纯化促红细胞生成素的方法

专利名称：纯化促红细胞生成素的方法
纯化促红细胞生成素的方法本发明涉及纯化促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞 的包含促红细胞生成素的培养上清以特定方式连续进行特定的色谱纯化步骤。促红细胞生成素，简称ΕΡ0，是刺激骨髓中红细胞形成的糖蛋白。EPO主要在肾中 形成，从此处借助血液循环到达其靶。在肾机能不全的情况下，受损的肾产生不足的EPO或 者根本不产生ΕΡ0，这导致骨髓干细胞几乎不产生红细胞。这种所谓的肾性贫血可以通过施 用生理量的EPO来治疗，该EPO刺激骨髓中红细胞的形成。用于施用的EPO可以从人尿中 获得或者通过基因工程方法产生。由于EPO仅在人体中痕量产生，所以从天然来源分离EPO 作为治疗应用实际上不可能。因此，基因工程方法是大量产生该物质的仅有的经济选择。自从1984年鉴定了人促红细胞生成素基因，促红细胞生成素的重组生产已经成 为可能。从二十世纪九十年代初开始，已经开发了各种含有人促红细胞生成素的药物，该人 促红细胞生成素通过基因工程路线在真核细胞，主要在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中 产生。重组人促红细胞生成素的生产在例如EP-A-0148605和EP-A-205564中有描述。促红细胞生成素的重组生产通常在CHO宿主细胞中完成。尽管这些宿主细胞曾经 在加入胎牛血清并且有时也加入牛胰岛素的培养基中生长，但是目前它们通常在无血清和 无蛋白培养基中生长。这种方式能够完全避免牛蛋白、牛病毒、牛DNA或者其他不期望的牛 源物质污染的风险。用于生长真核细胞的合适无血清和无蛋白培养基可由各种生产商提 供,例如MAM-PF2培养基，其例如由Bioconc印t，Allschwil, Switzerland出售；或者DMEM 禾口 DMENU12 培养基，其由例如 Invitrogen/Gibco，Eggenstein, Germany 出售。各种促红细胞生成素的色谱纯化方法在现有技术中也有描述。EP-A-0228452描述 了从液体中纯化生物活性促红细胞生成素的方法，该方法包括阴离子交换色谱和反相色谱 的色谱步骤。EP-A_(^67678描述了无血清培养基中产生的促红细胞生成素的纯化，其通过连续 进行的渗析，离子交换色谱，制备型反相HPLC和凝胶过滤色谱进行。此处，凝胶过滤色谱步 骤能够由离子交换色谱替代。同样地，提出于(第一)离子交换色谱前在Blue trisacryl 柱上进行染料亲和色谱。EP-A-0830376描述了纯化促红细胞生成素的方法，其中将来自培养上清的EPO在 色谱纯化的第一步中进行染料亲和色谱。然后在第二步中，进行疏水载体上的色谱，之后进 行羟基磷灰石色谱。然后进行反相HPLC，其后进行最后的色谱步骤阴离子交换色谱。EP-A-1127063描述了包括以下步骤的促红细胞生成素纯化方法示差沉淀，疏水 相互作用色谱，渗滤，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和尺寸排阻色谱。每个纯化步骤以 EP-A-1127063中提到的顺序进行。在该方法的一个变体中，纯化包括如下步骤示差沉淀， 疏水相互作用色谱，渗滤，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，进一步的渗滤和尺寸排阻色 谱。在每种情况下，该方法在第一步中进行沉淀，之后进行离心。同样地，强制进行凝胶过 滤以完成色谱纯化。国际申请W0-A-03/045996描述了 EPO的纯化方法，该方法包括阴离子交换色谱和 其后的反相色谱以及进一步阴离子交换色谱。第二阴离子交换色谱之后是利用凝胶过滤介4质的尺寸排阻色谱。促红细胞生成素的纯化也是EP-A-0428267的主题。此处，色谱在Q琼脂糖⑴ Sepharose)柱上进行，在某些情况下，随后进行反相色谱和凝胶过滤。W02005/121173提供了纯化通过发酵方法产生的EPO的方法。该方法基于至少4 种不同色谱分离方法的色谱纯化。第一阴离子交换色谱之后是亲和色谱、疏水相互作用色 谱和羟基磷灰石色谱，这3个最后提及的色谱类型的顺序是按需要进行的。最后，再次使用 阴离子交换色谱。因此，当使用这些方法来生产满足欧洲药典规定的纯度标准的EPO时，需要至少5 个色谱步骤。合适的EPO标准例如小于IOOppm的来源于宿主细胞的异源蛋白含量，小于 100pg/mg EPO的来自宿主细胞的DNA含量，以及最后满足关于同种型组成标准的组成(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)。本发明的目的是描述另一种纯化方法。