Rna的亚硫酸氢盐处理的制作方法

专利名称：Rna的亚硫酸氢盐处理的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用亚硫酸氢盐处理RNA的方法。
背景技术：
现已证实在单链DNA中，与以非常慢的速度将5-甲基胞嘧啶脱氨基成为胸腺嘧啶 相比，亚硫酸氢钠优先将胞嘧啶脱氨基成为尿嘧啶(Shapiro，R. ,DiFate,V.，and ffelcher, Μ, (1974) J. Am. Chem. Soc. 96 :906_912)。这项观察结果成为Frommer等人1992年的开发亚 硫酸氢盐基因组测序方案的基础(Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg Gff, MolloyPL and Paul CL. PNAS 89 :1827-1831 (1992)，该文献通过引用并入本 文)。概括而言，现在使用的Frommer方法包括以下基本步骤DNA的碱变性；使用亚硫酸 氢钠进行脱氨基；通过脱盐进行脱磺化，随后进行碱处理并中和。尽管所述条件适合于进行 DNA的亚硫酸氢盐处理，但是该所使用的严厉条件将彻底破坏RNA。因此，由于降解，在这些 条件下使用亚硫酸氢钠处理RNA的任何测定法在临床环境下都是无效的。亚硫酸氢盐修饰方法以及其已建立的变式方法的缺点之一是现已发现该方 法即便使用DNA作为起始材料，也导致84-96%的原始输入DNA发生降解(Grunau et al. Nucleic Acids Research 29 (13) e65 (2001))。与此方法相关的巨大损失意味着实践上 很难成功地分析少量细胞的甲基化状态，或成功地分析DNA已经处于部分降解状态的古老 的保存标本(archival specimen) 0此外，由于与现有方法相关的固有的降解，不可能按照 已经被公立的人类基因组计戈丨J (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, Nature, 409,860-921)或私人的 CELERA 测序计划(J Craig Venter et al. ,2001, Science, 291,1304-1351)所成功使用的相同方式对生物体的完整基因组进行测序和装配 以确定整个基因组范围内的甲基化状态，这是因为DNA被片段化使得由于在序列中存在大 量“间隙(gap)”而使其不能以任何有意义的方式被克隆、测序和组装。由上述说明可见，此 类条件将使RNA完全降解，因此阻碍了任何用于检测的下游程序。现有技术中使用的亚硫酸氢盐方法的另一个缺点是通常只有小片段的DNA可以 被扩增。经验表明，通常可成功处理并扩增不到约500个碱基对(bp)。该现有技术不适用 于新的分子生物学方法，例如长距离聚合酶链反应(PCR)，其使得扩增一般长达约50kb的 大段未处理基因组DNA成为可能。目前，甚至还不可能分析完整基因的甲基化状态，因为在 哺乳动物基因组中大量基因的长度超过50kb。上述事实又进一步使经亚硫酸氢盐处理的 RNA的扩增复杂化。即便是为了观察相对小的基因(<4kb)的甲基化状态，PCR反应也不得不艰 难地通过目的基因区域(D. S Millar, K. K 0w, C.L.Paul，P. J. Russell, P. L. Molloy, S.J.Clarke,1999, Oncogene,18(6) 1313-24 ；Millar DS, Paul CL, MolloyPL, Clarke SJ. (2000). J Biol Chem;275(32) =24893-9) 0目前用于亚硫酸盐DNA处理的方法还是繁琐 和耗时的。标准方法通常需要多次试管转换、柱纯化、透析、将DNA包埋在琼脂糖珠中或在 反应中加入添加剂以试图减少例如基因组DNA的某些区域未转化这样的问题。
由于上述难题，迄今尚未开发出亚硫酸氢盐处理RNA的标准方法。Shapiro等人 首先描述了利用亚硫酸氢盐对RNA的作用作为研究RNA结构和功能的工具(Shapiro R， Cohen BI and Servis RE，1970，Nature，227 1047-8)。然而，RNA 的用量非常大(5mg)，并 且即便是在与亚硫酸氢盐试剂一起温育7天后，该方法的效率也仅为92%。其他人尝试利 用RNA的亚硫酸氢盐处理测定RNA的三维结构(Lowden et al.，1976，Nucl. Acids. Res. 76 3383-96 ；Goddard et al. , 1978,89 531-47 ；Digweed et al.，1982，127 :531_37)，但是这 些方法仅使核酸中极少量的胞嘧啶转化为尿嘧啶。此后，Mellor等人描述了 RNA的亚硫酸 氢盐转化方法(Mellor EJC, Brown F and Harris TJR, 1985, J Gen Virol,66 1919-29), 但在这个花费至少120小时来完成且需要2. 5 μ g起始RNA的复杂方法中，仅有60-80%的 胞嘧啶得到修饰。本发明的发明人此前开发过使用亚硫酸氢盐处理核酸的方法。所述方法公开于美 国专利第7288373号中，其描述了 DNA的亚硫酸氢盐处理；以及W02004/096825中，并可通 过商标为Methyleasy 的商购试剂盒的形式实施。用于进行DNA亚硫酸盐处理的其他商用试剂盒以商品名甲基SEQr亚硫酸氢盐转 化试剂盒(methyl SEQr bisulphite conversion kit, AppliedBiosystems, cat#4374960)、 Methylamp-96DNA jf % i式 ^lJ ^ (Methylamp-96DNA modification kit, Epigentek, cat#P-1008)、EpiTect 亚硫酸氢盐试剂盒(EpiTect bisulphite kit, Qiagen, cat#59104) 和 EZ DNA 甲基化引导试剂盒(EZDNA methylation direct kit, Zymo Research, cat#D5020)进行销售。因此，为了对RNA进行亚硫酸氢盐处理，特别是为了检测少量的起始材料，需要更 可靠的方法，该方法不导致大量RNA的降解并克服或至少降低与已知RNA处理相关的一种 或多种问题。通过深入的调查和研究，本发明的发明人现已开发出亚硫酸氢盐处理RNA的强效 方法，该方法导致最少的RNA降解或没有RNA降解，并且能够对极少量的RNA样品进行亚硫 酸氢盐处理、分析和回收。

发明内容
本发明涉及亚硫酸氢盐处理RNA的改进方法，其有效并可适用于多种不同的分子 生物学技术，并且能够实现RNA的大量回收而没有显著降解。本发明第一方面提供了亚硫酸氢盐处理RNA的方法，所述方法包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在约50_90°C下反应约5_180分钟以形成经处理的RNA ； 和回收所述经处理的RNA。在本发明的一个实施方案中，此方法还进一步包括对所回收的RNA进行部分或完 全的脱磺化。在本发明的另一个实施方案中，此方法进一步包括在反应步骤之前的变性步骤。在其他实施方案中，此方法可包括捕获步骤，从而可使RNA与固相，例如磁珠结 合。当RNA在一个或多个步骤中与固相结合时，此方法还可包括洗脱步骤以从所述固相上 去除RNA。
