专利名称：一种从酱香白酒大曲中提取微生物真菌总dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种白酒大曲微生物真菌总DNA提取的方法，特别涉及一种从酱香白 酒大曲中微生物真菌总DNA提取的方法。
背景技术：
中国酱香白酒大曲是生产酱香白酒的糖化发酵剂，虽然前人已经在大曲微生物的 分析方面作了大量的研究，但是以形态学和生理化指标为基础的细菌检测和分类方法较为 复杂，而且所得出的结论难免与实际情况有所偏差。利用传统的实验室分离培养方法，由于 环境的复杂性和培养条件的限制，认为能用现有技术培养的微生物仅占微生物总种类数的
左右，并且传统的实验室分离培养方法不能及时反映出某一生态环境中细菌的构成和 变化规律。目前，大分子rRNA及其基因rDNA已被作为一个分子指标，广泛地应用于各 种微生物的遗传特征和分子差异的研究。在基因水平上研究酱香大曲微生物的关键之一是 从酱香大曲样品中高效的获得可进行分子操作的基因组DNA。由于酱香大曲样品中所含的 成分复杂，微生物种类繁多，大曲中含有的蛋白质，氨基酸和多糖含量较高，从中提取出高 质量的微生物总DNA的难度较大。随着微生物生态学的发展，各种土壤样品中提取DNA的 方法陆续建立起来，但是由于酱香白酒大曲的特殊性，提取方法一直在探讨过程中。
发明内容
本发明的目的是提供一种从酱香白酒大曲中提取真菌总DNA的方法，本发明的提取的方法，包括如下步骤步骤1、对酱香白酒大曲进行前处理得到提取物；步骤2、对前处理得到提取物进行提取得到真菌总DNA。本发明的方法，其中步骤1中所述前处理步骤如下(1)取大曲，加入含0. 05-0. 2ff/V% PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3_5W/V% 土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，缓冲液pH8.0，其中大曲和缓冲液的重量体积比为 3-8 25，振摇；(2)超声处理；静置后低速离心；取上清液，高速离心；(3)沉淀加入0. 05-0. 2ff/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸缓冲液混合；高速离心，去除上清液，得到提取物。前处理步骤中，所述磷酸缓冲液优选的是含0. 1%W/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯 烷酮)和4W/V%土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8. 0，所述大曲和磷酸缓冲液的重量 体积比优选为5 25。前处理中所述超声处理的时间优选为6-7分钟。所述低速离心的转 速优选为800-1000转/分钟。所述高速离心的转速优选为8000-9000转/分钟。本发明的方法，其中步骤2中所述提取步骤如下A.提取物用混合溶剂混合，混合溶剂的组成如下50-200mM Tris-HCl (三(羟甲 基)氨基甲烷盐酸盐)pH8. 0，50-200mM EDTANa2 (乙二胺四乙酸二钠)pH8. 0，200mMNaCl，1-3% PVP, 1-3% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)pH8. 0，溶剂为水。B.混合后 180run/min，37°C条件下振荡 30min，加 10-30% SDS 继续振荡 lOmin，细 胞进行裂解；65°C水浴Ih后，6000r离心15min，收集上清液，加0. 25-1倍体积PEG (聚乙二 醇)(30% ) -NaCl (1. 6mol/L)的水溶液，混勻后室温下静止2h，悬浮，6000_8000run/min，离 心。C.用酚-氯仿-异戊醇(体积比25 24 1)抽提一次，离心、收集水相；D.用异丙醇沉淀DNA。其中步骤D优选是用0. 6倍体积的异丙醇沉淀，优选的沉淀温度是-20°C，过夜沉淀。步骤2中所述提取步骤，优选还包括步骤E，用70%冷乙醇冲洗所得DNA沉淀的步
马聚ο本发明的方法，其中对大曲进行前处理，能使真菌更好的从大曲颗粒里面分散出 来。步骤2中的步骤C是为了除去蛋白，以及多糖等杂质。本发明的方法可以从含有大量杂质的大曲样品中提取到一定纯度的片段，不经试 剂盒纯化直接用于后续的分子生物学分析。可以对大曲中的各种真菌总DNA无偏好的进行 提取。采用本发明直接提取大曲样品中的总DNA进行鉴定，避免了在传统培养过程中的筛 选和富集作用，能更直接真实地反应大曲样品中的微生物多样性及种群分布情况，较传统 培养、分离和鉴定也更为简易、准确。本发明的方法只用酚-氯仿-异戊醇(体积比，25 24 1)抽提一次，节省时 间，成本低。为达到上述目的，本发明根据酱香白酒大曲的特点，即蛋白质，氨基酸和多糖 含量较高，结合土壤中微生物总DNA的提取方法摸索出一种适用于酱香大曲中提取真菌总 DNA的提取方法。本方法不需纯化即可用于后续的一系列操作。此方法获得的总基因组片段大约为 23kb ；纯度为0拟60/0拟80 = 1. 762,0D260/0D230 = 1. 587 ；为利用 18S rDNA 分析等后续 一系列的分子生物学技术操作打好基础，使得利用先进的分子生物学技术对大曲微生物的 研究成为可能。