本发明意图获得这样的EPO终产物，其满 足欧洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)和/或关于含有重组促红细胞生成素的生物仿制药 物产品的指导(Guidance on Biosimilar MedicinalProducts Containing Recombinant Erythropoietins) (EMEA/CHMP/94256/2005)所定义的标准并且其可以在技术上以合适的 方式使用，特别是发酵的EPO的生产。特别地，本发明的目的在于本发明的方法从经济观点 而言优于现有技术方法。而且，本发明的目的在于本发明的方法使用具有很少的纯化性能 损耗的较少色谱纯化步骤并且省却特定的、技术复杂的色谱步骤，如亲和色谱。通过纯化促红细胞生成素的方法来解决技术问题，其中将产生促红细胞生成素的 真核细胞的包含促红细胞生成素的培养上清进行以下步骤a)移除细胞组分；和b)以规定的顺序通过以下色谱步骤处理a)的产物i)反相色谱；ii)阴离子交换色谱；iii)羟基磷灰石色谱。在所述方法的优选实施方案中，在步骤a)之前以及步骤a)至b iii)之间不使用 其他色谱方法。另外，还优选在步骤b iii)之后也不使用其他色谱方法。本发明的方法提供促红细胞生成素产物的增殖(propagation)，该产物满足欧洲 药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)和/或关于含有重组促红细胞生成素的生物仿制药物产品 的指导(EMEA/CHMP/94256/20(^)所定义的标准。在本文中，如此制备的促红细胞生成素满 足以下标准小于IOOppm的来源于宿主细胞的异源蛋白含量，小于100pg/mg EPO的来自宿 主细胞的DNA含量，以及最后满足关于同种型组成标准的组成(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)。 而且，获得的EPO产品在生物测定中具有至少150000IE/mg的生物活性。而且，IEF中的条 带结构和糖基化模式相应于商业Erypo 产品。事实上，在纯化来自哺乳动物细胞培养物的生物技术EPO生产的发酵上清的方法 中，将自细胞组分纯化的发酵上清以规定顺序通过以下色谱步骤处理i)反相色谱(RP色谱)ii)阴离子交换色谱(DEAE色谱)iii)羟基磷灰石色谱(HA色谱)
以极其有利但令人惊讶的方式来解决提出的问题。根据存在的现有技术(特别 是TO2005/121173，根据该国际申请，若可能则应该避免RP色谱)寻求解决所定义问题的 本领域技术人员不会成功预期减少纯化满足标准的EPO所需要的色谱步骤的数量是可能 的。结果是需要较少的设备，人力和材料并且也节约时间，但最重要的是关于病毒污染的最 大安全性。此外，本发明的方法允许使用较少的辅助剂和仅可接受的有机溶剂，例如乙醇或 2-丙醇。这个目标以适合的方式通过按照规定顺序使用上述色谱步骤来实现。本发明的方法所用的色谱原理从文献已知并且对本领域技术人员已知(Meyer， Praxis der Hochleistungs-Fliissigchromatographie [实用高效液相色谱]，Wiley-VCH Weinheim 2004 ；Unger, Handbuch der HPLC[HPLC 手册]，part 1 and 2，GIT Verlag Darmstadt 1994)。而且，关于色谱介质的更先进和详细的信息可以参见各厂商或供应商的 广品fe息。而且，产生促红细胞生成素的真核细胞优选为哺乳动物细胞，优选人细胞，并且特 别优选表达人重组促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。另一优选方法提供将那些条带模式和糖基化模式与参考物质不相应的洗出液部 分额外地进行另外的ii)的阴离子交换色谱和/或iii)的羟基磷灰石色谱。而且，优选超滤在步骤i)、ii)和/或iii)之后进行。在另一优选方法中，步骤a)包括微滤和随后的超滤。在一优选方式中，反相色谱在作为固定相的载体材料上进行，该载体材料选自 C1-至C8-改性的硅胶、基于聚苯乙烯/ 二乙烯基苯的疏水聚合载体以及硅胶或聚合物基底 上的疏水整体相(monolithic phase)材料，并且将水性链烷醇溶液用作洗脱液。作为洗脱 液特别优选使用乙醇或2-丙醇或它们的混合物，非常特别优选使用2-丙醇，并且与适合地 缓冲的水性体系一起使用。在另一优选方法中，阴离子交换色谱在作为固定相的载体材料上进行，该载体材 料带有选自二乙氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)、季铵基团或二甲氨基乙基(DMAE)的 官能团。而且，优选阴离子交换色谱法包括至少一个洗涤步骤，该洗涤步骤使用水性缓冲 体系，优选基于有机酸的缓冲体系，特别是乙酸缓冲液。