专利名称：结合il-23r的多肽的制作方法
技术领域：
本发明广泛地涉及炎性和自体免疫疾病以及癌症的治疗。具体地，本发明涉及与IL-23R杂ニ聚受体(heterodimeric receptor)的IL-23R亚单位结合、并且阻断IL-23与其受体的相互作用的多肽。
背景技术：
IL-23是Thl7细胞生成和存活所必需的细胞因子。大量来自临床前模型和临床实践的证据表明，Thl7细胞在包括类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化的许多自体免疫疾病的病理学中发挥着至关重要的作用。IL-23R是Thl7细胞上的关键靶标。IL-23杂ニ聚受体由两个亚单位IL-23R和IL-12R0 I组成，IL-23R是IL-23途径独有的亚单位。IL-12R0 I与IL-12受体共享，因此属IL-12途径。类似地，IL-23细胞因子由两个亚单位pl9和p40组成，pl9亚单位为IL-23独有，p40与IL-12共享。IL-23与杂ニ聚IL-23受体的结合介导某些T细胞亚型、NK细胞和骨髓细胞的活化。重要地，IL-23R中的遗传变异与银屑病和克罗恩病(Crohn’ s disease)有夫，并且还与强直性脊柱炎，沃格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)、系统性硬化症、贝赫茨病(Behcet's disease, BD)、原发性Sj0gren综合征(Primary Sjogren'sSyndrome)、古德帕斯彻病(Goodpasture disease)的易感性有牵连。另外，已经表明了IL-23在移植物抗宿主病(Graft Versus Host disease)和慢性溃疡中的重要性，并且IL-23与肿瘤发生有牵连。IL-23途径的阻断在自体免疫疾病的许多临床前模型中是有效的。但是，共享配体以及IL-23和IL-12途径之间的受体亚单位的性质导致了比之前认识的更加复杂的生物学过程，而且IL-23阻断与IL-12阻断的分离似乎在效果和安全性方面具有重要的治疗意义。之一或另ー个或者二者的阻断可以在细胞因子亚单位或受体亚单位的水平上进行。尽管靶向IL-23/IL-12细胞因子的抗体得以批准(例如，靶向p40的优特克单抗)或者处于临床开发中(Abbott Laboratories),以及有仙灵德雅(Schering Plough)的IL-23特异性抗-pl9抗体处于早期临床开发中，由于以下原因，需要有效果优异、且安全性更好的IL-23特异性阻断· IL-23杂ニ聚受体的分布相对地受限于主要在发炎/患病组织中发现的表达IL-23杂ニ聚受体的细胞。相反地，IL-23可以全身检测到，并且更为充足。·业已表明靶向IL-23的pl9亚单位之上的受体在以下情形中很有利细胞因子是细胞结合的，并且/或者不充足，如在例如来自类风湿性关节炎患者的滑膜的自体免疫组织中所表明。·靶向受体在以下患者中将会更有效地阻断具有可对IL-23信号转导更易感的受体变体(即，信号转导需要极少配体的低阈值变体)的患者。另外，尽管最初开发用以阻断IL-12，有临床前和临床证据表明优特克单抗的效果 通过IL-23阻断介导，并且阻断IL-12途径基于以下观察结果可能是有害的·在优特克单抗的银屑病试验中，IL-23-特异性细胞因子亚单位pl9(而不是IL-12-特异性细胞因子亚单位p35)在噬斑中是减量调节的。 尽管pl9和p40剔除小鼠耐受实验自体免疫疾病的诱导，但IL-12特异性亚单位P35的剔除加剧了若干实验自体免疫疾病。·除效果优异的潜力之外，选择性地在IL-12和IL-23之上剔除IL-23还在有关感染易感性的安全性方面具有显著优势，因为已显示阻断两种细胞因子増加了对弓形虫(Toxoplasma gondii)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)和结核分枝杆菌(M. tuberculosis)以及类似其他病原体的易感性。·安全性优势另外还可与肿瘤发生能力的可能性有夫。临床前数据表明，抑制IL-12提高肿瘤的生长，而抑制IL-23可以减少肿瘤的生长。与IL-12p40相反，IL-23在人肿瘤中是超量表达的。而且，鼠科动物有效性研究显示，IL-23剔除小鼠或抗-IL-23治疗的小鼠耐受肿瘤形成，而IL-23水平升高可以增加肿瘤的形成。因此，本领域在以下方面存在需求通过阻断IL-23R来选择性地阻断IL-23杂ニ聚受体的分子、包括这些分子的组合物、筛选这些分子的方法以及使用这些分子用以治疗性地治疗多种炎性和自体免疫疾病和癌症的方法。这样的分子应当由于亲和カ效果表现出良好的祀标保留(target retention),并且应当使治疗定位于与疾病有关的炎症地点，而不会显著地损害系统免疫。
发明内容
一方面，本发明涉及具有三聚结构域(trimerizing domain)和至少ー个与人IL-23R结合且不激活IL-23杂ニ聚受体的多肽序列的多肽。在其他方面，本发明的多肽与人IL-12Ri3 I或人IL-12Ri3 2中的至少ー个不结合，并且该多肽与天然的人IL-23竞争结合人 IL-23R。三聚结构域可以包括在 26、30、33、36、37、40、41、42、45、46、47、48、49、50和51位置处具有至多5个氨基酸置换的人四联蛋白(tetranectin)三聚结构域(SEQ IDNO: 108)的多肽。这些多肽可以形成三聚复合物。多肽可以发生三聚，以形成三聚复合物。再进ー步，本发明的多肽包括至少ー种与IL-23R结合的多肽，其与三聚结构域的N-端和C-端中的一端相连接，并包括位于N-端和C-端中的另一端的炎症调节子(modulator)。本发明的多肽还可以具有与N-端和C-端中的姆ー个相连接的与IL-23结合的多肽，其中N-端处的多肽与C-端处的多肽相同或不同。多肽还可以具有与多肽共价连接的治疗剂。再进ー步,本发明的多肽包括C型凝集素样结构域(C-Type Lectin Like Domain,CLTD)，并且其中CTLD的环区段(loop segment) A的环1、2、3或4或者环区段B中包括与IL-23结合的多肽序列。在各方面，CTLD的多肽序列选自SEQ ID NO: 133、134、135、167、137、138、139、140 和 141。本发明还涉及防止在表达IL-23R的细胞中IL-23R被IL-23活化的方法。该方法包括使细胞与本发明的三聚复合物接触。在另一方面，本发明包括ー种包括三聚复合物和至少ー种药学可接受赋形剂的药物组合物。可以将该组合物给药，以治疗免疫疾病或癌症。组合物还可以包括炎症调节剂、化疗药剂或细胞毒剂。再进ー步，本发明涉及制备本发明的多肽的方法。该方法包括选择与IL-23R结合的第一多肽；和将所述第一多肽与多聚结构域的N-端或C-端中的一端相融合。第一多肽可以经选择与IL-12Ri3 I或IL-12Ri3 2中的至少ー个不结合。多肽可以用于制备防止表 达IL-23R的细胞中IL-23R的活化的三聚复合物。再进ー步，本发明涉及与天然的人IL-23竞争结合天然IL-23R的多肽，其中该多肽不活化人IL-23R，并且与IL-12Ri3 I或IL_12Ri3 2中的至少ー个不结合。多肽可以是在环区段A中的环I、2、3或4中的一个中或在环区段B中被修饰以结合IL-23R的CTLD，并且可以选自 SEQ ID N0:133、134、135、167、137、138、139、140 和 141 中的ー个。
