新的癌基因、从其衍生的重组蛋白及其应用的制作方法

专利名称：新的癌基因、从其衍生的重组蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的来自人的癌基因，该癌基因参与了人宫颈癌 的发生，以及从该癌基因衍生的重组蛋白及其在医学应用中的用途。
背景技术：
已有许多文献报道了染色体的不稳定性与癌症的发生相关。此外， 最近已经报道，在控制细胞周期中G2/M期检查点的分子的缺陷导致了 染色体的不稳定。然而，因为在许多癌细胞中，在细胞中控制检査点 的分子的基因缺陷并不能被经常地观察到，因此诱导染色体不稳定的 机理从许多方面来说尚不清楚，所述染色体不稳定性与癌症的发生有 着至关重要的关系。
宫颈癌的发生中包括了人乳头瘤病毒(HPV)如HPV-16或HPV-18
型的感染，这一点已经广为人知。在宫颈癌组织中，已经观察到的HPV 感染的频率在90%或者以上。在由HPV感染诱导的宫颈癌的发生机理 中，病毒的E6和E7基因产物扮演了重要的角色。具体来说，已经知 道E6加速了 p53肿瘤抑制蛋白降解的过程，而E7阻断了 Rb基因的产 物pRB(成视网膜细胞瘤)肿瘤抑制蛋白的抑癌活性，这两个步骤造成了 肿瘤发生。但是，被HPV感染激活的特异性的致癌蛋白还未被鉴别。 尤其是E6和E7， HPV的病毒基因产物，诱导了染色体的不稳定性并 使细胞癌变(Carcedze),但是与其直接相关的机理的详细情况在许多方 面还基本上是未知的。因此，为了能够治疗宫颈癌，鉴别出作为HPV的耙的致癌蛋白及编码它的癌基因是非常重要的。宫颈癌是从癌前期 状态，即发育异常(宫颈鳞状上皮细胞的发育异常)发展为侵入性的癌 症。在某些情况下，疾病可以保持在发育异常阶段而不发展为癌症。 在另一方面，也有相当多情况下，发育异常可以很快地发展为晚期癌 症。鉴于这样的情况，进行更精确的癌症诊断以鉴别与宫颈癌发生直 接相关的分子，可能是非常重要的。

发明内容
如上所述，在HPV感染宫颈上皮细胞、经过一种癌前期状态、即 发育异常诱导侵入性癌症发生的过程中，其直接的起源应该被认为是
这样一种机制，即抑制一些癌基因的表达的p53肿瘤抑制蛋白或pBR 肿瘤抑制蛋白的表达抑制活性被破坏了，并且这种破坏导致癌基因进 入了高水平表达的状态。因此，必须首先鉴别癌基因的完整的核苷酸 序列及其编码的致癌蛋白，这将开辟一条道路，以发展一些手段，用 于抑制致癌蛋白的生物化学功能，并且进一步用于阻断由致癌蛋白推 进的癌变的机制。
此外，鉴定癌基因的完整的核苷酸序列及其编码的致癌蛋白的氨 基酸序列，可以允许我们生产核酸探针以检测从癌基因转录的mRNA 的表达，或者利用其重组致癌蛋白产生针对致癌蛋白的特异性抗体。 换句话说，它使我们可以开发出利用核酸探针或特异性抗体的诊断方 法，用于诊断在子宫颈中经由HPV感染引起的癌前期状态、即发育异 常发展到侵入性癌症的过程中的早期阶段。
为了解决上面的问题，本发明的一个目标是鉴别一个来自人类的新 的癌基因的完整核苷酸序列及其编码的致癌蛋白的氨基酸序列，它们 在例如由HPV感染宫颈上皮细胞导致的宫颈癌中直接参与了癌变的机 制，此外本发明还提供了编码癌基因蛋白的肽链的全长多核苷酸，所 述全长多核苷酸衍生自新的癌基因，可用于重组生产致癌蛋白，并提 供由其重组生产的致癌蛋白的肽链。为了解决上面的问题我们进行了广泛的研究，最后发现并克隆了 一个基因，它在宫颈癌细胞中当向其中加入环境激素时表达增加。我 们的结论是，这个克隆的基因是一个癌基因，这是因为
(1) 该基因在癌细胞中高度表达；
(2) 宫颈癌由HPV感染引起，并且将E6和E7基因从HPV转 导到细胞中表达E6和E7蛋白能够增加所述基因的表达；
(3) p53蛋白抑制所述基因启动子区的活性；
(4) p53蛋白的缺失或突变在事实上参与了宫颈癌的发生；
(5) 所述基因的表达可以由一个双链的干扰短链RNA(siRNA) 所抑制以阻止肿瘤的生长，并且在经过进一步的研究后，完成了本发 明。
因此，根据本发明的癌基因多核苷酸是一个衍生自人的、参与了 宫颈癌发生的新的癌基因多核苷酸，它包含了编码氨基酸序列 SEQ.ID.No.l的核苷酸序列。尤其是，它是一个多核苷酸，其中编码氨 基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列是SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序 列。
本发明还-提供了在上述根据的本发明的癌基因多核苷酸的基础 上，通过重组生产的肽或其盐。具体来说，本发明的重组肽是重组肽 或其盐，含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l或其部分氨基酸序列。尤其是， 它可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的重组致癌蛋白。本发明还提供 了一个重组载体，含有编码重组肽的多核苷酸，可用于制备该重组肽。 例如，当目标是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的本发明的重组致癌蛋白 时，所述重组载体就是含有癌基因多核苷酸的重组载体，所述癌基因 多核苷酸含有编码氨基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列，尤其是含有 一个多核苷酸，其中编码氨基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列是 SEQ.ID.No.2。本发明还提供了使用所述重组载体转化宿主细胞后产生的转化细 胞；例如，使用针对本发明的所述重组致癌蛋白的重组载体转化宿主 细胞而产生的转化细胞。因此，生产本发明的重组肽或其盐的过程是 一个生产从本发明的癌基因衍生出的重组肽或其盐的的过程，包括下 列步骤
培养上述的转化细胞使得转化细胞生产本发明的重组肽；以及
收集从培养物中产生的重组肽。尤其是在优选情况下，它可以是 一个包含下列步骤的生产本发明的重组致癌蛋白的过程
培养所述转化细胞，其中已经转化了全长的基因DNA以使转化细 胞生产本发明的重组致癌蛋白；以及
收集从培养物中产生的重组致癌蛋白。
利用上述的本发明的重组肽，本发明提供了一个抗体的发明，它 是使用重组肽作为免疫原而产生的特异性抗体。例如，本发明的抗体 可以是一个对氨基酸序列SEQ.ID.No.l中623到1185区域的部分氨基 酸序列表现出特异反应性的抗体。
此外，本发明提供了一个含有所述特异性抗体的抗体试剂盒以进 行抗原-抗体反应，用于检测含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白 或从致癌蛋白衍生的肽片段。此外，本发明提供了一个含有本发明的 特异性抗体的诊断试剂盒，用于通过抗原抗体反应检测含有氨基酸序 列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白或从致癌蛋白衍生的肽片段。
本发明还提供了一个反义多核苷酸，含有与核苷酸序列 SEQ.ID.No.2中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列，它是一个具有至 少一段选自15到300碱基区域的DNA片段。此外，就根据本发明的 探针杂交试剂盒而言，还提供了一个含有上述反义多核苷酸作为DNA 探针的探针杂交试剂盒，可用于检测含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2、其 部分核苷酸序列的mRNA或由mRNA制备的cDNA。此外，本发明还 提供了一个含有所述反义多核苷酸作为杂交探针的诊断试剂盒，通过探针杂交的方法，用于检测含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的 表达，该mRNA被翻译为含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白。
在另一方面，本发明还提供了一个引物对，用于对含有核苷酸序 列SEQ.ID.No.2的cDNA进行PCR扩增，引物对由如下核苷酸序列组
成
5' -TTGGATCC ATGAC ATCC AGATTTGGG AA AAC AT AC AGT A GG-3，；和
5 ， -TTG AATTCCTAGC AATGTTCC A AAT ATTC A ATC ACTCT AG A-3'，此外本发明还提供了一个引物对，用于对含有核苷酸序列 SEQ.ID.No.2的cDNA的部分链进行PCR扩增，引物对由如下核苷酸 序列组成
5，-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3，；和 5 ， -TTGAATTCCTAGC AATGTTCC AAAT ATTC A-3'。
另外，至于双链的短链干扰RNA的发明，本发明提供了一个双链 的短链干扰RNA，能够在宫颈癌细胞中抑制含有核苷酸序列 SEQ.ID.No.2的mRNA的表达，其中双链的siRNA的核苷酸序列为 CGGACTACCCTTAGCACAA。此外，它还可用于药物组合物中以在宫 颈癌细胞中抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的表达，从而 阻止癌细胞的生长，所述药物组合物含有本发明的所述双链的短链干 扰RNA。
附图简述
图l显示了报道的果蝇dWAPL和本发明的hWAPL之间的氨基酸 序列的比较。
图2显示了本发明的hWAPL在位于C-末端一侧的623到1185氨 基酸的部分氨基酸序列中与dWAPL—致的或同源的氨基酸的比对。
图3显示了人的WAPL蛋白与小鼠的WAPL蛋白的氨基酸序列之 间的极高的同源性。上排和下排分别是人和小鼠WAPL的序列，白色 和灰色部分分别表示相同和相似的氨基酸。框中的部分是与果蝇WAPL 具有相似性的区域。
7图4显示了使用抗hWAPL-N抗体和抗hWAPL-C抗体对Saos-2 细胞(第2、 3道)和NIH3T3细胞(第1道)的抽提液的Western印迹分析 结果。
图5显示了(A): Northern印迹以评估hWAPL蛋白在卵巢癌、肺 癌、结肠癌、子宫体癌和宫颈癌的癌细胞(T)与相应的正常细胞(N)中相 比的表达水平；(B):实时PCR的结果，以证实hWAPL基因在宫颈癌、
子宫体癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肾癌、结肠癌的癌细胞oo与相应
的正常细胞(N)中相比的表达；以及(C): RT-PCR检测在癌细胞(T)中从 HPV衍生的E6/E7基因的mRNA的表达结果。
图6显示了(A): Western印迹，以证实由来自HPV16的E6和E7 重组蛋白诱导的hWAPL蛋白的表达，以及在HDK1细胞中p53抑制蛋 白的切割；以及(B): Western印迹，以证实E6和E7基因转录的抑制， p53抑制蛋白水平和BPV衍生的E2对hWAPL蛋白表达抑制的增加。
图7显示了(A):染色体的不稳定性和多倍体的增加；以及(B): 在HeLa细胞中由GFP-hWAPL融合蛋白的过量表达诱导的微核形成频 率的增加。
图8显示了在HeLa细胞中染色体的不稳定性和由GFP-hWAPL 融合蛋白的过量表达诱导的多核化频率的增加。
图9显示了 hWAPL蛋白诱导NIH3T3成纤维细胞的癌变，具体为 (A):在培养HA-hWAPL 3T3细胞系中转化灶结构的形成；(B):在无 胸腺小鼠注射HA-hWAPL3T3细胞系的位点肿瘤的形成；(C):在肿瘤 形成区HA-标记的hWAPL蛋白的过量表达；以及(D):癌变细胞中的 异型有丝分裂。


图10显示了 hWAPL siRNA在来自HPV16阳性宫颈癌的SiHa细 胞中对细胞生长抑制效应的评估结果，显示为细胞数量(单位为x103， 纵坐标)对转化siRNA的时间(单位为小时，横坐标)的作图。
本发明的最佳实施方案
下面将对本发明进行详细描述。假定染色体的不稳定性在很大程度上参与了宫颈癌细胞中的癌变 机制，我们搜索了作为染色体不稳定性诱导因素的人源蛋白。我们特 别搜索了在染色体不稳定事件中具有很高潜力能够诱导异倍性或等位 基因形成的蛋白。
我们注意到，在来自动物中遗传基因研究得最深入的果蝇的许多 蛋白中，已报道dWAPL蛋白在减数分裂过程的分裂间期中是一个控制 异染色质结构的蛋白。具体来说，我们发现，当蛋白表现的这种控制 异染色质结构的功能在正常细胞的有丝分裂过程中表达时，偶尔可以
诱导出异倍性或等位基因的形成。我们首先调查了对应于这种dWAPL 的蛋白是否实际上编码在人基因组基因上。基于报道的dWAPL基因的 核苷酸序列(GenBank登录号No. U40214),我们从GenBank中登记的 作为人源的基因片段的cDNA片段中搜索显示出显著同源性的片段， 并且选择了含有与dWAPL基因相似的核苷酸序列的KIAA0261片段。
为了鉴定含有KIAA0261片段的全长的cDNA，我们在EST数据 库中搜索人源的表达标记的核苷酸序列，它可以是一个含有不翻译部 分的片段，该不翻译部分被推测为位于KIAA0261片段5，-侧的上游核 苷酸序列，并且选择了EST克隆BE410177、 BF9516和BE257022。
我们使用5'-RACE方法参照EST克隆测定了位于KIAA0261片段 5'侧的上游核苷酸序列。此外，因为很有可能与dWAPL功能相同的蛋 白实际上是在一个具有减数分裂过程的细胞中表达，我们使用了一个 市售的cDNA文库、即人睾丸cDNA试剂盒(Marathon-ReadyTM cDNA Kit;Clontechlnc.)作为模板，克隆了含有KIAA0261片段的核苷酸序列 和上面测定的位于5'-侧的上游核苷酸序列的全长的cDNA。
实际的测序表明在克隆的全长cDNA中编码区有3570个碱基对， 推测对应于一个具有1190个氨基酸的氨基酸序列。作为与dWAPL蛋 白同源的人源蛋白，它被称为"人WAPL (hWAPL)"，相应的基因称为"hWAPL基因"。对应于hWAPL基因中ORF的全长的核苷酸序列 由SEQ.ID.No.2所代表，推测的hWAPL蛋白的氨基酸序列由 SEQ.ID.No.l所代表。将本发明的hWAPL基因的ORF编码的氨基酸序 列、即推测的hWAPL蛋白的氨基酸序列与dWAPL蛋白的氨基酸序列 进行比较，表明，如图1所示，在C-末端区域的623到1185氨基酸的 部分序列中的同一性为35%，同源性为53%。表现出这样的同一性和 同源性的氨基酸显示于图2中。
此外，我们克隆了一个编码小鼠源类似物、小鼠WAPL蛋白的 cDNA，假定除人以外的一些哺乳动物中也可以含有相应的蛋白。在对 其测序后，将编码的氨基酸序列进行比较。事实上，证实了人WAPL 蛋白和小鼠WAPL蛋白彼此之间显示出非常高的同源性。图3显示了 比对的结果。我们已经对人WAPL基因的编码区的全长的核苷酸序列 进行了登记，在DDBJ/EMBL/GenBank中的登录号为No. AB065003。
我们对Saos-2细胞和NIH3T3细胞的抽提液进行了 Western印迹 分析，使用抗-hWAPL-N抗体和抗-hWAPL-C抗体，它们是对人WAPL 蛋白的肽链特异性的抗体，在实施例6中有所解释。如图4所示，结 果发现了一个与抗体反应的蛋白带，分子量为大约140Kda。因此，证 实了在人源细胞中人WAPL蛋白实际上在某种程度上存在。
此外，在下述的各种证实方法的基础上
实施例2:在人癌组织中表达hWAPL基因；
实施例3:用源自HPV 16型的E6和E7诱导hWAPL基因的表达；
实施例4: p53抑制蛋白抑制hWAPL基因产物的启动子活性；
实施例7: hWAPL蛋白诱导染色体的不稳定性；
实施例8: hWAPL蛋白诱导NIH3T3成纤维细胞的癌变，可以得 出结论，hWAPL基因是一个癌基因，至少参与了宫颈癌发生的机制。
含有hWAPL基因全长cDNA的质粒pGEMhWAPL被用来产生含有WAPL基因全长cDNA的转化子；在下述的实施例1中获得的大肠 杆菌DH5 pGEMhWAPL菌株，已经保存在位于Chuo 6th， 1-1-1， Higashi， Tsukuga， Ibaragi， 305-8566的国立高等工业科学和技术研究所的国际专 利物种贮藏所(国立生物科学和人类技术研究所)，原始保存日期为2003 年1月7日，在布达佩斯公约之下的国际保藏管理局的保藏号为FERM BP-8269。
我们还证实了，作为hWAPL基因产物的hWAPL蛋白的表达可以 使用双链的短链干扰RNA(siRNA)来抑制。具体来说，表现出这样的表 达抑制活性的双链的短链干扰RNA(siRNA)包括，例如其核苷酸序列 为CGGACTACCCTTAGCACAA。在这种情况下，癌细胞的进一步生 长也被抑制，所以癌症的发生可以被阻止。
对于一个其氨基酸序列与本发明的氨基酸序列SEQ.ID.No.l(以下 有时被称为"本发明的蛋白")一致或基本上一致的蛋白，其例子可以 包括一个氨基酸序列，它与氨基酸序列SEQ.ID.No.l的同源性在大约 70%或以上、优选情况下在大约80%或以上、更优选情况下在90%或 以上、最优选情况下在大约95%或以上。
对于一个其氨基酸序列与氨基酸序列SEQ.ID.No.l —致或基本上 一致的蛋白，优选情况下这样的肽可以具有与氨基酸序列SEQ.ID.No.l 基本上一致的氨基酸序列，并且与具有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白 具有基本上相当的活性。
