新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶的制作方法

专利名称：新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有肽基a -羟基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的分离多肽、用于制 备这样的多肽的方法和这样的多肽在用于产生C端a _酰胺化肽的方法中的用途。
背景技术：
在多细胞生物体中，某些肽(“前体”)，像神经肽，是在一连串切割并进一步修饰肽底 物来产生完整功能的生物反应性肽的酶促步骤中翻译后修饰的。该过程在反式_高尔基体 中开始并作为未成熟的分泌颗粒继续。对于多数这类肽，非常重要的晚期翻译后修饰是羧 基端的a酰胺化。C端残基的a酰胺化对于参与人或动物代谢的数种肽激素的活性是关键的。数种 肽激素现今被用作药物治疗人类(例如用于控制肥胖症和/或糖尿病)或作为潜在药物在 开发中。这种肽激素的一个实例是胰淀粉样肽(例如Symlin ，醋酸普兰林肽，其为人胰淀 粉样肽的类似物)。人胰淀粉样肽是37个氨基酸残基的肽，其可用于治疗或预防肥胖症和 /或糖尿病。因此，为了获得完整生物学活性，胰淀粉样肽的C端需要被酰胺化。同样地肽 YY (PYY)应该被a酰胺化以获得完整生物学活性。大肠杆菌(￡ co7i)和酵母被广泛用于真核生物来源的肽的重组表达。然而，由 于C端a _酰胺基的性质，使用基于大肠杆菌和酵母的现有技术微生物表达系统不能将肽 激素表达为活性形式，因为a酰胺化酶在这些生物体中不能被天然表达。因此，C端a酰 胺必须被引入到重组表达肽中，这使用例如具有a酰胺化酶的离体修饰。在数种真核生物体中发现，凭借双功能肽基a-酰胺化单加氧酶(PAM)将具有C 端Gly的肽前体酶修饰为a-酰胺。关于该酶，已描述了多种编码不同同工型的可变剪接 转录物变体。关于多细胞生物体，已专门描述该酶(Metazoa)。将肽中C端Gly残基转化为 a-酰胺是两步过程，其中PAM的N端结构域(命名为PHM)催化甘氨酸转化为a _羟基甘 氨酸，然后PAM的C端结构域(命名为PAL)催化a -羟基甘氨酸转化为a -酰胺。在真核 生物体中，两个催化结构域顺序工作来催化神经内分泌肽为活性a-酰胺化产物。在来自 真核生物体的PAL结构域中，两条二硫桥是高度保守的。虽然通过化学方法合成包含C末端上酰胺基(a酰胺)的小肽是可能的，但是产 生较大的a-酰胺化肽是困难和昂贵的。因此，a酰胺化酶可用于转化重组前体肽为成熟 肽。US4708934描述从甲状腺髓样癌细胞系和组织样品中提取的肽基-甘氨酸a -酰 胺化单加氧酶。US5789234描述通过重组DNA技术产生a -酰胺化酶。W090/08194涉及一种用于通过使用真核生物C端a酰胺化酶从前体肽产生C端 a酰胺化肽的方法。还描述了一种用于真核表达这些C端a酰胺化酶的方法。W089/02460描述一种牛来源的PAM酶、其克隆、cDNA和通过重组DNA技术的表达。EP0448513描述一种用于重组表达来源于非洲爪蟾Cfeflo/ws Lae vis)的肽基甘 氨酸a-羟化单加氧酶的方法，其包括培养用重组杆状病毒转染的昆虫细胞来产生该酶，其中编码肽基甘氨酸a-羟化单加氧酶的DNA已掺入到重组杆状病毒中。EP0465404描述一种来源于非洲爪蟾的酶(PHL ；PAL)、酶的克隆及其在昆虫细胞 中的重组表达，该酶催化切割在C端a-羟化肽的a-羟基甘氨酸部分中的N-C键。US 20060292672描述一种用于表达PAM或其两个催化结构域的一个的细胞系。EP2172550描述一种重组C端a -酰胺化酶衍生物，其不形成来源于非洲爪蟾的C 端a-酰胺化酶中通常存在的5个二硫键中的至少1个，和描述一种在大肠杆菌中重组产 生所述衍生物的方法，其中获得的包含体是增溶的并经历重折叠步骤。发明概述
