人源抗h5n1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其应用的制作方法

专利名称：：人源抗h5n1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程抗体技术，具体涉及一种人源抗H5N1血凝素蛋白广谱中和性抗体，本发明还涉及该抗体在制备预防或治疗禽流感药物中的应用。
背景技术：
：高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。高致病性禽流感病毒H5N1自1997年发生18人感染6人死亡疫情以来，一直受到国际社会的高度关注，特别是自2003年以来高致病禽流感病毒H5N1动物疫情在亚洲已成地方性流行，并且已经蔓延到欧洲和非洲，人感染病例以及发生人感染病例的国家和地区不断扩大。高致病性禽流感病毒H5N1突破了种属屏障不仅对禽类带来巨大威胁，严重影响国家的经济发展，而且对人类健康也带来巨大的威胁，会不会由H5N1禽流感病毒导致一次流感大流行已引起全球的高度关注。流感病毒是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，基因组分为8个节段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA识别靶细胞表面受体并与受体相结合，具有与宿主细胞膜融合活性，能够诱导机体产生保护性中和抗体。由于HA基因突变而引起的HA抗原变异往往会导致免疫失败和变异毒株流行，流感病毒频繁并且持续的发生抗原性变异，目前缺乏有效的人用禽流感疫苗及治疗药物。作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制剂，中和性抗体在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此，研制特异性针对H5N1禽流感病毒的中和性抗体尤其是针对不同H5N1分离株具有广谱中和效应的抗体以用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻瘆病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内00%保护动物免受病毒攻击。已有研究表明通过局部注射人免疫球蛋白，Fab或F(ab，)2等形式单抗进行被动免疫获得较好的预防与治疗甲型人流感的效果(RamisseF,etal.ClinExpImmunol.1998,111(3):583-587;OkunoY,etal.JVirol.1994,68(1):517-520;MozdzanowskaK,etal.JVirol.2003,77(15):8322-8328.);关于H5亚型的抗体应用研究表明，抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白中和性抗体对小鼠有良好保护和治疗效果(SimmonsPC,etal.PlosMed.2007,4(5):0928-0936;HansonBJ,etal.RespirRes.2006,7:126-127.);在1918西班牙流感治疗中，已有用病人恢复期血清治疗获得良好效果的报道(LukeTC,etal.AnnInternMed.2006,145:599—609)，介于血制品容易污染，且来源非常有限，使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，而人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(AntibodyDrug)。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法，但缺乏特异性和均一性。继而建立的B淋巴细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),其特异性强，性质均一，易于大量生产。然而McAb多为鼠源性，鼠源McAb的异源性反应极大地限制了McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白(Vacciniaimmuneglobulin,VIG)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测均需花费大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。如同当初血源性疫苗向基因工程疫苗的转变，现在也急需用基因工程抗体替代血源性VIG,如通过嵌合抗体技术(Boulianne,G丄.etal.,1984;Morrison,S丄.etal.,1984)、人源化抗体技术(Jones,P.T.etal.,1986)、携带人单抗的转基因小鼠技术(Green,L丄.etal.,1994)、异体杂交瘤技术(James,K.etal.，1987)、噬菌体表面展示技术(Barbas，C.F.etal.,1991)等产生人源化抗体，现已成为国内外研究的重大方向，并正在逐步走向成功，所有一切都为本发明解决问题提供了新思路。
发明内容本发明的第一个目的在于提供一种人源抗H5N1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其活性片段。本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备预防或治疗禽流感药物或诊断试剂中的应用。本发明运用噬菌体表面呈现技术，从中国安徽某禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗禽流感病毒基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体分别命名为AVFluFabll和AVFluFab33。这两株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合高致病性禽流感病毒H5N1的功能性抗体。它们特异性识别H5N1高致病性禽流感病毒颗粒抗原，且均针对禽流感病毒血凝素蛋白HA,与禽流感病毒H5N1具有明显的免疫荧光反应(IFA)和酶联免疫(ELISA)反应，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能。AVFluFabll和AVFluFab33特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗高致病性禽流感病毒H5N1抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国安徽H5N1禽流感恢复期病人血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，AVFluFabll和AVFluFab33分别隶属于抗体重链家族VH4和VH3,抗体轻链家族VL2和VL1。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定发明中每个抗体的抗原结合特征和抗髙致病性禽流感病毒H5N1功能特征。决定每株中和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸详细序列及其比较结果如图1所示，图中"-"符号表示与第一行抗体序列相同的氨基酸，阴影部分为CDR区。AVFluFabll轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；AVFluFab33轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。编码AVFluFabll轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.l所示，重链可变区的基因序列如SEQIDNO.3所示。AVFluFab33轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.5所示，重链可变区的基因序列如SEQIDNO.7所示。应当理解，在不影响Fab抗体活性的前提下，本领域技术人员可对SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6或SEQIDNo.8所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列，例如在非高变区将具有类似性质的氨基酸进行替换，例如将SEQIDNo.2的第7位的Val替换为Ala。.