.5g/l到10g/l的K2S2O5终浓度。15分钟后观察到颜色的首次减弱。随着时间进展，颜色进一步减弱。在室温下24天后，将样品稀释60次后使用UV/VIS测量溶液的颜色。在450nm处监测吸光度。450nm处的高吸光度产生黄色/棕色。结果显示于表4中。
表4450nm处甘露糖蛋白溶液的吸光度，其作为亚硫酸盐浓度(在UV/VIS测量前将200g/l甘露糖蛋白溶液稀释60倍，并将吸光度数值乘以60)和储存时间的函数。
表4显示亚硫酸盐的添加显著降低了溶液的吸光度，因此显著减弱了溶液的颜色。
实施例5 热处理后的酶活性降低。
在以下的实验中研究蛋白质水解活性(
，Sigma Aldrich)的降低。向1ml甘露糖蛋白溶液中添加300.000个单位的
。沸腾10分钟之前和之后测量活性。结果在表5中给出。
用于测定蛋白酶和β-葡聚糖酶活性的方法的细节在“材料和方法”章节中给出。
表5在热处理后降低蛋白质水解活性 根据表5，该热处理将蛋白质水解活性降低至低于检测界限，即＜0.2％的原始活性。
用
(Sigma Aldrich)进行相同的实验，见表6。
表6热处理后葡聚糖酶活性的降低
根据表6，该热处理将β-葡聚糖酶的活性降低至低于检测界限，即＜0.2％的原始活性。
实施例6 使用以下方法，测定作为pH和浓度的函数的、根据本发明的方法制备的液体甘露糖蛋白样品(LMP)的浊度 从实施例1中制备的粉末起，以50、100、200、300和400g/l的浓度制备甘露糖蛋白溶液。在400g/l的情况下，使用加热达成完全溶解。在20℃的温度下，在装有钨丝灯(400-600nm)的HACH 2100N浊度计(Hach-Lange)中测量浊度。用HCl或NaOH溶液将样品的pH调节至pH4.0、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0。
将可商业获得的甘露糖蛋白样品Mannostab(Laffort)以200g/l的浓度溶解，并且也在pH4.0、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0下测量浊度。
表7根据本发明的液体甘露糖蛋白样品(LMP)和商业样品的NTU作为pH和浓度的函数。
根据表7，根据本发明的液体甘露糖蛋白制剂的浊度在所测试的所有条件下都相当低。浊度至多是商业样品浊度的8％。在低pH例如pH 4下，以及在浓缩的样品例如浓度为400g/l的样品中就是这样。
实施例7 该实施例展示了过滤基础葡萄酒(base wine)后，添加根据本发明的甘露糖蛋白质样品的作用。
借助于膨润土(bentonite)将长相思(Sauvignon blanc)和霞多丽澄清，并过滤获得基础葡萄酒。以三种不同的方式处理基础葡萄酒 1.用0.45μm孔径的药筒过滤将基础葡萄酒过滤。不添加甘露糖蛋白质。
2.首先用0.45μm孔径的药筒过滤将基础葡萄酒过滤。然后以20g/hl的终浓度添加甘露糖蛋白。
3.首先以20g/hl的浓度向基础葡萄酒中添加甘露糖蛋白。然后用0.45μm孔径的药筒过滤将葡萄酒过滤。
表8显示葡萄酒的浊度。
表8浊度(NTU) 结果显示甘露糖蛋白的添加延迟了晶体的形成，并且根据本发明的甘露糖蛋白溶液可以在过滤基础葡萄酒之前或之后便利地添加而不显著地影响其浊度。
权利要求
1.甘露糖蛋白溶液，所述溶液在200g/l的甘露糖蛋白浓度和pH 4至pH 8的pH范围内通过浊度法测得的浊度低于70NTU。
2.根据权利要求1的甘露糖蛋白溶液，其不含蛋白酶活性，并任选地不含β-葡聚糖酶活性。