基本上相当的活性可以包括、例如含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l 的蛋白的活性，比如诱导癌症的功能、酶活性、转录活性以及与结合 蛋白结合的活性。
在此所用的术语"基本上相当"是指这些活性在本质上(例如生物 化学或药理学上)是一致的。
11与氨基酸序列SEQ.ID.No.l —致或基本上一致的氨基酸序列的例 子包括
(i) 氨基酸序列SEQ.ID.No.l;
(ii) 从氨基酸序列SEQ.ID.No.l中缺失了 1到30个、优选为1到 20个、更优选为1到IO个氨基酸的氨基酸序列；
(iii) 向氨基酸序列SEQ.ID.No.l中增加了 1到30个、优选为1到 20个、更优选为1到IO个氨基酸的氨基酸序列；
(iv) 向氨基酸序列SEQ.ID.No.l中插入了 1到30个、优选为1到 20个、更优选为1到IO个氨基酸的氨基酸序列；
(v) 在氨基酸序列SEQ.ID.No.l中用其它氨基酸置换了 1到30个、 优选为1到20个、更优选为1到IO个氨基酸的氨基酸序列；
(vi) 从上述的(ii)到(v)中选择两个或多个进行组合修饰的氨基酸序列。
本发明的蛋白的一个例子可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白。
本发明的一个部分肽可以是上述的本发明的蛋白的任何部分肽， 一般来说优选的为含有本发明的蛋白的至少5个或以上氨基酸、更优 选为至少IO个或以上氨基酸、更优选为具有与本发明的蛋白相当的活 性的肽。
在本发明的蛋白或其部分肽(以后有时称为"本发明的蛋白")中， 根据常规的肽的表示法，左端是N-末端(氨基末端)，右端是C-末端(羧 基末端)。
在本发明包括了含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白的蛋白中， C-末端可以从羧基(-COOH)、羧酸盐(-C00—)、酰胺(-CONH2)和酯基 (-COOR)中任选。在酷中R的例子包括Cl6-院基例如甲基、乙基、正丙基、异丙基 和正丁基；C3.8-环烷基例如环戊基和环己基；C^2-芳香基例如苯基和
a-萘基；苯基-Cu2-烷基例如苯甲基和苯乙基；Cw4-芳烷基例如a-萘 基-Cl2-焼基，包括a-萘基甲基；以及新戊酰氧基甲基，它通常用作酯
进行口服。
当本发明的蛋白在c-末端以外的位置具有羧基基团(或羧酸盐)
时，其中羧基基团被酰胺化或酯化的蛋白也是本发明的一种蛋白。这
里的酯可以是上述的C-末端的酯。
此外，本发明的蛋白的例子还包括一种蛋白，其中在N-末端的氨 基酸残基(例如甲硫氨酸残基)的氨基基团被一个保护基团所保护，诸如
Ck芳基、包括d—6-垸酰基例如甲酰基和乙酰基； 一种蛋白，其中在 体内切割形成的N-末端的谷氨酸残基被转化为焦谷氨酸的形式； 一种 蛋白，其中在分中一个氨基酸残基中的侧链上的一个取代基(例如
-OH、 -SH、氨基、咪唑基、吲哚基和胍基)被一个适当的保护基团(例
如，Ci-6-酰基，通常包括诸如甲酰基和乙酰基的d(垸酰基)所保护； 以及一种共轭蛋白，诸如其中连接了糖链的所谓的糖蛋白。
本发明的蛋白的盐可以是一种生理可接受的酸(例如无机和有机 酸)或碱(例如碱金属盐)的盐，特别优选的是生理可接受的酸加成的盐。 这样的盐的例子包括无机酸如盐酸、磷酸、氢溴酸和硫酸的盐，以及 有机酸如乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、 柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲基磺酸和苯甲基磺酸的盐。在下 面，这样的盐也包括在本发明的蛋白中。
本发明的蛋白或其盐可以通过已知的从人类或温血哺乳动物的细
胞中纯化蛋白的方法来制备，或者也可以通过将编码蛋白的DNA如下
述转化而产生的转化子进行培养而制备。当从人或哺乳动物的组织或细胞进行生产时，人或哺乳动物的组 织或细胞被匀浆，然后用酸抽提。然后通过组合的色谱步骤例如反向 色谱和离子交换色谱将抽提液纯化以分离出所需的产物。
编码本发明的致癌蛋白的多核苷酸可以是任一含有上述的编码本
发明的致癌蛋白的核苷酸序列的多核苷酸(DNA或RNA，优选为DNA)。 多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA例如编码本发明的致癌蛋白的 mRNA，可以是单链的也可以是双链的。当是双链时，它可以是双链 DNA、双链RNA或DNA: RNA的杂合体。当是单链时，可以是正义 链、即编码链，也可以是反义链即非编码链。
编码本发明的蛋白的多核苷酸可用来对本发明的蛋白的mRNA进 行定量，这可以使用已知的方法或对其进行修改，例如在Experimental Medicine增刊"新的PCR及其应用"，15(7), 1997中描述的方法。
一个编码本发明的蛋白的DNA可以是任一含有上述的编码本发 明的蛋白的核苷酸序列的DNA ，并且可以是基因组DNA 、基因组DNA 文库、来自上述的细胞/组织的cDNA,来自上述的细胞/组织的cDNA 文库或人工合成的DNA。
用于文库的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒或噬菌粒。细胞或组 织的总RNA或mRNA部分的制备物可以用于通过直接的反转录酶聚 合酶链式反应(在后面称为"RT-PCR")进行扩增。
可用于本发明的探针DNA的核苷酸序列可以是任何序列，诸如含 有在高度严谨条件下可以与核苷酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核苷酸序 列的DNA序列，以及编码的蛋白与含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋
白具有基本上相当的活性的DNA序列。在高度严谨条件下可以与核苷酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核苷酸 序列可以是一个与核苷酸序列SEQ.ID.No.2具有同源性为大约70%或 以上、优选为大约80%或以上、更优选为大约90%或以上、更优选为 大约95%或以上的核苷酸序列。
杂交可以根据已知的方法或其修饰方法来进行，例如在《分子克 隆第二版》(J. Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中描
述的方法。当使用市售的文库时，杂交可以按照附带的手册来进行。 在更优选情况下，杂交可以在高度严谨条件下进行。
高度严谨条件可以包括、例如钠浓度为大约19到40mM，优选为 大约19到20mM，温度为大约50到70°C，更优选为大约60到65°C ， 在最优选情况下，钠浓度为大约19mM，温度为大约65。C。
在更具体的情况下，编码含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白的 DNA可以是含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的DNA。
编码本发明部分的肽的DNA可以是任何含有编码上述的本发明 的肽的核苷酸序列的DNA，并且可以是基因组DNA、基因组DNA文 库、来自上述的细胞/组织的cDNA，来自上述的细胞/组织的cDNA文 库或人工合成的DNA。
编码本发明的部分肽的DNA可以是一种含有包括核苷酸序列 SEQ.ID.No.2的DNA的部分核苷酸序列的DNA，或者是另一种DNA， 其含有包括在高度严谨条件下可与核苷酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核 苷酸序列并且编码一种蛋白与含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白具 有基本上相当的活性的DNA的部分核苷酸序列。
可以与核苷酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核苷酸序列的定义如上所述。
15杂交方法和高度严谨条件可以如上所述。
含有编码本发明的蛋白或其部分肽(以下有时称为"本发明的蛋
白")的DNA序列的一部分、或与DNA互补的核苷酸序列的一部分的 多核苷酸可以包含编码本发明的蛋白或其部分肽的DNA和RNA。
根据本发明，在编码被克隆或测定的本发明的蛋白的DNA的核苷 酸序列数据的基础上设计和合成了能够抑制本发明的蛋白基因的复制 和表达的反义多核苷酸(核酸)。这样的多核苷酸(核酸)可以与本发明的 蛋白基因的RNA杂交以抑制RNA的合成或活性，或通过与和本发明 的蛋白相关的RNA相互作用而调节或控制本发明的蛋白基因的表达。 与在和本发明的蛋白相关的RNA中选定的序列互补的多核苷酸以及能 够与和本发明的蛋白相关的RNA特异性杂交的多核苷酸，对于在体内 和体外对本发明的蛋白基因的表达进行调节或控制、以及对于疾病的 治疗或诊断，是非常有用的。在此所用的术语"相应于"是指与包括 塞因的核苷酸、核苷酸序列或核酸的部分序列同源或互补。在核苷酸、 核苷酸序列或核酸与肽(蛋白)之间的关系方面，术语"相应于" 一般是 指在一个蛋白(肽)中的一个氨基酸，从核苷酸(核酸)的序列或其互补序 列衍生的一个控制序列。优选的靶区域的例子可以包括在本发明蛋白 基因中的一个5'-端的发夹环， 一个5'-端的6个碱基对的重复、 一个5'-端的非翻译区、 一个蛋白翻译起始密码子、 一个蛋白编码区、 一个ORF 翻译终止密码子， 一个3'-端非翻译区、 一个3'-端回文区和一个3'-端 的发夹环，但是在本发明的蛋白基因中的任何区域都可以被选为靶。
一个给定的核酸和与靶区域至少部分互补的多核苷酸之间、以及 耙和可杂交的多核苷酸之间的关系可以被称为"反义"。反义多核苷 酸的例子包括含有2-脱氧-D-核糖的多核苷酸、 一个含有D-核糖的多核 苷酸、其它类型的多核苷酸如嘌呤或嘧啶碱的N-糖苷、以及其它含有 非核苷酸结构的聚合物(例如市售的蛋白核酸和合成的序列特异性的核酸聚合物)或其它含有特殊键的聚合物，只要聚合物中含有一个其构型
如在DNA或RNA中观察到的可以接受碱基配对或碱基结合的核苷酸。 它们可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA或DNA:RNA 杂合体。它们还可以包括未修饰的多核苷酸(或未修饰的寡核苷酸)，那 些具有已知的修饰如本领域熟知的标记、加帽、甲基化、用类似物取 代至少一个天然的核苷酸及分子内的核苷酸修饰的多核苷酸；那些具
有不带电荷的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸 酯)的多核苷酸；那些具有带电荷的键或含硫的键(例如硫代磷酸酯和二 硫代磷酸酯)的多核苷酸；那些具有一个侧链基团的多核苷酸，所述侧 链基团包括蛋白(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽和聚-L-赖氨酸)或糖(例如单糖)；那些含有一个中间化合物(如吖啶和补骨脂素) 的多核苷酸；那些含有一个鏊合化合物(例如金属、放射性金属、硼和 氧化金属)的多核苷酸；那些含有烷基化试剂的多核苷酸；以及那些含 有修饰的键(例如a-异头型核酸)的多核苷酸。在此所用的术语"核苷"、 "核苷酸"和"核酸"不仅可以包括那些含有嘌呤和嘧啶碱的化合物， 而且还包括那些另含有其它修饰杂环碱基的化合物。这样的修饰物质 可以含有甲基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或其它杂环化合物。 修饰的核苷和修饰核苷酸可以在糖基团上修饰；例如一个或多个羟基 可以被卤素或脂肪族的基团所取代，或者可以被转化为另一个官能团 如醚和胺。
本发明的反义多核苷酸(核酸)是一个RNA、 DNA或修饰的核酸 (RNA、 DNA)。修饰的核酸的例子包括但不限于核酸的硫衍生物或硫代 磷酸衍生物以及那些对多聚核苷酰胺或寡聚核苷酰胺的降解有抗性的 核酸。本发明的反义核酸可以被优选设计为，例如使产生的反义核酸 在细胞中更加稳定、使反义核酸在细胞中有较高的通透性、对靶正义 链具有亲和性、或者如果它有毒性，产生的反义核酸可以具有较低的 毒性。
多种这样的修饰在本技术领域中是广为人知的，并且在例如J.Kawakami等，Pharm Tech Japan, Vol.8, pp.247, 1992; Vol.8, pp.395， 1992; S.T. Crooke等编，反义研究和应用，CRC Press, 1993中已经公开。
本发明的反义核酸可以包含转化的和/或修饰的糖、碱基和/或键， 因此可以以一种特别的形式诸如脂质体和微球体的形式提供，可以应 用于基因治疗或可以作为加合物提供。这样的加合物的例子包括聚阳 离子加合物、如作为磷酸结构中的电荷中和剂的多聚赖氨酸，以及疏 水加合物、例如一个增强与细胞膜相互作用或增加核酸的摄取的脂类 (例如，磷脂和胆固醇)。优选的用于加成的脂类的例子包括胆固醇及其 衍生物(例如氯甲酸胆固醇酯和胆酸)。它可以通过碱基、糖或分子内核 苷键连接到核酸的3'-或5'-末端。另一种可用的基团可以是、例如一个 具体定位于一个核酸的3'-或5'-末端以防止核酸酶诸如核酸外切酶和 RNase降解的加帽基团。这样的加帽基团的例子包括但不限于那些在本 领域已知的羟基保护基团例如乙二醇、包括聚乙二醇和冰縮四乙二醇。
反义核酸的抑制活性可以使用本发明的转化子、本发明的体内或 体外基因表达系统、或本发明的蛋白的体内或体外翻译系统来测定。 可以使用任何己知的多种方法将核酸引入细胞。
编码本发明的蛋白的D N A可以用任何已知的方法来标记；例如同 位素标记、荧光标记(例如，使用荧光素进行荧光标记)、生物素酰化和
酶标 。
完整地编码本发明的蛋白的DNA可以通过已知的PCR方法扩增 来克隆，使用含有本发明蛋白的部分核苷酸序列的合成的DNA引物， 或者通过与标记了编码本发明的蛋白的部分或全长DNA片段或合成的 DNA进行杂交来筛选整合在一个适当的载体中的DNA。杂交可以使用 例如在《分子克隆第二版》(J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中描述的方法来进行。当使用市售的文库时，杂交可以按 照附带的手册来进行。一个DNA的序列可以使用已知的试剂盒例如MutanTM-super Express Km (TaKara Shuzo Co.， Ltd.)、 MutanTM-K (TaKara Shuzo Co.， Ltd.),利用已知的方法例如ODA-LA PCR、带缺口双链方法和Kunkel 方法或修改的方法来进行转化。
根据使用的情况，编码克隆的肽的DNA、如果需要、可以这样使 用或者在用限制性酶消化后或添加了接头后使用。DNA可以在5'-末端 带有ATG作为翻译起始密码子，在3'-末端带有TAA、 TGA或TAG 作为翻译的终止密码子。可以使用适当的合成的DNA接头来添加翻译 起始密码和或翻译终止密码。
本发明的蛋白的表达载体可以通过例如(i)从编码本发明的蛋白的 DNA中切下所需DNA片段，和(ii)将DNA片段连接在适当的表达载体 的启动子的下游来制成。
可以使用的载体的例子包括从大肠杆菌衍生的质粒(例如， pBR322、 pBR325、 pUC12和pUC13);从枯草芽孢杆菌衍生的质粒(例 如pUB110、pTP5和pC194);从酵母衍生的质粒(例如pSH19和pSH15); 噬菌体例如X-噬菌体；哺乳动物的病毒例如逆转录病毒、痘苗病毒和杆 状病毒；pAl-ll; pXTl; pRc/CMV; pRc/RSV和pcDNAI/Neo。
用于本发明的启动子可以是任何适合于在基因表达中所用的宿主 的启动子。例如，当使用哺乳动物细胞作为宿主时，可以使用SR a-启动子、SV40启动子、HIV-LTR启动子、CMV启动子或HSV-TK启动子。
在这些启动子中，优选使用CMV(黄瓜花叶病毒)启动子或SR ot-启动子。当宿主是大肠杆菌时，优选的启动子为trp启动子、lac启动 子、recA启动子、X-PL启动子、lpp启动子和T7启动子；当宿主是芽
19孢杆菌时，优选的启动子为SPOl启动子、SP02启动子和penP启动子； 当宿主是酵母时，优选启动子为PH05启动子、PGK启动子、GAP启 动子和ADH启动子。当宿主是昆虫细胞时，优选启动子为多角蛋白 (polyhetdrin)启动子和P10启动子。
如果需要，也可以使用其它的表达载体，包括那些含有增强子、 剪接信号、poly-A加尾信号、选择标记和/或SV40复制原点(以下有时 称为"SV40ori")的载体。选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶(以下 有时称为"dhfr")基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]、氨卞青霉素抗性基因(以 下有时称为"Ampr")和新霉素抗性基因(以下有时称为"Neor" ， G418 抗性)。尤其是在使用缺失了 dhfr基因的中华仓鼠细胞、以dhfr基因为 选择标记时，可以使用缺乏胸腺嘧啶的培养基来筛选所需基因的整合。
