专利名称：：一种异芦荟色苷d和芦荟苷的分离提取方法
技术领域：
：本发明属于医药及生物领域，涉及一种提取芦荟有效成分的方法，具体涉及一种采用高速逆流色谱提取芦荟苷(Aloin)及异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)的分离提取方法。
背景技术：
：芦荟(Aloe)是百合科芦荟属多年生肉质草本植物，在医药、日化和食品保健领域有广泛应用。但是，由于芦荟有效成分多样复杂，而且很多化学成分的性质是非常相近的，因此分离芦荟中各种成分，获得百克乃至公斤级单体的技术一直是芦荟基础和高品质产品开发生产的难题。蒽醌类化合物是芦荟的主要药效成分，其中的芦荟苷(Aloin)及异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)更成为近年来该领域的研究热点。芦荟苷又名芦荟甙，芦荟大黄素甙，芦荟甙在排出体内污物、防止动脉硬化，抑制肿瘤生长方面有重要的功效；异芦荟色苷D属于异苷类，由于其具有抗菌消炎作用，同时是芳香风味前提物质，在医药领域、精细化工领域已受到相当的重视。目前对于芦荟有效成分的提取，国内外多采用硅胶、聚酰胺柱色谱法或大孔吸附树脂进行分离提取，但上述分离方法操作繁琐，成本高，效力低，很难进斗亍工业生产。高速逆流色i普(HighSpeedCounterCurrentChromatography,HSCCC)是一种不用固态载体的液液分配色谱分离技术，与其它的色谱技术相比，HSCCC操作简单，效力高，能够完全消除载体导致的样品不可逆吸附和对样品的沾染、失活、变性等影响。一但建立了良好的分离条件，它能在短时间内实现复杂混合物中各组分的高效、高纯度分离和大量样品的制备，因此分离条件的研究和建立是HSCCC实现成功分离的关键。由于HSCCC在分离提取上的优势，目前已有较多的研究通过其分离获得芦荟的有效成分。王春燕等以溶剂系统氯仿-甲醇-水(9:10.5:8)的上相为固定相，下相为流动相，从芦荟生药中一次性分离得到芦荟苷和芦荟大黄素；陈存社等经过分析得出，用氯仿-甲醇-丙酮-水(9:8:1:8)为溶剂系统分离纯化芦荟有效成分蒽醌类物质芦荟大黄素和芦荟大黄素苷的效果最佳；潘霞等以芦荟全叶为原料，经过一系列的预处理手段获得芦荟色酮粗提物，采用氯仿-甲醇-水(4:3:2滩合溶液和二氯甲垸-甲醇-水(5:4:2)混合溶液为溶剂分离系统，经过两步HSCCC分离纯化出纯度在95X以上的卢荟色酮单体。但是以上的研究均存在着一定的不足(1)一次性分离所得样品单一，虽然可同时获得芦荟苷(芦荟大黄素苷)和芦荟大黄素，但实际上芦荟苷即为芦荟大黄素的前体物质，功效相似；(2)所采用的溶剂毒性较大，如氯仿、二氯甲烷等，造成污染及生产上的不安全性。而对于异芦荟色苷D，目前尚未见任何报道可使其与芦荟苷在同一次分离制备过程同时获得。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用高速逆流色谱一次同时高效分离制备高纯度异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)和芦荟苷(Aloin)的方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的一种异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，包括如下步骤以芦荟为原材料获得初提物，在高速逆流色谱中进行分离提取。所述的初提物是以戸荟为原料，加入极性溶剂超声提取，所得提取液回收溶剂减压干燥而得。芦荟原料可以是新鲜芦荟或芦荟制品，其中优选的原料为芦荟药材。所述的极性溶剂为丙酮、甲醇或丙酮:甲醇(86:24)。优选溶剂为丙酮。溶剂与原料的重量比为1525:1。所述的高速逆流色谱溶剂系统的流动相和固定为正己垸-乙酸乙酯-丙酮-水构成。其中的体积比例为正己烷:乙酸乙酯两酮:水=0.50.1:46:0.52:46。优选的体积比例为正己垸:乙酸乙酯两酮:水=02:5:0.52:5，可以为0.2:5:0.5:5、0.2:5:1:5、0.2:5:1.5:5或0.2:5:2:5。所述的高速逆流色谱的溶剂系统采用上相作为流动相，下相作为固定相。所述固定相、流动相的用量与原料的重量比为94120:230250:0.30.6。