此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述Fab段抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。进一步，本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够特异性识别H5N1表面抗原，具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。可将上述编码Fab抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。此外，可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗H5N1的全抗免疫球蛋白。在本发明的实施例中，将上述2株Fab抗体(AVFluFabl1、AVFluFab33)的轻链和重Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc并转染昆虫S巧细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现了全抗体的分泌型表达，得到全抗体AVFluIgGll和AVFluIgG33。利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、WesternBlot、流式细胞术及SPR亲和力测定对获得的全抗体进行功能鉴定，结果表明2株人源IgG全抗体(AVFluIgGl1、AVFMgG33)均特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素HA,其中AVFluIgGll识别线性表位，亲和力高达1.20xl(T"M;AVFluIgG33识别空间构象的表位，亲和力为l化xi(^M。利用血凝抑制试验和微量中和试验对全抗体进行功能鉴定，结果表明AVFluIgGll可以广泛有力地中和HA基因进化上属于Clade0,1,2的H5N1人禽流感病毒代表株；AVFluIgG33可交叉中和2005-2006年中国区分离的所有Clade2系毒株及其它同系国际毒株，对属于Clade0的代表株A/HongKong/156/97及Clade1的代表株A/Vietnam/1203/2004没有中和活性，其中血凝抑制试验结果与中和试验结果相一致。2株禽流感抗体对小鼠的保护性实验，结果表明2株抗体均具有保护性，并且在2.5mg/kg剂量对小鼠具有完全的保护性，其保护性具有剂量依赖性。利用多个真核表达系统分段表达安徽株HA,包括构建安徽株HA的2个亚基HA1和HA2杆状病毒重组质粒转染SF9细胞，以及构建HA1的N端和C端缺失突变体克隆转染293T细胞进行瞬时表达，利用免疫荧光IFA对2株抗体(AVFluIgGll、AVFluIgG33)所针对的抗原表位进行分析，初步将这2株人源单抗所结合的表位区域限定在HA第94~274位氨基酸之间。生物信息学分析H5N1禽流感毒株HA(94274)氨基酸序列，参考以前报道的H5亚型禽流感病毒HA的关键抗原位点及其三维结构，同时结合本发明WesternBlot及中和试验结果，推测可能的关键抗原位点，以安徽株HA1为骨架，对推测的关键氨基酸位点进行定点突变，通过IFA分析人源抗体与一系列HA突变体的结合活性，结果表明AVFMgGll识别的线性表位位于HA1上第116-123位氨基酸(IIPKSSWS),在266株人源毒株中的保守程度为96.2%~99.6%，其中llel16，Ilein,Pro118,Serl20Serl21,Trpl22和Serl23突变，会导致AVFluIgGll对安徽株HA抗原的结合活性消失或明显减弱。AVFhxIgG33识别的构象型表位由3个空间位点SiteI(11ell6,Ilell7,Trp122),SiteH(Glul26,Serl29)和SiteHI(Lysl52,Asnl55)共同组成，其中Ilell6、Ilell7、Trpl22是AVFluIgGll和AVFluIgG33共同识别的重叠表位。本发明运用噬菌体抗体库技术，成功地获得了2株两株具有广谱中和活性的特异性针对H5N1人禽流感病毒HA的高亲和力人源单抗；并在小鼠动物模型上验证了2株禽流感抗体的保护性效果。在国际上首次解析了人源抗H5N1禽流感病毒血凝素HA中和抗体表位，并首次结合三维结构分析我国毒株的特性，在空间结构上描述了分布于HA头部的抗原变异位点及与人体免疫有关的关键抗原决定簇。这一结果的获得为人禽流感的预防和治疗带来了希望，对HA进化乃至抗原漂移机制及疫苗免疫原的设计具有重要意义，不仅为设计新型表位疫苗及药物奠定基础，也为禽流感疫情监测提供理论指导。利用上述获得的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和高致病性禽流感病毒H5N1感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗由H5N1禽流感病毒引起的人禽流感的特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感。基于上述工程抗体基因及其直接或间接的基因产物，可制成喷雾型抗体制剂和注射型抗体制剂用于人感染H5N1高致病性禽流感的预防和治疗。图l显示的是抗禽流感病毒H5N1人源Fab抗体可变区基因的氨基酸序列比较；图2显示的是纯化后IgG的SDS-PAGE电泳图，其中M为分子量标准，1和2分别为AVFluIgGll和AVFluIgG33;图3显示的是抗禽流感病毒H5N1人源IgG单抗与禽流感病毒H5N1及其重组HA以及流感病毒H1N1、H3N2的免疫荧光反应结果；图4显示的是竞争型ELISA检测结果；图5显示的是WesternBlot分析抗原抗体结合特异性的结果；图6显示的是应用表面等离子共振技术测定抗禽流感病毒人源单抗AVFluIgGll亲和力的结果；图7显示的是应用表面等离子共振技术测定抗禽流感病毒人源单抗AVFluIgG33亲和力的结果；图8显示2株人源抗禽流感病毒单抗对小鼠的保护性评价。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例l材料和方法1.病毒、细胞、载体人源H5N1分离株A/Anhui/1/2005(GenebankaccessionnumberDQ371928),A/Guangxi/1/2005(DQ371930),A/Hunan/1/2006(FJ492879),A/Zhejiang/1/2006(FJ492880),A/Sichuan/1/2006(FJ492881),A/Fujian/1/2005(FJ492882),A/Fujian/1/2007(FJ492883),A/Guangdong/1/2006(FJ492884),A/Jiangxi/1/05(FJ492885),A/Xinjiang/1/2006(FJ492886),A/VietNam/1203/2004(AY818135),A/HongKong/156/1997(AF023709),A/Turkey/15/2006(EF619989),A/Indonesia/5/2005(EU146622)由中国疾病预防控制中心病毒病所及美国疾病预防控制中心提供。菌株为XLI-Blu(美国Stratagene);噬菌体表达载体为pComb3(40kb),由美国Scripps研究所馈赠；所用噬菌体为VCSM13(美国Invitrogene公司)。杆状病毒表达载体为pAC-L-Fc(德国PROGENPR3003)(Liang,M.F.，Stefan,D.,Li，D.X,,Queitsch,I"Li,W.,andBautz,E.F.BaculovirasexpressioncassettevectorsforrapidproductionofcompletehumajnIgGfromphagedisplayselectedantibodyfragments.JournalofImmunologicalMethods.247:119-130.),昆虫细胞Sf9及MDCK细胞来自美国细胞培养中心(ATCC)。纯化的杆状病毒系统表达重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)购自美囯蛋白科学公司(ProteinSciencesCorp.)。2.抗原制备2.1H5N1禽流感病毒抗原的纯化将H5N1禽流感病毒分离株A/Anhui/1/2005以100TCID5o感染7590%满的MDCK细胞，37。