图 IA 和 IB 显示了人 IL-23(SEQ ID NO: I)、人 IL_23R(SEQ ID NO: 5)、人IL-12R@1(SEQ ID NO:6)、人 IL-12Rβ 2 (SEQ ID NO: 7)、人 IL-12A(SEQ ID NO: 3)和人IL-12B(SEQ ID NO:2)的多肽序列。图2A、B、C和D显示了用于本发明的示例性多肽的四联蛋白三聚模块变体(modulevariants)的例子。图3显示了四联蛋白家族的三聚结构单元(structural element)的氨基酸序列对比。以下蛋白质的包括外显子2和外显子3的前3个残基的对应于残基V17至K52的氨基酸序列(单字母代码)加以下划线人四联蛋白(SEQ ID NO:99);鼠四联蛋白(SEQ IDNO: 100) (Sorensen 等人，Gene, 152:243-245, 1995);分离自 S鱼(reef shark)软骨的四联蛋白同源蛋白质(SEQ ID NO: 107) (Neame和Boynton, 1992，1996);和分离自牛软骨的四联蛋白同源蛋白质(SEQ ID NO: 106) (Neame和Boynton,数据库编号PATCHX:u22298)。七元重复单元(h印tad repeats)中a和d位置处的残基以黑体列出。除区域的其他保守残基之外，所列四联蛋白蛋白质家族三聚结构単元的共有序列(SEQ ID NO: 108)还包括附图所示七元重复单元中a和d位置处出现的残基。表示脂肪族疏水残基。图4显示了已知3D-结构的10种CTLD的氨基酸序列对比。主要ニ级结构单元的序列位置在各个序列的上方示出，按顺序编号标记为“ α N”(表示α -螺旋编号N)和“ β Μ”(表示β -链(β -strand)编号Μ)。与CTLD的两个保守ニ硫桥键的形成有关的四个半胱氨酸残基在图中示出，并分别编号为“(1”、“(11”、“(111”和“(1￥”。两个保守ニ硫桥键分别是CI-CIV和CII-CIII。人四联蛋白序列中的各个环1-4和LSB(环5)通过下划线示出。10中C-型凝集素为hTN:人四联蛋白(SEQ ID NO: 109) ;MBP :甘露糖结合蛋白(SEQ IDNO: 110) ；SP-D :表面活性蛋白 D(SEQ ID NO:lll) ;LY49A :NK 受体 LY49A (SEQ ID NO: 112)；Hl-ASR :脱唾液酸糖蛋白受体的Hl亚单位(SEQ ID NO: 113) ;MMR_4 :巨噬细胞甘露糖受体结构域4(SEQ ID NO: 114) ；IX-A(SEQ ID NO: 115)和 IX_B(SEQ ID NO: 116):分别为凝固因子 IX/X-结合蛋白结构域 A 和 B ;Lit :胰石蛋白(Iithostatine) (SEQ ID NO: 117) ；TU14 被囊动物C-型凝集素(SEQ ID NO: 118)。除TU14タト，所有这些CTLD均来自人蛋白质。图5 显不了分离自人(Swissprot P05452) (SEQ ID N0:119)、小鼠(SwissprotP43025)(SEQ ID NO:120)、鸡(Swissprot Q9DDD4)(SEQ ID NO:121)、牛(Swissprot Q2KIS7)(SEQ ID NO:122),大西洋鲑(Swissprot B5XCV4)(SEQ ID NO:123)、青蛙(Swissprot Q5I0R9) (SEQ ID NO: 124)、斑马鱼(GenBank XP_701303) (SEQ ID NO: 125)的四联蛋白以及分离自牛软骨(Swissprot u22298) (SEQ ID NO: 126)和鲨鱼(SwissprotP26258) (SEQ ID NO: 127)的相关CTLD同源物的氨基酸序列对比。图6显示了在CTLD中生成随机化环(randomized loop)的PCR策略。图7显示了修饰成含有用于克隆、指示Ca2+结合位点的人四联蛋白CTLD的DNA和氨基酸序列。限制位点用实线加以下划线。环用虚线加以下划线。钙配位残基为黑体斜体，包括位点 I :D116、E120、G147、E150、N151 ;位点 2 :Q143、D145、E150、D165。CTLD 结构域开始于黑体的氨基酸A45(即ALQTVCL...)。对天然四联蛋白(TNCTLD)碱基序列的改变用小写显示。限制位点使用不改变天然氨基酸序列的沉默突变生成。图8显示了若干结合IL-23R的本发明多肽的序列。根据本发明序列通过在已经在一个多个环区被修饰的具有人四联蛋白CTLD支架结构的多肽的文库中选择多肽产生。这些序列的CTLD支架(scaffold)开始于人四联蛋白的A45 (SEQ ID NO: 119)。显示已随机化的环区的序列部分加以下划线。图9显示了成熟形式的人(SEQ ID N0S: 143 [核苷酸序列]和142 [氨基酸序列])以及鼠科四联蛋白(SEQ ID N0S: 144[核苷酸序列]和145[氨基酸序列])始于其三聚结构域的编码区的核苷酸和氨基酸序列对比，示出有已知的ニ级结构单元。图10显示了竞争ELISA的結果。对存在或不存在本发明多肽的情况下人IL-23与人IL-23R的结合进行评价。图11显示了对在本发明的ATRMER 复合物4G8、天然人IL-23和优特克单抗的存在下IL-23诱导的IL-17生成进行比较的实验結果。图12显示了对在本发明的ATRMER 复合物1A4和优特克单抗的存在下IL-23诱导的IL-17生成进行比较的实验結果。图13显示了对在本发明的ATRMER 复合物4G8、天然人IL-23和优特克单抗的存在下IL-12诱导的IFNy生成进行比较的实验結果。图14显示了对响应于IL-23和本发明多肽的NKL细胞中的Stat_3磷酸化进行比较的实验結果。图15是显示与本发明的几种ATRMER 多肽复合物有关的实验结果的表格。图16显示了人四联蛋白的三维结构(带状形式(ribbon format),说明了蛋白质的ニ级结构特征。结构以Ca2+-结合形式解析。图17A说明了人四联蛋白(HTN)以及几种四联蛋白同源物包括人甘露糖结合蛋白(MBP)、大鼠甘露糖结合蛋白-C(MBP-C)、人表面活性蛋白D、大鼠甘露糖结合蛋白-A(MBP-A)和大鼠表面活性蛋白A的CTLD的三维覆盖结构。CTLD覆盖结构使用Macintosh用Swiss PDB Viewer Deep View ν· 4· 0· I以人四联蛋白的三维结构作为模板生成。图17Β显示了图17Α所示的人四联蛋白和四联蛋白同源物的CTLDS的相应的氨基酸序列。在图17Β中，IHUP=人甘露糖结合蛋白，1BV4A=大鼠甘露糖结合蛋白，2GGUA=人表面活性蛋白D，IKXOA=大鼠甘露糖结合蛋白A，1R13=大鼠表面活性蛋白Α。图18Α说明了人四联蛋白(HTN)以及几种四联蛋白同源物包括人胰腺炎相关蛋白、人树枝状细胞-特异性ICAM-3-捕获非整联蛋白2 (DC-SIGNR)、大鼠聚集蛋白聚糖、小鼠清道夫受体(scavenger receptor)和人清道夫受体的CTLD的三维覆盖结构。CTLD覆盖结构使用Macintosh用Swiss PDB Viewer Deep View v. 4. 0. I以人四联蛋白的三维结构作为模板生成。图18B显示了图18A所示的人四联蛋白和四联蛋白同源物的CTLDS的相应的氨基酸序列。在图18B中，ITDQB=大鼠聚集蛋白聚糖，IUVOA=人胰腺炎相关蛋白，20X8A=人清道夫受体，20X9A=小鼠清道夫受体，1SL6A=人DC-SIGNR。·