所述的高速逆流色谱的分离过程中，流动相流速为0.8~1.2ml/min。当高速逆流色谱采用的色谱柱直径为2.16mm，柱体积120mm，流动相流速1.0ml/min，主机转速860rpm，进样量500mg条件时，异戸荟色苷D的收集时间段为100-140min，芦荟苷的收集时间段为17(T250min。本发明通过大量研究和实验工作，确定了初提处理技术，选择了正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水作为溶剂系统(通常采用的是正己垸-乙酸乙酯-甲醇-水系统)，优化了其配制比例，将上相作为流动相、使异芦荟色苷D和芦荟苷得到理想的分离提取效果。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.本发明可以在同一次分离过程中，同时得到高纯度异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)和戸荟苷(Aloin)二个单体产品；2.本发明无需使用氯仿、二氯甲烷等毒性大的溶剂，污染小，安全性高；3.本发明采用上相作为流动相，下相作为固定相(正己烷乙酸乙酯甲醇水体系)，随后在回收正己垸、乙酸乙酯的同时就得到产品，相对比用下相(水相)作为流动相的方法，本发明在去除溶剂、获得固体产品方面有明显的优点；4.本发明的提取率高，异芦荟色苷D达21呢以上；芦荟苷达42%以上；5.本发明的固定相保留率高，达78%以上；6.本发明所用原料明确，即芦荟或芦荟药材，从中可以获得大量异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)和戸荟苷(Aloin)单体；7.本发明操作简单，分离条件固定，适于工业化生产。为了验证本方法提取异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)和芦荟苷(Aloin)的效果，本发明还采用HPLC对提取物进行纯度分析，用UV、IR、1HNMR、13CNMR及MS进行结构分析，以"产物质量/进样质量"00%"计算其提取率。图l戸荟丙酮粗提物的高速逆流色谱图图2HPCL中异戸荟色苷D的谱图图3HPCL中戸荟苷的谱图图4异卢荟色苷D的化学结构图5芦荟苷的化学结构具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例l称取25g戸荟药材粉末于烧杯中，用500ml丙酮分三次，超声20min提取，每次提取后离心，收集上层清液，三次提取液混合，用旋转蒸发仪60。C回收溶剂使提取物呈清膏状，然后于真空干燥箱60'C减压干燥，得到棕黄色有光泽的固体，称重，得到丙酮提取物16.26g，提取率为65.06%。密封保存于10°C高速逆流色谱分离提取采用Mk5QuilkPrep500高速逆流色谱仪(英国AECS公司)，配有聚四氟乙烯管(PTFE)分离柱(管直径2.16mm，分离体积120ml)，SeriesII恒流泵(ScientificSystem公司)，SPD-10Avp紫外可见检测器(苏州岛津仪器公司)，N2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)。在分液漏斗中配制二相系统,将正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水(0.2:5:1.5:5)置分液漏斗中，充分振摇后静置，下相作为固定相，上相作为流动相，超声脱气；称取适量上述卢荟粗提物粉末，用6ml下相超声辅助溶解，配成浓度为85.5mg/ml的样品溶液，过滤，取滤液用进样阀进样5ml,采用单线圈、尾接头的洗脱方式，首先使管路充满固定相，当仪器以860rpm的速度稳定运行时，将流动相以1.0ml/min流速泵入管路。当明显有流动相从管路尾端流出时，说明已达到两相平衡，计算得到固定相保留率，本实验的固定相保留率为79.1%。进样后30秒后镏分接收器开始自动接流分，速度为5min/tube，流出液用紫外检测器在254nm处进行检测，同时记录色谱图，根据色谱图收集流分。将所得对应于峰I(异芦荟色苷D)和峰II(芦荟苷)(见附图1)的流分合并，回收溶剂，得组分I和组分II。