C吸附l2小时，吸附后用Hank's液清洗细胞，补加维持液液，放置于33~35°C培养箱培养，当75~100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融1~2次，离心收获上清，经甲醛灭活和安全检查后，将上清浓缩后缓慢加于30%~60%蔗糖垫层之上，40000g,4。C离心3h(BeckmanSW28)。收集乳白色病毒条带用PBS溶液重悬，于-70。C保存备用。2.2H5N1禽流感血凝素HA在昆虫杆状病毒表达利用流感室提供的H5N1禽流感病毒分离株A/Anhui/1/2005的cDNA为模板进行PCR扩增HA基因，引物用于克隆禽流感HA的引物HAF:5'-CGCGGATCCATGGAGAAAATAGTGCTTC-3';HAR:5'-CGCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGAATGCAAATTCTGCA墨3'，2端均引入BamHI酶切位点，并且在3'段添加6-His标签。纯化的扩增产物用BamHI酶切，将酶切后的片段回收，直接克隆到同样经BamHI酶切的杆状病毒表达载体pAcUW51中，使HA基因在多角体启动子的控制下，经PCR鉴定目的基因插入方向后，获得重组质粒为pAc-HA。通过将重组质粒转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白，表达采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下将5吗的重组质粒DNA与0.5ng的BaculoGold线性DNA混合混合后，利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为5(T/。的Sf9细胞，27。C培养4天后，收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定和扩增。具体操作见Baculovirusexpressionvectorsystem手册。3.噬菌体抗体库的构建用淋巴细胞分离液(美国Sigma)从安徽疫区禽流感病人恢复期抗凝血中分离淋巴细胞，用RNeasyMiniKit(德国QIAGEN)提取总细胞RNA,用Oligo-dT引物将提取的RNA采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMlIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR.CatNo.l8080-051)逆转录成cDNA,用一组扩增人源抗体IgGl重链Fd及轻链Kappa和Lambda的引物对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94°Cl分钟，54°Cl分钟，72。C2分钟，35个循环。上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化试剂盒QIAquickTMkit(德国QIAGEN公司)纯化后，获得650-700bp左右的Kappa、Lambda和Fd链PCR产物。建库方法参见文献Barbas,C.Fill"Kang,A.S.,andlamer,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982。将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacI/Xbal和XhoI/Spel克隆入噬菌体载体pComb3,将克隆入轻、重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10pl蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200pl电转菌XLI-Blu(电转条件为Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37°C1小时，力口入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液37。C培养1小时，加入80-100ml前述SB,37°C2小时后加入辅助噬菌体VCSM13lxio12,l小时后加入卡那霉素(7(^g/ml)，37。C摇床培养过夜。用4%PEG8000和3。/。NaCI沉淀噬菌体上清，经9000rpm,20分钟，4'C离心后，用2ml0.02MPBSpH7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20。C冰柜中。4.用于抗体库富集筛选的H5N1禽流感病毒抗原的制备在生物安全三级实验室生物安全柜中搡作，使用m级生物安全防护。扩增毒株为A/Anhui/1/2005(H5N1)，将病毒原液作梯度稀释为10",l(T2，l(T3，10，寺用。将生长状态良好的MDCK细胞(细胞贴壁达80%)倒出细胞生长液，用Hank氏液清洗细胞2-3遍。分别将不同稀释度的病毒稀释液lml感染MDCK细胞，35'C吸附lh,吸附完成后，用Hank氏液清洗细胞2-3遍，在培养瓶中加入维持液，至35'C培养。待感染细胞有70%-80%出现病变进行收获，收获之前将细胞冻融l-2次，收获上清，进行红细胞凝集试验(HA)测定血凝滴度。经甲醛灭活后，感染MDCK细胞，盲传三代确定已完全灭活，进行蔗糖垫层超速离心纯化。5.噬菌体抗体库的富集筛选筛选抗原为超速离心纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)和纯化的杆状病毒系统表达重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)，使用时用0.1MNaHC03(pH8.6)的溶液稀释，包被96孔酶标板。富集筛选方法基本按文献进行(Barbas,C.Fill"Kang,A.S.,andlamer,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegenefflsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982)，具体如下用0.1MNaHCO3(pH8.6)的溶液包被纯化的H5N1禽流感病毒抗原(1:200稀释)，每孔100W,4。C过夜；次日用lxPBST洗去未吸附的抗原，用4%的脱脂奶37'C封闭l小时，弃封闭液；每孔加入801噬菌体抗体库，37'C孵育2小时，弃去孔中未结合的噬菌体，用lx丁BST(50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.5%Tween20，pH7.5)洗液冲洗各孔，冲洗时，用带有吸头的移液器反复吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌体；最后用ddH20洗两遍，吸净孔中的液体；每孔加入5(HdGly-HCl(pH2.2)的洗脱液，室温孵育10分钟，期间反复吹打数次。加入适量的2MTris,以中和洗脱下来的噬菌体；将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜制备的XLI-Blu菌液中(OD60。=1),室温孵育15-20分钟；然后转入250ml三角瓶中，加入SBIOml(氨苄青霉素:20吗/ml，四环素10吗/ml),立即取10pl涂氨节青霉素平皿，以滴定噬菌体；三角瓶与37。C振荡培养1小时，加入IOOmlSB(氨节青霉素100g/ml),37tM小时后，加入辅助喧菌体VCSM13lml,37°C振荡培养2小时，加入卡那霉素(终浓度70g/ml)，37'C培养过夜。如此反复筛选4次。6.Fab段抗体的诱导表达人源中和性抗禽流感病毒H5Nl基因工程Fab抗体可溶性表达产物的制备基本按文献进行(Barbas,C.Fill"Kang,A.S.,andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrarieson■phagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982)，具体为将带有阳性抗体轻重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA,用SpeI和NheI切除载体中的gIII，变FdgIII融合蛋白为独立表达的蛋白，连接后转化XL1-Blu菌，从过夜生长的氨苄平皿中挑取单个菌落，接种SB或TB细菌培养液，当细菌长至006()0=0.2-0.3,加入lmMIPTG，在3(TC诱导表达10-12小时。