所述亚硫酸氢盐试剂可以是亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠。优选的亚硫酸氢盐试剂 是偏亚硫酸氢钠。优选使用浓度为约IM至约6M的亚硫酸氢盐试剂进行所述反应步骤。更 优选所述浓度为约2M至约4M。在特别优选的实施方案中，所述亚硫酸氢盐试剂的浓度为约 3M。优选所述亚硫酸氢盐反应步骤进行约5-180分钟。在优选的实施方案中，所述反 应步骤进行约5-150分钟。在另一个实施方案中，所述反应步骤进行约5-120分钟。在另 外的实施方案中，所述反应步骤进行约5-90分钟。在另一个实施方案中，所述反应步骤进 行约5-60分钟。在另一个优选实施方案中，所述反应步骤进行约10-30分钟。在特别优选 的实施方案中，所述反应步骤进行约20分钟。在另一个优选实施方案中，所述反应步骤进 行约30分钟。在另一个优选实施方案中，所述反应步骤进行约45分钟。在另一个优选实 施方案中，所述反应步骤进行约60分钟。在另一个优选实施方案中，所述反应步骤进行约 90分钟。在另一个优选实施方案中，所述反应步骤进行约120分钟。在另一个优选实施方 案中，所述反应步骤进行约150分钟。优选在约50°C至约90°C的温度下进行所述反应步骤。在另一个实施方案中，在约 65°C至约85°C的温度下进行所述反应步骤。在另一个实施方案中，在约60°C至约80°C的温 度下进行所述反应步骤。在不同的优选实施方案中，在约60°C、70°C、75°C、80°C或85°C的 温度下进行所述反应步骤。在特别优选的实施方案中，在约70°C的温度下进行所述反应步
马聚ο在优选的实施方案中，在约60_80°C的温度下使用浓度为约3M的亚硫酸氢钠或偏 亚硫酸氢钠进行所述反应步骤约10-30分钟。在特别优选的实施方案中，在约70°C的温度 下使用浓度为约3M的亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠进行所述反应步骤约20分钟。可在能够增强亚硫酸氢盐反应的添加剂的存在下进行所述反应步骤。所述添加剂 可以是二硫苏糖醇(DTT)、醌醇、尿素、甲氧胺或其混合物。所述方法可进一步包括在所述反应步骤后的稀释步骤，以将盐浓度降低至基本不 干扰核酸沉淀步骤或经处理的RNA与固相结合的水平。可使用水进行所述稀释步骤以将盐 浓度降低至低于约1M，优选低于约0. 5M。所述回收步骤可包括沉淀所述经稀释的处理RNA，或者清洗所述固相支持物以从 结合的经处理RNA上基本上去除例如盐(包括亚硫酸氢盐)的材料。可使用醇类沉淀剂进 行RNA沉淀。所述醇类沉淀剂可以是异丙醇、乙醇、丁醇、甲醇或其混合物。优选所述醇为 异丙醇。所述固相支持物可包括磁珠。如果所述方法中包括任选的变性步骤，优选使用加热使RNA变性，通常在约50°C 至约90°C的温度下进行。更优选通过将RNA样品加热至约80°C来进行所述变性步骤。所回收的经处理RNA的脱磺化可包括除去存在于经处理的RNA上的磺酸基团以 获得基本不含磺酸基团或者磺酸基团数量减少的经处理的RNA，而不诱导大量RNA链断裂。 如果所述方法中包括任选的脱磺化步骤，其进行可通过使用缓冲剂或碱性试剂调整所回收 的RNA的pH，从而除去存在于所述处理的RNA上的部分或所有磺酸基团，由此获得基本不 含磺酸基团的RNA样品。优选在约7. 5至约11. 5的碱性pH下进行所述脱磺化步骤。更优 选PH为从约8. 5至约11.5。在优选的实施方案中，所述pH为约8. 7。在另一个优选实施 方案中，所述PH为约10.5。在另一个优选实施方案中，所述pH为约11.5。
优选在约0°C至约90°C的温度下进行所述脱磺化步骤。在不同的优选实施方案 中，所述温度可以在选自约5°C至约85°C，约10°C至约70°C，约20°C至约60°C或约30°C至 约50°C的范围。在优选的实施方案中，在约5°C、约10°C、约20°C、约30°C、约40°C、约50°C、 约60°C、约70°C、约75°C、约80V或约85°C的温度下进行脱磺化。优选所述脱磺化进行约1-30分钟。在不同的优选实施方案中，脱磺化进行约5-25 分钟，或约10-20分钟。在特别优选的实施方案中，脱磺化进行约1-10分钟，或约5-10分钟。在优选的实施方案中，脱磺化在约8. 5至约11. 5的pH以及约0°C -85°C的温度 下进行约1-20分钟。在另一个优选实施方案中，脱磺化在约8. 5至约11. 5的pH以及约 20-75°C的温度下进行约5-15分钟。在另一个优选实施方案中，脱磺化在约8. 5至约11. 5 的PH以及约20-60°C的温度下进行约5-15分钟。在另一个优选实施方案中，脱磺化在约 8. 5至11. 5的pH以及约30-50°C的温度下进行约5_10分钟。在特别优选的实施方案中， 脱磺化在约8. 5至11. 5的pH以及约40°C的温度下进行约5分钟。在尤其优选的实施方案 中，脱磺化在约8. 7的pH以及40°C的温度下进行约5分钟，或者在约11. 5的pH以及40°C 的温度下进行约5分钟。优选回收大于约70%的经亚硫酸氢盐处理的RNA，优选回收大于约75%的经亚硫 酸氢盐处理的RNA，优选回收大于约80%的经亚硫酸氢盐处理的RNA，优选回收大于约90% 的经亚硫酸氢盐处理的RNA，优选回收大于约95%的经亚硫酸氢盐处理的RNA。 优选回收大于约70%的脱磺化RNA，优选回收大于约75%的脱磺化RNA，优选回收 大于约80 %的脱磺化RNA，优选回收大于约90 %的脱磺化RNA，优选回收大于约95 %的脱磺 化 RNA。此方法还进一步包括加工或分析所述经处理的RNA样品。待处理的核酸样品可包括RNA或者DNA和RNA 二者的组合。所述样品可以是纯化 的或粗提取物。所述样品可从组织、器官、细胞、微生物、生物样品或环境样品制备或得自于组织、 器官、细胞、微生物、生物样品或环境样品。优选所述组织或器官选自由脑、结肠、泌尿生殖系统、肺、肾、造血系统、乳房、胸 腺、睾丸、卵巢、子宫及其混合物组成的组。优选所述微生物选自由细菌、病毒、真菌、原生动物、类病毒及其混合物组成的组。优选所述生物样品选自血液，尿液，粪便，精液，脑脊髓液，灌洗液，唾液，拭子，来 源于例如脑、结肠、泌尿生殖系统、肺、肾、造血系统、乳房、胸腺、睾丸、卵巢、子宫的细胞或 组织，来自胚细胞系或胚外细胞系、环境样品、植物，包括细菌、细胞内寄生虫、病毒、真菌、 原生动物和类病毒在内的微生物的组织。此方法可在反应容器中进行。所述反应容器可选自试管、平板、毛细管、孔、离心 管、微离心管、载玻片、盖玻片和表面。有利地，可实施本发明的方法而不导致RNA样品显著降解或损失，这体现了本发 明对可商购试剂盒的改进。