具体实施例方式在各方面，本发明涉及与IL-23R结合并且包括多聚结构域多肽序列和一个或多·个与结合的多肽序列的多肽。在一方面，本发明的多肽发挥IL-23R拮抗剂的作用。两个、三个或更多个多肽可以多聚，以形成包括与IL-23R结合的多肽的多聚复合物。在另外可选的实施方式中，多肽与IL-23R结合，但不与IL-12Ri3 I或IL-12 β 2結合。此外，本发明提供通过将多肽或多肽的多聚复合物给予有需求的患者来治疗被试者中免疫介导疾病、癌症和其他疾病的方法。定义在更详细地界定本发明之前，对若干术语进行定义。除非在本文中给出术语的特定定义，本说明书通篇使用的术语和短语应当理解成具有与本领域通常所理解的相同的含义。而且，如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文中清楚地另外指明，単数形式“一”、“ー个”和“该”包括复数的所指对象。“IL-23”是在先天和适应性免疫中发挥作用的细胞因子，是指属于IL-6总科的杂ニ聚蛋白质复合物。杂ニ聚复合物由活化的树枝状噬菌细胞和角化细胞分泌。IL-23也由表皮朗格汉斯细胞表达。IL-23A也称ρ19亚单位IL-B30，或简称“ρ19”，其与ρ40亚单位IL-12B 缔合，形成 IL-23(pl9/p40)。IL-23A(pl9) (SEQ ID NO: I)和 IL_12B(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列示于图I中。IL-23由许多种病原体和病原体产物与危险为损伤的自身信号(self-signal) —起进行增量调节。IL-23在银屑病表皮组织中、在多发性硬化患者的树枝状细胞中是增量调节的，并且还已经显示IL-23在促进肿瘤发生和生长中有活性。此外，IL-23不仅刺激嗜中性白细胞和巨噬细胞的滲透，而且还促进肿瘤微环境中的血管发生和炎性介质。IL-23可以导致IL-12和干扰素的減量调节，以上二者都是细胞毒性免疫反应所必需的细胞因子，并控制抗癌效应物淋巴细胞的流入和活性。已经表明，IL-23使得适应性细胞毒性效应器响应远离抗癌免疫而重新起效为滋养肿瘤的促炎和促血管发生(proangiogenic)效应器途径。因此，IL-23使得识别出的肿瘤细胞能够存留，伴有肿瘤相关炎症。这ー概念可以解释存在大量肿瘤特异性T细胞的情况下细胞的生长。
术语“IL-23杂ニ聚受体”是指IL-23R和IL-12R0 I的杂ニ聚多肽复合物。该受体与IL-23结合。IL-23R和IL_12R0 I的多肽序列示于图I中。术语“IL-23R”是指可以与IL-12R0 I复合形成IL-23杂ニ聚受体的多肽。IL-23R也称作IL-23R亚单位。术语“IL_12Ri3 I”是指与IL-23R复合形成IL-23杂三聚受体并且分别、独立地与IL-12R^2复合形成杂ニ聚IL-12受体的多肽。IL_12R0 I和IL_12R0 2的多肽序列示于图I中。“抑制剂”和“拮抗剂”或者“活化剂”和“激动剂”分别指抑制性或活化性分子。“抑制剂”是降低、阻断、防止、延迟活性、失活、脱敏、或減量调节例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞相关的生物功能或活性的分子。活化剂是增加、激活、促进、提高活性、敏化或增量调节例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞相关的生物功能或活性的分子。“激动剂”是与靶标相互作用以导致或促进靶标活化增加的分子。“拮抗剂”是与激动剂的作用相反的化合物。拮抗剂防止、降低、抑制或中和激动剂的活性。即使在没有识别出激动剂的情形下，拮抗剂 也可以防止、抑制或降低靶标例如目标受体的构成活性。基因、受体、配体或细胞的“调节剂(modulator) ”是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性可以在其调节特性方面被活化、抑制或改变。调节剂可以单独作用，或者其可以使用辅因子，例如，蛋白质、金属离子或小分子。术语“IL-23R拮抗剂”是指如下的任意分子其単独地或与IL_12Ri3 I复合结合IL-23R，并通过多种机制阻断或抑制受体信号传导，上述机制可以包括阻断IL-23的结合能力、阻断受体杂ニ聚体形成、或者阻断或诱导影响细胞内信号传导(包括构象变化或受体内化)的变化。如本文所用，术语“结合单元”是指相互具有结合特异性的ー对分子的ー员。结合配对的单元可以是天然得到的，或者全部或部分地合成产生。分子对的ー个单元具有与分子对另ー単元的特定空间和极性构成结合并因此与其互补的表面区域或空腔。因此，配对的単元具有彼此特异性结合的特性。当提到配体/受体、抗体/抗原或其他结合对吋，“特异性”或“选择性”结合是指作为结合对的ー员在结合对另ー员的异质群体中存在的决定性因素的结合反应。因此，在给定的条件下，例如，指定的配体与特定的受体结合，不与样品中存在的其他蛋白质以显著
的量结合。如本文所用，术语“多聚结构域”是指如下的氨基酸序列其包括可以与其他的具有多聚结构域的氨基酸序列缔合以形成多聚复合物的功能性。在本发明的各实施方式中，多聚结构域是ニ聚结构域、三聚结构域、四聚结构域、五聚结构域等。这些结构域能够形成两个、三个、四个、五个或更多个本发明的多肽的多肽复合物。在一个实施例中，多肽含有氨基酸序列——“三聚结构域”，其与两个其他的三聚结构域形成三聚复合物。三聚结构域可以与其他的相同氨基酸序列的三聚结构域缔合(均聚物)，或者与不同氨基酸序列的三聚结构域缔合(异聚物)。这种相互作用可以由三聚结构域组成部分之间的共价键以及由氢键力、疏水力、范德华力和盐桥导致。本发明多肽的三聚结构域可以获自如美国专利申请公开第2007/0154901号(‘901申请)所述的四联蛋白，在此将其全文并入作为引证。成熟人四联蛋白单链多肽序列在本文中提供为SEQ ID NO: 142。四联蛋白三聚结构域的例子包括SEQ ID N0:99的氨基酸17-49、17-50、17-51和17-52，其代表由人四联蛋白基因的外显子2编码的氨基酸序列，以及任选地由该基因的外显子3编码的前一、ニ或三个氨基酸。其他例子包括氨基酸1-49、1-50、1-51和1-52，其代表全部的外显子I和2，以及任选地由基因的外显子3编码的前一、ニ或三个氨基酸。另外可选地，仅仅一部分由外显子I编码的氨基酸序列包括在三聚结构域中。具体地，三聚结构域的N-端可以开始于SEQ ID NO:99的残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17中的任意处。在具体的实施方式中，N-端为IlO或V17，C_端为 Q47、T48、V49、C(S)50、L51 或 K52(根据 SEQ ID NO:99 编号)。此外，图 2A-2D 提供了人四联蛋白三聚结构域可能的平截变体(truncation variant)的编号。在本发明的ー个方面，三聚结构域是作为四联蛋白家族三聚结构単元共有序列的具有氨基酸序列SEQ ID NO: 108的四联蛋白三聚结构单元(“TTSE”) JnUS 2007/00154901中更充分地描述，在此将其全文并入作为引证。如图3所示，TTSE包围着蛋白质四联蛋白家族的天然存在成员的变体，具体地为在不会对TTSE形成α螺旋卷曲螺旋(coiled coil)三聚体的能力以任何相当的程度产生不利影响的情况下氨基酸序列经修饰的变体。在本发 明的各个方面，根据本发明的三聚多肽包括以下三聚结构域作为TTSE :与SEQ ID NO: 108共有序列的氨基酸序列同一性为至少66%的三聚结构域；例如，其与SEQ ID N0:108共有序列的氨基酸序列同一性为至少73%、至少80%、至少86%或至少92%(仅对明确(不是X)的残基进行计数)。換言之，SEQ ID NO: 108中指定氨基酸的至少ー个、至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个可以被置換。在ー个具体的实施方式中，在SEQ ID NO: 142的50 (C50)位置处的半胱氨酸可以有利地诱变成丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其他氨基酸残基，以避免形成可导致不希望发生的多聚的不希望产生的链间ニ硫桥键。其他已知的变体包括至少ー个选自氨基酸残基第 6、21、22、24、25、27、28、31、32、35、39、41 和 42 号(根据 SEQ ID NO: 142 编号)的氨基酸残基，其可以被任何不破坏螺旋的氨基酸残基置換。已经显示出这些残基与使天然四联蛋白単体的三个TTSE之间的三聚复合物稳定的分子间相互作用没有直接牵连。在图3所示的一方面，TTSE具有重复的式a-b-c-d-e-f-g (N至C)的七元重复单元，其中残基a和d (即26、30、33、37、40、44、47和51位)(根据SEQ ID N0:99编号)可以是任意的疏水氨基酸。在进ー步的实施方式中，TTSE三聚结构域可以通过以下方式修饰引入聚组氨酸序列和/或蛋白酶切割位点，例如凝血因子Xa或粒酶B (參见US 2005/0199251，在此将其并入作为引证)，以及包括C-端KG或KGS序列。另外，为有助于提纯，2位上的脯氨酸可以用甘氨酸置換。TTSE平截和变体的具体非限定性实施例示于图2A-2D。此外，与已知人四联蛋白的三聚结构域具有相当大同源性(大于66%)的三聚结构域表IL L