用HPLC进行纯度分析，Watersl525高效液相色谱仪，Waters717型自动进样器，2996型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站(美国waters公司)。流动相为甲醇水，梯度洗脱，洗脱程序为030min:40%A—80%A，60%B—20%B;3040min，80%A—95%A，20%B—5%B;A为甲醇相，B为水相(含醋酸0.34%)流速l.OmL/min;柱温为25°C，DAD扫描波长范围为190370nm，紫外检测波长为254nm;6用UV、IR、1HNMR、13CNMR及MS进行结构分析。TENSOR37紅外光谱仪(德国Bruker公司)KBr压片，BrukerAvanceIII400MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)，LCMS-IT-TOF高分辨质谱仪(日本岛津公司)。质谱条件:离子源ESI，雾化气压35psi，干燥气流量llmL/min，干燥温度35(TC,质谱扫描质量范围501000。全扫描一级质谱和选择离子全扫描二级质谱两种方式同时测定。分析结果组分I为单一物质，纯度为98.62%;组分II为二成分成的组分，总纯度99.54%(面积归一法)(见附图2，3)。组分I、组分II分别回收溶剂，得到产物I和产物II。产物I为淡黄色固体粉末，重108.6mg，提取率(产物质量/进样质量)为21.2%;产物II为黄色结晶粉末，重219.2mg，提取率为42.7%。产物I经测定其结构数据为U\amax(nm)MeOH:299.1，299.9;IR(KBr)cm-1:3446，1649，1602，1514，1383;TOF画MS(m/z):555.1878[M隱H]-，1HNMR及13CNMR(CD30D)数据见表1。以上数据与文献报道的异芦荟色苷D—致，确定为异芦荟色苷D，其结构如附图4。产物II为A、B两个成分的混合物，总纯度99.54%,经HPLC-DAD分析，相同色谱条件下成分B与芦荟苷B对照品峰的保留时间和紫外光谱吸收一致，初步确定为芦荟苷B;成分A的紫外吸收光谱与成分B—致，初步确定为芦荟苷异构体-芦荟苷A。经进一步测定，A、B两个成分的UVlmax(nm)MeOH:223.3，270.3，297.5，357.0，IR(KBr)cm-1:3442，1619，1458，1386，1261。光谱数据与芦荟苷B对照品光谱数据相符；经LC-MS/MS分析，成分A、B与芦荟苷B对照品的m/z均为417，分子离子峰、碎片离子相同，综合以上分析结果，确定产物II为芦荟苷A、B的混合物，其结构如附图5。实施例2称取30g芦荟生药材粉末于烧杯中，用甲醇丙酮(7:3)混合液500ml，分三次超声30min提取，离心，收集上层清液合并，用旋转蒸发仪60。C回收溶剂使提取物呈清膏状，然后于真空干燥箱6(TC减压干燥，得到棕黄色有光泽的固体，称重，得到甲醇提取物19.38g，提取率为64.60%。密封保存于10"C以下备用。高速逆流色谱分离提取，在分液漏斗中配制二相系统,将正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水(0.2:5:1.0:5)置分液漏斗中，充分振摇后静置，下相作为固定相，上相作为流动相，超声脱气；称取适量上述芦荟粗提物粉末，用6ml下相超声辅助溶解，配成浓度为80.1mg/ml的样品溶液，过滤，取滤液用进样阀进样5ml，采用单线圈、尾接头的洗脱方式，首先使管路充满固定相，当仪器以860rpm的速度稳定运行时，将流动相以1.0ml/min流速泵入管路。当明显有流动相从管路尾端流出时，进样，30秒后馏分接收器开始自动接流分，速度为5min/tube，流出液用紫外检测器在254nm处进行检测，同时记录色谱图，根据色谱图收集流分。分析结果组分I、组分II分别回收溶剂，用无水乙醇重结晶得到产物I和产物II。产物I为淡黄色固体粉末重83.2mg，提取率(产物质量/进样质量)为20.8%;产物II为黄色结晶粉末，重172.8mg，提取率为43.2%。用HPLC进行纯度分析，产物I(异芦荟色苷D)纯度为99.04%;产物II(戸荟苷A、B)纯度98.66%实施例3称取100g芦荟生药材粉末于烧杯中，用甲醇丙酮(l:2)混合液1500ml，分三次超声30min提取，离心，收集上层清液合并，用旋转蒸发仪6(TC回收溶剂使提取物呈清膏状，然后于真空干燥箱6(TC减压干燥，得到棕黄色有光泽的固体，称重，得到甲醇丙酮提取物67.18g，提取率为67.18%。