附图是0. 8 %琼脂糖的胶作出的电泳图，1-—Marker, 2-—白曲，3-—黑曲，4-—黄曲，5-—母曲。结果表明本方法对不同 大曲的微生物总DNA的提取效果均较好
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行具体说明，实施例是为了进一步阐述本发明，而不 会给本发明造成任何限制。样品取自贵州仁怀金士酒业有限公司，且均为合格的成品大曲。实施例1取5g 大曲 +25mL 磷酸缓冲液(ρΗ8. 0) +0. 1 % PVPP, +ImL 土 温(80 或 60)摇 床30min,超声6-7min,静置2_5min，，沉淀低速(IOOOrpm)离心5min，取出上清，混合，高速(9000rpm)离心8min，去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP)，25mL，打散后高速离心 (9000rpm) 8min，去上清。加10-15mL提取液(提取液成分是100mM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐 酸盐)ρΗ8· 0，IOOmM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二钠)ρΗ8· 0，200mM NaCl,l% PVP,2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)pH8.0)，摇勻。在180run/min，37°C条件下振荡30min，加 2mL 20% SDS继续振荡lOmin。65°C水浴Ih后6000g离心15min，收集上清液，加0. 5倍体 积PEG (聚乙二醇)(30% ) -NaCl (1. 6mol/L)，混勻后室温下静止2h，在IOOOOg离心20min, 加4MNaAC(pH5.4)至终浓度0. 3mol/L，用酚-氯仿-异戊醇(体积比，25 24 1)抽提一 次，0. 6倍体积异丙醇沉淀过夜，12000g离心20min，沉淀干燥后，20-200 μ L TE溶解，-20V 冰箱中保存备用。实施例2取3g 大曲 +25mL 磷酸缓冲液(pH8. 0) +0. 1 % PVPP, +ImL 土 温(80 或 60)摇 床30min,超声6-7min,静置2_5min，，沉淀低速(IOOOrpm)离心5min，取出上清，混合， 高速(9000rpm)离心8min，去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP)，25mL，打散后高速离心 (9000rpm) 8min，去上清。加5-10mL提取液(提取液成分是100mM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐 酸盐)ρΗ8· 0，IOOmM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二钠)ρΗ8· 0，200mM NaCl,l% PVP,2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)pH8.0)，摇勻。在180run/min，37°C条件下振荡30min，加 2mL 20% SDS继续振荡lOmin。65°C水浴Ih后6000g离心15min，收集上清液，加0. 5倍体 积PEG (聚乙二醇)(30% )-NaCl (1.6mol/L)，混勻后室温下静止2h，在IOOOOg离心20min， 加4MNaAC(pH5.4)至终浓度0. 3mol/L，用酚-氯仿-异戊醇(体积比，25 24 1)抽提一 次，0. 6倍体积异丙醇沉淀过夜，12000g离心20min，沉淀干燥后，20-200 μ L TE溶解，-20V 冰箱中保存备用。实施例3取8g 大曲 +25mL 磷酸缓冲液(pH8. 0)+0. 2% PVPP, +ImL 土温-80 摇床 30min，超 声6-7min，静置2-5min，沉淀低速(IOOOrpm)离心5min，取出上清，混合，高速(9000rpm)离 心8min，去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP)，25mL,打散后高速离心(9000rpm) 8min,去上清。加15-25mL提取液(提取液成分是100mM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐 酸盐)ρΗ8· 0，IOOmM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二钠)ρΗ8· 0，200mM NaCl,l% PVP,2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)pH8.0)，摇勻。在180run/min，37°C条件下振荡30min，加 2mL 20% SDS继续振荡lOmin。65°C水浴Ih后6000g离心15min，收集上清液，加0. 5倍体 积PEG (聚乙二醇)(30% ) -NaCl (1. 6mol/L)，混勻后室温下静止2h，在IOOOOg离心20min, 加4MNaAC(pH5.4)至终浓度0. 3mol/L，用酚-氯仿-异戊醇(体积比，25 24 1)抽提一 次，0. 6倍体积异丙醇沉淀过夜，12000g离心20min，沉淀干燥后，20-200 μ L TE溶解，-20V 冰箱中保存备用。