与使用亚硫酸氢盐处理DNA的已知方法不同，本发明的方法基本不导致RNA的降 解，或使RNA降解减少，这意味着由于保留了足够完整的模板，经亚硫酸氢盐处理的RNA适合于下游的应用，例如PCR。因此，本发明的方法可用于需要精确测量样品中RNA的存在量 的情况，例如通过qPCR进行基因表达分析，以及在药物治疗期间对RNA病毒进行病毒负荷 量监测以确定治疗是否成功。除非文章内容另有需要，否则在本说明书全文中术语“包含(包括)”应被理解为 含有指定的元素、整体或步骤，或者元素组、整体组或步骤组，但也不排除其它元素、整体或 步骤，或者元素组、整体组或步骤组。包含在本说明书中的文献、法规、材料、装置或物品等的任何讨论都仅出于提供本 发明内容的目的。不能认为由于以上任一项内容或所有内容在本申请的各项权利要求的优 先权日之前已在澳大利亚存在，就认定这些内容构成部分现有技术的基础或者是本发明相 关领域的普遍常识。在本发明全文中，可将任何一个或多个实施方案与任意的其他一个或多个实施方 案组合，并且所有这些组合均在本文公开的范围之内。为了更清楚地理解本发明，将参考以下附图和实施例对优选实施方案进行阐述。


图1显示了从分离自胰腺癌细胞系PC-3的RNA回收经亚硫酸氢盐处理的RNA的 比较。根据厂商的说明，使用TriZ0lTM(Invitr0gen)分离RNA。随后，将RNA重悬在以下脱 磺化缓冲剂中Tris/HCl缓冲剂，pH 9. 5,10. 5、11. 5和12。随后在所述的温度下温育所述 的时间。温育后，使用异丙醇沉淀RNA，并在预制的(2%)琼脂糖凝胶(Invitrogen)中进 行电泳。在95°C下进行标准DNA脱磺化30分钟，并且如图1所示，导致RNA样品完全降解， 以至于无法用于下游的应用。图2显示了使用高输入量(input)的RNA和HIV-1逆转录酶对经亚硫酸氢盐转 化的Acrometrix HCV样品进行的逆转录PCR(RT-PCR)，其中使用了不同的脱磺化时间或没 有脱磺化，从而测定能够用于获得阳性RT-PCR信号的最短脱磺化时间。#1 脱磺化0分钟 §76 0C ；#2 脱磺化1分钟@76°C ；#3 脱磺化2分钟@76°C ； #4 脱磺化5分钟@76°C ； #5 脱 磺化10分钟@76°C ；#6 脱磺化15分钟@76°C ；#7 脱磺化15分钟@76°C (对照逆转录酶)； #8 =RT阴性对照；#9 =PCR阴性对照。图3显示了使用多种不同逆转录酶并使用低输入量的经亚硫酸氢盐转化的 Acrometrix HCV样品进行的RT-PCR，其中使用了不同的脱磺化时间以测定在使用不同逆转 录酶的情况下能够获得阳性RT-PCR信号的最短脱磺化时间。图4显示了在使用TE缓冲剂脱磺化5分钟后，低输入量的经亚硫酸氢盐转化的 Acrometrix HCV RNA的RT-PCR，其中使用不同的pH和温度以确定使用此缓冲剂的最佳条 件。图5显示了在40°C下使用组成不同的两种缓冲剂脱磺化5分钟后，不同低输入量 的经亚硫酸氢盐转化的Acrometrix HCV RNA的RT-PCR。结果显示可在宽的pH范围内使用 一系列的缓冲剂进行脱磺化。图6显示pH、时间和温度对使用IOOmM NaHCO3进行IOIU经亚硫酸氢盐转化的HCV RNA的脱磺化的影响，并且证明一些缓冲剂可耐受宽的条件，同时保持有效脱磺化的能力。图7显示在86°C下在pH 10. 5的TE缓冲剂中或在76°C下在pH 11. 5的TE缓冲剂中，经亚硫酸氢盐处理5、10、15、20、25和30分钟的PC3 RNA获得的qPCR数据。图8显示了在76°C下用pH 11.5的TE缓冲剂处理5分钟的RNA的一系列稀释，以 及与未经修饰的野生型引物(其与经亚硫酸氢盐处理的引物靶向相同的区域)相比的扩增 反应效率。图9显示了磁珠可有效用于捕获HCV RNA,并可有效进行RNA的亚硫酸氢盐处理、 回收、脱磺化和扩增，同时仍与支持物结合。图10显示了使用本发明和商业试剂盒对HCV RNA进行亚硫酸氢盐处理的比较。
具体实施例方式下文通过非限定的方式详细描述用于处理RNA的实施方案。本发明提供了用于处理和分析RNA样品的方法。此方法的优点在于提供了用于修 饰RNA的简单且高效的方法，并可用于，例如检测RNA的甲基化图谱或RNA甲基化的变化， 基因表达的量化，以及测量极少量的RNA从而量化响应药物治疗的病毒拷贝数的能力。本 发明的方法提供了具有较高产量、较高的RNA分子量且没有RNA完全降解的简化方法，因此 能够分析量少于此前认为可能进行分析的量的RNA，并且易于应用于大量的样品。本发明涉及使用亚硫酸氢盐处理RNA的方法，此方法包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在约50_90°C下反应约5_180分钟以形成经处理的RNA ； 和回收所述经处理的RNA。本文公开的优选实施方案涉及使用亚硫酸氢盐处理RNA的方法，此方法包括
任选地将RNA变性以基本除去RNA中存在的任何显著二级结构；使用亚硫酸氢盐试剂处理所述RNA，并温育反应物，从而形成经处理的RNA ；将盐浓度降低至基本不干扰核酸沉淀步骤或者经处理RNA与固相结合的水平；回收所述经处理的RNA ；和任选地对所回收的经处理RNA进行部分或完全脱磺化，从而除去存在于经处理的 RNA上的磺酸基团以获得基本不含磺酸基团或者磺酸基团数量减少的经处理RNA，而不诱 导显著量的RNA链断裂。本发明的方法特别适用于分析RNA样品。本发明的方法是有利的，因为能够实施其而不显著程度地破坏或剪切核酸样品， 例如RNA链。本发明的方法还可有效地对极少量的RNA进行亚硫酸氢盐处理，例如0. 5 μ g 或更少，如仅约0. 2 μ g或更少，0. 1μ g或更少，500ng或更少，250ng或更少，IOOng或更少， 50ng 或更少，15-150 阿克(attogram)，或 60-120 阿克。(1 阿克=Ixl(T18g)因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于处理RNA的方法。在本发明的多个实 施方案中，此方法可包括部分或全部的以下步骤使RNA变性；将RNA与亚硫酸氢盐一起温 育，从而使用磺酸基团修饰核苷酸；稀释或者纯化经亚硫酸氢盐处理的RNA，以除去盐(包 括亚硫酸氢盐)；沉淀经修饰的RNA，或将经修饰的RNA从固相洗脱；和使经修饰的RNA发生 反应以部分或完全除去磺酸基团。可进行任选的变性步骤，例如通过对RNA进行加热。通常在受控条件下进行所述 任选的脱磺化步骤，从而部分或完全除去存在于经亚硫酸氢盐处理的RNA上的磺酸基团，而没有显著RNA降解。所述样品可由组织、细胞制备，或者可是任何生物样品，例如血液，尿液，粪便，精 液，唾液，拭子，脑脊髓液，灌洗液，来源于例如脑、结肠、泌尿生殖系统、肺、肾、造血系统、乳 房、胸腺、睾丸、卵巢、子宫的细胞或组织，来自胚细胞系或胚外细胞系、环境样品、植物，包 括细菌、细胞内寄生虫、病毒、真菌、原生动物和类病毒等的微生物的组织。