阴离子交换色谱法特别优选包括至少一个洗涤步骤，该洗涤步骤使用PH值为3. 5 至5. 5，特别优选pH值为4. 0至5. 0，并且最优选pH值为约4. 5的水性缓冲溶液。合适的 缓冲液特别是乙酸盐缓冲液，优选乙酸钠缓冲液。在一优选方式中，用于阴离子交换色谱法的洗脱液是无机酸的水性缓冲溶液。在 另一特别优选的方式中，用于阴离子交换色谱法的洗脱液是氯离子的水性缓冲溶液。在另一优选方法中，羟基磷灰石色谱法包括至少一个洗涤步骤，该洗涤步骤使用 基于有机酸的缓冲体系，优选乙酸缓冲液。作为羟基磷灰石色谱法中的洗脱液，同样优选使用基于无机酸的缓冲体系，特别 优选磷酸缓冲液。特别优选的实施方案的说明本发明提供了纯化促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细 胞的包含促红细胞生成素的培养上清进行以下步骤6
a)移除细胞组分；和b)以规定的顺序通过以下色谱步骤处理a)的产物i)反相色谱；ii)阴离子交换色谱；iii)羟基磷灰石色谱。反相色谱用作“捕捉步骤”。在该第一纯化步骤中，从发酵上清中浓缩ΕΡ0。此处 重要的是样品分子与固定相之间的不同疏水相互作用。样品组分越少溶于水，即它们越非 极性，它们越多地被保留。反相色谱可以用常规可商购的相材料在硅基底和聚合物基底上 进行，该相材料特别适合于蛋白分析。常用的材料是大孔硅胶材料，例如300 A或500 A ，且具有短链碳负荷，例如Cl，C2，C3和C4 ；无孔疏水的基于聚苯乙烯/ 二乙烯基苯的聚合 载体；以及特别地，疏水整体相材料，同样在硅胶或聚合物基底上。这些固定相的生产商或 供应商包括例如是 Merck、Waters> GE Healthcare、Tosoh Bioscience、Bio-Rad、Dionex、 YMC> Phenome-nex> Machery-Nagel 禾口 BIO Separations。优选的反相材料是无孔疏水的基于聚苯乙烯/ 二乙烯基苯的聚合载体。特别优选 SOURCE 30RPC 或者来自 GE Healthcare 的相应的 15 μ m 材料(SOURCE 15RPC)。优选可用的洗脱液是具有合适缓冲的水性体系的醇例如乙醇或2-丙醇或者它们 的混合物。使用2-丙醇是特别优选的，因为与乙醇相比洗脱液中的有机溶剂部分明显较 低，这表明了安全和经济方面的优势。而且，2-丙醇由于其溶混性和溶解性质而作为增溶 剂是特别优异的(Unger,Handbuch der HPLC[HPLC 手册]，part 1,GIT Verlag Darmstadt 1994 ；Nowotny et al. , Chromatographia 1988,25,409-412)。阴离子交换色谱基于样品溶液与所用的缓冲介质之间的带电离子的竞争性相 互作用。它可以用常规可商购的阴离子交换树脂来进行，该阴离子交换树脂具有二乙氨 基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)、季铵或二甲氨基乙基(DMAE)官能化。这些相材料可 以从例如 GE Healthcare、I^osohBioscience、Bio-Rad 或 Merck 获得。优选使用二乙氨 基乙基(DEAE)-官能化的阴离子交换树脂。在阴离子交换色谱法中，特别优选使用可从 TosohBioscience获得的TSKgel DEAE_5PW(30 μ m)。根据最终EPO产物所要求的糖基化模 式，该色谱步骤是重要的。在优选的实施方案中，阴离子交换色谱法包括酸洗涤步骤(“酸洗”)，借此由于pH 值的降低，洗脱并因而分离了促红细胞生成素的碱性同种型(EP-14^878)。在本文中，“酸 洗”是指洗涤缓冲液的PH值为3. 5至5. 5之间，特别优选4. O至5. O之间，最优选约4. 5。 合适的缓冲液特别是乙酸钠缓冲液。为了进行羟基磷灰石色谱法，可能使用常规的羟基磷灰石(也称为羟基磷灰石 (hydroxylapatite))材料。羟基磷灰石是六边形晶体磷酸钙并且特别适合于分离蛋白和其 他生物聚合物。该纯化步骤用于移除“磷酸化的"ΕΡ0分子。优选使用CHT陶瓷羟基磷灰石 (Bio-Rad)，特别优选1型CHT陶瓷羟基磷灰石(Bio-Rad)。从再加工的意义上而言，对于产品质量，特别是条带或糖基化模式与参考物质不 相应的那些洗出液部分，为了增加总产率，不仅重复反相色谱，还重复阴离子交换色谱和羟 基磷灰石色谱。这些部分通常是主要部分的开头和拖尾边缘部分，其本身在第一纯化步骤 后已经表现出期望的产品特征。利用标准方法进行不同纯化水平的部分质量的分类(等电点聚焦(IEF)和具有脉冲电流检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD) =Lasne, Nature 2000，405605-635 ； Hollander et al.