专利名称：一种大肠菌群快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠菌群快速检测方法。本发明涉及一种通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法快速检测大肠菌群。通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群。本发明方法适合各种生物学界、医药界、食品界以及各种物品中微生物大肠菌群的快速检测。
背景技术：
微生物大肠菌群的快速、准确的检测，是生物学界、医药界、食品界需要亟待解决的突出的问题。目前通用的大肠菌群的检测大都采用乳糖胆盐发酵管法。
对于大肠菌群的检测国内外均有不少的检测方法，乳糖胆盐发酵管法是大肠菌群国家标准(GB4789-2003)检验方法也是广为采用的方法。此法具有准确、可靠等优点。但是此法培养时间较长，一般接样后24h～72h才能观察结果。因此这种通用的方法具有配制过程复杂，检测周期过长，成本高等缺点。而且由于大肠菌群很难找到非培养的共同特征，这为寻找其快速检测方法带来了很大的困难，这也是一直以来少有研究者开发大肠菌群快速检测设备的原因之一。
发明内容
本发明的目的在于提出一种大肠菌群快速检测方法，使用本发明方法可以快速检测样品食品中的大肠菌群数量。本发明大肠菌群检测是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法快速检测大肠菌群。通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群数。本发明方法适合各种生物学界、医药界、食品界以及各种物品中微生物大肠菌群的快速检测。
本发明涉及一种大肠菌群快速检测方法，是在载玻片上涂有确定数量的采样样品，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群数量。
本发明所诉通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群，是说根据不同类型的食品按本类食品确定的比例检测大肠菌群数量。
采用本发明的大肠菌群快速检测方法，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群，其原理如下大肠菌群(Coliform bacteria或Coli-group)一般指在35℃环境下能发酵乳糖，产酸产气的一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。其中包括大肠杆菌、柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟杆菌(包括产气杆菌)等许多肠杆菌科细菌。
根据上述对大肠菌群的描述可见，大肠菌群都属杆菌，则大肠菌群数为杆菌总数的一部分。如果食品受到大肠菌群的污染，必然会使杆菌总数增加，那么杆菌总数占细菌总数的比例也会增加，则这个比例一定会大于未受大肠菌群污染的该种食品的比例。因此，只要确定某类食品符合食品卫生标准时的最大的临界比例，就可以通过测定该种食品的细菌总数和杆菌总数来检测出大肠菌群数量，以达到判定该种食品是否受到大肠菌群的污染，通过测定该种食品的细菌总数和杆菌总数来检测出大肠菌群数量。
一般来说，一个地区空气中和水中的菌群分布是平衡的，其中杆菌总数占细菌总数的比值应该仅在较小范围内波动。食品中的细菌污染归根到底也主要来源于空气和水中的细菌污染，因此食品中的杆菌总数占细菌总数的比值仅在较小的范围内波动。然而由于每一种食品的国家标准不同，出现了每一类食品所对应的临界比值也不尽相同。因此，要分类确定食品的临界比值。
采用本发明的大肠菌群快速检测方法，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群数量，其方法如下(1)样品的选择检测样品分为糖果类、焙烤类、非发酵性豆制品类、果蔬汁饮料类、膨化食品类、肉灌肠类等。
(2)样品稀释液的制备以无菌操作取25g(ml)样品，放于含有150ml生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇或研磨做成均匀溶液。固体检样用均质器，以8000r/min～10000r/min的速度处理1min，做成均匀稀释液。
采用中速定量滤纸过滤去除大的颗粒，将上述均匀稀释液用灭菌后的中速定量滤纸过滤后，用75ml的无菌生理盐水冲洗过滤后剩余的大颗粒，完全过滤后的液体即为1∶10的稀释液。
用1mL灭菌移液器吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL无菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。
另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌移液器管。
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个合适的稀释度进行检测。
(3)细菌总数和杆菌总数的检测从3个稀释度中分别用无菌的移液管取1ml稀释液至1ml的灭菌离心管中，采用转速8000r/min离心5min，用移液管移去上半部分的清液，留下0.5ml的液体于离心管中。二次离心采用11000r/min离心5min，用吸水纸吸取上层清液至刻度线处(残留液体体积为5ul时划线)。
用微量移液器移取浓缩菌液，注入到载玻片上，经干燥固定，用品红染色30s，冲洗后用生物显微镜镜检。记录细菌总数和杆菌总数。
(4)大肠菌群MPN值的检测本发明方法通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法快速检测大肠菌群。通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的微生物总数和杆菌总数，按确定的比例检测大肠菌群。本发明方法大肠菌群MPN值可以进行两种检测①大肠菌群MPN值的检测大肠菌群MPN值的检测是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法，在细菌总数X1和杆菌总数X2检测完成之后，按各种不同食品确定的大肠菌群比例检测大肠菌群MPN值，大肠菌群MPN值Y按式Y＝a-bX1+cX2(式中a、b和c分别为被检测地区统计的与杆菌总数X2和细菌总数X1比值等相关的回归常数)计算给出。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定大肠菌群MPN值检测是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法，在细菌总数X1和杆菌总数X2检测完成之后，按各种不同食品确定的大肠菌群比例检测大肠菌群MPN值是否符合国家标准。按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定值按式Z＝X2-dX1(式中d为被检测地区统计的杆菌总数X2与细菌总数X1的比值常数)的计算值是否大于零直接判定，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。