3.根据权利要求1或2的甘露糖蛋白溶液，其中，以菌落形成单位(CFU)/ml溶液为单位测量时，所述溶液中存在的活微生物的总量低于10。
4.根据权利要求1到3中任一项的甘露糖蛋白溶液，其为水性溶液。
5.根据权利要求1到4中任一项的甘露糖蛋白溶液，其还包含至少一种稳定添加剂，优选地其中所述稳定添加剂是二氧化硫。
6.根据权利要求1到5中任一项的甘露糖蛋白溶液，其具有50g/l至500g/l之间的甘露糖蛋白浓度。
7.根据权利要求1-6中任一项的甘露糖蛋白溶液，当其溶于水中产生1g/l(以总干重为基础)溶液时，在pH 3.5下测量时，具有4NTU或更小的浊度；和/或当其溶于12％v/v乙醇的水溶液中产生1g/l溶液(以总干重为基础)时，在pH 3.5下测量时具有20NTU或更小的浊度；和/或当其以0.2g/l浓度(以总干重为基础)溶于白葡萄酒中时具有≤10NTU的浊度。
8.生产根据权利要求1到7中任一项的甘露糖蛋白溶液的方法，包括a)对酵母细胞的悬浮液进行酶促水解，优选地在外源酶的作用下以及天然酵母酶的失活后进行，其中所述酵母细胞被降解，并且甘露糖蛋白和其它酵母组分从被降解的酵母细胞中溶解和释放；b)将溶解的甘露糖蛋白作为溶液回收，优选地使用膜过滤回收。
9.根据权利要求8的方法，其还包括步骤
c)用磷酸二酯酶处理作为溶液被回收的所述溶解的甘露糖蛋白，以及任选地
d)使用膜过滤纯化经Fdase处理的甘露糖蛋白溶液。
10.根据权利要求8或9的方法，其还包括步骤e)对步骤b)、c)或d)后获得的甘露糖蛋白溶液进行适合使蛋白酶和任选地β-葡聚糖酶失活的处理，优选地通过在70℃或更高的温度下、优选地在80℃和140℃之间的温度下对所述溶液进行热处理来实现，其中所述热处理优选地进行2秒和60分钟之间的时间。
11.根据权利要求8到10中任一项的方法，其中对步骤b)、c)、d)或e)后获得的所述甘露糖蛋白溶液进行灭菌。
12.能够通过根据权利要求8到11中任一项的方法获得的根据权利要求1到7中任一项的甘露糖蛋白溶液。
13.根据权利要求1-7、12中任一项的甘露糖蛋白溶液在葡萄酒稳定中的用途。
14.通过预防或延迟酒石酸盐结晶来稳定葡萄酒的方法，其中向葡萄酒或生产葡萄酒中使用的葡萄汁中添加根据权利要求1至7和/或12中任一项的甘露糖蛋白溶液。
15.生产针对酒石酸盐结晶而言稳定的红酒的方法，所述方法包括过滤葡萄酒和将经过滤的葡萄酒装瓶或包装的步骤，其中在过滤后和装瓶前向所述葡萄酒中添加甘露糖蛋白溶液。
16.根据权利要求15的方法，其中被添加进所述葡萄酒中的所述甘露糖蛋白溶液是根据权利要求1-7、12中任一项的溶液。
17.葡萄酒，特征是至少2的Tcrys经稳定的葡萄酒/Tcrys不稳定的葡萄酒。
全文摘要
本发明描述了甘露糖蛋白溶液，该溶液在200g/l的甘露糖蛋白浓度和pH 4至pH 8的pH范围内通过浊度法测得的浊度低于70NTU，优选低于60NTU，更优选低于50NTU，最优选低于40NTU。该溶液可有利地用于针对酒石酸盐沉淀对葡萄酒加以稳定，因为其高度澄清，并可以直接加入葡萄酒中而不引起任何混浊。
文档编号C07K14/395GK101663316SQ200880012821
公开日2010年3月3日 申请日期2008年4月17日 优先权日2007年4月20日
发明者彼得·菲利普·兰克豪斯特, 昂德里克·路易斯·比杰尔, 伊布拉赫姆·奥兹堪 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司