本发明涉及新的酶，其能够催化肽中a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺(肽基a-羟基 甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性)。新的肽来源于原核生物体并具有与对真核生物PAL酶所述的不同的物理化学和 结构特性。因此，本发明提供具有肽基- a _羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征 在于它们来源于原核生物体。本发明还提供具有肽基-a _羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征在于 它们在大肠杆菌中可被表达为可溶性酶促活性蛋白。本发明还提供具有肽基-a _羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征在于 它们具有不包含半胱氨酸残基或者包含至多1或至多2个半胱氨酸残基的氨基酸序列。本发明还提供一种具有肽基-a _羟基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的酶，其特征 在于其可通过包括以下步骤的方法产生a)在适合于酶表达的条件下培养重组大肠杆菌 菌株宿主细胞，该细胞包含含有编码酶的核苷酸序列的核酸构建体；和(ii)在宿主细胞破 碎和离心后从上清液中回收酶。本发明还提供能够催化肽中a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的酶，其中所述酶具 有包含下述基序(命名为基序1)的氨基酸序列
Xaax Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gin Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp ;其中XaafXaa^独立选自天然存在氨基酸,条件是Xaa: 和Xaa7不是Cys。本发明还提供能够催化肽中a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的酶，其中所述酶具 有包含下述基序(命名为基序2)的氨基酸序列
Asp Gly Tyr Xaa17 Asn Xaa18 Arg Xaa19 Xaa20 Xaa21 Phe Xaa22 Xaa23 Xaa24 Gly Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 Gly Xaa34 Xaa35 Xaa36 Gly Xaa37 Phe ;其中 Xaa17-Xaa37独立选自天然存在氨基酸,条件是Xaa17不是Cys。本发明还提供具有肽基_ a -羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其包含与 选自以下序列的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列(a) SEQ ID NO: 1的氨基酸 2-306 ； (b) SEQ ID NO: 2 的氨基酸3-336 ; (c) SEQ ID NO: 3 的氨基酸3-305 ; (d) SEQ ID NO: 4 的氨基酸3-279 ; (e) SEQ ID NO: 19 ； (f) SEQ ID NO: 20 ； (g) SEQ ID NO: 21 ； (h) SEQ ID NO: 22 和(i) SEQ ID NO: 23。本发明另外提供本发明的酶在用于通过催化肽中C端a-羟基甘氨酸残基转化 为a-酰胺残基来制备a-酰胺化肽的方法中的用途。本发明还提供使用本发明的酶产生α-酰胺化肽的方法。此外，本发明涉及一种用于通过提供编码本发明酶的分离核酸、包含 核酸的载体和宿主细胞由重组技术产生本发明酶的方法。


图I :质粒C的典型pETlla载体图谱,其编码来自赤细菌属(Erythrobacter)的 细菌PAL样结构域(SEQ ID NO: I)(不具有预测的信号肽)和N端融合伴侣(SEQ ID NO: 7)以及介于中间的接头区(SEQ ID NO: 8)中的HRV14 3C蛋白酶切割位点(用特征蛋白3 标记整个融合蛋白)。描绘了 Ndel、XhoI和BamHI限制酶位点。T7启动子区、氨苄青霉素 抗性基因、IacI阻抑区和复制起点位点也在载体图谱中示出。图2 :SDS-PAGE，显示加上RL9_THEMA TAP标签的赤细菌属PAL样结构域(A)和 大鼠PAL (B)的表达概况。Uind :未诱导的细胞培养物对照(阴性对照)，Ind :在30°C用 O. 5mM IPTG诱导3小时后，Sup :可溶性级分，Pel :不溶性级分。箭头指示凝胶上PAL条带 的分子量位置。虽然表达水平是可比的，但是赤细菌属PAL样结构域被表达为高度可溶性蛋白， 相比之下大鼠PAL被表达为不溶的并将需要重折叠来获得功能性酶。图3 :A =FPLC色谱图，显示加上RL9_THEMA标签的赤细菌属PAL样结构域的SP Sepharose FF纯化概况。用箭头所示的约O. 25 M浓度的NaCl洗脱融合蛋白。