报告基因或药物抗性基因也可用作选择标记(New Biochemical Experimental Lectures (Shin Seikagaku Jikken Koza) 2， nucleic acid III， 3.6 Mammalian cell expression vector, p84-103)。
可以使用的药物抗性基因和药物的组合的例子包括
(1) 嘌呤霉素-N-乙酰转移酶基因和嘌呤霉素的组合；
(2) 氨基糖苷磷酸转移酶基因(APH)和G418的组合；
(3) 潮霉素-B磷酸转移酶基因(HPH)和潮霉素-B的组合；以及
(4) 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)和霉酚酸酯 (mycophenolate)的组合。
当亲本细胞系是一个次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT) 或胸腺嘧啶激酶(TK)缺陷株时，可以使用这些基因和HAT(次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶)的组合。
二氢叶酸还原酶或氨卞青霉素抗性基因可以用作选择标记基因。如果需要，可以在本发明的蛋白的N-末端添加适合于宿主的信号
序列。当宿主是大肠杆菌时，可以使用PhoA信号序列和OmpA信号 序列；当宿主是芽孢杆菌时，可以使用a-淀粉酶信号序列和枯草杆菌 蛋白酶信号序列；当宿主是酵母时，可以使用MFci信号序列和SUC2 信号序列；当宿主是哺乳动物细胞时，可以使用胰岛素信号序列、a-干扰素信号序列和抗体-分子信号序列。
这样构建的含有编码本发明的蛋白的DNA的载体可以用来产生 转化子。
宿主可以是、例如大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、昆虫 或哺乳动物细胞。
大肠杆菌的例子包括大肠杆菌K12 DHl[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 60, 160 (1968)]、 JM103[Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)]、 JA221[Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517 (1978)]、 HBlOl[Jo腦al of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969)]禾口 C600[Genetics， Vol. 39， 440 (1954)]。
芽孢杆菌的例子包括枯草芽孢杆菌MT114[Gene, Vol. 24, 255 (1983)]和207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984)]。
酵母的例子包括酿酒酵母AH22、 AH22R—、 NA87-11A、 DKD-5D 禾口 20B-12;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913和 NCYC2036;以及巴斯德毕赤氏酵母KM71。
至于昆虫细胞，当病毒是AcNPV时，可以使用从黏虫幼虫(草地 夜蛾细胞；Sf细胞)衍生的确立的细胞、从粉纹夜蛾中肠衍生的MG1 细胞、从粉纹夜蛾卵得到的High FiveTM细胞、从甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)获得的细胞或从Estigmena acrea衍生的细胞。当病毒是BmNPV时，可以使用从蚕(中国家蚕N细胞；BmN细胞)确立的细胞。 可以使用的Sf细胞的例子包括Sf9细胞(ATCC CRL1711)和Sf21细胞， 这在Vaughn, J. L.等，In Vivo, 13， 213-217 (1977)中已经描述。
昆虫的例子包括家蚕幼虫[Maeda等，Nature, Vol. 315， 592 (簡)]。
哺乳动物细胞的例子包括猴细胞COS-7(COS7)、非洲绿猴肾细胞 系、中华仓鼠细胞CHO(以下称为"CHO细胞")、dhfr-基因缺失的中 华仓鼠细胞CHO(以下称为"CHO(dhfr-)细胞")、鼠L细胞、鼠AtT-20 细胞、鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3和人FL细胞。
大肠杆菌的转化可以按照例如在Proc. Natl. Acad. Sci. USA， Vol. 69, 2U0(1972)或Gene， Vol.17, 107(1982)中描述的方法进行。
芽孢杆菌的转化可以按照例如在Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111(1979)中描述的方法进行。
酵母的转化可以按照例如在酶学方法，Vol. 194, 182-187(1991)或 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, 1929 (1978)中描述的方法进行。
昆虫细胞或昆虫的转化可以按照例如在Bio/Technology, 6， 47-55 (1988)中描述的方法进行。
哺乳动物细胞的转化可以按照例如在细胞技术增刊8，新细胞技 术实验方法，263-267(1995) (Shuju Co. Ltd.)或Virology, Vol.52, 456(1973)中描述的方法进行。
因此，可以获得用含有编码本发明的蛋白的DNA的表达载体转化 得到的转化子。当对宿主为大肠杆菌或芽孢杆菌的转化子进行培养时，用于培养 的适当的培养基是含有碳源、氮源、无机盐等转化子生长所需组合物 的液体培养基。碳源的例子包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉和蔗糖。 氮源的例子包括无机和有机物如铵盐、硝酸盐、玉米浸汁、蛋白胨、 酪蛋白、肉汁、豆饼和土豆汁。无机盐的例子包括氯化钙、磷酸二氢 钠和氯化镁。可以添加酵母提取物、维生素和/或生长促进因子。预期
的培养基的pH为大约5到8。
培养大肠杆菌的优选的培养基的例子可以是含有葡萄糖和酪蛋白 氨基酸的 M9 培养基[Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 413-433, Cold Spring Harbor LaboHumanory, New York, 1972]。如果需要，可以添加其它的试剂例如3(3-吲哚丙烯酸用于高效 的启动子活性。
当宿主是大肠杆菌时，培养一般在大约15到43'C进行3到24小 时，如果需要，通气和/或搅拌。
当宿主是芽孢杆菌时，培养一般在大约30到4(TC进行大约6到 24小时，如果需要，通气和/或搅拌。
当对宿主为酵母的转化子进行培养时，可以使用的培养基的例子 包括Burkholder基础培养基[Bostian, K丄.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， Vol.77, 4505(1980)]和含有0.5%酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter， G. A. 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， Vol. 81, 5330(1984)]。培养基的pH优选 被调整到大约5到8。培养一般在大约20到35'C进行大约24到72小 时，如果需要，通气和/或搅拌。
当对宿主为昆虫细胞或昆虫的转化子进行培养时，培养基可以是 Grace昆虫培养基(Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788(1962))，适当时可以含有添加物如10。/。除去补体的牛血清。培养基的pH优选被调整到大约 6.2到6.4。培养一般在大约27X:进行大约3到5天，如果需要，通气 和/或搅拌。
当对宿主为哺乳动物细胞的转化子进行培养时，培养基的例子包 括含有大约5%到10%胎牛血清的MEM培养基[Science, VoU22, 501(1952)]、 DMEM培养基[Virology, Vol. 8， 396(1959)]、 RPMI 1640 培养基[The Journal of the American Medical Association, Vol. 199, 519(1967)]禾卩199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol.73， 1(1950)]。培养基的pH优选被调整到大约6到8。培 养一般在大约30到40'C进行大约15到60小时，如果需要，通气和/ 或搅拌。
如上所述，本发明的蛋白可以在转化子细胞的细胞内、细胞膜或 细胞外区域生产。
本发明的蛋白可以从上述的培养基中通过例如下面的方法分离和 纯化。
本发明的蛋白可以从培养的细菌或细胞中利用合适的方法提取， 方法为培养后，通过己知的步骤收集细菌或细胞，将它们悬浮在适当 的缓冲液中，使用超声、溶菌酶和/或冻融将细菌或细胞裂解，然后离 心或过滤以得到本发明的蛋白的粗提液。缓冲液可以含有蛋白修饰物 如尿素和盐酸胍和表面活性剂如Triton X-100 。当肽分泌到培养基中 时，在培养后通过己知的方法将细菌或细胞与上清液分离，然后收集 上清液。
这样获得的包含在培养基上清液或抽提液中的本发明的蛋白可以 通过将现有的分离/纯化方法进行适当组合来纯化。这种现有的分离/纯 化方法的例子包括利用溶解度的方法如盐析和溶剂沉淀；主要利用分子量差别的方法如透析、超滤、凝胶过滤和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳； 利用电荷差别的方法如离子交换层析；利用特异的亲和性的方法如亲 和层析；利用疏水性差别的方法例如反向高效液相色谱；以及利用等 电点差别的方法如等电聚焦。
当这样获得的本发明的蛋白是游离形式时，它可以通过现有的方 法或其修饰的方法被转化为盐。反过来说，当获得的是盐形式时，它 可以通过现有的方法或其修饰的方法被转化为游离的形式。
纯化前或纯化后，由重组子产生的本发明的蛋白可以被适当的蛋 白修饰酶作用以获得适当的修饰或部分去除一个肽。蛋白修饰酶的例 子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶和糖苷酶。
针对本发明的蛋白的抗体(以下有时简单称为"本发明的抗体") 可以是多克隆或者是单克隆的，只要它能够识别本发明的蛋白的抗体。
本发明的蛋白的抗体可以使用现有的制备抗体或抗血清的方法， 以本发明的蛋白为抗原来生产。
单克隆抗体的制备 (a)单克隆抗体产生细胞的制备
将本发明的蛋白单独或与载体和稀释剂结合起来施用到温血动物 中能够产生抗体的部位。在应用时，可以使用Freund's完全或不完全 佐剂来提高抗体生产能力。 一般来说在2到6周施用一次，总共施用 大约2到10次。温血动物的例子包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、 绵羊、山羊和禽类，优选为大鼠和小鼠。
为制备单克隆抗体产生细胞，从被抗原免疫的温血动物例如小鼠 中选择出表现抗体滴度的个体，并且在最后免疫后2到5天分离出脾 脏或淋巴结。包含在分离物中的抗体产生细胞可以与一个相同的或不同动物的骨髓瘤细胞融合以制备一个产生单克隆抗体的杂交瘤。可以 通过例如将下面描述的标记肽与抗血清反应然后测量结合到抗体上的 标记的活性来测定抗血清中的抗体滴度。融合可以使用现有的方法进
行，例如Kaehler-Milstein方法[Nature, 256,495(1975)]。融合促进剂的 例子包括聚乙二醇(PEG)和副流感病毒，优选PEG。
骨髓瘤细胞的例子包括温血动物的骨髓瘤细胞，例如NS-1、P3U1、 SP2/0和AP-1，优选为P3U1。抗体产生细胞(脾脏细胞)与骨髓瘤细胞 的数量比优选为大约1: 1到20: 1， PEG(优选为PEGIOOO到PEG6000) 添加浓度为大约10%到80%，通过在20到40°C、优选为30到37°C 1 到10分钟，细胞融合可以有效地进行。
可以使用多种方法中的任意一种来筛选产生单克隆抗体的杂交瘤 细胞；例如，通过在已经直接吸附了肽(蛋白)抗原或吸附了肽(蛋白)抗 原与载体的组合物的固相介质(例如，微孔板)中加入杂交瘤培养上清 液，然后加入抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞是鼠细胞时， 使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或用放射性试剂或酶标记的蛋白A，并最 后检测结合到固相介质上的单克隆抗体，或者在已经吸附了抗免疫球 蛋白抗体或蛋白A的固相介质上加入杂交瘤培养上清液，然后加入用 放射性试剂或酶标记的肽，最后检测结合到固相介质上的单克隆抗体。
可以通过现有的方法或其修改方法来筛选单克隆抗体。通常可以 使用含有HAT(次黄嘌呤、氨基蝶吟和胸腺嘧啶)的哺乳动物细胞培养 基。用于筛选和繁殖的培养基可以是任何杂交瘤能够生长的培养基； 例如，含有1%到20%、优选为0到20%胎牛血清的RPMI 1640培养基， 含有1%到10。/。胎牛血清(Wako Pure Chemicals Co. Ltd.)的GIT培养基， 以及无血清的杂交瘤培养基(SFM-lOl， Nissui Pharmaceutical Co.， Ltd.)。 培养温度一般为20到40°C、优选为大约37°C。培养时间一般为5天 到3周，优选为1到2周。培养一般可以在5%气态二氧化碳条件下进 行。杂交瘤培养上清液中的抗体滴度可以按照上面描述的测定抗血清中的抗体滴度的方法来测定。
(b)单克隆抗体的纯化
可以使用现有的方法来分离和纯化单克隆抗体，包括分离/纯化免 疫球蛋白的方法，如盐析、醇沉淀、等电点沉淀、电泳、使用离子交 换剂(例如DEAD)的吸附和解吸方法、超速离心、凝胶过滤，以及特异
性的纯化方法，在这种方法中抗体被活化的吸附剂如结合了抗原的固
相介质专一性收集，然后用蛋白A或蛋白G解离结合键而获得抗体。
多克隆抗体的制备
可以根据现有的方法或其修改方法来制备本发明的多克隆抗体。 例如，制备免疫原(肽抗原)或其与载体蛋白的混合物，然后象上述的单 克隆抗体的制备过程那样用它免疫温血动物，从被免疫的动物收集含 有本发明的蛋白的抗体产物，并在分离和纯化后，就可以制备到抗体 了。
就免疫温血动物的免疫原和载体蛋白的混合物而言，可以使用任 何类型的载体蛋白和任一的载体对半抗原的混合比率，只要能够有效 地产生用交联了载体的半抗原免疫的半抗原的抗体；例如，大约0.1到 20重量份、优选为大约1到5重量份的牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋 白、血蓝蛋白等结合到1重量份的半抗原上。
多种縮合试剂可用于将半抗原与载体偶联起来，包括戊二醛、碳 二亚胺、活化的顺丁烯二酰亚胺酯和活化的具有硫醇基和/或二硫吡啶 基团的酯试剂。
将縮合产物单独或与载体和稀释剂结合施用到温血动物能够产生 抗体的部位。在应用时，可以使用Freund's完全或不完全佐剂来提高 抗体生产能力。 一般来说在2到6周内施用一次，总共使用大约3到 10次。多克隆抗体可以从血液或腹水中收集，优选为如上所述免疫的温 血动物的血液。
抗血清中的多克隆抗体的滴度可以按照测定抗血清中的抗体滴度 的方法来测定。多克隆抗体的分离和纯化可以按照分离/纯化上述的单 克隆抗体过程中的分离和纯化免疫球蛋白的方法来进行。
含有与编码本发明的蛋白的DNA互补或基本上互补的核苷酸序
列的反义DNA(以后，后一个DNA有时称为"本发明的DNA"，前一 个反义DNA有时称为"反义DNA")可以是任何含有与本发明的DNA 互补或基本上互补的核苷酸序列、并且能够抑制DNA的表达的反义 DNA。
与本发明的DNA基本上互补的核苷酸序列可以是，例如，与本发 明的DNA互补的全部或部分核苷酸序列(即本发明的DNA的互补链) 具有大约70%或以上、优选为大约80%或以上、更优选为大约90%或 以上、最优选为大约95%或以上的同源性的核苷酸序列。特别优选的 是与编码本发明的蛋白的N-末端位点(例如，靠近起始密码子的核苷酸 序列)的区域的核苷酸序列的互补链具有大约70%或以上、优选为大约 80%或以上、更优选为大约卯％或以上、最优选为大约95%或以上的 同源性的反义DNA。这样的反义DNA可以使用例如现有的DNA合成 仪来制备。
下面将描述本发明的致癌蛋白(部分肽，包括盐)、本发明的DNA、 本发明的抗体和本发明的反义DNA的应用。
(2)促进或抑制本发明的致癌蛋白的表达的化合物的筛选方法
技术领域：
本发明的致癌蛋白、本发明的寡聚核苷酸、本发明的转化子或本 发明的抗体可用于促进或抑制本发明的致癌蛋白的表达的化合物的筛选方法。
具体来说，本发明提供了
(i)筛选促进或抑制本发明的致癌蛋白的表达的化合物的方法，包 括在含有或不含测试化合物的情况下培养能够表达本发明的致癌蛋白 的细胞和组织时，测定和比较本发明的致癌蛋白的表达量或编码本发
明的致癌蛋白的mRNA的量。