具体实施例方式
以下通过实施例的具体描述对本发明作进一步详细说明。
实施例1软糖类食品的大肠菌群MPN值检测食品卫生标准中规定细菌总数≤1000，大肠菌群MPN≤90。
①大肠菌群MPN值的检测当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值Y为Y＝91.726-0.232X1+0.739X2。软糖类食品的大肠菌群MPN值的检测结果见表1。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定值Z为Z＝X2-0.329X1，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。软糖类食品按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定结果见表1。
表1
实施例2焙烤类食品的大肠菌群MPN值检测食品卫生标准中规定细菌总数≤750，大肠菌群MPN≤30。
①大肠菌群MPN值的检测当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值Y为Y＝29.031-0.160X1+0.608X2。焙烤类食品的大肠菌群MPN值的检测结果见表2。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值是否达到国家标准的直接判定值Z为Z＝X2-0.2726X1，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。焙烤类食品按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定结果见表2。
表2
实施例3非发酵性豆制品的大肠菌群MPN值检测食品卫生标准中规定细菌总数≤50000，大肠菌群MPN≤70。
①大肠菌群MPN值的检测
当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值Y为Y＝26.334-0.022X1+0.096X2。非发酵性豆制品的大肠菌群MPN值的检测结果见表3。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定值Z为Z＝X2-0.3129X1，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。非发酵性豆制品按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定结果见表3。
表3
实施例4果蔬汁饮料类食品的大肠菌群MPN值检测食品卫生标准中规定细菌总数≤500，大肠菌群MPN≤30。
①大肠菌群MPN值的检测当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值Y为Y＝14.244-0.167X1+0.913X2。果蔬汁饮料类食品的大肠菌群MPN值的检测结果见表4。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定值Z为Z＝X2-0.231X1，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。果蔬汁饮料类食品按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定结果见表4。
表4
实施例5膨化食品类的大肠菌群MPN值检测食品卫生标准中规定细菌总数≤10000，大肠菌群MPN≤90。
①大肠菌群MPN值的检测当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值Y为Y＝21.476-0.018X1+0.080X2。膨化食品类的大肠菌群MPN值的检测结果见表5。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定值Z为Z＝X2-0.3415X1，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。膨化食品类按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定结果见表5。
表5
实施例6肉灌肠类食品的大肠菌群MPN值检测食品卫生标准中规定细菌总数≤50000，大肠菌群MPN≤30。
①大肠菌群MPN值的检测当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法大肠菌群MPN值Y为Y＝24.716-0.035X1+0.116X2。肉灌肠类食品的大肠菌群MPN值的检测结果见表6。
②按国家标准(GB4789-2003)大肠菌群MPN值直接合格判定当细菌总数为X1，杆菌总数为X2时，本发明检测方法按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定值Z为Z＝X2-0.273X1，当Z大于零时，则超过国家标准，不合格；当Z小于零时，则符合国家标准，合格。肉灌肠类食品按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定结果见表6。
表6
权利要求
1.本发明为一种大肠菌群快速检测方法，其特征在于大肠菌群检测是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法检测大肠菌群。
2.根据权利要求1所述的大肠菌群检测是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法，其特征在于大肠菌群的MPN值Y由与微生物总数X1和杆菌总数X2相关的比例关系式Y＝a-bX1+cX2(式中a、b和c分别为常数)计算给出。
3.根据权利要求1和2所述的大肠菌群检测是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法，其特征在于按国家标准大肠菌群MPN值的直接合格判定可由比例关系式Z＝X2-dX1(式中d为常数)的计算值是否大于零直接判定，当Z小于零时，则符合国家标准，合格。
全文摘要
本发明涉及一种大肠菌群快速检测方法。本发明涉及的一种大肠菌群检测方法是通过生物显微镜镜检定量样品中微生物总数和杆菌总数的比例的方法快速检测的，大肠菌群的MPN值Y由与微生物总数X
文档编号G01N15/10GK101042355SQ20071005555
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者殷涌光, 李敬贤, 丁筠 申请人:殷涌光