B.Alberts et al. ,1989 The Molecular Biology of the Cell,2nd Edition, Garland Publishing Inc NewYork and London,pp 995-997中总结了适合用于本发明的处理的最佳描述的哺乳动物 细胞类型。分析来自人、动物、植物、细菌和病毒来源的样品的RNA是指覆盖从受精到死亡后 48小时内的所有细胞、组织和器官的所有生命周期阶段，以及可源自组织学来源的样品如 显微镜载玻片样品，整块包埋的样品，或者从合成或天然表面或从液体提取的样品。所述分析还包括来自通过细胞外或细胞内的模式而与人疾病相关的原核生物或 真核生物或病毒(或其组合)的RNA。可使用任何适合用于获得RNA材料的方法。实例包括，但不限于本领域技术人员 熟知的商购DNA、RNA、试剂盒或试剂、工作站，包含蛋白酶试剂的标准细胞裂解缓冲剂和有 机提取法。本发明的方法可在反应容器中进行。所述反应容器可以是任何适合的容器，例如 试管、平板、毛细管、孔、离心管、微离心管、载玻片、盖玻片和或任何适合的表面。此方法通 常在一个反应容器中进行，以减少核酸样品降解或损失的可能性。通常，所述变性步骤包括热处理，然而，只要不影响原始RNA样品的完整性，也可 使用其他适合的变性试剂。本领域技术人员可理解，在一些情况下，并不需要此变性步骤， 这由试验确定。所述亚硫酸氢盐试剂通常是亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠。优选地，亚硫酸氢盐试 剂是偏亚硫酸氢钠。亚硫酸氢盐试剂使胞嘧啶碱基磺化，从而获得磺酸胞嘧啶(cytosine sulphonate)，随后通过磺酸胞嘧啶的水解脱氨获得磺酸尿嘧啶(uracil sulphonate) 0然 而，可理解，也可使用任何其他适合的亚硫酸氢盐试剂(参见Shapiro，R.，DiFate, V.，and ffelcher, Μ, (1974) J. Am. Chem. Soc. 96 :906_912)。与磺化试剂的温育可在低于7的pH以及有利于形成尿嘧啶磺酸基团的温度下进 行。低于7的pH最适用于进行所述磺化反应，由此将胞嘧啶碱基转化成磺酸胞嘧啶，随后 转化为磺酸尿嘧啶。然而，如果需要，本发明的方法也可以在高于PH 7的条件下进行所述 磺化反应。可在能够增强亚硫酸氢盐反应的添加剂存在下进行所述磺化反应。适合的添加剂 的实例包括，但不限于DTT、醌醇、尿素、甲氧胺。在这些试剂中，醌醇为还原剂。添加尿素和 甲氧胺以改进亚硫酸氢盐反应的效率。可理解，还可提供其他添加剂或试剂以辅助所述亚 硫酸氢盐反应。磺化反应导致RNA样品中的甲基化胞嘧啶保持不变，而未甲基化的胞嘧啶被转化 成尿嘧啶。所述磺化反应通常在约50-90°C的温度下进行约5-180分钟。在不同的优选实施 方案中，所述磺化反应在约50-90°C的温度下进行约5-150分钟，在约50-90°C的温度下进行约5-120分钟，在约50-90°C的温度下进行约5-90分钟，或在约50_90°C的温度下进行约 5-60分钟。在可选的实施方案中，使磺化反应在约50-90°C下进行足以达到所需的磺化水 平够长的时间，例如进行约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40 分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、70分钟、80分钟或约90分钟。在特别优选的实施 方案中，所述磺化反应在约70°C下进行约20分钟。 亚硫酸氢盐试剂的浓度通常为约IM至约6M，优选约2M至约4M，更优选约3M。发现在本发明的不同实施方案中运行特别良好的反应条件如下所述。制备待处 理的RNA或其他核酸达到20 μ 1体积。然后，208 μ 1新鲜制备的3Μ偏亚硫酸氢钠溶液 (BDH AnalaR#10356. 4D)pH 5. 0 (该 pH 可通过添加 IOM 氢氧化钠(BDH AnalaR#10252. 4X) 来调节到)以及12 μ IlOOmM的醌醇溶液(BDH AnalaR#103122E)。所添加的醌醇的浓度 可以是约IOmM至约500mM范围内的任何值，这根据试验确定。随后，将溶液充分混合，并 任选地由208 μ 1矿物油(Sigma，分子生物级Μ-5904)覆盖，或在热盖热循环器(heated lidthermocycler)内的0. 2ml的管中进行。随后，在适合的温度下，例如60_90°C，优选 70°C，或其他适合的温度下将样品静置10分钟至约3小时，优选20分钟，以获得用于完全 亚硫酸氢盐转化的时间。此反应步骤也可在将RNA与固相结合的情况下进行。本领域技术 人员可以理解，只要反应条件适合于核酸，例如RNA的磺化，可以改变上述体积、浓度，以及 温育时间和温度。此方法可包括稀释步骤，以使抑制后续反应的盐不与磺化核酸，即磺化RNA共沉 淀。优选将盐浓度稀释至小于约1M，例如小于约0.5M。通常所述稀释步骤使用水或缓冲剂 进行，从而将盐浓度降低至低于约1M，例如低于约0. 5M。例如，通常将盐浓度稀释至小于约 ImM至约1M，特别是小于约0. 5M,小于约0. 4M,小于约0. 3M,小于约0. 2M,小于约0. 1M,小于 约50mM，小于约20mM，小于约10mM，或者，如果需要，甚至可小于约ImM。本领域技术人员能 够简单地测定减少盐与核酸沉淀的适合的稀释度，从而能够实施随后的步骤，并使对所述 核酸样品的进一步净化或处理缩减至最小限度。通常在水中进行稀释，但也可在任何适合 的缓冲剂，例如Tris/EDTA或其他生物缓冲剂中进行，只要所述缓冲剂不明显沉淀核酸，或 导致盐与核酸一起明显沉淀以至于抑制后续反应。通常使用沉淀剂，例如醇进行沉淀。用 于沉淀核酸的示例性醇可选自异丙醇、乙醇或任何其他适合的醇。在可选的实施方案中，可向样品中添加结合剂以促进经反应的RNA与固相支持物 结合，以进行后续的纯化步骤。随后，可清洗结合的RNA以除去盐(例如亚硫酸氢盐)和任 何其他不期望的杂质，随后，将其从固相支持物洗脱到适合的洗脱缓冲剂中。这特别适合于 固定的固相支持物，例如柱，或磁性移动式支持物，例如包被磁珠。根据本发明的实施方案，可在固相支持物上进行一个或多个步骤。在一个实施方 案中，所有步骤均在固相支持物上进行。在优选的实施方案中，在固相支持物上进行脱磺化步骤。可通过将沉淀的经处理RNA的pH调节至约11. 5的最大pH来进行所述任选的脱 磺化步骤。然而，在一些实施方案中，优选较低的PH以使RNA降解最小化。暴露于高碱性 环境，例如PH 12或更高，会导致RNA分子完全降解，因此，使暴露于碱性pH的处理最少化， 以避免或限制链的断裂。可以使用适合的缓冲剂或碱性试剂在约PH 7. 0-11. 5下有效实施 所述脱磺化步骤。适合的缓冲剂或碱性试剂的实例包括具有PH 7. 0-11. 5的缓冲剂，例如，TEC Tris-EDTA' )、CAPS( ‘N-环己基-3-氨基丙磺酸’)、磷酸盐、甘氨酸、甲胺和碳酸氢 钠，但不限于此。