密封保存于l(TC以下备用。高速逆流色谱分离提取，在分液漏斗中配制二相系统,将正己垸-乙酸乙酯-丙酮-水(0.15:5:0.5:4.5)置分液漏斗中，充分振摇后静置，下相作为固定相，上相作为流动相，超声脱气；称取适量上述芦荟粗提物粉末，用7ml下相超声辅助溶解，配成浓度为85.03mg/ml的样品溶液，过滤，取滤液用进样阀进样5ml,采用单线圈、尾接头的洗脱方式，首先使管路充满固定相，当仪器以860rpm的速度稳定运行时，将流动相以1.0ml/min流速泵入管路。当明显有流动相从管路尾端流出时，进样，30秒后馏分接收器开始自动接流分，速度为5min/tube，流出液用紫外检测器在254nm处进行检测，同时记录色谱图，根据色谱图收集流分。结果分析-组分I、组分II分别回收溶剂，得到产物I和产物II。产物I重90.68mg，提取率(产物质量/进样质量)为21.33%;产物II重178.9mg，提取率为42.17%。用HPLC进行纯度分析，产物I(异芦荟色苷D)纯度为98.15%;产物11(声荟苷A、B)纯度98.02%。表1.产物I的1HNMR及13CNMR(CD30D)数据<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于包括如下步骤以芦荟为原材料获得初提物，在高速逆流色谱中进行分离提取。2.如权利要求1所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于所述的高速逆流色谱溶剂系统为正己垸-乙酸乙酯-丙酮-水。3.如权利要求2所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于所述的高速逆流色谱溶剂系统的溶剂质量比例为正己烷:乙酸乙酯诉酮:7jC=0.50.1:46:0.52:46。4.如权利要求2或3所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于所述的高速逆流色谱的溶剂系统采用上相作为流动相，下相作为固定相。5.如权利要求14任一所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于:所述固定相、流动相的用量与原料的重量比为94120:230250:0.30.6。6.如权利要求1所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于所述的高速逆流色谱的分离过程中，流动相流速为0.81.2ml/min。7.如权利要求1所述的异戸荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于所述的初提物是以芦荟为原料，加入极性溶剂超声提取，所得提取液回收溶剂减压干燥而得。8.如权利要求7所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于所述的极性溶剂为丙酮、甲醇或丙酮-甲醇混合物中的一种。9.如权利要求7或8所述的异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其特征在于溶剂与原料的重量比为1525:1。全文摘要本发明公开了一种异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法，其以芦荟为原材料获得初提物，在高速逆流色谱中，以正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮∶水(体积比0.5～0.1∶4～6∶0.5～2∶4～6)构成上相流动相和下相固定相，进行分离提取。本发明首次在同一分离过程中同时获得高纯度异芦荟色苷D(IsoaloeresinD)和芦荟苷(Aloin)二个单体产品，所用溶剂污染小、安全性高，方法提取率高，操作简单，适于工业化生产应用。此法在芦荟有效成分提取及生物医药领域具有广阔的应用前景。文档编号C07D309/00GK101665478SQ20091019248公开日2010年3月10日申请日期2009年9月18日优先权日2009年9月18日发明者万金志,邱春媚,陈欣霞申请人:中山大学