，LaborPraxis 2004，56-59 ；Hokke et al.，Eur. J. Biochem. 1995,228,981-1008 ；Dionex Technical Note42，1997)。每种情况下使用的参 考物质是可商购的Erypo 产品(JANSSEN-CILAG)。在将培养上清用上述色谱方法的纯化之前，进行通过1. 2-μ m-和0. 65-μ m-滤 器的微滤以去除细胞。然后对无细胞滤液进行超滤(截止(cut-Off) 10000Da)至1/10原 始体积。超滤之后，将浓缩的细胞上清过滤灭菌并用于第一色谱步骤(反相色谱)。过 滤步骤特别是过滤灭菌从文献已知并且对本领域技术人员是已知的(Mimir，Handbuch Ultrafiltration, BehrHamburg 1990 ；Ullmann Vol.2,10-2,10-21 and Vol. 311-6 ； Gasper, Handbuch der industriellen Fest-Fliissig-Filtration, Hiithig Heidelberg 1990 ；Ullmann A16,187-258)。发现通过本发明的方法获得的EPO满足欧洲药典所定义的质量标准。特别地，同 种型组成和糖基化模式相应于欧洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 1316)或含有重组促红细胞生 成素的生物仿制药物产品的指导(EMEA/CHMP/94256/20(^)所定义的标准。参考物质是可 商购的Erypo 产品(JANSSEN-CILAG)。蛋白活性应该达到至少100000IU/mg，优选至少125000IU/mg，并且特别优选至少 150000IU/mg (也参见欧洲药典 01/2002 :1316)。根据本发明纯化的EPO优选为产生于真核细胞的重组人促红细胞生成素。优选在 哺乳动物细胞中生产重组ΕΡ0，特别优选在CHO细胞中生产重组ΕΡ0，例如如EP-A-0205564 和EP-A-0148605所述。发酵在可商购的培养基中根据常规方法进行。为本发明的目的，促红细胞生成素(EPO)理解为表示能够刺激骨髓中红细胞形成 的任何蛋白，并且其在欧洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)所述的测定(红细胞增多或正 常红细胞的小鼠中活性的测定)中可以明确鉴定为促红细胞生成素。促红细胞生成素可以 为野生型人促红细胞生成素的形式或其具有一或多个氨基酸取代，缺失或添加的变体。如 果其为促红细胞生成素的变体的形式，则由于氨基酸取代，缺失或添加，该变体优选与人野 生型促红细胞生成素差别仅为1至20个，优选仅为1至15个，特别优选仅为1至10个氨 基酸位置。在本发明中，促红细胞生成素的纯化或促红细胞生成素的浓缩意味着从混合物中 得到非常纯的形式的促红细胞生成素蛋白，换言之，将存在于混合物中的促红细胞生成素 浓缩至除了标准促红细胞生成素之外基本上不再存在其他蛋白。


图1表示反相色谱中促红细胞生成素峰的色谱分离的实例。图中是^Onm的UV 波长下毫吸收单位(mAU)比洗脱时间(以min.表示)形式的峰强度。图2表示阴离子交换色谱条件下促红细胞生成素峰的色谱分离的实例。图中是 ^Onm的UV波长下毫吸收单位(mAU)比洗脱时间(以min.表示)形式的峰强度。图3表示与Erypo 产品相比，阴离子交换色谱之后分离的EPO洗出液部分的IEF 凝胶的实例。
图4表示羟基磷灰石色谱中促红细胞生成素峰的色谱分离的实例。图中是在 ^Onm的UV波长下毫吸收单位(mAU)比洗脱时间(以min.表示)形式的峰强度。图5表示与Erypo 相比，羟基磷灰石色谱之后分离的EPO洗出液部分的IEF凝胶 的实例。图6表示纯化的最终EPO产物的天然糖基化状态。图7表示可商购的Erypo 产品(JANSSEN-CILAG)的糖基化状态。以下的实施例意图示例本发明，而不是加以任何限制。实施例实施例1 在CHO细胞中生产EPO在CHO细胞中发酵产生ΕΡ0。发酵通过如在真核细胞特别是CHO细胞的专利和科 技文献中描述的标准方法进行。于灌注反应器内，在无动物组分的培养基中进行培养。在高 达50天的时间段内连续收集细胞。通过合适的滤器(例如Opticap XLT30囊(capsule)， 其具有MiIligard 介质 0. 5-1. 2 μ m, MiIlipore 禾P Sartobran P Midi-caps 0. 45-0. 65 μ m, Sartorius)以l-21/min的流速进行微滤以移除细胞。然后，首先进行无细胞滤液的超滤 (截止 IOOOODa)(例如Ultran Pilot，聚醚砜4X0. 