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dins■三聚结构域的另ー个例子公开于US 6，190，886(在此全文并入作为引证)，其公开了包括胶原凝集素颈区(collectin neck region)的多肽。然后可以在适当条件下制造三聚体，其具有包括胶原凝集素颈区氨基酸序列的三段多肽。鉴别出若干胶原凝集素，其包括人SP-D的胶原凝集素颈区VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK[SEQ ID NO:]牛SP-D的胶原凝集素颈区VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK[SEQ ID NO:]大鼠SP-D的胶原凝集素颈区SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK[SEQ ID NO:]牛胶固素的胶原凝集素颈区VNALKQRVTILDGHLRRFQNAFSQYKK[SEQ ID NO:]牛胶原凝集素的胶原凝集素颈区VDTLRQRMRNLEGEVQRLQNIVTQYRK[SEQ ID NO:]人SP-D的颈区GSPGLKGDKGIPGDKGAKGESGLPDVASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPGGIPHRD[SEQID NO:]MBP三聚结构域的其他例子描述于PCT申请第US08/76266号，其公开号为WO2009/036349，在此将其全文并入作为引证。该三聚结构域可以再进ー步发生低聚，生成更高级的多聚复合物。在本上下文中，“三聚结构域”能够与其他类似的或相同的三聚结构域相互作用。相互作用是产生三聚蛋白质或多肽的类型。这种相互作用可以由三聚结构域组成部分之间的共价键以及由氢键力、疏水力、范德华力和盐桥导致。三聚结构域的三聚效果由卷曲螺旋结构导致，上述卷曲螺旋结构与两个其他三聚结构域相互作用，形成即使在相对较高温度下也很稳定的三联α螺旋卷曲螺旋三聚体。在各实施方式中，例如，基于四联蛋白结构单元的三聚结构域，复合物在至少60°C下是稳定的，例如，在一些实施方式中在至少70°C下是稳定的。“术语C-型凝集素样蛋白质”和“C-型凝集素”用来指存在于任何真核物种中或在其基因组中编码的含有ー个或多个CTLD，或一个或多个属于CTLD亚组的结构域——结合碳水化合物配体的CRD的任何蛋白质。该定义具体地包括膜联C-型凝集素样蛋白质、C-型凝集素、“可溶性” C-型凝集素样蛋白质和缺少功能性跨膜结构域的C-型凝集素，变异的C-型凝集素样蛋白质，其中一个或多个氨基酸残基经体内羰基化或任何其他合成后修饰的C-型凝集素，以及任何通过C-型凝集素样蛋白质和C-型凝集素的化学修饰得到的产品。CTLD由大约120个氨基酸残基组成，其特征是含有两个或三个链内ニ硫桥键。尽管来自不同蛋白质的CTLD之间在氨基酸序列水平上的相似性相对较低，已经发现若干CTLD的3D-结构是高度保守的，其结构可变性基本上限于常由至多5个环形成所谓的环区。几种CTLD含有一个或两个钙结合位点，大多数与钙相互作用的侧链位于环区内。基于3D结构信息可获得的CTLD，已经推断出CTLD在结构上的特征在于以β I、α I、α 2、β 2、β 3、β 4和β 5的顺序依次出现的7个主要ニ级结构单元(即，5个β -链和2个α-螺旋)。图4说明了 10中已知的C-型凝集素的对比。在所有3D结果已经测 定的CTLD中，β-链排列成两个反平行的β-折叠，ー个由β 和β 5组成，另ー个由β2、β3和β4組成。额外的β-链β O常常顺序在β I之前，当存在时，其与β 、β5-折叠整体上形成额外的链。而且，在迄今表征的所有CTLD中均不变地发现两个ニ硫桥键ー个连接α I和β 5 (CI-CIV)，一个连接β 3和将β 4和β 5连接起来的多肽区段(CII-CIII)。另外，图5显示了来自人四联蛋白和8种其他四联蛋白或四联蛋白样多肽的CTLD的对比。在CTLD的3D-结构中，这些保守的ニ级结构单元形成若干从核伸出的环的紧凑支架，在本上下文中将其统称为“环区”。在CTLD的一级结构中，这些环组织在两个区段中，即环区段A(LSA)和环区段B (LSB)。LSA表示连接β2和β 3的长的肽区段，其常常缺少规整的ニ级结构，含有至多4个环。LSB表示连接β-链β3和β 4的肽区段。已经显示，LSA中的残基与β 4中的个别残基一起，对包括四联蛋白CTLD的几种CTLD的Ca2+-和配体-结合位点具有特异性。例如，涉及到置换ー个或几个残基的诱变研究已经显示，结合特异性、Ca2+-敏感性和/或亲和カ的变化可以通过CTLD结构域来适应。ー些CLTD是已知的，包括以下的非限定性例子四联蛋白、胰石蛋白(Iithostatin)、小鼠巨噬细胞半乳糖凝集素、肝巨噬细胞受体、鸡神经蛋白聚糖、perlucin、脱唾液酸糖蛋白受体、软骨蛋白聚糖核蛋白质、IgE Fe受体、胰腺炎相关蛋白质、小鼠巨噬细胞受体、天然杀伤细胞组、干细胞生长因子、IX/X因子结合蛋白、甘露糖结合蛋白、牛胶固素、牛CL43、胶原凝集素肝I、表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、e-选择蛋白、被囊动物C-型凝集素、CD94NK受体结构域、LY49ANK受体结构域、鸡肝凝集素、鲑鱼C-型凝集素、HIV gp 120-结合C-型凝集素和树枝状细胞免疫受体。參见美国专利公开第2007/0275393号，在此将其全部并入作为引证，并參见Essentials of Glycobiology,果ニ版.A. Varki, R. D. Cummings, J. D. Esko, HH. Freeze, P.Stanley, C. R. Bertozzi, G. ff. Hart, M. E. Etzler 编著，CHS Press。“ATRMER 多肽复合物”或“ATRMER 复合物”是指同样包括CLTD的三个三聚结构域的三聚复合物(Anaphore, Inc. , San Diego, California)。措辞“有效量”是指任选地与治疗剂结合有效于预防、减轻或治疗所讨论结冰或病状的本发明多肽的量，无论其是同时给药还是依序给药。在具体的实施方式中，有效量是指本发明多肽的量和结合的治疗剂例如细胞毒剂或免疫抑制剂足以降低IL-23对IL-23R表达细胞的影响，影响IL-23R表达细胞与IL-23R协同发挥作用的其他途径，或影响其他免疫细胞与IL-23R表达细胞协同作用，降低细胞增殖或存活的倾向，或提高或另外(例如协同地)增加细胞经历凋亡的倾向，减少肿瘤体积，或延长患有癌症或免疫相关疾病的哺乳动物的生存。“治疗剂”是指细胞毒剂(cytotoxic agent)、化疗剂、免疫抑制剂、抗炎剂、免疫刺激剂和/或生长抑制剂。如本文用于辅助治疗所用，术语“免疫抑制剂”和“炎症调节剂”是指作用于抑制或掩蔽在此被治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。