在优选的实施方案中，可在8. 5-11.5之间的pH下进行脱磺化。在特别优 选的实施方案中，可在PH 8.7、pH 10.5或pH 11.5下进行脱磺化。特别优选的缓冲剂包括 TE、碳酸氢钠和CAPS。本领域技术人员可以理解，适合的缓冲剂或碱性试剂可选自大量已知 有用的缓冲剂和碱性试剂。脱磺化步骤的温度范围通常为从0°C或更低直到约90°C，其处理时间可在约1分 钟至约30分钟之间或更长(例如，长达约45或60分钟)变化，这取决于所使用的条件。在 本发明的优选实施方案中，脱磺化在约30-50°C的温度下进行约1-30分钟。在特别优选的 实施方案中，脱磺化在约40°C的温度下进行约2-20分钟，更优选约5-10分钟，更优选约5 分钟。本领域技术人员可以容易地确定适合于实施所述脱磺化反应的时间和温度。也可以 使用低于室温的温度，只要增加温育时间以使得可以进行充分的脱磺化。因此，所述脱磺化 步骤可以在低于10°C、约5°C、约10°C、约20°C、约22°C、约25°C、约30°C、约35°C、约37°C、 约 40°C、约 45°C、约 50°C、约 55°C、约 60°C、约 65°C、约 70°C、约 75°C、约 76°C、约 80°C、约 85°C、约86°C、约90°C下进行。用于实施所述脱磺化反应的特别有用的温度为约40_75°C， 优选约40°C。在一些实施方案中，例如在使用能够复制磺化RNA的逆转录酶时，可能完全不必 使核酸脱磺化。本领域技术人员可以简单地通过试验确定是否需要或期望进行脱磺化。本发明的另一个优点在于，实施此方法的时间范围比使用其他商用试剂盒的 处理方法的时间要少得多，所述其他商用试剂盒例如甲基SEQr亚硫酸氢盐转化试剂 盒(Applied Biosystems, cat#4374960)、Methylamp-96DNA 修饰试剂盒(Epigentek， cat#P-1008) ,EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(Qiagen，cat#59104)，和EZ DNA甲基化引导试剂 盒(Zymo Research, cat#D5020)。本发明提供了有效表征RNA的方法。本发明可对RNA样品实施有效的磺化和脱磺 化步骤。然而，应理解，如本文的公开，所述磺化或脱磺化步骤都不需要进行彻底，只要足以 在后续程序中表征核酸是否存在即可。本领域技术人员能够简单地测定是否应当将这些步 骤进行至接近完全，或者不完全反应是否足以进行所需的分析。例如，当使用少量细胞或少 量RNA时，通常需要进行更完全的反应。在表征较大量的核酸样品时，可进行不太完全的反 应，但仍可提供足以进行随后RNA样品分析的反应产物。本发明的特别优点在于，可处理并 表征极少量的RNA，例如约0. 5 μ g或更少，如约0. 2 μ g或更少，约0. 1 μ g或更少，500ng或 更少，250ng或更少，IOOng或更少，约15-150阿克，或约60-120阿克的量。如本文公开，本发明提供了方便地处理RNA的方法。此方法可用于分析RNA分子的 甲基化状态，或用于基因表达分析的方法或用于监测低水平RNA病毒例如丙型肝炎(HCV) 从而监测响应药物治疗的病毒负荷量。本发明的优点是通过稀释盐浓度并沉淀核酸，或者使核酸与固相支持物结合，以 高度有效的方式进行脱盐步骤。稀释步骤将盐浓度降低至在核酸沉淀或结合到固相支持物 时不干扰如脱磺化步骤的后续步骤的水平。沉淀步骤高度有效，并可任选地包括提高核酸 沉淀效率的载体。使用如柱或磁珠的固相支持物可获得最佳的回收，减少获得结果所需的 时间，并且易于自动化。因此，本发明的方法使损失最小化，并且提高了核酸样品的回收。因 此，本发明提供另外的优点，即允许使用极少量起始材料并有效地表征甲基化、基因表达以及病原体的检测。此外，此方法包括脱磺化步骤时，可使用弱碱性pH的缓冲溶液以降低目标RNA被 显著片段化的可能性。将缓冲溶液的PH提高至远高于pH 11. 5会导致高分子量核酸，特别 是RNA的非常显著的片段化。因此，需要使此类片段化最小化时，通常使用低于约11. 5的 碱性PH，例如约8. 5-11.5。本发明的另一个优点在于，对于每个样品，可在单个试管或容器中进行反应，由此 使样品损失最小化，并且可对大量样品进行处理。与现有方法相比，本发明方法的另一个优 点在于，RNA —经磺化，即能重悬在具有碱性pH的缓冲剂中进行脱磺化步骤，而不需要添加 将完全破坏靶RNA的强碱，如在Clark等人1994所描述的方法中的那样。本发明的方法可用于表征各种RNA的甲基化状态，无论其为mRNA、tRNA、rRNA、 micr0RNA、shRNA、siRNA，还是任何其他种类的目标RNA、组织或生物。本发明的方法也可与 基因组测序方法例如 Frommer et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 1827-1831 (1992)中 所述的那些方法结合使用，此文献通过弓I用并入本文。本发明还提供了用于确定样品甲基化状态的方法，或用于量化样品基因表达谱的 方法，或用于量化患者样品中病毒的循环水平的方法。所述方法可使用本发明的RNA处理 方法对样品进行实施。测定样品甲基化状态的方法可使用待测样品和对照样品平行地进 行，从而能够比较并确定所述样品相对于参照样品的甲基化状态，这同样能够应用于基因 表达或病毒负荷量监测分析。例如，可比较样品以测定大体上或在具体位点上的甲基化是 否提高或降低。如本文所述，此类测定还可用于诊断和/或确定疾病的预后。此方法可进 一步包括报告样品的甲基化状态，例如在诊断应用中报告样品的甲基化状态，例如基于RNA 的病毒如HCV或HIV的存在或数量。应理解，可以以试剂盒的方式提供本发明方法的组分。所述试剂盒可包含适合的 化学试剂、反应容器如试管以及说明如何实施本发明方法的说明书。实施例方法和试剂化学试剂得自于以下琼脂糖来自BioRad (Hercules CA;鉴定的分子生物学级 #161-3101)；冰醋酸来自 BDH(Kylsyth，澳大利亚；AnalaR 100015N)；乙二胺四乙酸(EDTA) 来自 BDH(AnalaR 10093. 5V)；乙醇来自 Aldrich(St. Louis MO ；200proof E702-3)；异丙 醇来自 Sigma (St. Louis MO ；99 % +SigmaI-9516)；矿物油来自 Sigma (M-5904) ；3M 乙酸 钠溶液来自Sigma (S-7899)；氯化钠来自Sigma (ACS reagent S9888)；和氢氧化钠来自 BDH(AnalaR#10252. 4X)。酶/试剂得自于以下PCR预混母液(master mix)来自Promega(MadisonWI ； #M7505) ；Superscript III 逆转录酶(Invitrogen) ；HIV 逆转录酶(Ambion#AM2045)； iScript 逆转录酶试剂盒(Biorad#1708897)和 DNA 标记物来自 Sigma (Direct load PCR low ladder lOO-lOOObp，Sigma D-3687 禾口 lOO-lOKb，Sigma D-7058)。