能够表达本发明的致癌蛋白的细胞和组织的例子包括来源于人的 细胞、温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、禽类、兔、猪、绵羊、牛 和猴)细胞(例如，神经细胞、内分泌细胞、神经内分泌细胞、神经胶质 细胞、胰腺e-细胞、骨髓细胞、肝细胞、脾细胞、血管素膜细胞、表 皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂 肪细胞、免疫细胞(例如巨嗜细胞、T-细胞、B-细胞、自然杀伤细胞、 肥大细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性白细胞、单核细胞、树 枝状细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破 骨细胞、乳腺细胞、间质细胞及其前体细胞、干细胞和癌细胞，以及 任何这些细胞存在的所有组织，例如脑、脑部位点(例如嗅球、杏仁核、 基底池、海马区、视丘、下丘脑、大脑皮质、延髓(medula oblongata). 小脑)、脊髓、垂体腺、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺(thyroid gland)、 胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、胃肠道(例如大肠和小肠)、血 管、心脏、胸腺、脾脏、唾液腺、外周血、前列腺、睾丸(精巢)、卵巢、 胎盘、子宫、骨、软骨、关节和骨骼肌。在此，可以使用己确立的细 胞或原代培养系统。特别是，优选使用上述的本发明的转化体细胞。
培养能够表达本发明蛋白的细胞的方法如同上述的培养本发明的 转化体的方法。
除了上述的测试化合物外，测试化合物还可以是一个DNA文库。本发明的癌细胞的表达量可以使用现有的方法来测定，例如使用
例如抗体的免疫化学方法，或者可以使用利用Northern杂交、RT-PCR 或TaqManPCR的现有方法来测定编码本发明的致癌蛋白的mRNA。
可以根据现有的方法或其修改方法通过杂交来比较mRNA的表达 量，例如在《分子克隆第二版》，J. Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989中所描述的方法。
具体来说，按照现有的方法来测定编码本发明的致癌蛋白的 mRNA的量，即通过将从细胞中提取的RNA与本发明的多核苷酸或其 部分或本发明的反义多核苷酸接触，然后测量与本发明的多核苷酸或 其部分或本发明的反义多核苷酸结合的mRNA的量。本发明的多核苷 酸或其部分或本发明的反义多核苷酸可以使用例如放射性同位素或染 料进行标记，有助于测定与本发明的多核苷酸或其部分或本发明的反 义多核苷酸结合的mRNA的量。放射性同位素的例子包括32P和3H， 染料的例子包括荧光染料如荧光素、FAM(PE Biosystems Inc.)、 JOE(PE Biosystems Inc.)、 TAMRA(PE Biosystems Inc.)、 ROX(PE Biosystems Inc.)、 Cy5(Amersham Inc.)禾口 Cy3(Amersham Inc.)。
mRNA的量的测定可以通过使用反转录酶将从细胞提取的RNA 转化为cDNA，然后使用本发明的多核苷酸或其部分或本发明的反义多 核苷酸作为引物测量通过PCR扩增的cDNA的量。
因此， 一种增加编码本发明的致癌蛋白的mRNA的量的测试化合 物可以被选为促进本发明的致癌蛋白表达的化合物，而一种降低编码 本发明的致癌蛋白的mRNA的量的测试化合物可以被选为抑制本发明 的致癌蛋白表达的化合物。
本发明还提供了
(ii)筛选促进或抑制启动子活性的化合物的方法，包括在存在或不含测试化合物的情况下，对使用重组DNA转化获得的转化子进行培养
时，测定并比较报告蛋白的活性，在所述重组DNA中报告基因被连接
在编码本发明的致癌蛋白基因的启动子或增强子区域的下游。
可以使用的报告基因的例子包括lacZ(e-半乳糖苷酶基因)、氯霉 素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、生长因子、e-葡糖醛酸酶、碱性磷 酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)和e-内酰胺酶。
通过使用现有的方法测定报告基因产物(例如mRNA和蛋白)的 量，增加了报告基因产物的量的测试化合物可以被选为控制(尤其是促 进)本发明的蛋白的启动子或增强子活性的化合物，即作为促进本发明 的蛋白的表达的化合物。反过来，降低了报告基因产物的量的测试化 合物可以被选为控制(尤其是抑制)本发明的蛋白的启动子或增强子活 性的化合物，即作为抑制本发明的蛋白的表达的化合物。
测试化合物可以如前所述。
可以通过现有的技术构建或分析含有报告基因的载体(例如，参见 Molecular Biotechnology 13， 29-43, 1999)。
因为抑制本发明的致癌蛋白的表达的化合物可以抑制本发明的致 癌蛋白的生物学活性，它作为一种安全、低毒的抑制本发明的致癌蛋 白的生物学活性的医用药物是有用的。具体来说，它在作为癌症如肺 癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、 乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌、特别是宫颈癌的预防或 治疗剂方面是有用的。
使用本发明的筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或其盐可以
是，例如从下面的物质中选出的一种化合物肽、蛋白、非肽化合物、 合成的化合物、发酵产品、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取
31物和血浆。化合物的盐可以是如同描述的本发明的致癌蛋白衍生的肽 的盐。
当使用利用本发明的筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物作为上 述的治疗或预防试剂时，它可以照常使用。例如象在含有本发明的蛋
白的药物中描述的那样，它可以制成片剂、胶囊、酏剂(elixir)、微囊、
无菌溶液和悬浮液。
化合物或其盐的剂量依赖于多种因素，例如它的效果、靶疾病、 接受者和给药路线。例如，抑制本发明的蛋白表达的化合物的口服给
药来治疗癌症，它的剂量对于正常成年人(体重60公斤)来说每天为大 约0.1到100mg，优选为大约1.0到50mg,更优选为大约1.0到20mg。 尽管化合物的剂量依赖于多种因素诸如接受者和靶疾病，但在非肠道 给药时，在给一个正常的成年人(体重60公斤)施用抑制本发明的蛋白 的化合物治疗癌症时，每天静脉内注射的适当剂量为大约0.01到30mg， 优选为大约0.1到20mg，更优选为大约0.1到10mg。对于其它的动物， 可以施用将重量转换为60公斤的量。
(3)本发明的致癌蛋白的分析
本发明的抗体可以特异性识别本发明的致癌蛋白，因此可用于在 测试溶液中测定本发明的致癌蛋白，尤其是使用三明治免疫测试方法 的分析。
因此，本发明提供了
(i) 一种在测试溶液中测定本发明的致癌蛋白的方法，包含下列步 骤将本发明的抗体与测试溶液和本发明标记的蛋白进行竞争性反应， 然后测定结合到抗体上的本发明的标记的蛋白的比例；以及
(ii) 一种在测试溶液中分析本发明的致癌蛋白的方法，包含下列步 骤将测试溶液同时或连续地与在载体上不溶的本发明的抗体以及另 一个标记的本发明的抗体进行反应，然后测定在不溶性载体上的标记试剂的活性。
在(ii)中描述的测定中，理想的情况是一个抗体是能够识别本发明 的致癌蛋白的N-末端的抗体，而另一个抗体是能够与本发明的致癌蛋 白的C-末端反应的抗体。
针对本发明的致癌蛋白的单克隆抗体可以使用例如组织染色的方 法用来测定本发明的致癌蛋白或进行检测。为了这些目的，可以使用
抗体分子本身，也可以使用抗体分子的F(ab')2、 Fab'或Fab片段。
对使用本发明的抗体测定本发明的致癌蛋白的步骤没有特别的限 制，它可以是任何步骤，只要在测量溶液中相对于抗原的量(例如肽的 量)的抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量可以通过化学的或物理的方法 来测定，并且可以使用利用含有已知量的抗原的标准溶液作出的标准 曲线来计算所需的值。例如，浊度测定法、竞争测定、放免分析和三 明治分析方法都适合使用，根据灵敏度和特异性，下面描述的三明治 分析方法是特别优选的。
在使用这样的标记材料的分析中使用的标记试剂的例子包括放射 性同位素、酶、荧光物质和发光材料。放射性同位素的例子包括[1251]、 [1311]、卩H]和["C]。在这些当中，优选的是表现出很高比活性的稳定的 酶，包括e-半乳糖苷酶、P-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶 和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺和异硫氰酸荧光素。发 光材料的例子包括氨基苯二酰肼、氨基苯二酰肼衍生物、荧光素和硝 酸双-N-甲基吖啶。生物素-亲和素系统可用于将抗原或抗体与标记试剂
5口 口 o
抗原或抗体可以使用物理吸附，或者使用通常用于不溶化或固定 化肽或酶的化学键进行不溶化。载体的例子包括不溶性的多糖如琼脂
糖、葡聚糖、和纤维素；合成树脂例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷；以及玻璃。
在三明治分析中，本发明的不溶性的单克隆抗体与测试溶液反应 (第一个反应)，然后与另一个标记的本发明的单克隆抗体反应(第二个 反应)。然后，可以测定在不溶性的载体上的标记试剂的活性来分析在 测试溶液中的本发明的蛋白的量。第一个和第二个反应可以以相反的 次序，同时或连续地进行。标记试剂和不溶化的方法可以是如上所述 的方法。在使用三明治分析的免疫测定方法中，并不必需只使用一个 抗体来作为固定介质或进行标记，而是可以使用两个或多个抗体的混 合物来例如提高测量的灵敏度。
在根据本发明使用三明治分析法测定本发明的致癌蛋白中，用于 第一个和第二个反应的本发明的单克隆抗体优选为结合到本发明的癌 蛋白上不同位点的抗体。具体来说，对于用于第一个和第二个反应的 抗体而言，当用于第二个反应的抗体识别本发明的致癌蛋白的C-末端 时，用于第一个反应的抗体为识别C-末端以外的位点，例如N-末端的 抗体。 '
本发明的单克隆抗体可以用于三明治分析法以外的测量系统中， 例如竞争分析法、免疫测量法和浊度测定法。 '
在竞争分析法中，测试溶液中的抗原和标记的抗原与抗体进行竞 争性反应，未反应的标记抗原(F)与结合的标记抗原(B)分开(B/F分离)， 测定被标记B或F的量来分析在测试溶液中抗原的量。这种反应分析 可以在液相方法中使用，其中一种可溶性的抗体用作抗体，聚乙二醇 和针对上述抗体的第二抗体被用于B/F分离，此外也可以在固相方法 中使用，其中一种固定化的抗体被用作第一抗体，或者第一抗体是可 溶性的，第二抗体是一种固定化抗体。
在免疫测量法中，在测试溶液中的抗原和一个固定化抗原与给定量的标记的抗体进行竞争反应，然后分离固相和液相，也可以是测试 溶液中的抗原与过量的标记抗体进行反应，然后加入一种固定化的抗 原将未反应的标记抗体结合到固相上，然后将固相和液相分离。然后， 测定在两种相中的标记的量以分析在测试溶液中的抗原的量。
浊度测定法测定在凝胶或溶液中由于抗原-抗体反应形成的不溶 性沉淀的量。即使当测试溶液中的抗原量很少以至于只形成少量的沉 淀时，利用激光散射的激光浊度测定法也可以适当使用。
对于实施每一种分析本发明的免疫测定方法而言，不需要特殊的 条件或操作。可以根据每种方法的通用条件和操作进行对熟悉本领域 技术的人来说熟知的修改，来建立本发明的蛋白的测量系统。有关这 些通用的技术步骤的详细情况可以在各种综述和教科书中发现。
这些文献可以是，例如"放射免疫分析"Hiroshilrie编，Kodansha， 1974年出版；"放射免疫分析第二版"Hiroshilrie编，Kodansha， 1979 年出版；"酶免疫分析"Eiji Ishikawa等编，Igaku-Shoin， 1978年出版; "酶免疫分析第二版"Eijilshikawa等编，Igaku-Shoin， 1982年出版； "酶的免疫分析第三版"Eijilshikawa等编，Igaku-Shoin， 1987年出版; "酶学方法"Vol. 70 (免疫化学技术(部分A));"酶学方法"Vol. 73 (免 疫化学技术(部分B));"酶学方法"Vol. 74(免疫化学技术(部分C));
"酶学方法"Vol. 84(免疫化学技术(部分D:免疫分析精选))；"酶学
方法"Vol. 92 (免疫化学技术(部分E:单克隆抗体和普通免疫分析方 法))；和"酶学方法"Vol. 121 (免疫化学技术(部分I:杂交瘤技术和 单克隆抗体))(这些由Academic Press出版)。
当使用本发明的抗体分析本发明的致癌蛋白的水平检测到该水平 降低时，例如，可以得出诊断，受试者有与本发明的致癌蛋白不足有 关的疾病，或者在将来可能得此病。当检测到本发明的蛋白的水平增加时，例如，可以得出诊断，受 试者有由本发明的致癌蛋白过量表达所诱导的疾病，包括癌症例如肺
癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、 乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌(特别是宫颈癌)，或者在将 来可能得病。
本发明的抗体可用于检测存在于样品例如体液和组织中的本发明 的致癌蛋白。它也可以用于制备抗体柱，用于纯化本发明的致癌蛋白， 在纯化中检测每个级分中的本发明的蛋白，以及分析本发明的蛋白在 测试细胞中的特性。
(4)基因诊断试剂
本发明的多核苷酸或反义多核苷酸也可用作例如核酸探针，用于
检测主要是人体编码本发明的致癌蛋白的DNA或mRNA的异常(基因 缺陷)。例如，它可用作损伤、突变、或DNA或mRNA的表达减少或 mRNA的过量表达的基因诊断试剂。
上述的使用本发明的多核苷酸或反义多核苷酸的基因诊断，可以 根据例如现有的Northern杂交或PCR-SSCP来进行(参见Genomics, Vol. 5， pp.874-879 (1989); Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America, Vol.86, pp.2766-2770 (1989))。
例如，当使用Northern杂交检测到mRNA表达降低时，可以得出 诊断，受试者有与本发明的致癌蛋白不足有关的疾病，或者在将来可 能得病。
当使用Northern杂交检测到mRNA过量表达时，例如，可以得出 诊断，受试者有由本发明的致癌蛋白过量表达所诱导的疾病，包括癌 症例如肺癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、 膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌(特别是宫颈癌)，或者在将来可能得病。 (5)含有反义多核苷酸的药物
能够互补结合到本发明的多核苷酸(例如DNA)上并抑制多核苷酸 (例如DNA)的表达的本发明的反义多核苷酸具有较低的毒性，并且可 以在体内抑制本发明的蛋白或本发明的多核苷酸(例如DNA)的活性。 因此，它可用作由本发明的蛋白的过量表达诱导的疾病的预防或治疗 剂，例如癌症如肺癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺 癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌。
当使用反义多核苷酸作为上述的预防或治疗剂时，反义多核苷酸 可以配制成上述的本发明的多核苷酸的剂型。
这样获得的制剂具有较低毒性，可以口服或非胃肠道施用到人或 哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗和猴)。
反义多核苷酸可以这样给药，为了促进摄入也可以与生理可接受 的载体如佐剂结合使用，使用基因枪或导管如水凝胶导管。
反义多核苷酸的剂量依赖于许多因素而变化，例如靶疾病、接受 者以及给药路线，当本发明的反义多核苷酸局部给药到器官(例如，肝 脏、肺、心脏和肾脏)以治疗癌症时，剂量为例如每个成年人(60公斤体 重)每天大约0.1到100mg。
此外，反义多核苷酸可以用作诊断的核苷酸探针，用来测定组织 或细胞中本发明的癌基因的存在或其表达状态。
本发明还提供了
(i) 一个含有编码本发明的蛋白的RNA或其互补RNA的一部 分的双链RNA;(ii) 一种含有双链RNA的药物； 在适当时
(iii) 一个含有编码本发明的蛋白的RNA—部分的核酶；以及
(iv) —个含有核酶的药物。
这些双链RNA(RNAi;RNA干扰方法)和核酶象上述的反义寡聚核 苷酸一样能够抑制本发明的多核苷酸(例如，DNA)的表达，并能够在体 内抑制本发明的致癌蛋白或多核苷酸(例如DNA)的活性。因此，它可