这可以包括抑制细胞因子生成、减量调节或抑制自身抗原表达、抑制免疫细胞向慢性炎症位点迁移或掩蔽MHC抗原的物质。这些药剂的例子包括但不限于2_氨基-6-芳基-5-取代嘧啶(參见美国专利第4，665，077号)；非甾族抗炎药物(NSAID);咪唑硫嘌呤(azathioprine);环磷酰胺；溴隐定；danazol ；氨苯砜；戊ニ醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利第4，120, 649号所述)；用于MHC抗原和MHC片段的杭-特应抗体；环孢菌素A ;类固醇，例如糖皮质激素，如泼尼松(rednisone)、甲泼尼松(methylprednisolone)、地塞米松和氢化可的松(hydrocortisone)；氨甲喋呤(ロ服或皮下)；hydroxycloroquine ;柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine);来氟米特(Ieflunomide);细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-Y (IFN-Y )，- β 或_α抗体、抗肿瘤坏死因子-ct抗体(例如，如infliximab、adalimumab或Cimzia)、抗-TNF a immunoadhesin (etanercept)、抗肿瘤坏死因子 _β 抗体、抗-TGF- β 抗体、抗-白细胞介素_2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-IL-6抗体、抗-IL-6R抗体、抗-LFA-I抗体，包括抗-⑶Ila和抗-⑶18抗体；抗_し3了4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan_T抗体，优选抗-⑶3或抗-⑶4/⑶4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(W0 90/08187,公开于1990年7月26日)；链激酶JGF-β ;链道酶；来自宿主的RNA或DNA ；FK506 ；RS-61443 ；deoxyspergualin ;雷帕霉素(rapamycin) ;T_ 细胞受体(Cohen 等人，U. S. Pat.No. 5，114，721) ;T-细胞受体片段(Offner 等人，Science, 251:430-432(1991) ;W0 90/11294; Janeway, Nature, 341:482 (1989);和 WO 91/01133);和 T-细胞受体抗体(EP 340，109)例如T10B9，整联蛋白抑制剂例如Tysabri、CCR9或CCR6拮抗剂、抗-TLlA抗体或者抑制抑制免疫反应的细胞因子例如IL-10或IL-27。术语“细胞毒剂”是指抑制或防止细胞的功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(例如 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和 Lu 的放射性同位素)，化疗剂，毒素，例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素或其片段。“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂，例如硫化三环氮丙基磷(thiotepa)和CYTOXAN 环磷酰胺；烷基磺酸酷，例如白消安(busulfan)、improsulfan 和哌泊舒凡(piposulfan);氮杂环丙烧，例如 benzodopa、卡波酉昆、meturedopa 和 uredopa ； M PS] P/E ^ethylenimines)和 methylamelamines，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚こ基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚こ基磷酰胺、三亚こ基硫代磷酰胺和trimethylolomelamine ；acetogenins (特别是泡番蒸枝辛(bullatacin)和bullatacinone);喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan))；草苔虫内酉旨(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；cryptophycins (特别是 cryptophycin I 和 cryptophycin 8) ；dolastatin ；duocarmycin 包括合成的类似物 Kff-2189 和 CB1-TM1) ；eleutherobin ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海绵抑制素(spongistatin);氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰氮芥(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、ニ氯甲基ニこ胺(mechlorethamine)、ニ氯甲基ニこ胺氧化物盐酸盐、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、胆留醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲洛憐月安(trofosfamide)、尿啼ロ定芥(uracil mustard);亚硝基服(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯尿菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、啼 ロ定亚硝脲(nimustine)和雷诺氮芥(ranimustine);抗生素，例如烯ニ炔抗生素(例如 calicheamicin，特另Ij 是 calicheamicin Y 11 和 calicheamicin ω 11 (參见，例如 Agnew, Chem Intl. Ed. Engl.，33:183-186 (1994));达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A ; ニ膦酸酯，例如clodronate ；埃斯培拉霉素(esperamicin);以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关的色蛋白烯ニ炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycins)、放 戈 1 : C(cactinomycin; 、 carabicin、 φ红霉素(carminomycin; 、
H ^ (carzinophilin； Λ(chromomycinis) Λ(dactinomycin； λ