溶液如下(1)IOmM Tris/0. IM EDTA, pH 7. 0-12. 5 ； (2) 3M 偏亚硫酸氢盐(5. 6g， 溶于含 500 μ 1 ION NaOH 的 IOml 水(BDH AnalaR#10356. 4D) ； (3) IOOmM 醌醇(0. 55g/50ml 水；BDH AnalaR#103122E) ； (4) IOOmM NaHCO3, pH 8. 0-11. 5 (BDH#10247) ； (5) IOmM CAPS, pH 11-11. 5(Sigma#C6070) ； (6) 50X TAE凝胶电泳缓冲剂(242g Trizma碱，57. Iml 冰醋酸，37. 2g EDTA和水至1L)；和(7) 5X琼脂糖凝胶上样缓冲液(Iml 溴酚蓝(Sigma B6131)、 Iml 二 甲苯蓝(Sigma Χ-4126)、3· 2ml 甘油(Sigma G6279) ,8 μ 1 0. 5Μ EDTA，pH 8. 0,200 μ 1 50Χ TAE缓冲液和水至10ml)。组织和细胞系根据厂商数据册中的说明，使用TriZ0lTM(InVitr0gen)从胰腺癌细胞系PC3分离 RNA。HCV RNA是根据厂商的说明，使用QiaAmp UltraSens(Qiagen)病毒试剂盒分离的 OptiQual HCV RNA高阳性对照，并重悬至5，000IU/μ 1的终浓度。RNA的亚硫酸氢盐转化将3. 35g 亚硫酸氢钠(Sigma 59000 500g ；批号 116K0761)溶于 5ml Xceed 试剂 1 (Methyleasy Xceed kit, Human Genetic Signatures，悉尼，澳大利亚)。将所述试剂力口 热至80°C直到完全溶解，随后冷却。将0. Ilg 氢醌(Merck 8. 22333. 0250 ；批号 K36100033 702)溶于 IOml 不含核酸 酶的水。将5 μ 1 RNA与220 μ 1亚硫酸氢盐试剂以及12 μ 1醌醇在PCR管中混合，并在PCR 仪中在70°C下温育20分钟。将800μ 1 不含核酸酶的水以及 2μ 1 GlycoBlue (Ambion ΑΜ9515 ；批号 0705003) 加入，将样品充分混合，随后加入Iml异丙醇，并将样品在4°C下温育1小时。在4°C以16000 Xg离心20分钟沉淀RNA。弃去上清，并使用70%乙醇在温和涡旋下清洗所述沉淀。再次以16000xg将样品 在4°C下离心7分钟。弃去上清，并将沉淀风干数分钟。将沉淀重悬在70 μ 1脱磺化缓冲液(Xceed试剂5，Methyleasy Xceed试剂盒， Human Genetic Signatures，悉尼，澳大利亚)并在PCR仪中在76°C下脱磺化0-15分钟。将RNA冷却，随后向2 μ 1预混母液中添加11 μ 1 RNA，其中，对于每份反应，预混母 液包含以下成分1 μ 1 IOmM dNTPS ；1μ 1 随机 H 引物(300ng/y 1)。将样品在65°C下加热5分钟，然后在冰上放置至少1分钟，随后添加7 μ 1预混母
液，对于每份反应，预混母液包含以下成分 将样品混合，并进行如下的逆转录25°C 2分钟，27°C 2分钟，29°C 2分钟，31°C 2 分钟，33 0C 2分钟，35 0C 2分钟，37 °C 30分钟，45°C 10分钟，50 °C 10分钟，70 °C 5分钟，随后在15°C浸泡。取出5μ1 cDNA用于PCR分析，每份反应包含以下37. 5 μ 1 Promega 预混母液1. Ομ 1 Fl 引物(lOOng/μ 1)1. Ομ 1 RO 引物(lOOng/μ 1)5. 5 μ 1 7jC循环条件如下 使用以下装置PCR仪是ThermalHybaid PX2 (悉尼，澳大利亚)，凝胶记录系 统是 Kodak UVItec EDAS 290 (Rochester NY)，微离心机是 Eppendorf5415_D (Brinkman Instruments ；Westbury NY)。RNA 分离使用2%预制的琼脂糖凝胶(Invitrogen)。将目标RNA样品或RT-PCR产物直接 上样到平板的孔中，并使用mother-base (Invitrogen)解析凝胶。RNA的亚硫酸氢盐处理下文列出了证明本发明亚硫酸氢盐处理效果的示例性方法。此方法成功地回收了几乎所有的经处理RNA。应理解，可改变样品或试剂的体积或量。将终体积为20 μ 1的RNA在80°C下加热2分钟，以使存在于目标分子中的任何二 级结构变性。可使用在高于50°C的温度下温育以改进二级结构的变性效率。疑似具有高度 二级结构的分子可能需要较高的温度以在亚硫酸氢盐处理之前去除所有的结构。在一些情 况下，可以不必在处理前对RNA进行热变性。RNA变性可以在从约37°C至约90°C的任何温 度下进行，并且其持续时间可在约5分钟至约8小时之间变化。温育后，依次加入208 μ 1 3Μ偏亚硫酸氢钠(5. 6g，在含500ml IONNaOH的IOml 水中；BDH AnalaR#10356. 4D ；新鲜制备)和 12 μ 1 IOOmM 醌醇(0. 55g，在 50ml 水中，BDH AnalR#103122E;新鲜制备)。醌醇是还原剂，并有助于减少试剂的氧化。也可以使用其它 还原剂，例如由于已知二硫苏糖醇(DTT)抑制核糖核酸酶的作用，因此特别有用。用200 μ 1 矿物油覆盖样品，或在热盖热循环器内的0.2ml PCR管中进行。矿物油的覆盖可以阻止试 剂的蒸发和氧化，但却不是必需的。随后将样品在70°C下温育20分钟。一般而言，亚硫酸 氢盐处理可以在从约50°C至约90°C的任何温度下进行，并且其持续时间可在约5分钟至约 180分钟之间变化。在偏亚硫酸氢钠处理后，除去矿物油，并且如果DNA浓度低或有利于沉淀后沉淀 物的可视化，则加入Ιμ tRNA(20mg/ml)或2μ 1 glycoblue。这些添加剂是任选的，特别 是在RNA以低浓度存在时，所述添加物可以用于通过其与靶RNA的共沉淀而提高RNA的产