收获细菌，离心后加入原培养液l/10体积的PBS(0.02MpH7.4)重悬，反复冻融三次，4°C12000rpm离心30分钟，上清即为表达的Fab抗体。备用于进一步的检测和鉴定。阴性对照为载体pComb3转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。7.人源抗H5Nl禽流感病毒Fab抗体的ELISA检测7.1Fab表达的检测用0.1MNaHC03(pH9.6)的溶液包被抗人Fab抗体(美国Sigma,1:2000稀释使用)，4'C过夜；4%脱脂奶封闭，37°Clh，加入表达的Fab抗体，37'Clh;加入酶标抗人Fab二抗(美国Sigma,1:2000稀释使用)，37°Clh;显色液显色，2MH2SCU终止反应，酶标仪检测吸光度A值。7.2间接酶联免疫法检测Fab与H5N1禽流感病毒及重组HA结合活性用纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)和重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)作为包被抗原，随后的步骤同上。8.人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析用QiagenMiniprepKit(德国QIAGEN)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻重链的测序引物分别为5'-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3'和5'-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3，。测序结果和InternetV-Base基因库中IgG基因序列比较。9.全抗体重组表达质粒的构建将获得的Fab抗体的轻链先用XbaI单酶切，然后用Klenow酶进行补平，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。再用Sacl对目的片段进行酶切，此时琼脂糖凝胶电泳中所见的大约700bp的片段即轻链片段。再次使用凝胶回收试剂盒回收轻链片段。pAC-L-Fc载体(德国PROGENPR3003)经SacI/EcoRV双酶切，用QIAGEN酶切回收试剂盒回收目的片段。轻链片段与pAC-L-Fc载体连接(常规连接方法)，转化XL1-Blue感受态细胞，挑取克隆pAC-L-L-Fc。重链片段的克隆对pComb3-Fab进行Xhol/Spel双酶切，琼脂糖凝胶电泳中除载体片段外可见一700bp左右片段，即重链片段，用凝胶回收试剂盒回收。pAC-L-L-Fc的处理Xhol/Spel双酶切质粒，QIAGEN酶切回收试剂盒回收目的片段。将回收的重链片段(约700bp)各2pl分别与2pl处理好的pAC-L-L-Fc连接，转化，挑取克隆，酶切、测序鉴定。10.转染和扩毒釆用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下将5吗的重组质粒DNA与0.5pg的BaculoGold线性DNA混合混合后，利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为5(T/。的Sf9细胞，27。C培养4天后，收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定和扩增。具体操作见Baculovirusexpressionvectorsystem手册。11.全抗体IgG分泌表达和纯化重组病毒感染生长密度70%左右的Sf9细胞，27。C吸附lh.改用SF-900IISFM无血清培养液，27。C培养35天后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清(HarlowE,LaneD."Antibodies:ALaboratoryManual".ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，l988.)。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式细胞术对所获对纯化的IgG抗体功能特性进行鉴定。具体操作如上。12.间接免疫荧光(IFA)检测H5N1禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)感染MDCK细胞，35。C培养约48小时，收获细胞，滴加至玻璃底片上，吹干，丙酮固定15mhi并干燥，制成病毒抗原片。同时利用已构建的表达禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重组杆状病毒感染Sf9细胞，4-5天后收获感染细胞制成重组HA抗原片。加入表达的IgG全抗体，37'C温育30min,冲洗，加入FITC标记的抗Fab抗体(美国Sigma),37。C温育30min,冲洗，晾干，显微镜下观察。13.Westernblot检测抗原分别为纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/05)、真核表达的重组禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)。阳性对照为禽流感病人恢复期血清，阴性对照为针对甲肝病毒人源单抗HAVIgG16。抗原进行SDS-PAGE电泳，半干法进行蛋白质的电转移，将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到NC膜。转膜后对凝胶进行考马斯亮兰染色以检査蛋白质是否转移完全。将分子量标准的泳道剪下，标出分子量标准的参照蛋白位置。对NC膜进行封闭，5%脱脂奶室温封闭2小时。一抗AVFMgGll，AVFluIgG33及HAVIgG16表达上清与抗原反应，阳性血清用封闭液1:10稀释与抗原反应，室温反应2小时。lxPBST洗涤3次后与HPR标记的抗人Fab(Sigma公司，l:500使用)室温反应l小时。lxTBST洗涤3次后放入DAB底物显液色中，至棕色阳性条带出现适时终止反应，避光保存。14.酶联免疫吸附试验(ELISA)14.1ELISA滴定纯化IgG全抗体抗原结合活性用0.1MNaHC03(PH9.6)的溶液分别包被纯化的安徽株H5N1禽流感病毒颗粒，4。C过夜。用PBS-T洗液洗板3次，充分去除液体，加入5%脱脂奶100M1,37。C温育lh。PBS-T洗液洗板3次，充分去除液体，加入用5%PBS-脱脂奶进行不同稀释的纯化IgG抗体lOOnI,37。C温育lh。PBS-T洗液洗板6次，充分去除液体，加入酶标抗人Fc抗体(Sigma公司，1:2000稀释使用)10(^1,37。C温育lh。PBS-T洗液洗板6次，充分去除液体，加入显色液A、B室温显色10min'2MH2S04终止反应，OD450读数。14.2竞争ELISA采用安徽株H5N1禽流感病毒颗粒作为包被抗原，根据上文中ELISA滴定纯化IgG全抗体的滴度，选择每孔加入4nglgG抗体作为一抗；不同稀释度的Fab抗体，分别为AVFluFabll,AVFluFab33及无关对照抗体H34作为竟争抗体，二抗为酶标抗人Fc抗体，具体搡作如上文3.3.1中所列。15.亲和力测定这里我们利用生物传感器BIAcoreTM1000测定2株人源单抗的亲和力，本发明使用纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/05)作为抗原偶联至生物传感芯片来测定AVFluIgG33的亲和力，而AVFluIgGll的亲和力则通过偶联重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)来测定。1)BIAcore1000的开启将CM5传感芯片模块按要求嵌入BIAcoreTMIOOO仪器(Dock);初始化(Prime)5min;0.5mlNormalizingsolution正常化(Normalize)5min。2)偶联抗原首先要进行Preconcentration-抗原，目的是选择一个合适pH值的NaAC(10mM)稀释抗原，使其在此条件下的偶联值能达到最高。