(daunorubicin)、detorubicin、6_ ニ偶氮 _5_ 氧代 _L_ 正亮氨酸、ADRiAMYCINig^ilI霉素(doxorubicin)(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代_阿霉素、2_吡咯啉代-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达(idarubicin)、·marcellomycin、丝裂霉素，例如丝裂霉素C、霉酷酸、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泊非罗霉素(potf iromycin)、票呤霉素、quelamycin、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星(streptozocin)、杀結核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗-代谢物，例如氨甲噪呤和5-氟尿啼唳(5-FU);叶酸类似物，例如ニ甲叶酸(denopterin)、氨甲噪呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤类似物，例如氟达拉滨(f Iudarabine)、6_巯基票呤、thiamiprine、硫鸟票呤(thioguanine);啼卩定类似物，例如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、ニ脱氧鸟苷、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依诺他宾(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、轻甲雄酮(dromostanolone)丙酸酯、硫雄留醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺(anti-adrenals)，例如氨基苯乙哌卩定酮、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充物，例如亚叶酸(frolinic acid);醋葡醒内酯(aceglatone);醒磷酰胺苷、a_Ldophosphamide glycoside);氣乙 0 内酸；eniluracil ；安 ロ丫 ロ定(amsacrine)；bestrabucil ;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate) ；defofamine ;脱擬秋水仙碱(demecolcine);亚丝酉昆(diaziquone);依氟鸟氨酸(elfornithine);依氟鸟氨酸乙酸盐(elliptinium acetate);埃博霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；轻基脲；蘑燕多糖；lonidainine ；maytansinoid,例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol ； ニ 月安硝卩丫卩定(nitraerine);喷司他丁 (pentostatin) ；phenamet ；卩比柔比M (pirarubicin);洛索葱酉昆(Iosoxantrone);足 ロ十草酸(podophyllinic acid) ;2_ 乙基酰肼；甲基节肼；PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.);萝芙减(razoxane) ;rhizoxin ;西索菲兰(sizofiran);错螺胺(spirogermanium);细父链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone) ;2，2’，22 "-三氯三乙基胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);氮烯唑胺(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine) ; ニ溴甘露醇(mitobronitol) ; ニ溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烧(pipobroman) ;gacytosine ;阿拉伯糖苷(“Ara_C”)；环磷酰胺；硫替派；紫杉醇(taxoids),例如 TAXOL 太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 太平洋紫杉醇的不含 Cremophor > 白蛋白エ程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和TAXOTERE 多烯紫杉醇(doxetaxel) (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);苯丁酸氮芥(chloranbucil) ;GEMZAR 吉西他滨(gemcitabine) ;6_硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；钼类似物，例如顺氯氨钼(cisplatin)和卡波钼(carboplatin);长春碱；钼；足叶こ式(etoposide) (VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；NAVELBiNE :温诺平(Vinorelbine);米托蒽醌(novantrone);替尼泊式(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate) ； CPT-11 ;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ；ニ氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维生素A，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)以及上述
任意者的药学可接受盐、酸或衍生物。该定义中还包括蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米(bortezomib) (Velcade)、BCL_2 抑制剂、IAP 拮抗剂(例如 Smac mimics/xIAP 和 cIAP 抑制齐U，例如某些肽、吡啶化合物例如(S) -N- {6-苯并[1，3] dioxol-5-基-I-[5- (4-氟-苯甲酰基)-吡啶-3-基甲基]-2-氧代-1，2- ニ氢-吡啶-3-基} -2-甲基氨基-丙酰胺，χΙΑΡ反义)、HDAC抑制剂(HDACI)和激酶抑制剂(Sorafenib)。该定义中还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括，例如，他莫西芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫西芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 轻基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapri stone)和FAREST0N-托瑞米芬(toremifene);抑制酶芳香化酶(aromatase)的芳香化酶抑制齐U，其调节肾上腺中的雌激素产生，例如，4 (5)-咪唑、氨基苯こ派啶酮、MEGASE 甲地孕酮醋酸酷、AROMAS1N 依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVlSOR 伏氯唑(vorozole)、FEMARA 