虚线表示电 导率曲线，实线表示在280nm的UV吸收信号。在X轴上的数字表示级分和ml。B =SDS-PAGE凝胶，显示来自图3A色谱图上主峰的级分。Apl :装载到柱子上的装 载物(application), Ft :流通级分。在一个阳离子交换色谱步骤后，TAP标签提供有效的 捕获和高纯度。图4A :FPLC色谱图，显示用HRV14 3C蛋白酶加工融合蛋白后，释放RL9_THEMA标 签的成熟微小杆菌属(Exiguobacterium) PAL样结构域的Q Sepharose HP分离。以箭头 所示的约0.4M NaCl洗脱主峰。虚线表示电导率曲线，实线表示在280nm的UV信号。在X 轴上的数字表示级分和ml。图4B :来自图4A所示的FPLC分离的洗脱级分的SDS-PAGE分析。图4A. Apl :装 载到柱子上的装载物，Ft:流通级分。在装载物泳道中，两条条带代表成熟微小杆菌属PAL 样结构域(约30 kDa)和释放的纯化标签(约18 kDa)。来自纯化的主峰几乎只包括成熟 PAL (实箭头)，而释放的TAP标签不结合阴离子交换柱并在流通级分中存在(虚箭头)。图5 :分别代表α -羟基甘氨酸(Gly (OH))和α -酰胺(-ΝΗ2)(在相关峰下标记) 的合成的α-羟基苯甲酰甘氨酸和苯甲酰胺的UPLC分析。用在N端具有或不具有TAP标 签的细菌PAL样酶加上相关辅因子在37°C孵育α-羟基苯甲酰甘氨酸3小时。加粗箭头指 示最显著的酶促转化为苯甲酰胺。图5. A :使用酸性(MES ρΗ5. 5)或碱性(Tris ρΗ7. 5)缓冲条件测试的具有(+TAP) (SEQ ID NO: 7)或不具有(-TAP)纯化标签的赤细菌属PAL样结构域的分析。阴性(neg.) 对照(ctrl)是不加入酶的样品的色谱图。α羟基苯甲酰甘氨酸转化为苯甲酰胺可在如之 前文献所述的高PH (图5A 6/7)下自发发生。然而，从α-羟基苯甲酰甘氨酸和苯甲酰胺 底物峰面积的相对面积得出的结论是，加入酶可催化转化，具有(图5Α 2/7)和不具有TAP 标签(图5Α 4/7)两者都在ρΗ7. 5时最有效。
g 5. B(MES pH5. 5) iMfê (Tris pH7. 5)W W (+TAP)(SEQ ID NO: 7) W'ê'itêifflii {Chthoniobacter) PAL faille°
( S 5B 3/7)
pH5. 5( 53 5B1/7) o 6MS if, Mìi^XWL PHM MWüEmnn PAL PAL f fêo X $é -.MMVC, tM/l^i+o Y $é :MS AfMMm MS tfltWM i#1; 0íf#JttXíM ( c M Gly f m ) : 13934, 66 Da, a -C a -) =13951 Da, a - fM : 13876. 62Da
AB :ia! PHM mil (2 /W ), C(Planctomyces) PAL #
^ ssio (2/Jnw),d:^mmmpMn^niá, ú3 (2/m),e:# mpal10 (5/JnBí ),F:^MPAL#^}| )j|!c,Sá 3 (5 /jNftf ) 0M7 :^m^HìèMMPALW^fàià (SEQ ID NO: 1-4) W MitW C m a ^
sttMmM#w^#iíWíi ^íRMsif0 x$éy$é -Msmm
MS tfltWM ie^dj ; a -^ c M a - H
sttMn-.m 4023Da) mm -im (^39490a)
(w/w) A(SEQ ID NO: 1) i) PHM &bSéftXtM (etri), ii) 1:1250, iii)1:500, iv) 1:100
B :i￥ J^ M (SEQ ID N0: 4) i) PHM(etri), ii) 1:1250, iii) 1:500,
iv) 1:100
C:^±fêiffl (SEQ ID NO: 3) i) PHM&b I Mj (etri), ii) 1:100, iii) 1:50,iv) 1:25
D MA'IftMM (SEQ ID NO: 2) i) PHM&b I Mj (etri), ii) 1:100, iii) 1:50,iv) 1:25
aX
rnvfummmta-iMw^t^êBio
2-imBi>iís a -im bsa -m^p - -f-mvfum a-m
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PHMW Wi&W2-a-llftl
