专利名称：：D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法
技术领域：
：本发明所属的
技术领域：
是医药化工中间体分析领域，本发明涉及的是P-内酰胺类半合成抗生素阿莫西林，阿扑西林，头孢羟氨苄，头孢拉宗和头孢匹胺等的侧链D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)及中间体的测定新方法。
背景技术：
：近年来，双酶法合成D-pHPG已成为酶工程合成领域的研究热点之一。目前，双酶法合成中D-对羟基苯甘氨酸及其中间体N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸(NCD-pHPG)的定量测定主要采用HPLC法和TLC法等。HPLC法和TLC法测定效率不高，式样处理麻烦。
发明内容本发明所建立的方法则是根据Weatherbum提出的原理，利用双酶法合成反应混合物中NH/的增加量的摩尔数与D-pHPG生成量的摩尔数相等的性质，以酚-次氯酸法测出NH4+增量从而确定D-pHPG含量；另以PDAB法测定NCD-pHPG的含量。具体实施例方式1.材料与方法1.1、仪器721分光光度计(上海第三分析仪器厂)，TG328A分析天平(上海天平仪器厂)，25iU微量进样器(上海医用激光仪器厂)。1.2试剂1.2.1(NH4)2S04标准溶液的配制准确称取(NH4)2S04，配制成2mg/ml的标准溶液，密封，冰箱保存备用。1.2.2溶液A的配制准确称取苯酚2g和硝普盐(二水合亚硝基铁氰化钠，Na2Fe(CN)3.N0.2H20)10g,溶于200ml蒸馏水中，即得溶液A。密封，冰箱保存备用。1.2.3溶液B的配制准确称取NaOHlg，量取NaOCl溶液(含5.2%有效氯)1.68ml溶于100ml蒸馏水中，即得溶液B。密封，冰箱保存备用。1.2.4NCD-pHPG标准溶液的配制准确称取NCD-NCD-pHPG，配制成4mmo1/L的标准溶液，密封保存备用。1.2.5PDAB溶液的配.制准确称取PDAB(对二甲氨基苯甲醛溶液)，用6mol/L盐酸配制成5%溶液，避光保存备用。1.3分析方法1.3.1NH/标准曲线的绘制分别取(NH4)2SO4标准溶液0，2，4，6，8，10，12，14ul，加入到装有5ml溶液A的8支试管中，各补加蒸馏水20，18，16，14,12，10，8,4p1，以Parafilm封口，剧烈震荡混匀，再各加溶液B5ml，彻底混匀，37。C水浴lh取出，以加蒸馏水20ul的一管做空白，于625nm处测吸光度，绘制标准曲线。1.3.2NCD-pHPG标准曲线的绘制取6支试管，分别加入NCD-pHPG标准溶液0，0.4，0.8，1.2,1.6，2.0ml.，补加蒸馏水至2.0ml，再加入2,0mlPDAB溶液，混匀，以加蒸馏水2.0ml的一管做空白，于438nm处测吸光度，绘制标准曲线。1.3.3双酶法合成反应混合物的测定操作方法将双酶法合成反应混合物稀释适当倍数，4000r/min离心30min，先取20ul上清夜，加入到装有5ml溶液A的试管中，以下同1.3.1操作，于625nm处测吸光度，査标准曲线，即得上清NH4+摩尔浓度，乘以稀释倍数即为双酶法合成反应混合物样品中NH/摩尔浓度，再测出双酶法合成反应零时混合物中NH/摩尔浓度，求出增加量，即得样品中D-pHPG的摩尔浓度；另取0.5ml上清，向其中加入1.5m].蒸馏水和2.0mlPDAB溶液，以下同1.3.2操作，于438nm处测吸光度，査标准曲线，即得上清NCD-pHPG摩尔浓度，乘以稀释倍数即为双酶法合成反应混合物样品中NH/摩尔浓度.2.结果2.1标准曲线和回归曲线先作如下换算(NH4)2S04质量体积浓度(mg/ml"2mg/mlX实家加ml数；NH/摩尔浓度d(mmol/L"质量体积浓度/132.13X2X1000.以C,为横坐标，A^为纵坐标作标准曲线，相应的回归方程为:A62^0.0388d+0.014(产0.9993);在试验中采用标准加入法，分别准确加入一定量的(NH4)2S04，稀释适当倍数后按双酶法合成反应混合物的测量的操作，代入回归方程即可得出结果。2，2NCD-pHPG标准曲线与回归曲线先作如下换算NCD-pHPG摩尔浓度(mmol/L)Cf4mmol/LX实加ml数.以C2为横坐标,A438为纵坐标作标准曲线，相应的回归方程为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>在试验中采用标准加入法，分别准确加入一定量的NCD-pHPG，稀释适当倍数后按1.3.3操作，代入回归方程即可得出结果。回归率实例在-5批体积均为100ml的双酶法合成反应混合物中，采用标准加入法,分别准确加入一定量的(NH4)2S04和NCD-pHPG,稀释适当倍数后按1.3.3操作，测定NH/和NCD-pHPG的含量，结果见表1.表一NH/和NCD-pHPG回归实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.4D-pHPG含量的HPLC验证取3批双酶法合成反应混合物离心上清夜，HPLC法(固定相岛津OLC-ODS,流动相10%乙腈，流速0.5ml/min，检测波长214nm)测定其中的D-pHPG含量。