来曲唑(Ietrozole)和ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole);和杭-雌激素，例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(niIutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、柳培林(Ieuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3-ニ氧戍环核苷胞卩密唳类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制粘附细胞(abherant cell)増殖中所涉及信号传导途径中基因表达的那些，例如，如PKC-alpha、Ralf和H-Ras ;核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYME 核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECT1N 疫]Vi> LEIJVECT1N 疫苗和 VAX1D 疫苗；PROLEUK1N rIL-2 ;LURTOTECAN 拓扑异构酶I抑制剂；ABARELIX rmRH ;和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。“生长抑制剂”在用于本文时是指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂是在S期显著降低超量表达这些基因的细胞百分数的药剂。细胞抑制剂的例子包括(在S期以外处)阻断细胞周期进展的药剂，例如诱导Gl败育和M-期败育的药剂。经典的M-期阻断剂包括长春花(vincas)(长春新碱和长春碱)、紫杉醇和topo II抑制剂,例如阿霉素、表柔比星、正定霉素、足叶こ式和博来霉素。败育Gl的药剂也会溢出至S期败育，例如，DNA烷基化剂，例如，他莫西芬、泼尼松、氮烯唑胺、氮芥(echlorethamine)、顺氯氨钼、氨甲喋呤、5_氟尿卩密唳和ara_C。更多信息可见述于TheMolecular Basis of Cancer, Mendelsohn 和 Israel 编著·，第 I章，标题“Cell cycleregulation, oncogenes, and antineoplastic drugs，，，Murakami 等人作(WB Saunders:Philadelphia, 1995, pg. 13)。还包括有诱导细胞应激的药剂，例如，如精氨酸消除剂，如精氨酸酶。还包括有影响B细胞的抗体,例如利妥昔单抗(Rituximab)、抗-BAFF或抗-APRIL抗体，以及T细胞消除抗体，例如Campath。而且，IL-23R拮抗剂与阿司匹林和NFkB途径抑制剂的组合也是有益的。如本文所用，“协同活性”、“协同”、“协同作用”或“协同有效量”是指当使用IL-23R拮抗剂和治疗剂的组合时其作用(I)大于当单独(或分別)使用IL-23R拮抗剂或治疗剂时达到的效果和(2)大于IL-23R拮抗剂或治疗剂相加(加和)的結果。这种协同或协同作用可以通过多种本领域已知的方式进行測定。例如，synergistic effect of IL-23R拮抗剂和治疗剂的协同作用可以在考察以下方面的体外或体内測定方式中加以观察细胞因子从免疫细胞中释放的減少、存在的免疫细胞的数量或种类，或者在癌症的情况下，肿瘤细胞数量或肿瘤质量的減少。术语“癌症”、“癌性”和“恶性(maligant)”是指或描述典型特征在于不受调节的细胞生长的哺乳动物生理状況。癌症的例子包括但不限于癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和白血病。这些癌症更具体的例子包括扁平细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃肠癌、霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巣癌、肝脏癌例如肝癌和肝细胞瘤、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宮内膜癌、骨髄瘤(例如多发性骨髄瘤)、唾液腺癌、肾癌例如肾细胞癌和维尔姆斯瘤(Wilms’tumors)、基细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌和各种类型的头和颈癌。术语“免疫相关疾病”是指哺乳动物免疫系统的组成部分导致、介导或另外有助于哺乳动物发病的疾病或异常。还包括免疫反应的刺激或干涉对疾病发展具有改善作用的疾病。该术语中包括自体免疫疾病、免疫介导的炎性疾病。免疫相关和炎性疾病(其一些是免疫或T细胞介导的，可以根据本发明治疗)的例子包括全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、脊柱关节病(spondyloarthropathies)、强直性脊柱炎，系统性硬化症(硬皮病)、先天性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、原发性干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、系统性血管炎、结节病、自体免疫溶血性贫血(免疫全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自体免疫血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、青少年淋巴细胞甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球性肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病例如多发性硬化、突发性脱鞘性多发神经病变或格林-巴利综合征、沃格特-小柳-原田病、古德帕斯彻病和慢性发炎性脱鞘性多发神经病变、肝胆疾病例如传染性肝炎(甲型、こ型、丙型、丁型、戊型肝炎和其他的非嗜肝病毒)、自体免疫慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎(granulomatous hepatitis)和硬化性胆管炎、炎性疾病例如炎性肠病(溃疡性结肠炎克罗恩氏病)、麸质敏感性肠病、惠普耳氏病(Whipple’s disease)和纤维化肺病、自体免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病、变态反应病例如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏感性和风疹、免疫肺病例如嗜曙红肺炎、特发性肺纤维化和超敏性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病、免疫介导或自体免疫眼病例如葡萄膜炎、干眼症、贝赫茨病(BD).传染病包括AIDS (HIV感染)、甲型、こ型、丙型、丁型和戊型肝炎、细菌感染、真菌 感染、原生动物感染和寄生虫感染。“B细胞恶性肿瘤”是与B细胞有关的恶性肿瘤。例子包括霍奇金氏病，包括淋巴细胞为主型霍奇金氏病(LPHD);非霍奇金氏淋巴瘤(NHL);滤泡中心性(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞白血病(ALL);慢性淋巴细胞白血病(CLL);多毛细胞白血病；浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；AIDS或HIV相关的淋巴瘤；多发性骨髄瘤；中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；移植后淋巴增生病(PTLD);华氏巨球蛋白血症(淋巴浆细胞性淋巴瘤)；黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤；和边缘区淋巴瘤/白血病.