MBIJiSttM a -a -a - mtmü
üBSa -EC 1. 14. 17. 3 SttMS^Pl ^ffffiatl“PALS|,V<PAL,,sK“Jte -aa
ita -!M o PALa
$1tMSmMit $BS>HGAD,PGL4. 3. 2. 5
mmviumn-c(phlk palsiw^ tm^ d) m mit cm
R-Gly (OH) - R-NH2R JéfljL g S0
本文所用的表述“本发明的酶”意指具有肽基_ a -羟基甘氨酸a -酰胺化裂合酶 活性的本发明多肽。非肽底物(例如a -羟基苯甲酰甘氨酸)也充当PAL的底物。术语“PAL样”意指与已知真核生物PAL酶具有相同活性的酶。“靶肽”意指在a -酰胺化过程中被修饰而获得C端a _酰胺基的肽。靶肽应该在 C端中包含Gly残基。靶肽可被描述为具有式R’ -X-Gly，其中X代表任何氨基酸且X是将 被转化为氨基酸酰胺的氨基酸，即对于该氨基酸，在酶促a-酰胺化过程反应中-C00H被 转化为C0-NH2，R’代表肽的剩余部分，和Gly代表C端甘氨酸残基。靶肽的一个实例是胰淀粉样肽前体，其除了胰淀粉样肽序列外还在C端包含Gly 残基。与本发明相关的Gly-延伸肽前体的其他非限制性实例包括神经肽Y (NPY)、肽 YY (PYY)、PYY-3-36、胰多肽(PP)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、胃泌素、降钙素、降钙素相关 肽(CGRP)、胃泌素释放肽、加压素、催产素、神经激肽A、胰泌素、胰抑释素、阿黑皮质素原 (POMC)、a-促黑素细胞激素(a MSH)、Y _促黑素细胞激素(Y 1MSH)和酰胺化铰链肽 (HP-N)，或者它们的功能类似物。本文所用的术语“分离的多肽”或“分离的多核苷酸”指的是从其天然来源分离的 多肽或多核苷酸。本文所用的术语“纯化”或“回收”指的是从样品中移除污染物。例如，本发明的 PAL酶是通过移除溶液或制品中的污染蛋白和其他化合物纯化。在一些方面，使用细菌表达 本发明的PAL酶，并通过移除其他宿主细胞成分来纯化这些重组PAL酶，从而增加样品中重 组PAL的百分比。术语“实质上纯的多肽”在本文中指，多肽制品包含至多20%、至多10%或至多5% 重量的与其天然或重组缔合的其他多肽材料。因此，以制品中存在的总多肽材料的重量计， 优选实质上纯的多肽是至少80%纯、至少90%纯或优选至少95%纯。本发明的多肽优选为 实质上纯的形式，即多肽制品基本上不含与其天然或重组缔合的其他多肽材料。这可例如 通过公知的重组方法或通过经典的纯化方法制备多肽来实现。在一个方面，“％纯度”定义为目标蛋白的量/(目标蛋白的量+宿主细胞污染物的 量)X 100。其可通过SDS-PAGE分析或确定量的HPLC分离来确定。在一个方面，本发明多肽为至少1%纯，例如至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、 至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯。本文使用的关于本发明多肽的术语“回收”意指，在一个实施方案中，多肽/酶不 与显著水平(例如，至多1%、至多2%、至多3%、至多5%、至多10%或至多25%)的产生多肽的 系统(例如，细胞培养物)内所包含的任何外来和不合需要的生物分子缔合。回收的多肽 指的是，由于人类干预(不管是自动、手动还是两者)而通过纯净阶段的本发明的多肽。应 当理解，在组合物中存在的本发明的回收多肽和本发明的分离多肽也在本发明内。换言之， 术语“回收”或“分离”并不意在排除有其他化合物或材料的人工或合成混合物。本文可交换使用术语“蛋白”、“肽”和“多肽”。其中肽是蛋白的一部分，本领域技 术人员理解该术语在上下文中的使用。本文可交换使用表述“本发明的酶”和“本发明的多 肽”。氨基酸序列的“修饰”意指，在序列中置换、缺失和/或添加(包括插入)一个或多个氨基酸。在另外的方面中，它也包括一条或多条氨基酸侧链的置换。术语“表达载体”本文定义为这样的线性或环状DNA分子，其包含编码本发明多肽 的多核苷酸，并与提供其表达的另外的核苷酸有效连接。术语“质粒”、“表达载体”和“载体” 可交换使用，因为质粒是目前最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这样的起等价功能 的其他形式的表达载体。