以用作预防或治疗剂用于由本发明的致癌蛋白过量表达所诱导的疾 病，例如癌症例如肺癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列 腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌， 尤其是宫颈癌。
双链RNA可以在本发明的多核苷酸序列的基础上根据现有的方 法(参见例如Nature, Vol. 411， p.494, 2001)来设计和生产。
核酶可以在本发明的多核苷酸的基础上根据现有的方法(参见例 如Trends in Molecular Medicine, Vol.7， p.221, 2001)来设计和生产。例 如，它可以通过将现有的核酶连接到编码本发明的蛋白的RNA的一个 部分上来产生。编码本发明的蛋白的RNA的一个部分的例子是一个靠 近本发明的RNA上能够被现有的核酶降解的限制性位点的部分(RNA 片段)。
当使用双链RNA或核酶作为上述的预防或治疗剂时，它可以象使 用反义多核苷酸中描述的那样配制和给药。
(6)含有本发明的抗体的医疗药物
能够中和本发明的致癌蛋白的癌变活性的本发明的抗体可以用作 预防或治疗剂用于本发明的致癌蛋白过量表达所诱导的疾病，例如癌 症例如肺癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌，尤其是宫颈癌。
上述的含有本发明的抗体的用于预防和治疗疾病的药物可以口服 或非胃肠道施用给人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、 狗和猴)，可以作为溶液或药物组合物的合适剂型使用。剂量可以依赖 于许多因素而变化，例如接受者、靶疾病、症状以及给药路线，本发
明的抗体的剂量可以是，例如， 一般为0.01至lj 20mg/Kg，优选为0.1 到10 mg/Kg，更优选为0.1到5 mg/Kg，每天大约1次到5次，优选为 每天1到3次。它可以通过静脉内注射而适当地给药。在其它的非胃 肠道或口服给药方式中，可以使用与上述相似的剂量。如果症状特别 严重，剂量也可以根据症状增加。
本发明的抗体可以本身或作为适当的药物组合物给药。用于上述 给药的药物组合物含有上述的抗体或其盐以及可药用的载体、稀释剂 或赋形剂。这些组合物被提供为适合于口服或非胃肠道给药的剂型。
具体而言，口服的组合物的例子包括固体和液体剂型，包括片剂 如糖衣片剂和薄膜片剂、丸剂、颗粒、粉末、胶囊例如软胶囊、糖浆、 乳剂和悬浮剂。这样的组合物使用现有的方法制备，并且含有在药物 领域常用的载体、稀释剂或赋形剂。用于片剂的载体或赋形剂的例子 包括乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸镁。
用于非胃肠道给药的组合物的例子包括注射液和栓剂。注射液的 例子包括静脉内注射液、皮下注射液、皮内注射液、肌内注射液和静 脉内滴注液。这样的注射液可以用现有方法制备；例如，通过将上述 的抗体或其盐在注射液常用的无菌水或油液中溶解、悬浮或乳化。用 于注射的水性液体的例子包括盐水和含有葡萄糖或其它佐剂的等渗溶 液，可以与适当的助溶剂结合使用，包括醇类如乙醇；多元醇如丙二 醇和聚乙二醇；非离子性表面活性剂如聚山梨酸酯80和HCO-50(氢化 的蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物)。油状液体的例子包括芝麻油和大豆油，可以与助溶剂如苄基苯甲酸和苄醇结合使用。这样制备的注射 液一般填充在适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂一般通过将上述的 抗体或其盐与常用的栓剂基质混合而制备。
口服或非胃肠道给药的药物组合物方便地制备成适合于活性组合 物的剂型。这样的单位剂型的例子包括片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安
瓿)和栓剂。每个单位剂型优选一般含有大约5到500mg上述抗体。特 别是，注射剂含有5到100mg，而另外的剂型含有10到250mg。
每个上述的组合物可以含有其它的活性组合物，只要当它们与抗 体复合时不产生不需要的相互作用。
(7)转化DNA的动物
本发明提供了非人类的哺乳动物，例如一个"敲入"动物，它含 有编码本发明的人源致癌蛋白的DNA(以下称为"本发明的癌基因 DNA")或其变体DNA。
具体来说，本发明提供了
(1) 一个具有本发明的人源癌基因DNA或其变体DNA的非人类哺
乳动物("敲入"动物)；
(2) "敲入"动物，其中非人类哺乳动物为啮齿动物；
(3) "敲入"大鼠或小鼠，其中啮齿动物是大鼠或小鼠；以及
(4) 一个重组载体，其中含有可以在非人类哺乳动物中表达的本发 明的人源癌基因DNA或其变体DNA。
含有本发明的人源癌基因DNA或其变体DNA的非人类哺乳动物 (以下称为"本发明的转化DNA的动物")可以通过将所需的DNA转 入一个未受精的卵、 一个受精卵、 一个精子或生殖细胞包括它们的原 始细胞而产生，优选为在非人类哺乳动物发育的胚胎发生阶段(更优选 为在单细胞或受精卵细胞阶段并且通常直到8细胞阶段)，可以使用适当的方法例如磷酸钙方法、电脉冲方法、脂质转染法、凝聚、微注射、
微粒枪法和DEAE-葡聚糖进行。通过DNA转化方法，可以将本发明所 需的外源DNA转化到体细胞、活器官或组织细胞中，用于细胞培养或 组织培养。此外，可以通过现有的细胞融合方法将细胞与上述的生发 细胞融合，以产生本发明的DNA转化的动物。
非人类哺乳动物的例子包括牛、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、
豚鼠、仓鼠、小鼠和大鼠。在这些动物中，优选的为啮齿动物，特别 是小鼠(例如纯系如C57BL/6和DBA2株，以及杂交系如B6C3F, 、 BDF!、 B6D2F^ BALB/c、 ICR株)或大鼠(例如，Wistar和SD)，因为对于产 生一个疾病动物模型来说，它们的个体发育和生物学周期相对较短， 并且易于饲养。
对于能够在哺乳动物中表达的重组载体而言，"哺乳动物"除了 上述的非人类哺乳动物外，还可以是人。
本发明的人源癌基因的变体DNA不是指在非人类哺乳动物中天 生的与本发明的癌基因类似的DNA，而是人工突变的DNA。
本发明的变体DNA可以是这样的本发明的人源癌基因DNA，其 原始核苷酸序列已经改变(例如，突变)，诸如添加了一个碱基、缺失、 或用其它碱基取代的DNA，或是一个异常的DNA。
异常的DNA是指一个DNA，它能够表达与本发明的正常致癌蛋 白相同但活性不同的蛋白；例如一个DNA，它表达了一个本发明的正 常致癌蛋白的活性被抑制的肽。
为了将本发明的癌基因DNA转化入靶非人类哺乳动物，一般来说 优选使用的DNA为结合在一个能够在非人类动物细胞中表达DNA的 启动子的下游的DNA构建体。例如，当转化本发明的人源DNA时，
41已经结合了本发明的人源癌基因DNA的DNA构建体(例如，载体)被 微注射到一个靶非人类哺乳动物的受精卵中，例如， 一个鼠的受精卵， 该DNA构建体位于任一的多种启动子的下游，这些启动子能够表达从 任何与本发明的DNA具有较高的同源性的多种非人类哺乳动物(例如 兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠)衍生的DNA，从而产生一个能 够高效表达本发明的癌基因DNA的DNA转化的非人类哺乳动物。
适用于本发明的致癌蛋白的表达载体的例子包括大肠杆菌衍生的 质粒、枯草芽孢杆菌衍生的质粒、酵母衍生的质粒、噬菌体如A-噬菌 体、反转录病毒如莫洛尼白血病病毒和哺乳动物病毒如痘苗病毒和杆 状病毒，优选为大肠杆菌衍生的质粒、枯草芽孢杆菌衍生的质粒和酵 母衍生的质粒。
调控DNA表达的启动子的例子包括
(i) 从病毒(例如猿猴病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒、JC病 毒、乳癌病毒和脊髓灰质炎病毒)衍生的DNA的启动子；
(ii) 从各种哺乳动物(例如人、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠和小 鼠)衍生的启动子；例如白蛋白、胰岛素II、 uroplakinll、弹性蛋白酶、 红细胞生成素、内皮素、肌酸激酶(muscle cretine kinase)、胶质原纤维 酸性蛋白、谷胱甘肽S-转移酶'、血小板衍生生长因子(5、角蛋白Kl、 K10和K14、 I和II型胶原蛋白、环-AMP依赖性蛋白激酶pi亚基、肌 营养不良蛋白、酒石酸抗性碱性磷酸酶、心房钠利尿因子、内皮受体 酪氨酸激酶(一般縮写为"Tie2")、钠钾腺苷三磷酸酶(Na,K-ATPase)、 神经丝轻链、金属硫堇I和IIA、金属蛋白酶-1组织抑制剂、MHCI类 抗原(H-2L)、 H-ms、肾素、多巴胺(5-羟化酶、甲状腺过氧化物酶(TPO)、 肽链延伸因子la(EF-la)、 (3-肌动蛋白、oc-和p-肌球蛋白重链、肌球蛋 白轻链1和2、髓鞘基质蛋白、甲状腺球蛋白、Thy-l、免疫球蛋白、 可变H链部分(VNP)、血清淀粉状P组合物、肌红蛋白、肌钙蛋白C、 平滑肌a-肌动蛋白、前脑啡肽原A和加压素启动子。在这些启动子中， 优选的为能够在全身高效表达的巨细胞病毒启动子、人类肽链延伸因子lot(EF-la)、人类和禽类(5-肌动蛋白启动子。
上述的载体优选包含在DNA转化的非人类哺乳动物中能够终止 所需信使RNA转录的序列(一般称为"终止子")。例如可以使用来自 牛或多种哺乳动物的DNA序列，优选为猿猴病毒SV40终止子。
此外，如果需要，可以给每个DNA连接上剪接信号，在启动子区 的5，-上游中、在启动子区和翻译区之间或在翻译区的3'-下游连入增强 子区或一部分真核DNA内含子以更高地表达所需的癌基因DNA。
使用从人源的肝、肾或甲状腺细胞得到的全部或部分基因组 DNA、来自成纤维细胞的DNA或各种市售的基因组DNA文库，或是 通过现有方法从来自肝细胞、肾细胞、甲状腺细胞或成纤维细胞的RNA 制备的互补DNA作为起始材料，可以获得本发明的正常致癌蛋白的翻 译区。为了通过突变诱导产生异常的DNA，可以通过点突变诱导方法 对从上述细胞或组织获得的正常肽的翻译区进行突变以产生突变的翻 译区。
可以通过常用的DNA工程步骤将翻译区产生为能够在DNA转化 的动物中表达的DNA构建体，其中翻译区被连接在启动子的下游，或 者如果需要，可以连接在转录终止位点的上游。
本发明的人源癌基因DNA在受精卵细胞阶段进行转移以便DNA 被靶非人类哺乳动物中所有的生殖细胞和体细胞所携带。在一个DNA 转化后产生的动物的生殖细胞中存在本发明的癌基因DNA意味着产生
的动物的所有后裔在它们的所有生殖细胞和体细胞中都携带本发明的 癌基因DNA。这类遗传了本发明的癌基因DNA的动物的后代在它们 的所有生殖细胞和体细胞中都携带本发明的癌基因DNA。
转化了本发明的人源的癌基因DNA的非人类哺乳动物，在经过交配证实了该哺乳动物稳定地携带了人源的癌基因DNA后，可以作为携
带癌基因DNA的哺乳动物在常规的繁殖条件下连续地繁殖。
本发明的人源癌基因DNA在受精卵细胞阶段进行转移以便DNA 被靶非人类哺乳动物中所有的生殖细胞和体细胞所携带。在一个DNA 转化后产生的哺乳动物的生殖细胞中存在本发明的癌基因DNA意味着 产生的动物的所有后裔在它们的所有生殖细胞和体细胞中都携带本发 明的癌基因DNA。这类遗传了本发明的人源癌基因DNA的动物的后 代在它们的所有生殖细胞和体细胞中都携带本发明的癌基因DNA。
可以产生在两条同源染色体上都带有转导的DNA的纯合动物，并 且雄性和雌性动物可以交配以连续地繁殖，以便所有的后代都连续地 带有DNA。
在具有本发明的人源癌基因DNA的非人类哺乳动物中，本发明的 正常DNA高效表达，固有的正常DNA的活性可以被促进，有时会导 致出现本发明的蛋白的活性过强。因此，它可以被用作疾病的模型动 物。例如，本发明的正常DNA转化的动物可以被用来解释本发明的致 癌蛋白活性过强的机制、或是与本发明的致癌蛋白相关的疾病的机制， 还可用来研究这些疾病的治疗。
此外，因为转化了本发明的人源的癌基因DNA的非人类哺乳动物 表现出本发明的游离蛋白量的增加，因此可用于筛选针对与本发明的 致癌蛋白相关的疾病的治疗剂。
另一方面，带有异常的本发明的DNA的非人类哺乳动物，在经过 交配证实了该动物稳定地携带了转导的DNA后，可以作为携带DNA 的动物在常规的繁殖条件下连续地繁殖。此外，所需的异常DNA可以 整合到上述的质粒中作为起始材料。带有启动子的DNA构建体可以通 过常规的DNA工程过程产生。异常的本发明的DNA在受精卵细胞阶段被转化，以便DNA被靶哺乳动物中所有的生殖细胞和体细胞所携带。 在DNA转化后产生的动物的生殖细胞中存在异常的本发明的DNA意 味着产生的动物的所有后裔在它们的所有生殖细胞和体细胞中都携带 异常的本发明的DNA。这类遗传了异常的本发明的DNA的动物的后 代在它们的所有生殖细胞和体细胞中都携带异常的本发明的DNA。可 以产生在两条同源染色体上都带有转化的DNA的纯合动物，并且雄性 和雌性动物可以交配以连续地繁殖，以便所有的后代都连续地带有 DNA。
在具有异常的本发明的DNA的非人类哺乳动物中，异常的本发明 的DNA高效表达，固有的正常DNA的活性可以被抑制，有时会导致 本发明的蛋白的失活型的失效。因此，它可以被用作疾病的模型动物。 例如，本发明的异常DNA转化的动物可以被用来解释本发明的致癌蛋 白失活型不应性的机制，还可用来研究这些疾病的治疗。
作为一种特殊的应用，高度表达异常的本发明的DNA的动物可以 用作一个模型，以解释在本发明的蛋白的失活型不应性中异常的本发 明的肽对正常肽活性的抑制(显著的负活性)。
此外，因为转化了异常的本发明的DNA的非人类哺乳动物表现出 本发明的游离致癌蛋白量的增加，因此可用于筛选针对致癌蛋白或其 失活型不应性的治疗剂。
本发明的DNA转化的动物可用于研究与本发明的致癌蛋白相关 的疾病的临床症状，例如本发明的蛋白的失活型不应性。此外，动物 可以在与本发明的致癌蛋白相关的疾病模型中给出每个器官的更特异 的病理观察，并且对新的疗法的开发以及研究和治疗由于上述疾病引 起的第二种疾病有贡献。
可以从本发明的DNA转化的动物中提取每个器官、切碎，用蛋白
45酶如胰蛋白酶处理以获得游离的DNA转化的细胞。然后将细胞进行培 养，并将培养的细胞进行世系研究。此外，它还可用于鉴定产生本发 明的致癌蛋白的细胞，以及研究其中与细胞凋亡(apotosis)、分化或生 长或信号传导和畸形有关的机制。因此，它可以成为一种有效的研究 对象，用来阐明本发明的致癌蛋白及其活性。
此外，为了开发针对与本发明的致癌蛋白相关的疾病如本发明的 蛋白的失活型不应性的治疗剂，本发明的DNA转化的动物可用于提供 一种有效和快速的筛选方法，使用上述的测试和分析步骤进行筛选。
一个其类似于本发明的癌基因的基因DNA是失活的非人类哺乳 动物的生殖干细胞，对于产生不足以表达本发明的癌基因DNA的非人 类哺乳动物模型是非常有用的。 一个其类似于本发明的癌基因的基因 DNA表达不足的非人类哺乳动物不具有可以被本发明的致癌蛋白诱导 的各种生物活性。因此，它可以作为一个模型用于本发明的致癌蛋白 的生物活性失活所引起的疾病。因此，它对于阐明疾病的原因以及研 究其治疗方法是有用的。
(8a)筛选针对由本发明的癌基因DNA缺失或损坏而引起的疾病的治疗 或预防化合物的方法
一个其本发明的DNA表达不足的非人类哺乳动物可以用来筛选 针对由本发明的DNA缺失或损坏而引起的疾病的治疗或预防化合物。
因此，本发明提供了一种用于筛选针对由本发明的DNA缺失或损 坏而引起的疾病的治疗或预防化合物或其盐的方法，包括下列步骤-将测试化合物施用给本发明的DNA表达不足的非人类哺乳动物，然后 观察和/或测定动物中的变化。
用于筛选过程的本发明的DNA表达不足的非人类哺乳动物可以 如前所述的非人类哺乳动物。测试化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发 酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆，它们可 以是新的也可以是已知的化合物。
(8b)筛选促进或抑制本发明的癌基因DNA的启动子活性的化合物
本发明提供了一种筛选促进或抑制本发明的癌基因DNA的启动 子活性的化合物或其盐的方法，包括下列步骤将测试化合物施用给 本发明的DNA表达不足的非人类哺乳动物，然后测定报告基因的表达。
在筛选方法中，在本发明的DNA表达不足的非人类哺乳动物中， 本发明的DNA表达不足的非人类哺乳动物可以是这样的动物，其中本 发明的DNA由于转导了报告基因而失活，并且报告基因可以在本发明 的DNA的启动子控制下表达。
测试化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发 酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆，它们可 以是新的也可以是已知的化合物。
可以使用的报告基因可以如前所述；适当的p-半乳糖苷酶基因 (lacZ)、可溶性碱性磷酸酶基因和荧光素酶基因。
在本发明的癌基因DNA被报告基因取代了的本发明的DNA表达 不足的非人类哺乳动物中，报告基因在本发明的DNA的启动子控制之 下，以便可以跟踪报告基因编码的物质以检测启动子的活性。