然后将分别含有NHS、EDC、乙醇胺以及50吗/ml禽流感抗原(选择pH4.5NaAC稀释)的各100jul的小管置于BIAcore1000自动进样器架的适当位置，开动仪器，流动相为HBS-EPBuffer以5pl/min的流速流过样品池，仪器自动将75fil的NHS和75(_d的EDC加入到同一个空管中，混勾，注射70nL的NHS/EDC混合物(10(al/min)使芯片表面活化，之后注射抗原60^il(50ng/mL,10|al/min，6min)，使其通过氨基固定到传感片表面，偶联后用乙醇胺封闭，注射50mMNaOH洗掉表面未偶联的蛋白和乙醇胺。3)加入不同稀释度的单抗基线(baseline):流动相HBS-EPBuffer以5(al/min的流速流过偶联好的样品池，使其平衡至基线；结合(association):注入不同稀释度单抗(0—500nM,流速30^/min注入2min)结合至饱和；解离(dissociation):换HBS-EPBuffer,待单抗结合与解离达到平衡(解离约3min)。再生(regeneration):在注射不同浓度单抗溶解液前需快速注射10^120mMGlydne-HCl对芯片进行再生。回复基线更换为HBS-EPBuffer,再次回到基线，开始下一个循环测定。亲和常数用BIAcore附带软件BIAevaluation3.0计算。首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量，每份抗体或血清作8孔稀释，每孔用抗原25pl，那么测定一份需a2mL抗原。根据总共参与试验的抗体(2份AVFluIgGll和AVFluIgG33)或阴阳性血清(2份)的份数计算所需病毒抗原量为0.8ml。接下来计算病毒稀释度，用病毒红细胞凝集滴度(HA滴度)除以8，得到的商即为4个红细胞凝集单位的稀释度。同时需对新配制的4个凝集单位抗原进行复核滴定取50pl稀释好的抗原，用等量PBS作倍比稀释后加入50nl红细胞悬液，至室温孵育3060min后观察凝集结果。若只有前4孔出现凝集，表明50pl病毒含有8个凝集单位(即25pl中含有4个红细胞凝集)，则该病毒稀释准确。将待测2份单抗(AVFluIgGll和AVFluIgG33)及阴阳性血清(2份)从原液其进行倍比稀释8孔，每孔保留25pl，之后每孔各加入25pl待测病毒液(4个凝集单位的抗原)；混匀，至室温孵育1530min,然后每孔加入1%红细胞悬液50pl混勻，至室温孵育3060min,观察红细胞凝集抑制试验结果。结果判定当特定的抗体与相应的红细胞凝集素抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象，红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。17.微量中和试验将人源抗禽流感病毒IgG纯化抗体(AVFMgGll，AVFluIgG33)及阴阳性对照血清过滤除菌作系列稀释后，与100TCID50的H5N1禽流感病毒50nl以l:l混合，放37。C温箱作用2小时。选择8孔进行病毒回滴，将病毒作系列倍比稀释，使之成为100TCID50,50TCID50,...0.7。设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将MDCK细胞与100TCID50病毒进行混合培养；设立4个重复孔为阴性细胞对照，即将细胞与稀释缓冲液混合培养。加100pl细胞液U.5xl04)于含有病毒-抗体(血清对照)混合物以及倍比稀释病毒回滴工作液的微量板中，37。C温箱孵育18-22小时。弃去微量培养板中的细胞液，PBS洗细胞一次，加入100nl/孔固定液，于室温固定细胞10分钟，弃固定液，室温干燥。ELISA检测中和抗体滴度PBS洗去残留丙酮，加入一抗(抗流感病毒和蛋白-NP单克隆抗体)室温作用l小时，PBS洗涤培养板4次，加入稀释好二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG)室温作用l小时，洗板6次，每孔加入OPD底物IOO^tl(10mgOPD+20ml柠檬酸缓冲液+10^d130%双氧水，即用即配)。室温10分钟显色，1M硫酸终止，记录490nm每孔OD。结果判定(细胞阳性对照平均OD值-细胞阴性对照平均OD值)/2+细胞阴性对照平均OD值=XX二细胞半数感染域值，每孔OD值低于X值时，判定中和试验反应阳性，中和反应阳性的抗体最高稀释度即为中和抗体滴度。18.动物保护试验8周龄雌性小鼠分别腹腔接种0.5ml不同浓度计量的纯化抗体(AVFluIgGll，AVFluIgG33)包括0.025mg/kg,0.25mg/kg,2.5mg/kg;阳性对照组注射越南株血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)的高免兔多抗血清；阴性对照組为纯化人IgGl型抗体(Sigma,Missouri,USA),每组5只，每批分别腹腔注射。被动免疫24小时后，用禽流感病毒安徽株(AH/1/05)50u^lOLD50(=104MID50;1055EID50)的感染计量攻击小鼠，连续21天观察并记录小白鼠发病，体重及死亡状况，测定其保护率。19安徽株H5N1禽流感病毒HA的分段及突变表达为了鉴定2株人源单抗与HA抗原结合的表位，利用流感室提供的H5N1禽流感病毒分离株A/Anhui/1/2005的cDNA为模板进行PCR扩增HA1、HA2及其缺失基因。引物如表3-l中所列(本文通篇有关H5N1血凝素HA的编号均为成熟HA蛋白的编号，不包含前16个氨基酸的信号肽)，分别以N端和C端为基点对HA1进行缺失突变，其中N端缺失33aa，103aa,133aa，203aa共4段，其克隆分别命名为HA1N34，HA1画,HA1N134,HA1N2Q4;C端(包括并从第322位起)分别缺失至第274,234,194，146及94位氨基酸,其克隆命名为HAlcm,HA1C274,HA1C234，HA1C194,HA1C146，HA1C94。将以上扩增的PCR产物纯化酶切，克隆至各自相应的表达载体中(如表l)，克隆均转化Eco//DH5oc,提取质粒，经酶切、测序鉴定。重组质粒分别转染昆虫细胞及293T细胞，经间接免疫荧光(IFA)检测人源单抗与分段及突变表达HA的结合活性。20.安徹株H5N1禽流感病毒HA1的定点突变20.1生物信息学分析可能的HA抗原位点本文利用DNASTAR软件中的MegAlign程序(DNASTARInc.,USA)对涉及中和试验及血凝抑制试验的进化上属于Clade0,1，2的代表毒株的HA氨基酸序列进行了分析比对，根据上文通过分段表达HA确定人源单抗与HA结合的最小区域为94~274aa,参考以前报道的H5亚型禽流感病毒HA的关键抗原位点及其三维结构，同时结合本发明WestemBlot及中和试验结果，我们着重分析了这一区域(94~274aa)在以上CladeO，1,2各代表毒株间存在的关键抗原变异位点，由于这些变异位点的存在可能引起个别毒株对人源中和抗体(AVFluIgG11,AVFluIgG33)产生逃逸的，进而推测人源单抗(AVFluIgGll，AVFluIgG33)可能针对的关键抗原位点。经过生物信息学及前文中相关研究数据(WB，MNT,HI)等综合分析，本文以安徽株HA1为模板，对上述分析获得的关键氨基酸位点的进行突变，而突变氨基酸的选择我们遵循以下分析通过分析流感病毒数据库中收录的266株人源H5N1禽雍感病毒HA的上述分析获得的关键区域氨基酸序列(InfluenzaVirusResourcehttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html),除了高度保守的氨基酸位点，每个被选定的关键氨基酸都被突变成禽流感毒株中相应位置出现的变异氨基酸，其中主要考虑本文参与中和试验的Clade0，1,2代表毒株及其出现的变异；而高度保守的氨基酸位点则突变成为甘氨酸(Gly)。20.2安徽株H5N1禽流感病毒HA定点突变克隆构建采用重叠延伸PCR方法，引物设计方案如下，HA1编码区上游引物含起始密码子和BamHI酶切位点，为CF:5'-CGCGGATCCATGGAGAAAATAGTGCTTC-3';下游引物含终止密码子和Xhol酶切位点，C1R:5'-CCGCTCGAGTTATAGAGGACTATTTC-3'(见表1)。突变引物中含有定点突变氨基酸的编码序列，其上、下游突变引物序列彼此重叠且互补，见表2。按照文献记载的重叠延伸PCR法进行，具体参见文献[HoSN，HuntHD,HortonRM,PullenJK,PeaseLR.(1989)Site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction.Gene77:51-59.]。纯化突变HA1PCR产物，经BamHI/XhoI双酶切后，直接克隆到pCDNA3.0质粒中。