本文使用的“表达载体”或“载体”指的是这样的DNA构建体，其包 含与能够影响DNA在合适宿主中表达的合适控制序列有效连接的DNA序列。这样的控制序 列例如可包括影响转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵基因序列、编码合适mRNA核 糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体例如可为质粒、噬菌体或仅潜在 的基因组插入片段。一旦转化到合适宿主中，载体可例如复制并独立于宿主基因组起作用， 或在一些实例中可将其自身整合到基因组中。两条氨基酸序列之间的关联性由参数“同一性”(“％同一性”)描述。在本发明氨 基酸序列的上下文中，同一性可通过任何合适的技术/程序确定，通常通过使用具有起始 空位罚分为-12和延伸罚分为-2的BL0SUM50评分矩阵的Needleman-Wunsch比对分析(参 见 Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453)确定。使用 Needle 标记 的“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的输出，百分比同一性可如下计算(相同的 残基X 100)/(比对的长度-比对中空位的总数)。因为Needleman-Wunsch比对提供两 条序列之间的总体或全局同一性测定，所以应该认识到，靶序列(其可为较大肽序列的部 分或子序列)可以类似于完整序列的方式应用，或备选地，可将局部比对值用于评估子序 列之间的关系，例如通过 Smith-Waterman 比对(J. Mol. Biol. (1981) 147:195-197)确 定，其可通过可得的程序获得。适合于分析同一性的其他局部比对方法可包括应用启发式 局部比对算法的程序，例如FastA和BLAST程序。当本文使用的术语“编码序列”意指核苷酸序列时，其直接指定其蛋白产物的氨基 酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，开放阅读框通常以ATG起始密码子或备 选起始密码子(例如GTG和TTG)开始并以终止密码子(例如TAA、TAG和TGA)结束。编码 序列可为DNA、cDNA、合成或重组核苷酸序列。术语“cDNA”本文定义为可通过逆转录从获自 真核细胞的成熟、剪接mRNA分子中制备的DNA分子。cDNA没有通常存在于相应基因组DNA 中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在成为成熟剪接mRNA之前通 过一系列的步骤加工。这些步骤包括通过称为剪接的过程移除内含子序列。cDNA来源于 mRNA,因此没有任何内含子序列。术语“编码…的核酸分子”、“编码…的核酸序列”、“编码…的DNA序列”和“编码… 的DNA”指的是，沿着一连串脱氧核糖核酸的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖 核苷酸的顺序决定沿着蛋白链的氨基酸的顺序。DNA序列因此编码蛋白(例如酶)的氨基 酸序列。本文使用的术语“核酸构建体”指的是单链或双链的核酸分子，其从天然存在基因 中分离，或者其经修饰而以非天然方式包含核酸区段，或者其为合成的。当核酸构建体包含 表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。术语“有效连接”在本文中指一种结构，其中控制序列位于相对于多核苷酸序列的 编码序列的合适位置，使得控制序列指导多肽的编码序列的表达。术语“表达”包括涉及多 肽产生的任何步骤，其包括例如转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。本文与从给定来源(即生物体)中衍生的多肽或多核苷酸相关地使用的术语“来源于”意指，与来源生物体相比，多核苷酸(编码多肽的多核苷酸)与该来源生物体中天然 存在的多核苷酸序列相同或为其变体，而不管该多核苷酸序列是否已被插入到另一生物体 中或者该多肽由另一生物体产生。“来源于”在本发明的上下文中还意指“从…中鉴定”。“来 源于”在本发明的上下文中还意指用细菌核苷酸/蛋白序列从数据库中鉴定本发明的酶，即 通过在蛋白数据库(例如Uniprot、trEMBL或RefSeqP)中进行计算机辅助检索。本文在本发明的上下文中使用的术语野生型意指，其天然存在的形式(例如基因 或蛋白序列)。也包括由通过在包括细菌核苷酸/蛋白序列数据的数据库中检索而推测的 核苷酸序列所编码的蛋白。