权利要求
1.一种从酱香白酒大曲中提取真菌总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1、对酱香白酒大曲进行前处理得到提取物；步骤2、对前处理得到提取物进行提取得到真菌总DNA ；其中步骤1中所述前处理步骤如下(1)取大曲，加入含0.05-0. 2W/V % PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V % 土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，缓冲液pH8.0，其中大曲和缓冲液的重量体积比为 3-8 25，振摇；(2)超声处理；静置后低速离心；取上清液，高速离心；(3)沉淀加入0.05-0. 2ff/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸缓冲液混合；高速离心，去除上清液，得到提取物；其中步骤2中所述提取步骤如下A.提取物用混合溶剂混合，混合溶剂的组成如下50-200mMTris-HCl (三(羟甲基) 氨基甲烧盐酸盐)pH8. 0，50-200mM EDTANa2 (乙二胺四乙酸二钠)ρΗ8· 0，200mMNaCl，1-3% PVP, 1-3% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)pH8. 0，溶剂为水；B.混合后180run/min，37°C条件下振荡30min，加10-30%SDS继续振荡lOmin，细胞进 行裂解；65°C水浴Ih后，6000r离心15min，收集上清液，加0. 25-1倍体积PEG(聚乙二醇) (30% )-NaCl (1.6mol/L)的水溶液，混勻后室温下静止2h，悬浮，6000_8000run/min，离心；C.用酚-氯仿-异戊醇(体积比25 24 1)抽提一次，离心、收集水相；D.用异丙醇沉淀DNA。
2.权利要求1的方法，其特征在于，其中前处理步骤中，所述磷酸缓冲液是含 0. 05-0. 1%W/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)和2-4W/V%土温-80或土温-60的磷酸 缓冲液，PH8.0，所述大曲和前处理液的重量体积比为4-5 15-25。
3.权利要求2的方法，其特征在于，其中前处理步骤中，所述磷酸缓冲液是含0.W/ V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)和4W/V%土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8. 0， 所述大曲和磷酸缓冲液的重量体积比为5 25。
4.权利要求1的方法，其特征在于，其中前处理中所述超声处理的时间为6-7分钟，所 述低速离心的转速为800-1000转/分钟，所述高速离心的转速为8000-9000转/分钟。
5.权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤D是用0.6倍体积的异丙醇沉淀。
6.权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤D的沉淀温度是-20°C。
7.权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤D过夜沉淀。
8.权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤2中所述提取步骤，还包括步骤E，用70% 冷乙醇冲洗所得DNA沉淀的步骤。
9.权利要求1的方法，其特征在于，其中A.混合溶剂的组成如下100mM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH8.0， IOOmM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二钠)ρΗ8· 0，200mM NaCl，1 % PVP，2% CTAB (十六烷基 三甲基溴化铵)pH8. 0，溶剂为水。
10.权利要求1的方法，其特征在于，其中混合后180run/min，37°C条件下振荡30min，加2mL 20% SDS继续振荡lOmin，细胞 进行裂解；65°C水浴Ih后6000g离心15min，收集上清液，加0. 5倍体积PEG (聚乙二醇)(30% ) -NaCl (1. 6mol/L)，混勻后室温下静止 2h，悬浮，6000_8000run/min，离心。
全文摘要
本发明涉及一种白酒大曲微生物真菌总DNA提取的方法，特别涉及一种从酱香白酒大曲中微生物真菌总DNA提取的方法。
文档编号C07H21/04GK102071187SQ20091022870
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者张春辉, 李季, 李长文, 梁慧珍, 闫希军, 魏纪平 申请人:贵州仁怀茅台镇金士酒业有限公司