对重组克隆进行双酶切及测序鉴定。重组质粒转染293T细胞，经间接免疫荧光(IFA)检测人源单抗与定点突变表达HA的结合活性。21非高变区突变后的抗体对H5N1抗性的研究基于AVFluIgGl1轻链可变区氨基酸序列，将SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第7位的Val替换为Ala，将SEQIDNo.4重链可变区的第12位的Glu替换为Gln。分别合成AVFluIgGll的轻链编码核酸序列(在相应位置将密码子gtg替换为gcc)以及重链编码核酸序列(在相应位置将密码子gag替换为cag)。按照上述917的方法，将轻链基因和重链Fd段克隆到pAC-L-Fc中，并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，并对该突变体进行免疫学检测。结果1.人源抗H5N1禽流感病毒抗体库的富集筛选用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)对噬菌体抗体库进行富集筛选，经3轮筛选后随机挑取384个克隆。用抗人Fab抗体(sigma公司，1:2000稀释使用)、H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)抗原和越南株重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)包被96孔板，加入待测样品上清，用酶标抗人Fab二抗(Sigma公司，l:2000稀释使用)进行ELISA检测。结果显示共获得245株人源Fab表达阳性克隆。在245株人源Fab表达阳性克隆中，有142个克隆对安徽株禽流感病毒的ELISA检测为阳性；同时还有68株Fab克隆对越南株血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)的ELISA检测为阳性，因此本发明获得的142株对安徽株禽流感病毒特异性结合的抗体中，有68株同时针对越南株HA反应为阳性。2.人源抗H5N1禽流感病毒Fab抗体的序列分析用DNASTAR序列分析软件进行分析处理，比较InternetV-Base基因库中的IgG序列，上述142株对安徽株禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)特异性结合人源Fab单抗中，其中68株与越南株重组HA(A/VietNam/1203/2004)也反应的Fab克隆为同一抗体基因序列，本文命名为AVFluFabll;其余74株为另一相同抗体基因序列，命名为AVFluFab33。因此本发明成功筛选并克隆2株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体，其重链可变区主要分类在IgGVH4和VH3家族，其轻链可变区主要分类在IgGVL2和VL1家族。2株人源Fab抗体的可变区基因的氨基酸序列及其相互比较如图l所示，"-"符号表示与第一行抗体序列相同的氨基酸，阴影部分为CDR区。3.全抗体IgG表达和纯化将2株已完成功能鉴定Fab抗体(AVFluFabll、AVFluFab33)的轻链和重Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清，通过SDS-PAGE检验全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，分别位于约28KD、55KD处，如图2所示。4.间接免疫荧光鉴定人源IgG抗体对H5N1禽流感抗原的结合特异性为了证实所获得的人源IgG抗体对禽流感病毒H5N1的结合特异性，本发明进一步通过间接免疫荧光试验UFA)鉴定全抗体的功能活性。结果表明，2株人源IgG抗体(AVFluIgGll和AVFMgG33)与安徽株禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)及其重组HA免疫荧光均为阳性，与甲1型人流感病毒A/Hubeihs/53/2005(H1N1)及甲3型人流感病毒A/Yunnan/1145/2005(H3N2)免疫荧光均为阴性，如图3所示。免疫荧光结果证明从抗体库筛选获得的阳性克隆均针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA,而与甲l型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗。5.竞争ELISA釆用安徽株H5N1禽流感病毒颗粒作为包被抗原，选择每孔加入4nglgG抗体作为一抗；加入不同稀释度的Fab抗体，分别为AVFluFabll，AVFluFab33及无关对照抗体H34作为竞争抗体，同时选择加入PBS为空白对照，即不加竟争抗体的情况下此OD值为最大结合，二抗为酶标抗人Fc抗体。结果如图4所示，随着竟争抗体AVFluFabll,AVFluFab33浓度增加，这2株IgG抗体AVFluIgG11，AVFluIgG33与抗原的结合率降低，而对照Fab抗体(H34)的加入则对这2株IgG抗体无影响，说明这2株抗体之间存在部分的竞争，其所针对的表位可能有部分的重叠。6.Westernblot检测本发明选择的抗原分别为纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/05)、杆状病毒表达的重组禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/05)。阳性对照为禽流感病人恢复期血清，阴性对照为针对SARS病毒人源单抗SARS58。如图5所示，AVFluIgGll与天然灭活的安徽株禽流感病毒HA及重组表达安徽株禽流感病毒HA均有反应，与病人血清结果一致，出现的目的条带分别为天然灭活病毒HA约62kD,重组HA70kD左右；而AVFluIgGll与以上两种抗原均不反应阴性；对照均未出现非特异反应(结果未列出)。证明2株特异结合H5N1禽流感病毒HA蛋白的人源单抗中，AVFluIgGll针对可能针对线性表位，而AVFluIgG33可能针对构象型表位。7.亲合力测定本发明使用纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/05)作为抗原偶联至生物传感芯片来测定AVFluIgG33的亲和力，而AVFluIgGll的亲和力则通过偶联重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)来测定，亲和常数用BIAcore附带软件BIAevaluation3.0计算，如图6,图7所示。AVFluIgG11针对重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)的结合常数(K。)和解离常数(Krf)分别为l^xloV^S-1与2.30xlO-7S"，由此计算出AVFluIgGll结合抗原亲和力达到皮摩尔级，即Kfl.20xlO-"M。同时，本发明使用纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/05)作为抗原偶联至生物传感芯片来测定AVFMgG33的亲和力，其结合常数(K。)和解离常数(Krf)分别为5.02xl04M"S-1与1.75x10-48、由此计算出AVFluIgG33结合抗原亲和力达到纳摩尔级，即KD=3.49xlO—9M,由此可见2株人源抗H5N1禽流感病毒单抗均具有很高的亲和力，见表l。表1.抗禽流感病毒人源抗体针对越南株rHA及安徽株病毒颗粒的亲合力测定<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>8.血凝抑制试验(HI)选择分属禽流感病毒CladeO,Cladel，Clade2.1，Clade2.2,Clade2.3的多株代表毒株及对照H1N1，H3N2参与血凝抑制试验，分析获得的2株人源单抗针对不同毒株的交叉反应性，结果表明，AVFluIgGll和AVFluIgG33与对照普通流感病毒A/Wyoming/3/03(WY/3/03)及A/NewCaledonia/20/99(NC/20/99)均无血凝抑制活性。AVFluIgGll对本发明所选择的Clade0，Cladel,Clade2三个引起人H5N1禽流感的主要进化支系的毒株均有血凝抑制活性，引起各毒株发生血凝抑制所需的最低抗体范围约在1.63.1itig/ml之间(见表2)。