在一个实施方案中，术语野生型包括不具有信号肽和前导肽的 肽序列。本文使用的术语“成熟”(本发明的酶、多肽或氨基酸序列)意指，推定的多肽最小 功能序列，其中未添加天然或人工氨基酸延伸(例如信号肽或融合伴侣)。本文使用的术语“宿主细胞”包括，具有包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达 载体的易受转化、转染、转导等影响的任何细胞类型。表述“纯化标签”意指，在酶的N或C端与酶融合并用于纯化该酶的肽序列。表述“TAP”标签指的是来源于嗜热细菌的热稳定碱性蛋白标签，当其与酶的肽序 列在N或C端融合时可用于纯化该酶，如在以编号W0 2006/108826和W0 2008/043847公 布的国际专利申请中所揭露。表述“融合酶”、“融合蛋白”或“加上标签的酶”意指具有与酶的C端或N端连接 的“融合伴侣”的酶。融合伴侣的一个实例是蛋白标签，其可增加融合蛋白的表达水平、溶 解度或纯化。表述“接头”意指将融合伴侣(例如纯化标签)和酶连接在一起的氨基酸序列。接 头序列可例如包括促进靶蛋白更好折叠的序列和/或用于切除纯化标签的切割位点。“螺旋结构”的特征在于具有导致由链间氢键稳定的卷曲结构的氨基酸序列。“％溶解度”定义为，来自宿主细胞裂解物的可溶性蛋白的量/ (来自宿主细胞裂解 物的可溶性+不溶性蛋白的量)X 100。它可通过基于SDS-PAGE分析来比较细胞裂解物的 不溶性和可溶性级分而确定。在本上下文中，术语“功能性酶”意在表示与天然酶具有相似功能的蛋白。蛋白可 与天然酶结构上相似并通过如下方式衍生自天然酶向天然酶的C端和N端之一或两者中 添加一个或多个氨基酸，在天然氨基酸序列中的一个或多个不同位点上置换一个或多个氨 基酸，或在天然酶的一端或两端或者在氨基酸序列中的一个或数个位点上缺失一个或多个 氨基酸，或在天然氨基酸序列中的一个或多个位点上插入一个或多个氨基酸。“装载物”意指装载在纯化柱上的包含酶的样品。“流通”意指不与纯化柱结合的 包含宿主细胞蛋白和污染物的部分装载物。“主峰”指的是具有最强UV强度并包含蛋白的 纯化色谱图中的峰。“mAU”是毫吸光度单位。“UV280强度”是以毫吸光度单位计量的在 280nm波长下的吸光度，在该波长下蛋白将吸收。“IPTG”是异丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖 苷。SDS-PAGE是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。FPLC (快速蛋白液相色谱)是类 似于高效液相色谱(HPLC)的一种液相色谱形式，其用于从复杂混合物中分离或纯化蛋白。 LC-MS (液相色谱-质谱)是结合液相色谱(或HPLC)的物理分离能力和质谱的质量分析 能力的分析技术。
氨基酸在本上下文中，3字母或1字母表示的氨基酸用作如表1中所示的其常规 意思。除非明确指出，本文提及的氨基酸为L-氨基酸。另外，除非另外指定，肽的氨基酸序 列的左端和右端分别是N端和C端。表1 :氨基酸的缩写
权利要求
1.一种能够催化a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的分离多肽，其中所述多肽包含含有下述基序I的氨基酸序列Xaa1 Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gln Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 GlyXaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp ；中 、Xb&2、、XBBg'* 、XBBg、XBBg^、Xaa15和Xaa16独立选自天然存在氨基酸,条件是Xaa1和Xaa7不是Cys。
2.一种能够催化a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的分离多肽，所述多肽选自 (a)包含与SEQID NO: I的氨基酸2-306有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽； (b)包含与SEQID NO: 2的氨基酸3-336有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽； (c)包含与SEQID NO: 3的氨基酸3-305有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽； (d)包含与SEQID NO: 4的氨基酸3-279有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；和 (f)具有肽基-a-羟基甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性的多肽，其特征在于它具有不包含半胱氨酸残基或者包含至多I个或至多2个半胱氨酸残基的氨基酸序列。