例如，当编码本发明的致癌蛋白的DNA区的一部分被一个来自大 肠杆菌的P-半乳糖苷酶基因(lacZ)所取代时，(3-半乳糖苷酶代替了本发 明的致癌蛋白在自然情况下表达本发明的致癌蛋白的组织中表达。因 此，例如通过用p-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3』引哚-(3-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)作为试剂进行染色，就可以方便地观察在活动物中本发明 的致癌蛋白的表达状态。具体来说， 一个与本发明的致癌蛋白同源的 蛋白缺陷的小鼠或其组织切片通过例如戊二醛进行固定，用磷酸盐缓 冲液(PBS)冲洗，然后在室温或大约37'C下与含有X-gal的染色液反应 30分钟到1小时。这样获得的组织样品用lmMEDTA/PBS冲洗以终止 (3-半乳糖苷酶的反应，然后可以观察到颜色。此外，编码lacZ的mRNA 也可以这样检测。
使用上述筛选方法获得的化合物或其盐选自上述的测试化合物， 所述测试化合物能够促进或抑制本发明的癌基因DNA的启动子活性。
通过上述筛选方法选出的化合物可以形成盐，可以是生理可接受 的酸(例如无机酸)或碱(例如有机碱)的盐，优选为酸加成的盐。这样的 盐的例子包括无机酸如盐酸、磷酸、氢溴酸和硫酸、或有机酸如乙酸、 甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、 草酸、甲基磺酸和苯甲基磺酸的盐。
因为促进本发明的癌基因DNA的启动子活性的化合物或其盐促 进肽的活性，它在作为例如预防和治疗剂用于与本发明的致癌蛋白不 足相关的疾病的医用药物方面是有用的。
在另一方面，抑制编码本发明的致癌蛋白的DNA的启动子活性的 化合物及其盐，在作为安全低毒的抑制本发明的致癌蛋白的癌症诱导 活性的药物，例如作为癌症如肺癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵 巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌 和胰腺癌的预防或治疗剂方面是有用的。
从上述筛选选出的化合物的衍生物也可以使用。
含有通过筛选方法选出的化合物或其盐的药物可以制备成适合于
48运送到靶癌组织的剂型，如同含有针对给定癌症的现有的抗癌药的药 物。
因为这样制备的剂型是安全和低毒的，它可以施用给主要的接受
者人或可以预期获得同样的疗效的哺乳动物(如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、 绵羊、猪、牛、马、猫、狗和猴)。
化合物或其盐的剂量依赖于多种因素例如靶疾病、接受者和给药
路线而改变。例如，口服施用抑制本发明的DNA的启动子活性的化合 物来治疗癌症，它的剂量对于正常成年病人(体重60公斤)来说每天为 大约0.1到100mg，优选为大约l.O到50mg，更优选为大约1.0到20mg。 尽管化合物的剂量依赖于多种因素如接受者和靶疾病而改变，但在非 肠道给药时，在给一个正常的成年病人(体重60公斤)使用抑制本发明 的DNA的启动子活性的化合物治疗癌症时，每天静脉内注射的适当剂 量为大约0.01至ij 30mg，优选为大约0.1至ij 20mg，更优选为大约0.1 到lOmg。对于其它的动物，可以施用将重量转换为60公斤的量。
因此，本发明的癌基因DNA表达不足的非人类哺乳动物，对于筛 选促进或抑制本发明的癌基因DNA的启动子活性的化合物或其盐来说 是相当有用的，并且对賴明由于本发明的癌基因DNA表达不足引起的 各种疾病的原因，以及开发用于疾病的预防或治疗剂，具有极大的贡 献。
此外，使用含有本发明的致癌蛋白的启动子区域的DNA，编码给 定蛋白的基因可以连接在下游位点，并且产物可以被注射到动物卵细 胞中以产生所谓的转基因动物(渗入基因的动物)，以便可以特异性地引 起癌基因的体内表达而同时避免癌变。此外，合适的报告基因可以连 接到启动子区以建立一个表达基因的转化细胞系，可以用作一个体内 搜索系统，用于搜索能够特异性促进或抑制本发明自身的致癌蛋白的 体内生产能力的低分子量化合物。20091 当被用于预防或治疗癌症时，调节本发明的致癌蛋白的活性的化
合物或其盐可以和其它的抗癌试剂结合使用，例如ifosfamide、 UTF、 阿霉素、博来霉素(peplomycin)、顺氯氨铂、环磷酰胺、5-FU、 UFT、 氨甲蝶呤、丝裂霉素C和米托蒽醌。
实施例
参考实施例本发明将更为具体。这些实施例包含在本发明的最优 选实施方案中，但是本发明不限于这些实施方案。
实施例1
编码人的hWAPL的cDNA的克隆和测序
使用市售的cDNA文库、人的睾丸cDNA试剂盒 (Marathon-Ready cDNA Kit; Clontech Inc.)作为模板，使用下述两个引 物进行PCR:
引物l
(j^列:TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG);禾口
引物2
(序歹U: TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA)。 在PCR反应中使用了 Advantage 2聚合酶混合物试剂盒(Clontech Inc.),
参考试剂盒的说明用下列的温度循环进行扩增
(1) 94 °C 1分钟；
(2) 94°C 10秒，72°C 2分钟，共5个循环；
(3) 96°C 10秒，70°C 2分钟，共25个循环，然后在72。C进 行延伸反应5分钟。反应后，参考pGEM-Teasy (PROMEGA)的使用说 明，将获得的PCR扩增的产物被克隆到质粒载体pGEM-T easy (PROMEGA)中。它被转化到大肠杆菌DH5 a (Invitrogen)中，利用质粒 载体pGEM-Teasy上的氨卞青霉素抗性基因，在含有氨卞青霉素的LB 琼脂培养基上筛选带有质粒的克隆。每个选出的克隆带有的质粒被测序，获得克隆的新的CDNA的序
列(SEQ.ID.No.2)。含有从cDNA核苷酸序列中的ORF推导出的氨基酸 序列(SEQ.ID.No.l)的新的蛋白被命名为人的WAPL(hWAPL)。带有克 隆在质粒中的全长hWAPL cDNA的转化子被命名为大肠杆菌DH5 pGEMhWAPL。
实施例2
hWAPL基因在人癌组织中的表达
在东京医学院医院外科切除癌组织的受试病人的同意之下，提供 了外科切除的癌组织的样品。通过Northern杂交和实时PCR检测了在 外科切除的癌组织的样品中存在hWAPL基因的表达，并测定了其表达
在Northern杂交中，利用具有与SEQ.ID.No.2的hWAPL全长序 列中的核酸从2511到2813的部分互补的核苷酸序列的DNA为检测探 针，从制备的总RNA中鉴定了从hWAPL表达的mRNA。另一方面， 在实时PCR中，使用扩增试剂盒SYBR Green I (TaKaRa Co. Ltd.)和下 列的PCR引物对作为引物，扩增了 hWAPL的cDNA:
5, -G AATTC ATAGGC ACAGCGCTGAACTGTGTG-3'禾口 5 ，匿TTGAATTCCTAGC AATGTTCC AAATATTC 3'
此外，人的P-肌动蛋白被用作内在的标准。用于扩增人的P-肌动 蛋白的cDNA的PCR引物是市售的引物对(Clontech): 5 ， -GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'和 5' -TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。
实时PCR选择的热循环条件如下
(a) 95。C 30秒；
(b) 95°C 3秒，68°C 30秒，共40个循环；然后
(c) 87。C 6秒。对于PCR反应中的热循环，使用了 Smart Cyder System (TaKaRa Co.Ltd.)。双链cDNA的量通过荧光标记的方法检测，以测定扩增产物 的量。
对于上面提到的癌组织样品，总RNA的比较样品是根据现有的方 法(Oikawa等，Cancer Res., 61， 5707-5709 (2001))，从每个组织的正常 细胞和癌细胞中制备的。在被检测宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、胃癌、 肾癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌的癌细胞之中，大约40%的宫颈癌癌细 胞样品表现出明显的hWAPL基因表达(图5)。
检测宫颈癌的癌细胞样品中是否存在HPV的感染。具体来说，参 考现有的方法(Nakagawa等，J. Med. Virol., 62, 251-258 (2000))，使用相 应的引物通过RT-PCR检测了来自HPV的E6/E7基因的mRNA区域， 并且在所有侵入性宫颈癌癌细胞样品中，HPV的感染和E6/E7基因的 表达都被证实了。意外的是， 一些胃癌样品也表现出hWAPL基因的高 表达。
实施例3
通过来自HPV 16的E6和E7诱导hWAPL基因的表达
使用下面的引物对通过RCR方法扩增和分离了来自HPV 16的E6
基因
16E6attBl:
5' - AAAAAGCAGGCTCC ACCATGTTTCAGGACCC ACAGGAGC GACCC-3，，和 16E6attB2:
5 ，-AGAAAGCTGGGTTACAGCTGGGTTTCTCTACGTG-3'
使用下面的引物对通过RCR方法扩增和分离了来自HPV 16的E7
基因16E7attBl:
5 ， - AA AAAGC AGGCTCC ACC ATGC ATGG AG ATAC ACCT ACAT-
3',和
16E6attB2:
5'-AGAAAGCTGGGTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGG-3'
然后，按照Naviaux等的步骤(Naviaux等，J. Virol., 70， 5701-5705 (1996))，每个这些基因被克隆到反转录病毒载体pCLXSN中，产生了 分别能够产生E6和E7重组子的反转录病毒LXSN-16E6和 LXSN-16E7。此外，同时产生了能够产生E6和E7重组子的反转录病 毒LXSN-16E6E7。
已经发现来自HPV的E2基因的产物能够结合到E6和E7基因的 启动子区域，具有抑制其转录的功能，并且来自牛乳头瘤病毒(BPV) 的E2基因的产物具有同样的抑制转录的功能。以pBPV-MII为模板通 过嵌套PCR获得了 BPV1 E2基因片段。在嵌套PCR中，所用的内侧 引物对为
5' - AAAAAGC AGGCTCCACC ATGGAGACAGCATGCGAAC-3'和 5' - AGAAAGCTGGGTCAGAAGTCC AAGCTGGCTGTAAAG-3'
所用的外侧引物对为
5, -GGGG AC AAGTTTGTACAAAAAAGC AGGCT-3'禾卩 5' -GGGGAC AAGTTTGTAC AAGAAAGCTGGGT-3'
这样获得的BPVl E2基因片段被克隆到反转录病毒载体 pCMSVpuro中，这是一个基于通用目的的病毒载体pCMSV (Clontech) 的载体，制备了能够产生来自BPV的E2重组子的反转录病毒 MSCV-puro BPV1E2。反转录病毒载体pCMSVpuro含有一个嘌呤霉素 抗性基因作为选择标记。用反转录病毒LXSN-16E6、 LXSN-16E7和LXSN-16E6E7感染人 表皮细胞HDKl(BioWhittaker)以分别产生来自HPV16的E6和E7重组 蛋白。使用用反转录病毒载体pCLXSN感染的人表皮细胞HDKl作为 阴性对照。通过将细胞在含有50ixg/mL G418的培养基中培养3天， 筛选到了其中建立了连续的反转录病毒载体感染的细胞系。感染后， 通过Western印迹，使用了识别致癌蛋白hWAPL的50到66的部分氨 基酸序列区(氨基酸序列CNFKPDIQEIPKKPKVEE)的特异性抗体，测 定了由来自HPV16的E6或E7重组蛋白诱导的hWAPL基因的表达(图 6)。
同时，通过Western印迹还测定了 p53抑制蛋白的表达量。然后， 再度证实了 E6产物促进p53肿瘤抑制蛋白的切割，导致了致癌蛋白 hWAPL的表达。
此外，当用MSCV-puro BPV1E2感染宫颈癌的癌细胞系CaSki、 SiHa和C33A时，在产生来自HPV16的E6和E7的CaSki和SiHa细 胞系中，由于来自BPV的E2抑制了E6和E7基因的转录，表现出剩 余的p53肿瘤抑制蛋白增加。与此相伴随，致癌蛋白hWAPL的表达被 抑制了(图6)。另一方面，在C33A细胞系中，诱导其癌变的机理不是 由HPV感染引起的，剩余的p53肿瘤抑制蛋白的量或致癌蛋白hWAPL 的表达量不受影响。这个结果表明，尽管致癌蛋白hWAPL的表达量增 加与癌变紧密相关，可能还存在一种独立的机制能够引起致癌蛋白 hWAPL的表达增加，这种机制不同于由来自HPV的E6和E7导致的 致癌蛋白hWAPL表达的增加。
实施例4
p53抑制蛋白抑制hWAPL基因的启动子活性
已经证实了 p53抑制蛋白具有从启动子抑制hWAPL基因转录的 功能。如下所述。
54以DLD-1细胞的基因组DNA为模板，使用下述引物对通过PCR 方法扩增和分离了 hWAPL基因的启动子
引物1:
(序列GTGCATCCCACCCACAGTGGAAGACATGG)禾口
引物2:
(序歹'J: CCGCTTCCGCCGGTGAATGGTCAGTGCTGG)。
PCR产物的DNA片段首先被克隆到pGEMT-easy (Promega)中， 然后用限制性酶EcoRI酶切的片段被克隆到pBluescript (Stratagene)中。 用Sall/Xhol酶切含有插入到质粒中的hWAPL基因的启动子区的区域， 然后克隆到pGL3-Basic载体(Promega)中。
在用 Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen)纯化后，使用 LipofectAmine2000 (Invitrogen)将获得的载体与p53表达载体共转染 HeLa细胞，以pHM6 (Roche)作为对照，pGR3-tK载体作为荧光素酶分 析的标准。在荧光素酶分析中使用双荧光素酶试剂盒(Promega)测定标 记蛋白荧光素酶的量，荧光素酶作为在hWAPL基因启动子控制下转录 和翻译的报告基因产物。
结果证实了当转导p53表达载体时，与对照相比，表达的p53抑 制蛋白的量的增加减少了 30%的标记蛋白荧光素酶的量，而荧光素酶 是在hWAPL基因启动子控制下转录和翻译的。换句话说，证实了p53 抑制蛋白具有导致hWAPL基因启动子活性降低的功能。
实施例5
构建表达载体生产hWAPL重组蛋白
通过使用PCR的点突变方法在具有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的 cDNA的第1至U 3570碱基区域的末端分别转导了一个HindIII和一个 EcoRI限制性位点。获得的PCR产物用HindlII/EcoRI酶切，相应的
DNA片段被插入一个HA-标记的哺乳动物表达载体pHM6 (RocheDiagnostics)中，构建了一个能够生产重组的HA-标记的hWAPL蛋白的 表达载体pHM6-hWAPL。该片段也被插入一个用于表达具有hrGFP融 合部分的融合蛋白的哺乳动物表达载体phrGFP-Nl (Stratagene)中，以 构建一个能够生产重组的GFP融合的hWAPL蛋白的表达载体 phrGFP-hWAPL。
使用LipofectAmine2000 (Invitrogen)将产生重组蛋白的表达载体 转染宿主哺乳动物细胞。在转染后培养2天后，在存在hrGFP标记表 达的基础上使用EPICS ALYRA HyperSort (Bechman Coulter)进行筛选。
在进一步培养和另外筛选后，获得了一个带有所需的表达载体能够生 产hWAPL重组蛋白的转化的宿主细胞系。
实施例6
针对hWAPL蛋白的特异性抗体的产生
为了产生针对致癌蛋白hWAPL的特异性抗体，通过化学合成制 备了一个具有位于致癌蛋白hWAPL N-末端区域的50到66(序列 CNFKPDIQEIPKKPKVEE)部分氨基酸序列的肽链(hWAPL5G.66)作为免 疫原肽。此外，通过重组产生了一个标记了 6XH组氨酸的融合多肽， 它含有位于致癌蛋白hWAPL C-末端区域814到1037的部分氨基酸序 列。
按照常规的技术，这两个免疫原肽被分别用来免疫兔，以产生特 异性针对这些抗原肽的多克隆抗体，抗-hWAPL-N抗体和抗-hWAPL-C 抗体。在实施例3等的Western印迹中，使用特异性针对hWAPL50.66 抗原的抗-hWAPL-N抗体检测致癌蛋白hWAPL。
实施例7
hWAPL蛋白诱导染色体的不稳定性
用表达载体phrGFP-hWAPL感染HeLa细胞以生产hrGFP融合的 hWAPL重组蛋白。执行实施例5描述的步骤筛选产生GFP-hWAPL融合蛋白的GFP-hWAPL阳性细胞系和不产生GFP-hWAPL融合蛋白的 GFP-hWAPL阴性细胞系。在筛选后传代5代后，根据Buse的方法(J. Biol. Chem., 274， 7253-7263 (1999))用激光扫描细胞仪分析染色体基因 DNA的含量。