40x量。当核酸的量小于0. 5 μ g时，通常期望使用添加剂作为载体以更有效地沉淀核酸。异丙醇净化处理的实施如下向样品中加入800 μ 1水，混合，随后加入Iml异丙 醇。用水或缓冲液将反应容器中亚硫酸氢盐的浓度降低至盐不与靶核酸一起沉淀的水平。 如本文公开，稀释度通常为约1/4至1/1000，只要盐的浓度被稀释至低于所期望的范围。再次混合样品，并在4°C下静置至少5分钟。沉淀步骤可保持5分钟至数小时的任 意时间段，但优选使样品沉淀1小时或更少。样品在微量离心机中离心10-15分钟，并将沉 淀物用70% -80%的乙醇洗涤1-2次。该洗涤处理可清除与核酸一起沉淀的任何残余盐。将沉淀物干燥后重悬在合适体积(例如50 μ 1)的TE (IOmM Tris/0. ImMEDTA)中， 或pH 7.0-11.5的其他缓冲液中。现已发现pH 11.5的缓冲液对于TE尤其有效，不过在 使用其他缓冲液时，较低的PH也是有效的。如果需要悬浮核酸并使其脱磺化，将样品在 20-90°C下温育约1-30分钟。对PC3细胞和PCR扩增敏感性的分析使PC3细胞培养物在标准条件下生长至90%汇合。用胰蛋白酶处理细胞， 清洗，随后使用血球计进行计数。随后根据需要稀释细胞。按照厂商的描述，使用 Trizol (Invitrogen)裂解细胞，随后使用上述磺化方法修饰RNA。随后，在0.2ml PCR管中将RNA按照以下比例稀释在10μ 1 Τ/Ε (pH 8. 0)中 1/100、1/1000、1/10000和1/100000。按照上述方式将RNA扩增40个循环。pH、时间和温度对经亚硫酸氢盐处理的RNA降解的影响如图1可见，温度和pH越高，RNA降解的可能性就越大。经亚硫酸氢盐处理的DNA 的正常脱磺化温度是95°C，处理30分钟，并且由图1可见，即便在90°C下处理15分钟，也导 致RNA样品完全降解，以至于使该材料无法用于下游的应用，例如PCR。为了生产精确量化 的RNA以用于如病毒负载量监测的应用，必须避免起始材料的显著降解。RNA在自然界中的 降解是随机的，因此这种随机性将影响样品间的差异，并且导致病毒负荷量评估不准确，而 这将在患者的治疗方案方面产生严重的后果。由图1可见，即便在70°C，也可以在温育15 分钟后观察到RNA显著降解，这表明应当缩短在此温度下脱磺化的时间，以使对RNA的破坏 最小化。除使用高PH脱磺化缓冲液(pH 12)的情况下之外，在60°C下的整个实验过程中， 基本没有观察到任何样品降解。因此，这些结果表明在使用TE作为脱磺化缓冲剂时的最佳 时间/pH和温度范围应为约60°C -70°C或更低，并使用11. 5或更低的pH，反应少于15分 钟。时间和温度对使用HIV RT进行经亚硫酸氢盐处理的RNA的RT-PCR扩增的影响图2和图3显示只要使用HIV RT获得相对大量的起始材料，即可扩增经亚硫酸氢 盐处理但没有任何显著脱磺化的RNA。然而，在此实施例中，当起始材料的量减少时，至少需 要脱磺化1分钟以产生最佳信号。此外，由数据(参见图2和图3)明显可见，某些RNA逆转录酶(RT)似乎比其DNA 聚合酶对应物“随意”得多，如为了扩增经亚硫酸氢盐处理的DNA，通常需要在80°C脱磺化 至少20分钟或更长的时间，以产生任何扩增的经亚硫酸氢盐处理的DNA。然而，对于逆转录 酶，只要目标浓度相当高，即可扩增未经任何脱磺化的RNA(参见图2和图3)。这表明逆转 录酶具有通读RNA分子上的大损伤例如磺酸基团的能力，而DNA上的磺酸基团似乎构成阻 塞物，从而当聚合酶到达该损伤时，阻止其复制经处理的DNA。因此，在将RT酶用于从经亚硫酸氢盐处理的RNA复制DNA链时，RT酶的这种尚不为人所知的性质特别有利，因为RT酶 提高了在某些情况下完全避免脱磺化步骤的可能性。由图1可见，由于需要高PH和高温以 除去磺酸基团，所以脱磺化步骤导致了经亚硫酸氢盐处理的RNA的最大破坏，因此，此步骤 的去除不仅节省了时间，而且将非常有利于减少或防止RNA降解。时间、温度和脱磺化缓冲剂的pH对经亚硫酸氢盐处理的RNA的RT-PCR扩增的影 响图4、5和6证明，经亚硫酸氢盐处理的RNA的有效脱磺化不仅依赖于温度、时间 以及缓冲剂的PH，而且还依赖缓冲剂的组成。因此，对于不同的缓冲剂，NaHC03*CAPS，在 40°C脱磺化5分钟时，用于相同样品脱磺化的最佳pH分别在pH 8. 7-11. 5之间变化(图5)。 对于TE缓冲剂，提高温度导致使用较低pH获得有效的脱磺化(图4)，而IOOmM NaHCO3可 用于在宽PH范围内对RNA进行脱磺化(图6)。本发明的特别特优点在于，证实了对极少量经亚硫酸氢盐处理的RNA，例如1-10IU HCV RNA(等价于约15-150阿克RNA)的扩增，由此证实RNA没有明显降解。此前从未在如 此低水平附近验证亚硫酸氢盐处理和随后的RNA检测。因此，根据RNA样品和所需的试验 设计，可使用PH不同的多种缓冲剂，并在不同的时间和温度下进行脱磺化。使用RNA的脱磺化反应条件的实时PCR分析图7显示了在低pH(10.5)条件下，甚至在高温(86°C )下，仅在逆转录和PCR前使 用TE缓冲剂脱磺化至少20分钟后才能产生最佳扩增曲线。然而，当pH提高至11. 5并降 低温度时，这实际上显著改进了 cDNA的扩增效率，并且在仅脱磺化5分钟后便没有明显的 扩增差异。结果显示了使用单轮一步式逆转录酶PCR对RNA进行的亚硫酸氢盐处理。在40 个PCR扩增循环后，使用基因特异性引物进行逆转录。通过在反应物中掺入Syto 9以测量 荧光。可见使用PH 11.5/76°C，可仅进行少到5分钟的脱磺化。由于现有技术认为pH提高 对RNA有害，所以这一发现非常令人惊奇。此试验的结果表明，在优化条件下RNA的实际脱 磺化非常迅速地发生。图8表明，在亚硫酸氢盐处理和脱磺化的最佳条件下，扩增经亚硫酸氢盐处理的 RNA产生与野生型RNA相同的扩增信号，说明改进的亚硫酸氢盐方法几乎没有造成输入RNA 损失。图8的结果显示了使用一系列稀释的输入RNA，并使用单轮一步式逆转录酶PCR对 RNA进行的亚硫酸氢盐处理。在40个PCR扩增循环后，使用基因特异性引物进行逆转录。 通过在反应物中掺入Syto 9以测量荧光。结果显示，当脱磺化时间减少至仅5分钟时，此 反应没有任何敏感性损失。此外，稀释研究显示，与未经处理的RNA相比，RNA的亚硫酸氢 盐处理没有导致任何敏感性的显著损失。在亚硫酸氢盐处理期间使用固相支持物图9显示在RNA的亚硫酸氢盐处理期间可使用不同的固相支持物。使Acrometrix HCV RNA 与来自三个不同供货商(Chargeswitch，Invitrogen ；Genemag, Chemicell;和 Magmax, Ambion)的磁珠结合，在保持与珠结合的同时进行亚硫酸氢盐处理，清洗以除去过 量的亚硫酸氢盐试剂，然后在单个步骤中进行洗脱和脱磺化，随后使用iScript逆转录酶 (Biorad)进行逆转录并随后进行PCR扩增。三种类型的珠中有两种在此实施例中有效，因此与亚硫酸氢盐处理相容并保持其RNA结合能力。在此方法中还可使用其他相容的支持 物，例如柱。使用固相支持物能够使此方法自动化和/或缩短时间，以获得与基于沉淀的 方法相比的结果。根据需要，可在此方法的任何时间点或整个方法过程中，如果需要也包括 PCR扩增过程中，将经处理的RNA与所述固相支持物结合。与商用亚硫酸氢盐试剂盒的比较使用4种主要的商用亚硫酸氢盐转化试剂盒来对HCV RNA的亚硫酸氢盐转化进行 比较，并将所得结果与本发明的方法(本文称作'HGS'法)比较。纯化Acrometrix HCV RNA，并且使用本文公开的HGS方法，或者根据厂商的说 明(表1)使用甲基SEQr亚硫酸氢盐转化试剂盒(Applied Biosystems, cat#4374960)、 Methylamp_96DNA 修饰试剂盒(Epigentek，cat#P_1008)，EpiTect 亚硫酸氢盐试剂盒 (Qiagen,cat#59104)或 EZ DNA 甲基化引导试剂盒(Zymo Research, cat#D5020)对 10，000 个拷贝、5，000个拷贝、1，000个拷贝、500个拷贝、100个拷贝、50个拷贝、20个拷贝和0个 拷贝进行亚硫酸氢盐转化。在脱磺化和/或洗脱后，按照本文公开的方式进行RNA的逆转录。使用设计用于 特异扩增亚硫酸氢盐转化HCV的两套不同引物组，通过PCR扩增20μ 1总cDNA中的Iy 1。 因此，在PCR中，每个反应有500、100、50、10、5、2. 5、1和0个拷贝的HCV。由图10所清楚显 示的，HGS法是有效保留所有HCV或允许有效扩增HCV的唯一方法。表1-亚硫酸氢盐转化和脱磺化条件