45m2，Schleicher &khiill)，接着进行灭 菌过滤(例如通过Opticap滤器单元，其具有0. 5μ mMi 1 Iigard前滤器和0. 2μπι Durapore 灭菌滤器，Millipore)。实施例2反相色谱(“捕捉步骤”)作为“捕捉步骤”在SOURCE 30RPC上进行反相色谱。在该第一纯化步骤中，从发酵 上清浓缩ΕΡ0。此处，进行几个洗涤步骤。第一洗涤步骤用PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)进 行。下一洗涤步骤用体积比为10/2/0. 1至10/1/0. 1的水/异丙醇/TFA混合物以40-50ml/ min的流速进行。产物洗脱用体积比为10/4/0. 1的水/异丙醇/TFA混合物以30-40ml/min 的流速进行。流速以适合该分离的方式优化和调整。之后，洗涤步骤用体积比为60/40的 异丙醇/0. 1% TFA溶液进行。洗脱之后直接将三氟乙酸产物部分用磷酸盐缓冲液(pH 10)以1 1的比率处理 并用15mM磷酸钠缓冲液稀释至pH 7.2。现在，将在那个步骤中中和的包含EPO的溶液过滤 灭菌。于TFA/乙腈体系中，在分析RP-HPLC分离柱上进行EPO浓缩的过程质量控制 (IPC)。该色谱步骤之后EPO产率达到至少50 %，优选至少65 %，并且特别优选至少80 %。实施例3 阴离子交换色谱以20ml/min的流速应用来自反相色谱的中和的EPO产物部分。现在，将包含EPO 的溶液以40ml/min恒定流速，通过3个洗涤步骤进行纯化，第一和第三洗涤步骤各自在7. 2 的PH值下用20mM乙酸钠溶液进行，而第二洗涤步骤在4. 5的pH值下用合适的乙酸钠溶液 进行。产物洗脱利用乙酸钠/氯化钠缓冲液(PH 7. ，(流速30-40ml/min)在梯度条件下 进行。在该方法中，缓冲液的量从0至80%缓慢地线性增加。在等电点聚焦(IEF)的辅助下，根据IEF中的条带位置分析洗出液部分并分成产 物池(product pool)(主要部分)和边缘部分。所用的参考材料是可商购的Erypo 产品。9主要部分的EPO含量通过RP色谱来测定。将所选的洗出液部分通过超滤浓缩并进行随后 的羟基磷灰石色谱的缓冲液交换。该色谱步骤之后，促红细胞生成素的产率达到至少20%， 优选至少30 %，并且特别优选至少40 %。等电点聚焦在超薄层聚丙烯酰胺凝胶上进行。为此目的，在应用之前必须将样品 溶液借助微量离心试剂盒(截止IOOOODa)脱盐和浓缩。聚焦在300-2000V的电压下完成。 5000Vh之后，显影完成。然后，将凝胶用硝酸银或考马斯染色并评价。实施例4 羟基磷灰石色谱该纯化步骤适合于移除“磷酸化的”EPO分子。利用超滤，将阴离子交换色谱的主 要部分进行缓冲液交换以进入羟基磷灰石柱的起始缓冲液中，然后进行过滤灭菌。将样品以30ml/min的流速注入1型CHT陶瓷羟基磷灰石相上。洗涤步骤用乙酸 钠缓冲液(PH 6. 8)并且样品洗脱用pH 6. 8的磷酸缓冲液以50ml/min的流速在梯度条件 下进行。在进行这些步骤时，磷酸缓冲液的量从0至25%缓慢地线性增加。满足规定的EPO部分存在于乙酸钠/磷酸钠缓冲液中，通过超滤将其与PBS (最终 填充缓冲液)进行缓冲液交换并冷冻于-20°C。各个部分的EPO含量用RP色谱测定。该色谱 步骤之后促红细胞生成素的产率达到至少30%，优选至少40%，并且特别优选至少50%。利用PNGase F (Roche Diagnostics GmbH)，在蛋白的碳水化合物链的酶促切割之 后通过HPAEC-PAD进行糖基化模式的分析。分离和脱盐之后，糖残基在高效阴离子交换剂 中用脉冲电流检测进行分析。获得的最终EPO产物在生物测定中具有至少150000IU/mg的生物活性并且满足欧 洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)或关于含有重组促红细胞生成素的生物仿制药物产品的 指导(EMEA/CHMP/94256/2005)的所有要求。另外，IEF中的条带结构和糖基化模式相应于 可商购的Erypo 产品。10
权利要求