GFP-hWAPL阴性细胞系表现出与宿主细胞HeLa细胞相当的染色 体基因含量，其中一半或以上由正常的二倍体组成，四倍体大约为二 倍体的一半。另一方面，在GFP-hWAPL阳性细胞系中，正常的二倍 体含量少，主要部分为多倍体，四倍体的含量略多于二倍体的含量， 八倍体也存在，含量为10.1%。因此，可以判断出hWAPL蛋白的过量 表达诱导了染色体的不稳定性(图7)。
同样地，核的异型、特别是多核化的诱导也源自于hWAPL蛋白 的过量表达。在传代3代以后，观察到的多核化的比率在GFP-hWAPL 阴性细胞系和用phrGFP-Nl载体(对照)感染的HeLa细胞中分别只是 5%和4%，而在GFP-hWAPL阳性细胞系中是15.6%(三倍或以上)(图 8)。
此外，与染色体的畸形、例如在染色体基因有丝分裂的分离过程 中由于异常的着丝粒分裂而产生的核的异型相关，微核形成的诱导也 是源自于hWAPL蛋白的过量表达。在GFP-hWAPL阳性细胞系中微核 形成的频率大约为在GFP-hWAPL阴性细胞系中的2倍(图7)。
实施例8
hWAPL蛋白诱导NIH 3T3成纤维细胞的癌变
用表达载体pHM6-hWAPL感染NIH 3T3成纤维细胞以产生HA-标记的hWAPL重组蛋白，产生了一个过量表达HA-标记的hWAPL蛋 白的重组细胞系HA-hWAPL3T3细胞系。产生了用pHM6载体感染的 HA-3T3细胞系作为阴性对照。当在平板上培养时，用于阴性对照的 HA-3T3细胞系象宿主细胞NIH 3T3成纤维细胞一样形成了类似均匀地铺满的单细胞层，而HA-hWAPL 3 T3细胞系则形成了聚集的结构。
对裸鼠在皮下注射了 HA-hWAPL 3T3细胞系和HA-3T3细胞系。 连续地追踪表明在IO天内，在所有注射了 HA-hWAPL 3T3细胞系的位 点都诱导了肿瘤发生，而在注射了 HA-3T3细胞系的位点没有诱导肿瘤 发生。使用抗-HA抗体和抗-hWAPL-C抗体进行Western印迹，证实了 HA-标记的hWAPL蛋白在癌变细胞中确实过量表达了。在癌变细胞中， 观察到异型的有丝分裂；例如，也观察到了三极分裂。
实施例9
使用定向于hWAPL基因的siRNA抑制癌细胞的生长
使用定向于hWAPL基因的siRNA，证实了抑制hWAPL蛋白的表 达可以导致对癌细胞生长的抑制。
(l)使用siRNA体外抑制癌细胞的生长
使用Silencer siRNA构建试剂盒(Ambion)，分别生产了定向于下 列基因序列(hWAPL AsiRNA)和对照(阴性对照)的siRNA: hWAPL AsiRNA: CGGACTACCCTTAGCACAA 阴性对照ACTACAACTGGTCGCAACC
在实际中，针对每一个制备了两个合成的寡聚体；具体来说，对 于hWAPL AsiRNA来说，是
AACGGACTACCCTTAGCACAAcctgtctc和 AATTGTGCTAAGGGTAGTCCGcctgtctc
对于阴性对照来说，是 AAACTACAACTGGTCGCAACCcctgtctc禾口 AAGGTTGCGACCAGTTGTAGTcctgtctc
然后，在每个合成的寡聚体中，在ctgtcto部分与T7启动子引物杂交，并用KlenowDNA聚合酶处理以制备完整的双链DNA。然后， 用T7RNA聚合酶转录，制备的反义链和正义链RNA彼此杂交，然后 用Rnase消化两端的粘性末端，产生了具有平末端的双链siRNA。
在一个来自宫颈癌的高度表达hWAPL的SiHa细胞中转导浓度为 lnM的hWAPL AsiRNA和阴性对照siRNA，以评估对细胞生长的影响。
siRNA被转化到来自HPV16阳性的宫颈癌的SiHa细胞中，其中 观察到了 hWAPL的高效表达。图10显示了以活细胞数(xlO勺为纵坐标 对转导siRNA后的时间(小时)为横坐标的作图的结果。在图中， "siRNA"指转染定向于DIF-2的siRNA， "cont"指转染对照的siRNA， "TSA"表明了在转染siRNA后分别向培养物中加入组蛋白脱乙酰酶 抑制剂、制滴菌素A时获得的结果。
直到转染hWAPL AsiRNA后20小时，可以观察到活的肿瘤细胞 数的增加。在此期间，与对照进行比较，可以表明对肿瘤生长的抑制。 然后，转导hWAPL AsiRNA的细胞开始显示出活细胞数量的减少，并 且在100小时后，只有少量细胞存活。与之相反，当通过加入制滴菌 素A抑制了包含在组蛋白中的乙酰化的赖氨酸的脱乙酰化进程时，减 弱了 hWAPL AsiRNA对细胞生长的抑制效果。
这些结果表明通过抑制hWAPL造成的细胞死亡是由于抑制了组 蛋白的修饰例如乙酰化而引起的，并且暗示了 hWAPL本身可能参与了 组蛋白编码的控制。
(2)体内抑制肿瘤生长的效果
对6周龄的BALB3T3/裸鼠接种2xl(^的SiHa细胞。从接种后10 天起，对接种的肿瘤细胞分别注射hWAPL AsiRNA和阴性对照siRNA， 两天一次，共5次。取hWAPL AsiRNA注射组中的6只动物、阴性对照siRNA注射 组中的6只动物和未处理组中的5只动物，对接种的肿瘤的大小的变 化进行评估。结果表明，与未处理组相比，hWAPL AsiRNA注射组中 平均的肿瘤大小减少了 33%。
此外，证实了我们克隆的hWAPL的cDNA核苷酸序列位于人基 因组的10q23.31到q23.32。其核苷酸序列在下面显示，同时给出了阐 述的hWAPL基因中5'-非翻译区和启动子区的核苷酸序列以及上面的 小鼠WAPL的cDNA核苷酸序列。在cDNA的ORFs中，从起始密码 子ATG到终止密码子TAG之间的区域用大写字母书写，而在启动子 区中，在与EST比较的基础上推测的转录起始位点之后的区域用大写 字母书写。
hWAPL的cDNA序列
gcgagcggctgttggaggaaggaggtgggggccgggagcgcaaatggcgttgagatggtycarggcc
ctgttcaaactccagcactgaccattcaccggcggaagcggcggcgcaggaggcggcggcggcccag
cgggggcacacagcaggctctgttaccagctccagcagtggcggccagcgagagctaggcccgsgcc
cggccggcggcgctcgaggcggggagggaagttgcggggccgccgctcctgcccccccaaccgggc
ttcctatttaccgaaagcagagtccctcgcctctctcggctctcacctgccggccctgctctcccgcgcgag
ggttccgcgcccgcccgcgggccgtarggagcgggagaaggcggargcggccccgtggccaaagca
cccgccaggcttccgaggagaatatgaaactggtgtcaaaATGACATCCAGATTTGGGA
60<formula>formula see original document page 61</formula>ATCTCTAGAGTGATTGAATATTTGGAACATTGCTAGctgctttacctttgctt caggtgctcggtaatgctggagctatccttagacaaagaaaagtcaagtcatgaaagaagtccttgaagat ataccaagaacattcatcagtatcattcgtgtttggatttttaaggccacctgatttcttcgtcatgcattcggcatttgctaaatgacagttactacatcaatctgcaactatcaaaaatgaggggaaaaggttcaggctgttaacaa
ttccatgcagtatttaaatacatttactttggcagagtttataccctccccttgttttcttgctttattctgggcaag
tttgaaggggaaaatttgtgetgctgttagtgcaactgctgtgtatgttgagccactgttgtcatgccagccag
gtgcaaaggcagcttagctactgaggtagcgaatgttctgaggacattctagacaacagcttagttccttttt
caggctcatttgcttttgcttttttgttgaatgattccaatcgtaaataaagcttttaataa加gtgaattttttggt
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tattcttgattaggtttgggttattgaactattttttacttttgagaccacaaccatattcaatatcataccataatgt
gtcatagctataggcacaagaaaaacaacagtttgagagaatattatataagatgatgtgccctgttaaaag
gaggaggcaaaatagtcaaacccagggtagtttacacttaatgctagggaggctcttaaaacattattagat
tttgaggaaagactctctagatata纖ctaatgttcagtacaataaatataaggaagctaaaacaccaatgt
ggaattcctgtttccagataacatgtatattcttctatagagtgacaggatcaattgcataagcgcaaagcctt
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tccaatcctatttttattttatacagtatttctcagctgtgatctttggagcaaaagccaacggcaggaaaaaat
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hWAPL基因的启动子区序列
atttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcatgatccgcctgc ctcggcctctcaaagtgctaggattacaggcgtgagccaccgtgcctggccgctgaacacaatttaaagct tcaattaatccaggtattcagtcaacaaatatttatagcacactttctgtgtgtgaggcactattctaggtgtgct tggc3teta3组gMC3333gtc3gcc
63atcctcgtcctc3tggagttt3tattcttgtga33cgaaat8g3t3咖aac犯gttcat3C3C3肌gcaaac
gtaatgactatgttatggagaaaagcagcagggaaaaggagatacagggtgctggatgaccttaaatagc
atggccaaggaaaacattactgagagacacacttgagcaaagacctgaaagcatgcagggaatgagttgt
gtgtgtctcttgaggactaacagagggaacaagtacgaagagggcccacaggcaggagctggcttggca
tgttctagtagtagacagaggcaggcccggcaaggtagga鄉gataggagtactcaggggccagatc
atgcagggccttttcaccgttaagaactttggattttagtattacaggaggacccttcagggtgtttgactagg
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gcctcccagctcccgggcggcggcctccgcaggcccggcacagctgcacagcccgcggtccccaggc
accggcgggtccctggaggggaagcgattgatacagctgcctgcactgcgccacccgcccggctgcccatctccgtggcacctgcgtctcccggctgggccgggagctagaagtggctgccgagaccgggagggcc cggccagtcgcccgctcccgctcccgcgcctggccctcggcccgcgacctcgcggacctggactacaa ctcccgtggggctccgacggccgggccaatggcgggcgcccggagcatgcggggcgcagcgcctgc gcggcggtttgagtaagcggctgcgcgattggctgcggggtcgggcggccgcgcggggactgtggga agcggagtgacggaGCGAGCGGCTGTTGGAGGAAGGAGGTGGGGGCCG
CCAGCACTGACCATTCACCGGCGGAAGCG 小鼠WAPL的cDNA序列
ncggccgccagggaggcctaggccctgtccggccggcgcgcctgaggtggggagggaagttgcggg
gccgccgctcaccccccaccccccctgtcgcccgagcttcctatttaccgaagcggagccgcggactgtg
acggcagcagagcccctcgcccctctcggtggcaccggtcggcactggtctctcgcgcggggctcccg
cgcccgcccgcgggccgttgggagccggagaggcggaggcggcccgaggccaaagcacccgccag
gcgccgaggggaatatgaaacaggtgtcaaaATGACATCCAGATTTGGAAAAACT
TCAGAATCTAGTGAGGCTGCTCAGCTGgAAGAAGTCACTTCTGTA<formula>formula see original document page 67</formula>ACCATGtgGGcaAAGCAGTGGAGGACTGCaTGAGGGCTATAATTGG
GAACATTGCTAGctgctttacctttgcttcaggtgcttggtaatgctgaagctatccttagacaaag aaaattggatttttatgatcacccgatttcttcatcatgcattctgcgtttgctaaatgacagttactacatcaatc tgcagctatcaaaaatgagggaaaaggttcaggctgttaacaatcccatgcagtatttaaatacacttac
在描述和图表中，当对核苷酸和/或氨基酸縮写时，縮写与 IUPAC-IUB生物化学命名委员会或本领域的常规縮写一致。下面列出 了一些例子。当氨基酸存在光学异构体时，除非特别说明，都是指L-异构体。
DNA:脱氧核糖核酸CDNA:互补的脱氧核糖核酸
A:腺嘌呤
T:胸腺嘧啶
G:鸟嘌呤
C:胞嘧啶
I:肌苷
R:腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)
Y:胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C) M:腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C) K:鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)
S:鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)
W:腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)
B:鸟噤呤(G)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)
D:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)
V:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)
N:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)或未知的或 其它碱基
RNA:核糖核酸 mRNA:信使核糖核酸 dATP:脱氧腺苷三磷酸 dTTP:脱氧胸苷三磷酸
dGTP:脱氧鸟苷三磷酸 dCTP:脱氧胞苷三磷酸 ATP:腺苷三磷酸
EDTA:乙二胺四乙酸
SDS:十二烷基硫酸钠
BHA: 二苯甲基胺
pMBHA:对-甲基二苯甲基胺
TOS:对-甲苯磺酰 Bzl:苯甲基Bom:苄氧甲基 BOC:叔-丁氧羰基 DCM: 二氯甲烷
HOBt: 1-羟基苯并三唑 DCC: N，N'-二环己基碳二亚胺 TFA:三氟乙酸
DIEA: 二.异丙基乙胺
Gly或G:甘氨酸
Ala或A:丙氨酸
Val或V:缬氨酸
Leu或L:亮氨酸
Ile或I:异亮氨酸Ser或S:丝氨酸
Thr或T:苏氨酸
Cys或C:半胱氨酸
Met或M:甲硫氨酸
Glu或E:谷氨酸
Asp或D:天冬氨酸
Lys或K:赖氨酸
Arg或R:精氨酸
His或H:组氨酸
Phe或F:苯丙氨酸
Tyr或Y:酪氨酸
Trp或W:色氨酸
Pro或P:脯氨酸
Asn或N:天冬酰胺
Ghi或Q:谷氨酰胺
pGhl:焦谷氨酸Tyr(I): 3-碘酪氨酸
DMF: N,N-二甲基甲酰胺Fmoc: N-9-新基甲氧基羰基 Trt:三苯甲基
Pbf: 2,2,4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Clt: 2-氯三苯甲基 BU、叔丁基；以及
Met(O):甲硫氨酸亚砜
工业实用性