AVFluIgG33对Clade0的代表株A/HongKong/156/1997及Clade1的代表株A/VietNam/1204/2003均无血凝抑制活性，这一点与ELISA结果相一致，即AVFluIgG33与越南株A/VietNam/1204/2003不反应；而AVFluIgG33对Clade2的所有毒株，包括Clade2.1,Clade2.2,Clade2.3均具有血凝抑制活性，其中Ciade2.3主要是从中国分离的人源H5N1毒株，从表2中所列数据可以看出，AVFluIgG33对亲本株A/Anhui/1/2005的血凝抑制活性最高(0.8ng/ml)，引起其它Clade2毒株发生血凝抑制所需的最低抗体范围约在1.63.1|ig/ml之间。表2人源抗体对不同H5N1毒株的血凝抑制活性A型流感病毒亚型遗传进化枝浓度Og/ml)aAWluIgGllAVFluIgG33HK/156/97H5N101.6>250雨l203/04H5NIf1.6〉250Indo/5/05H5N12.13.13.1Turkey/15/06H5N12.21.63.1XJ/1/06H5N12.23.13.1AH/1/05H5N12.31.60.8GX/1/05H5N12.31,61.6FJ/1/05H5N12.33.11.6JX/1/05H5N12,33.11.6SC/1/06H5N12.33.11.6A/Fujian/1/07(FJ/1/07)H5N12.3L63.1A/Wyoming/3/03(WY/3/03)H3N2NAb>250〉250A/NewCaledonia/20/99(NC/20/99)H1N1NA>250>2509.微量中和试验(MNT)本发明首先分析了人源抗体对中囯不同H5N1毒株的中和活性(见表3),除了A/Xinjiang/1/06，这些中国分离株主要集中于Clade2.3,结果表明，除A/Guangdong/1/2006夕卜，AVFluIgG11能够广泛地中和所有中国分离毒株，AVFluIgGl1对各株病毒(1OOTCID5o)中和效率达50%时的滴度范围主要在1.3~5.2lig/ml之间；AVFluIgG33可以广泛中和所有的中国分离株，尤其是针对Clade2.3的中国分离株表现出高的中和效率，滴度范围主要在0.83.1pg/ml。_表3人源抗体对中国不同H5N1毒株的中和活性_病毒遗传进化枝浓度(吗/ml)AVFluIgG11AVFluIgG33A/Xinjiang/画(XJ/1馬)2.21.312.5A/Anhui/1/05(AH/1/05)2.31.30.8A/Guangxi/1/05(GX/1/05)2.32.63.1A/Fujian/1/05(FJ/1/05)2.32.61.6A/Sichuan/1/06(SC/1/06)2.35.20.8A/Hunan/1/06(HN/1/06)2.31.30.8A/Zhejiang/1/06(ZJ/1/06)2.35.23,1A/Guangdong/1/06(GD/1/06)2,3>5001.6本发明进一步分析了人源抗体对中国及其他国家不同H5N1毒株的中和活性(见表4)，结果表明，AVFluIgGll能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade0，Clade1，Clade2.1,Clade2.2，Clade2.3的所有毒株，AVFluIgGll对各株病毒(100TCID5。)中和效率达50%时的滴度范围主要在0.40.8吗/ml之间；AVFluIgG33虽然不能中和Clade0的代表株A/HongKong/156/1997及Clade1的代表株A/VietNam/1204/2003;但是AVFMgG33对Clade2的所有毒株，包括Clade2.1，Clade2.2,Clade2.3均具有中和活性，其中Clade2.3主要是从中国分离的人源H5N1毒株，遍布中囯南方(A/Guangxi/I/2005、A/Fujian//2005)、北方(A/Xinjiang//2006)及中部地区(A/Anhui/1/2005、A/Hunan/1/2006、A/Zhejiang/1/2006、A/Sichuan/1/2006)。上述中和试验结果与血凝抑制试验结果是相符的，表明本发明获得了2株特异性针对H5N1禽流感血凝素HA的具有广谱中和活性的高亲和力人源单抗。_表4人源抗体对中国及其他国家不同H5N1毒株的中和活性_病毒遗传进化枝.浓度(pg/ml)__AVFluIgGll_AVFluIgG33A/HongKong/156/97(HK/156/97)00.4〉500A/VietNam/1203/04(VN/1203/04)10.8>500A/Indonesia/5/05(Indo/5/05)2.112.56.3A/Turkey/15/06(Turkey/15/06)2.20.46.3A/Anhui/1/05(AH/1/05)_^__^_10.动物保护试验2株人源抗禽流感病毒单抗对小鼠的保护性试验结果表明，2株抗体均具有保护性，并且在2.5mg/kg剂量对小鼠具有完全的保护性，其保护性具有剂量依赖性，如图8所示。11.非高变区突变后的抗体对H5N1抗性影响按照上述9~17的方法，将基于AVFluIgGl1修改后的轻链基因和重链基因克隆到pAC-L-Fc中，并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，得到突变体AVFhiIgGll'。对该突变体进行免疫学检测，间接免疫荧光实验表明AVFluIgGU，能特异性针对H5Nl禽流感病毒血凝素蛋白HA，而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应，亲和力实验、血凝抑制试验、微量中和实验以及动物保护试验表明其性质与AVFluIgGll基本相同。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage21</image>AspSerGlySerThrLysTyrAsnProSerLeuThrSerArgValThr505560lieSerValAspThrSerLysAsnGinPheSerLeuLysLeuSerSer65707580ValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGlyPheTrp859095GlyLeuAspGlyPheA印lieTrpGlyGinGlyThrThrValThrVal100105110〈210〉5<211>321<212>DNA<213〉人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400>5g恥etc3CgceigccgcccteagtgtctggggccCC3C3g3gggtc48accatetectgcactgggageagetecateggggesggttatgat96gtacactggta_ccagcagcttggagccCCCaaaetcetcate144tatggtaacageeggcccteaggggtccctgaccgattctctggc192tec朋gtctggcteagcctecctggccateactgggetcC3gget240gaggatgaggetgattatt￡LCtgccagtect￡ltgacageagegttgtg288gtattcggcggsggg肌gctggtceta321<2iO〉6〈211>107<212>PRT〈213>人工序列〈400〉6GluLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGinArgVal151015ThrlieSerCysThrGlySerSerSerAsnlieGl.yAlaGlyTyrAsp202530ValHisTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeulie354045TyrGlyAsnSerAsnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGinAla65707580GluAspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSerValVal859095ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>7<211〉366<212〉薩<213〉人工序列<220><221>CDS<222>(l)..