1.纯化促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞的包含促红细 胞生成素的培养上清进行以下步骤a)移除细胞组分；和b)以规定的顺序通过以下色谱步骤处理a)的产物i)反相色谱； )阴离子交换色谱；iii)羟基磷灰石色谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)之前以及步骤a)至biii)之间 没有使用其他色谱方法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述产生促红细胞生成素的真核细胞 是哺乳动物细胞，优选人细胞，并且特别优选表达人重组促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢 细胞。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其特征在于将产品质量与参考材 料不相应的那些洗出液部分额外地进行另外的i)的反相色谱和/或ii)的阴离子交换色 谱和/或iii)的羟基磷灰石色谱。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于在步骤i)、ii)和/或 iii)之后进行超滤。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其特征在于步骤a)包括微滤和随 后的超滤。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述反相色谱在作为 固定相的载体材料上进行，所述载体材料选自C1-至C8-改性的硅胶、基于聚苯乙烯/ 二乙 烯基苯的疏水聚合载体以及硅胶或聚合物基底上的疏水整体相材料组成的组中，并且其中 将水性链烷醇溶液用作洗脱液。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述阴离子交换色谱 在作为固定相的载体材料上进行，所述载体材料带有选自二乙氨基乙基(DEAE)、季氨基乙 基(QAE)、季铵基团或二甲氨基乙基(DMAE)的官能团。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述阴离子交换色谱 包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤使用水性缓冲体系。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述阴离子交换色谱 包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤使用基于有机酸的缓冲体系。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述阴离子交换色 谱包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤使用PH值为3. 5至5. 5的水性缓冲溶液。
12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其特征在于用于所述阴离子交 换色谱的洗脱液是无机酸的水性缓冲溶液。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其特征在于用于所述阴离子交 换色谱的洗脱液是氯离子的水性缓冲溶液。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述羟基磷灰石色 谱包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤使用基于有机酸的缓冲体系。
15.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述羟基磷灰石色谱包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤使用乙酸缓冲液。
16.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其特征在于用于所述羟基磷灰 石色谱的洗脱液是基于无机酸的缓冲体系。
17.根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其特征在于用于所述羟基磷灰 石色谱的洗脱液是磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明涉及制备促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞的包含促红细胞生成素的培养上清进行以下步骤a)移除细胞组分；和b)以规定的顺序通过以下色谱步骤处理a)的产物i)反相色谱；ii)阴离子交换色谱；iii)羟基磷灰石色谱。
文档编号C07K14/505GK102056940SQ200980120764
公开日2011年5月11日 申请日期2009年5月28日 优先权日2008年6月4日
发明者C·比尔, D·朔波尔-柯尼希, D·赖歇特, F-R·孔茨, L·法贝尔, M·辛霍费尔-沃夫拉, R·汉科, W·奥伊尔, W·维南德 申请人:赢创德固赛有限公司