3.一种具有肽基-a-羟基甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性的分离多肽，其特征在于它在大肠杆菌中可被表达为可溶性蛋白。
4.权利要求1-3中任一项的多肽,其包含0、1或2个半胱氨酸残基。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，所述多肽来源于原核生物体。
6.权利要求1-5中任一项能够催化a-羟基甘氨酸转化为a -酰胺的多肽，其中所述a -羟基甘氨酸是式R-Gly (OH)的C端a -羟基甘氨酸，其中R是肽，Gly (OH)是与所述肽的C端连接的a-羟基甘氨酸残基，和 其中所述a -酰胺具有式R-NH2。
7.一种用于产生具有肽基-a-羟基甘氨酸a-酰胺化裂合酶(PAL)活性的酶的方法，其包括以下步骤 a)在适合于酶表达的条件下培养非哺乳动物来源的重组表达宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码酶的核苷酸序列的核酸构建体；和 (ii)从(a)细胞破碎和离心后的上清液和/或(b)生长培养基中回收酶 其中宿主细胞为非哺乳动物来源，例如大肠杆菌菌株，且其中当在步骤(ii)中回收时，所述酶是可溶的。
8.权利要求7的方法，其中当在步骤(ii)中回收时，酶是催化活性形式，意指酶不需要重折叠的步骤来获得催化活性。
9.一种分离多肽，其为可通过权利要求7或8的方法获得的具有肽基-a-羟基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的酶，其中所述酶能够催化反应R-Gly(OH) — R-NH2, 其中R是肽，Gly(OH)是与所述肽的C端连接的a -羟基甘氨酸残基。
10.权利要求9的多肽，其进一步通过权利要求1-6中的任一项表征。
11.一种用于产生具有肽基-a-羟基甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性的酶的方法，其包括在适合于产生所述酶的条件下维持重组表达宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码权利要求1-6或权利要求8-9中任一项的多肽的核苷酸序列的重组核酸。
12.权利要求1-6或权利要求8-9中任一项的多肽用于催化肽中C端a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的用途。
13.一种用于产生a-酰胺化肽的方法，其包括 a)在适合于酶促活性的条件下，使得具有c端甘氨酸残基的靶肽能够与肽基甘氨酸a -羟化单加氧酶(PHM)和权利要求1-6或权利要求8-9中任一项的多肽两者反应,其中用所述PHM和所述多肽对所述靶肽进行的反应在两个单独的步骤中或同时进行； (ii)回收C端a-酰胺化肽。
14.权利要求12的用途或权利要求13的方法，其中回收的a-酰胺化肽被用作药物。
15.权利要求11-14中任一项的方法或用途，其中所述肽选自胰淀粉样肽、神经肽Y(NPY)、肽YY (PYY)、PYY-3-36、胰多肽(PP)、胰高血糖素样肽(GLP-I)、胃泌素、降钙素、降钙素相关肽(CGRP)、胃泌素释放肽、加压素、催产素、神经激肽A、胰泌素、胰抑释素、阿黑皮质素原(POMC)、a -促黑素细胞激素(a MSH)、y -促黑素细胞激素(Y 1MSH)和酰胺化铰链肽(HP-N)，或者它们的功能类似物。
全文摘要
本发明申请涉及能够催化α-羟基甘氨酸转化为α-酰胺的酶以及这样的酶用于产生C端α-酰胺化肽的用途。
文档编号C07K14/195GK102666570SQ201080054717
公开日2012年9月12日 申请日期2010年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者A.C.肖 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司