(366)<400>7etcgagtctgggggaggcttggtacaacctggggggtecctggtc48tectgtaca肌ctctggattcacctttElgCtatgccutg3gCtgg96gtccgccaggetccagggaaggggctgg3gtgggtcteagetattagt144ggt肌tggtggtagtggcacatactacgC3g3Ctecgtg助ggggegg192ttcaccatetec聊gacaattecaag肌Cacgatgtatctgatg24033C3gCctg卿gccgaggacacggccgt3tattactgtgtg卿gat288gactectatgatggcggtggtcattacggtctgC3Ctgg■ttc336tectggggccagggaaccetagtcaccgtc366<210>8<211>122<212>PRT<213>人工序列<400>8LeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGlySerLeuArgVal15101523SerCysThrAsnSerGlyPheThrPheSerAsnTyrAlaMetSerTrp202530ValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValS。rAlalieSer354045GlyAsnGlyGlySerGlyThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArg505560PheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrMetTyrLeuGinMet65707580AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgAsp85恥95AspSerTyrAspGlyGlyGlyHisTyrGlyLeuHisAsnTrpPheAsp100105110SerTrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal115120<210>9<211〉649<212>腿<213>人工序列<400>9gagctccagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcact60gggaccagcagtgacgttggtgattataactatgtctcctggtatcaacagcacccaggc120a犯gcccccacactcatgatttatgatgtc肌t肌gcggccctcaggggattctaatcgc180ttctctggctcc犯gtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgag240gacg郷ctgattattactgcagctcatatacaagcagcaacacttgggtgttcggcgga300tgaccgtcctgggtragccc朋ggctgccccctcggtcactctgttcccg360ccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcat犯gtgacttc420tax:ccgggagccgtgacagtggcctgg卿gcagatagcagccccgtcaaggcgggagtg480gagaCCElCCacaccctcc犯cggccagcagctacctgagc540ctgacgcctgagcagtggaagtcccacaaaagctacagctgccaggtcacgcatgaaggg600agcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcat649<210>10〈211〉663<212>DNA<213〉人工序列<400>10ctcgagtcgggcccaggactggtg犯gccttcgg兆accctgtccctcacctgcactgtc60tctggtggctCC3tC朋t3gttactactggagctggatccggcagccccc120ctggagtggattggctatctctttgax:agtggcagtaccaagUicaacccttcactxacg180恥tcgagtcaccatatcagtggacacgtcctctccctgaagctgagctct240gtgaccgctgcggacacggctgtgcgagag树tctggggtctcg3tggt300tttgatatatgacaacggtcaccgtctcttcagcctccacc犯gggccca360tcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggc420tgcctggtcaaggactacttccccgaatcggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctg4808CC3gCggCgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagc540agcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaat600C3C肌gCCC3ggtgg織agaaagttgagcccaaa/tcttgtgacaaaact660恥t663<210〉11〈211〉649<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉11gagctcacgcagccgccctcagtgtctggggcccc鄉gc滩agggtcaccatctcctgc60actgggagcagctccaacatcggggc鄉ttatgatgteicactggtaccagcagcttcca120ggaac邓ccccca犯ctcctcatctatggtaacagc犯tcggccctcaggggtccctgac180cgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggct240ctgattattactgccagtccgcgttgtggtattcggcgga300gggacc卿ctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccg360ccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttc420tacccgggagccgtgacagtggcctgg犯ggca_gata^gc￡igccccgtcaaggcgggagtg480gagaccaccacsccctccaaatca^gc犯caacaagtacgcggccagcagctatctgagc540ctgacgcctgagc敏gg肌gtcccacagaa_gctacagctgccaggtcacgcatg卿gg600鄉3CCgtggagaagacagtggcccctaca649<210〉12〈211〉693〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉12ctcg兆tctggggg鄉cttggtac朋cctggggggtccctgagagtctcctgta_caaac60tctggattcacctttagcaactatgccatgagctgggtccgccaggctccaggg卿ggg120ctggagtgggtctcagctattagtggt肌tggtggtagtggcacatactacgcagactcc180gtg犯ggggcggttcaccatctccagagac犯ttccaag3acacg.atgtatctgc肌atg240aacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgctcctatgat300ggcggtggtcattacggtctgcacaactggttcgactcctggggcc郷gaaccctagtc360accgtctccgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaag420agcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaccccgaaccg480gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtc540ctaca_gtcctcaggactctactccctcagcccgtgccctxcagcagcttg600ggca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