结果列于表二，对二氨甲基苯甲醛(PDAB)比色法与液相色谱(HPLC)法比较，相对平均偏差为3.54表二D-pHPG的含量测定序号对二氨甲基苯甲醛(PDAB)比色法液相色谱(HPLC)法<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.结论因此,本法在用于双酶法合成中D-pHPG及其中间体NCD-PhPG的测定时，是准确可靠的。权利要求1、D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法，利用721分光光度计(上海第三分析仪器厂)，TG328A分析天平(上海天平仪器厂)，25μl微二量进样器(上海医用激光仪器厂)，其特征还包括以下步骤；试剂的准备、NH4+标准曲线的绘制、NCD-pHPG标准曲线的绘制、PDAB溶液的配制、双酶法合成反应混合物的测量、分析结果几个过程。2、根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法，其特征是所述的试剂的准备为(1)(NH4)2S04标准溶液的配制准确称取(NH4)2S04，配制成2mg/ml的标准溶液，密封，冰箱保存备用；(2)溶液A的配制准确称取苯酚2g和硝普盐(二水合亚硝基铁氰化钠，Na2Fe(CN)3.N0.2H20)10g,溶于200ml蒸馏水中，即得溶液A,密封，冰箱保存备用；(3)溶液B的配制准确称取NaOHlg，量取NaOCl溶液(含5.2%有效氯)1.68ml溶于100ml蒸馏水中，即得溶液B。密封，冰箱保存备用；(4)NCD-pHPG标准溶液的配制准确称取NCD-NCD-pHPG，配制成4mmo1/L的标准溶液，密封保存备用，(5)PDAB溶液的配制准确称取PDAB(对二甲氨基苯甲醛溶液)，用6mol/L盐酸配制成5%溶液，避光保存备用。3、根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法，其特征是所述的NH4+标准曲线的绘制为分别取(NH4)2S04标准溶液0，2，4，6，8，10，12，14iU，加入到装有5ml溶液A的8支试管中，各补加蒸馏水20，18，16，14,12，10，8，4ul，以Parafilm封口，剧烈震荡混匀，，再各加溶液B5ml，彻底混匀，37-C水浴lh取出，以加蒸馏水20lU的一管做空白，于625nm处测吸光度，绘制标准曲线。4、根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法:.其特征是所述的NCD-pHPG标准曲线的绘制为取6支试管，分别加入NCD-pHPG标准溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0补加蒸馏水至2.0ml，再加入2.0mlPDAB溶液，混匀，.以加蒸馏水2.0ml的一管做空白，于438nm处测吸光度，绘制标准曲线。5、根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法，其特征是所述的双酶法合成反应混合物的测量为将双酶法合成反应混合物稀释适当倍数，4000i7min离心30min，先取20lU上清液，加入到装有5ml溶液A的试管中，以下同1.3.1操作，于625nm处测吸光度，査标准曲线，即得上清NH4+摩尔浓度，乘以稀释倍数即为双酶法合成反应混合物样品中NH4+摩尔浓度，再测出双酶法合成反应零时混合物中NH(+摩尔浓度，求出增加量，即得样品中D-pHPG的摩尔浓度；另取0.5ml上清液，向其中加入L5ml蒸馏水和2.0mlPDAB溶液，以下同1.3.2操作，于438nm处测吸光度，査标准曲线，即得上清液NCD-pHPG摩尔浓度，乘以稀释倍数即为双酶法合成反应混合物样品中NH/摩尔浓度。6、根据权利要求1或5所述的D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法，其特征是所述的分析结果为；(1)先作如下换算(NH4)2S04质量体积浓度(mg/ml^2mg/mlX实际加入毫升数；NH/摩尔浓度d(mmol/Lh质量体积浓度/132.13X2X1000;以C为横坐标,A625为纵坐标作标准曲线，相应的回归方程为:A62^0.0388d+0.014(F0.9993);在试验中采用标准加入法，分别准确加入一定量的(NH4)2S04,稀释适当倍数后按双酶法合成反应混合物的测量的操作，代入回归方程即可得出结果。(2)NCD-pHPG标准曲线与回归曲线先作如下换算NCD-pHPG摩尔浓度(mmol/L)C2:4mmol/LX实加ml数.以C2为横坐标,A438为纵坐标作标准曲线，相应的回归方程为:A43f0.156C2+0.0018r(r=0.9999)。在试验中采用标准加入法，分别准确加入一定量的NCD-pHPG,稀释适当倍数后按双酶法合成反应混合物的测量的操作，代入回归方程即可得出结果。全文摘要本发明所属的
技术领域：
是医药化工中间体分析领域，具体地说是涉及D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定新方法，包括以下步骤；试剂的准备、NH<sub>4</sub><sup>+</sup>标准曲线的绘制、NCD-pHPG标准曲线的绘制、PDAB溶液的配制、双酶法合成反应混合物的测量、分析结果几个过程，该发明具有分析数据稳定可靠的特点。文档编号G01N21/25GK101363794SQ20071005492公开日2009年2月11日申请日期2007年8月9日优先权日2007年8月9日发明者谢建中申请人:谢建中