本发明的hWAPL癌基因的全长核苷酸序列可用于生产由hWAPL 癌基因编码的重组hWAPL致癌蛋白，以及用于研究在来自多种上皮细 胞的细胞系中hWAPL致癌蛋白的过量表达诱导癌变的机理。此外，在 本发明中，鉴定的hWAPL癌基因的启动子区可以提供一个新的靶，在 通过抑制癌基因的转录从而抑制由hWAPL致癌蛋白的过量表达所诱 导的癌变的机制的基础上，用于研究癌症的预防或者治疗。此外，生 产本发明的hWAPL癌基因全长核苷酸序列的重组子，hWAPL致癌蛋 白，可用于制备核酸探针或PCR引物，用于检测由hWAPL癌基因转 录引起的mRNA的表达，或者用于制备特异性抗体，用于检测翻译的 hWAPL致癌蛋白肽。因此，这使得使用多种诊断试剂盒检测直接参与 癌症发生的hWAPL癌基因的过量表达成为可能。
71序列表
〈110〉日本电气株式会社(NEC Corporation) 黑田雅彦(Masahiko KURODA)
<120>新的癌基因、从其衍生的重组蛋白及其应用 (Novel Cancer Gene And Its Use)
<130> SPI090779-01
<160〉 2
1
〈210〉 <211〉 〈212〉 <213>
PRT 人
<400> 1
Met Thr Ser Arg 1
Ser Ser Lys Phe 20
Thr Lys Trp Gly 35
Pro Asn Phe Lys 50
Glu Glu Glu Ser 65
Ser Leu Pro Val
Tyr Ser Glu Ser 100
Leu Glu Ala Asn 115
Val Ser Asp Lys 130
Lys Ser Thr Asn 145
Asn Lys Leu lie
Glu Lys Asn Ser 180
Phe 5
Asp
Glu
Pro
Thr
Ser 85 Ser
Ser
Cys
Arg
Thr 165 His
Gly
Glu
Thr
Asp
Gly
70
Ser
Glu
Lys
Phe
lie 150 Ser
His
Lys Thr Tyr Ser 10
Val Phe Ser Asn 25
Thr Phe Met Ala 40
lie Gin Glu lie 55
Asp Pro Phe Gly
Lys Asn Leu Ala 90
Ala Ala Gin Leu 105
lie Ser His Val 120
Pro Leu Glu Asp 135
Val Glu Asp Asp
Asp Lys Val Glu 170
lie His Lys Asn 185
Arg Lys Gly Gly Asn Gly
15
Lys Arg Thr Thr Leu Ser 30
Lys Leu Gly Gin Lys Arg 45
Pro Lys Lys Pro Lys Val 60
Phe Asp Ser Asp Asp Glu 75 80 Gin Val Lys Cys Ser Ser
95
Glu Glu Val Thr Ser Val 110
Val Val Glu Asp Thr Val 125
Thr Leu Leu Gly Lys Glu 140
Ala Ser lie Ser Ser Cys 155 160 Asn Phe His Glu Glu His 175
Ala Asp Asp Ser Thr Lys 190Lys Pro
Asp Thr 210 lie Ser 225
Asn Asp
Ser Asp
Glu Asn
Arg Pro 290 Ser Gin 305
Ala Leu
Ala Lys
Gly Arg
Cys Asn 370 Thr Ala 385
Lys Ala
Asn Thr
Asp His
Lys lie 450 Glu Asp 465
Lys Thr Asn Ser Phe Thr
Asn 195 Trp
Pro
Phe
Pro
Leu 275 Thr
Gly
Ala
Lys
Thr 355 Val
Ser
Asp
Lys
Glu 435 Lys
Asp
Ala
Gin
Glu
Ala
Asn
lie
Glu
Leu 260 Asn
Asn
Ala
Lys
Gly 340 Arg
Thr
Thr
lie
Ser 420 Thr
Tyr
Asp
Pro
Asp 500 Asp
Glu
Ser
Lys
Asp 245 Leu
Glu
Cys
Ser
Ala 325 Gly
Asp
lie
Pro
Ala 405 Lys
Gly
Phe
Cys
Ser 485 Ser
Leu
Thr
Gin
Gly 230 lie
Glu
Ala
Arg
Asn 310 Asn
Val
Tyr
Gin
Ala 390 Thr
Lys
Gly
Gly
Gin 470 Pro
Gin
Pro
Thr
Phe 215 Ser
Arg
Met
lie
Thr 295 Phe
Ser
Ser
Thr
Asp 375 Asp
Ser
Asp
Asp
Phe 455 Val
Ser
Ser
Gly
Val 200 Gly
Val
Ser
Lys
Glu 280 Tyr
Asp
Glu
Cys
Val 360 Thr
Leu
Lys
Val
Glu 440 Asp
Glu
Leu
Gly
Val
Ala
Lys
Arg
Glu
Asp 265 Glu
Cys
Lys
Ser
Gly 345 Leu
Met
Gly
Thr
Lys 425 Gly
Asp
Arg
Gin
Thr 505 Pro
Ser
Arg
Thr
Asp 250 Asp
Asp
Arg
Leu
Ser 330 Thr
His
Glu
Glu
Thr 410 Leu
Gly
Leu
Lys
Pro 490 Asn
Glu
Glu
Pro
Gly 235 Cys
Asp
lie
Ala
Met 315 Lys
Ser
Pro
Arg
Ala 395 Thr
Glu
Ser
Ser
Thr 475 Pro
Asn
Ser
lie
Glu 220 Leu
lie
Phe
Val
Asn 300
Asp
Asp
Phe
Ser
Ser 380 Gly
Arg
Phe
Gly
Glu 460
Ser
Pro Ala Val
Lys 205 Ser
Phe
Leu
Lys
Gin 285 Lys
Gly
Gly
Arg
Cys 365 Met
Arg
Phe
Phe
Ser 445 Ser
Lys
Glu
Glu
Lys
Glu
Pro
Glu
Ser
Asn 270 Ser
Thr
Thr
Leu
Gly 350 Leu
Asp
Leu
Arg
Gly 430 Ser
Glu
Lys
Ser
Asn 510 Lys
Thr Asn
Ser Glu
Trp Asp 240 Leu Asp 255
Arg Leu
Val Leu
Lys Ser
Ser Gin 320 Asn Gin 335
Thr Val
Ser Val
Glu Phe
Arg Lys 400 Pro Ser 415
Phe Glu
Asn Tyr
Asp Asp
Arg Thr ■ Asn Asp 495
Leu Asp Pro lieAsn Lys 530 Gly Pro 545
Asn His
515 Gin
Lys
Pro
Gly Arg Asp
Gin Ser Val Thr 580
Asp Gly Val Phe 595
Val Thr lie Pro 610
Cys Arg Arg Glu 625
His Phe Asn Asp
Asp lie Glu Tyr 660
Thr Arg Cys Leu 675
Ser Phe Arg Met 690
Lys Thr Leu Asp 705
Ala Ala Leu Met
Asp Arg Ala Ser 740
Asp Ala Ser Ser 755
Lys Glu Lys lie 770
Asp Leu Glu Asn 785
Ser Leu Thr Ser
Leu Leu Gly Gly 820
Asp His Leu Ser 835
Asp
Ser
Ser 565 Val
Lys
Thr
Asp
Val 645 Leu
Ser
His
Asp
Tyr 725 Leu
Ala
Arg
lie
Lys 805 Leu
Arg
Lys
Pro 550 Glu
Arg
Ala
Gin
Lys 630
Val
Leu
Val
Leu
Ser 710 lie
Asp
Lys
Arg
Thr 790 Arg
Asp
Asp
520
Ser Lys Glu Asn 535
Thr Lys Ala Val
Glu Leu Pro Gly 570
Leu Ser Ser Lys 585
Pro Ala Pro Pro 600
Pro Tyr Gin Asp 615
Glu Leu Tyr Thr
Glu Phe Gly Glu 650
Ser Gly Leu Lys 665
lie Ser Leu Ala 680
Arg Ala His Gly 695
Gin His His Gin
Leu Ser Arg Asp 730
Leu Met lie Arg 745
Leu Leu Asn Glu 760
Leu Cys Glu Thr 775
Thr Gly His Leu
Ala His Glu
Gly
lie
Asp 840
Asp
Val 825 Glu
Trp 810 Asp
Glu
525
Thr Arg Lys lie 540
Tyr Asn Ala Arg 555
Pro Pro Val Val
Glu Pro Asn Gin 590
Ser Lys Val lie 605
lie Val Thr Ala 620
Val Val Gin His 635
Asn Gin Glu Phe
Ser Thr Gin Pro 670
Thr Lys Cys Ala 685
Met Val Ala Met 700
Asn Leu Ser Leu 715
Arg Leu Asn Met
Leu Leu Glu Leu 750
Lys Asp Met Asn 765
Val His Asn Lys 780
Ala Met Glu Thr 795
Phe Lys Glu Glu
Lys Val Lys Glu 830
Lys Leu Val Ala 845
Phe
His
Lys 575 Lys
Lys
Leu
Val
Thr 655 Leu
Met
Val
Cys
Asp 735 Glu
Lys
His
Leu
Leu 815 Cys
Ser
Ser
Trp 560 Pro
Asp
Thr
Lys
Lys 640 Asp
Asn
Pro
Phe
Thr 720 Leu
Gin
lie
Leu
Leu 800 Arg
Val
LeuTrp Gly 850 Asn Pro 865
lie Val
Gin Tyr
Leu Pro
Cys Met 930 Glu Trp 945
Ala Leu Arg Phe Glu Tyr
Ala
Glu
Ser
Asn
His 915 Arg
Gly
Asn
Asp
Ser 995 Phe
Glu Asn Ser
Arg
■ Gin
Ala
Ser
Cys
lie
■ Ala
Arg
Gin
Ala 885 Ala
Asn
lie
Thr
Val 965 Arg
Cys Ser
1010 Arg lie Gly 1025
Leu Glu Arg Leu lie Lys
Cys
Ser 870 Lys
Glu
Val
lie
Lys 950
Leu
Val Asn Ser
Leu 855 Tyr
Ala
Asp
Thr
Gly 935 Thr
Gin
Leu
Arg
Arg
Leu
Leu
Ser
Asn 920 Val
Gly
Val
Gly
Arg Asn Arg His 1000
Asp Ser Ser lie Cys 1015
Gly Gin Val His Ala 1030
Glu Arg Ala Ala Gin 1045
Asp Ala Pro Thr Thr 1060
Val
lie
Gin
lie 905 His
Leu
Glu
Pro
Leu 985 Cys
Leu
Ala
His 890 Cys
Val
Leu
Gin
Lys 970 Gly
Glu
Tyr 875 Cys
Leu
Gly
Asn
Asp 955 Tyr
Leu
Val
Glu
Ser 860 Lys
Glu
Ala
Lys
Leu 940 Gly
Leu
Leu
Asn
Val
Asp
Glu
Asp
Ala 925 Thr
Leu
Pro
lie
Leu Val Asn Met 1005
Ser Gly Glu Gly Asp 1020
Val Gin Ala Leu Val 1035
Leu Ala Glu Ser Lys 1050
Gin His Asp Lys Ser 1065
Thr
Ser
Leu
Ser 910 Val
Asn
lie
Gin
Asn 990 Glu
Asp
Gin
Thr
Val
Gin
lie 895 Lys
Glu
Asp
Gly
Glu 975 Leu
Thr
Ser
Leu
His
Leu 880 Gin
Pro
Asp
Asn
Thr 恥O Gin
Val
Ser
Leu
Phe 1040 Asp Glu 1055 Gly Glu Trp 1070
Gin Glu Thr Ser Gly Glu lie Gin Trp Val Ser Thr Glu Lys Thr Asp
1075 1080 1085
Gly Thr Glu Glu Lys His Lys Lys Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Asp
1090 1095 1100
Leu Asn Lys Ala Leu Gin His Ala Gly Lys His Met Glu Asp Cys lie 1105 1110 1115 1120
Val Ala Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Gly Cys Leu Cys Gin Glu Ser
1125 1130 1135
Pro lie Asn Val Thr Thr Val Arg Glu Tyr Leu Pro Glu Gly Asp Phe
1140 1145 1150
Ser lie Met Thr Glu Met Leu Lys Lys Phe Leu Ser Phe Met Asn Leu
1155 1160 1165
Thr Cys Ala Val Gly Thr Thr Gly Gin Lys Ser lie Ser Arg Val lie
751170 1175 Glu Tyr Leu Glu His Cys 1185 1190
1180
<210> 2
〈211〉 3570
<212〉 DNA <213〉人
〈400〉 2
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权利要求
1.一种双链的短链干扰RNA，其能够抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA在宫颈癌细胞中的表达，其中siRNA的核苷酸序列为CGGACTACCCTTAGCACAA。
2. —种药物组合物，其用于抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的 mRNA在宫颈癌细胞中的表达，从而阻止癌细胞的生长，其中所述药 物组合物含有权利要求1中所述的双链的短链干扰RNA。
3. —种引物对，其用于对含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA 进行PCR扩增，由下列成对引物组成核苷酸序列 5，-TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTA GG誦3，；和核苷酸序列A-3，。
4. 一种引物对，其用于对含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA 的部分链进行PCR扩增，由下列成对引物组成 -GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3';禾口 5 ，-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3'。
全文摘要
本发明从人中鉴定了一个新的癌基因的全部核苷酸序列，该癌基因直接参与了例如由HPV感染宫颈上皮细胞而诱导的宫颈癌的癌变机制，并鉴定了由该癌基因编码的致癌蛋白的氨基酸序列，还提供了编码衍生自新癌基因的致癌蛋白肽链的全长多核苷酸，可用于致癌蛋白的重组生产，并提供了由此重组生产的致癌蛋白的肽链。具体来说，本发明提供了来自人的参与了宫颈癌的发生的新的癌基因多核苷酸，其中含有编码氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，尤其是SEQ.ID.No.2的核苷酸序列的多核苷酸。
文档编号C07K16/32GK101608182SQ20091012616
公开日2009年12月23日 申请日期2004年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者黑田雅彦, 齐藤彰 申请人:日本电气株式会社;黑田雅彦