结论对于经亚硫酸氢盐处理的DNA，通常在至少80°C的温度下将样品脱磺化至少20分 钟或以上，以产生任何显著的扩增。然而，各种逆转录酶的情况与此相反，只要目标的浓度 相当高，逆转录酶能够扩增未经任何脱磺化的RNA(参见图2和图3)，或者在起始RNA浓度 较低时，仅进行低至5分钟的脱磺化(参见图4、5和6)。随后，无需任何后续处理即可使用 常规方法通过PCR进一步扩增将所产生的cDNA。从这些结果可见，某些逆转录酶在扩增经 亚硫酸氢盐处理的核酸方面比其DNA聚合酶对应物有效得多。这以及优化的转化和脱磺化 条件意味着能够有效地进行RNA的亚硫酸氢盐转化，由此显著改进此方法在转化过程中保 持RNA分子完整性的能力，从而使任何基于RNA的测定获得较好的敏感性。本领域技术人员可以理解，在不偏离广泛阐述的本发明的精神或范围的前提下， 可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种改变和/或改进。因此，在所有方面考虑，本 发明的实施方案都是说明性的而非限制性的。
权利要求
亚硫酸氢盐处理RNA的方法，所述方法包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在50-90℃下反应5-180分钟以形成经处理的RNA；和回收所述经处理的RNA。
2.如权利要求1所述的方法，包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在50-90°C下反应5-120 分钟。
3.如权利要求2所述的方法，包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在50-90°C下反应5_90分钟。
4.如权利要求3所述的方法，包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在50-90°C下反应5_60分钟。
5.如权利要求4所述的方法，包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在70°C下反应20分钟。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，进一步包括对所回收的RNA进行部分或完全 的脱磺化。
7.如权利要求6所述的方法，其中在最高达约pH11. 5的碱性pH下进行脱磺化。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中脱磺化在0-90°C的温度下进行1-30分钟。
9.如权利要求8所述的方法，其中脱磺化在20-50°C的温度下进行5-20分钟。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中回收大于70%的所述经处理的RNA。
11.如权利要求10所述的方法，其中回收大于80%的所述经处理的RNA。
12.如权利要求11所述的方法，其中回收大于90%的所述经处理的RNA。
13.如权利要求6-12中任一项所述的方法，其中回收大于70%的脱磺化的RNA。
14.如权利要求13所述的方法，其中回收大于80%的脱磺化的RNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中回收大于90%的脱磺化的RNA。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐试剂选自亚硫酸氢钠 或偏亚硫酸氢钠。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述回收步骤通过沉淀RNA或固相分 离而进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中回收步骤通过沉淀RNA而进行。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中至少一个步骤在固相支持物上进行。
20.如权利要求19所述的方法，其中处理、回收和脱磺化步骤在固相支持物上进行。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述固相支持物包括磁珠或柱。
22.如权利要求6-21中任一项所述的方法，其中脱磺化步骤在40°C的温度下进行。
23.如权利要求6-22中任一项所述的方法，其中脱磺化步骤进行5分钟。
24.如权利要求3-22中任一项所述的方法，其中脱磺化步骤在8.5-11. 5范围内的pH 下进行。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述pH为8.7、10. 5或11. 5。
26.如权利要求7所述的方法，其中使用碳酸氢钠、Tris-EDTA(TE)缓冲剂或N-环己 基-3-氨基丙磺酸(CAPS)缓冲剂获得所述碱性pH。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中待处理的RNA的量为0.5 μ g或更少。
28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中待处理的RNA的量为至少15-150阿克。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，还包括在反应步骤之前的变性步骤。
30.用于实施权利要求1-29中任一项所述方法的试剂盒，其包括含有试剂的容器和使 用所述试剂的说明书，所述试剂选自稀释剂、亚硫酸氢盐试剂和碱。
全文摘要
本发明涉及亚硫酸氢盐处理RNA的方法，所述方法包括使RNA与亚硫酸氢盐试剂在50-90℃下反应5-180分钟以形成经处理的RNA；和回收所述经处理的RNA。
文档编号C07B41/06GK101883747SQ200880118728
公开日2010年11月10日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月5日
发明者约翰·R·梅尔基, 道格拉斯·斯潘塞·米勒 申请人:人类遗传标记控股有限公司