“非霍奇金氏淋巴瘤”(NHL)包括，但不限于，低级/滤泡NHL、复发或顽固性NHL、前线低级NHL、III/IV期NHL、化疗耐性NHL、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥散性NHL、弥散性大细胞淋巴瘤、侵袭性NHL (包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发NHL)、自体干细胞移植之后复发或顽固性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小无裂细胞NHL、大包块病变NHL等。“肿瘤相关抗原”(TAA)或“肿瘤特异性抗原”(TSA)是肿瘤细胞中产生的可以触发宿主中免疫反应的分子。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞和正常细胞中均可见，但表达水平不同，而肿瘤特异性细胞则是由肿瘤细胞专有地表达。肿瘤细胞表面上呈递的TAA或TSA包括但不限于α-胎甲球蛋白、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、glypican_3、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原、MART-U gplOO、TRP-UTRP-2、MSH-I、MAGE-1, -2，-3，-12、RAGE-1, GAGE I-, -2、BAGE, NY-ESO-U β -catenin、CDCP-1、CDC-27、SART-U EpCAM、CD20、CD23、CD33、EGFR、HER-2、乳腺肿瘤相关抗原 BTA-1和 BTA-2、RCASl (SiSo 细胞上表达的受体结核癌抗原)、PLACenta-specific I (PLAC-I)、syndecan、丽(gp250)、个体基因型和其他者。肿瘤相关抗原还包括血型抗原，例如，Lea、Leb、LeX、LeY、H_2、B_l、B_2抗原(參见说明书末尾表19)。理论上，出于本发明的目的，TAA或TSA靶标在结合时不会被内化。“非天然氨基酸”或“非天然存在氨基酸”是指并非20种常见氨基酸之一的氨基酸，其包括，例如，通过对天然编码的氨基酸(包括但不限于20中常见氨基酸或吡咯赖氨酸(pyrolysine)和硒半胱氨酸(selenocysteine))进行修饰(例如后翻译修饰)产生、但其本身不会被天然地通过翻译复合物引入生长的多肽中的氨基酸。这些非天然氨基酸的例子包括，但不限干，N-こ酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-こ酰基葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸化酪氨酸。“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列二者。对于具体的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸的情况下，是指基本相同的核酸序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸可以编码任何给定的蛋白质。对于氨基酸序列，技术人员将会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质的以下単独置换是“保守修饰的变体”:将编码的序列中的氨基酸或特定百分比的氨基酸置换为保守氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守置換表是本领域公知的。保守置换的例子是以下组别之一中的氨基酸交换成同一组中的另ー氨基酸(授予Lee等人的美国专利第5，767，063号；Kyte和Doolittle (1982) J. Mol.Biol. 157:105-132) :(1)疏水性正亮氨酸、lie、Val、Leu、Phe、Cys 或 Met ; (2)中性亲水性Cys、Ser、Thr ； (3)酸性Asp、Glu ； (4)碱性Asn、Gin、His、Lys> Arg ； (5)影响链定向的残基Gly、Pro ； (6)芳香性Trp、Tyr> Phe ； (7)小氨基酸Gly、Ala、Ser。为考察抑制的程度，例如，将包括给定例如蛋白质、基因、细胞或有机体的样品或试样用可能的活化剂或抑制剂处理，并与没有抑制剂的对照样品比较。指定对照样品即不经拮抗剂处理的样品相对活性值为100%。当相对于对照的活性值为以下值时达到抑制 大约90%或更小、通常85%或更小、最通常80%或更小、更通常75%或更小、通常70%或更小、·小、最通常40%或更小、优选35%或更小、更优选30%或更小、再更优选25%或更小、最优选小于25%。当相对于对照的活性值为以下值时达到活化大约110%、通常至少120%、更通常至少140%、更通常至少160%、通常至少180%、更通常至少2倍、最通常至少2. 5倍、通常至少5倍、更通常至少10倍、优选至少20倍、更优选至少40倍、最优选40倍以上。活化或抑制的終点可以监测如下。活化、抑制和对例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人被试者进行处理的反应可以通过终点来监测。終点可以包括例如炎症、致瘤性或细胞脱粒或分泌的指示物，例如细胞因子、毒性氧或蛋白酶的释放的预定量或百分比。终点可以包括例如离子流量或传输；细胞迁移；细胞粘附；细胞增殖；转移的可能；细胞分化；和表型变化例如与炎症、细胞凋亡、转化、细胞周期或转移有关的基因表达的变化的预定量(參见，例如 Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158 ；Hood 和 Cheresh (2002) NatureRev.Cancer 2:91-100 ;Timme 等人(2003)Curr. Drug Targets 4:251-261 ;Robbins 和Itzkowitz(2002)Med. Clin. North Am. 86:1467-1495 ；Grady 和 Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum. Genet. 3:101-128 ;Bauer 等人(2001)Glia 36:235-243 ；Stanimirovic和 Satoh(2000)Brain Pathol. 10:113-126)。抑制终点通常为对照的75%或更低，优选对照的50%或更低，更优选对照的25%或更低，最优选対照的10%或更低。通常，活化终点为对照的至少150%，优选对照的至少2倍，更优选対照的至少4倍，最优选対照的至少10倍。“标记的”组合物可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学的方法直接或间接地检测。例如，可用的标记包括32P、33P、35S、14C、3H、125I、稳定同位素、荧光染料、高电子密度试剂、底物、表位标记或酶例如酶联免疫检测中使用的酶或fIuorettes (參见，例如，Rozinov 和 Nolan(1998)Chem. Biol. 5:713-728)。许多适用于本发明的非天然氨基酸是市售的，例如，可获自Sigma(USA)或Aldrich (Milwaukee, ffis. ,USA)。没有市售的任选地如本文提供或者如各种出版物提供或者使用本领域技术人员已知的标准方法合成。对于有机合成技术，參见，例如OrganicChemistry, Fessendon 和 Fessendon 著，(1982，第 2 片反,Willard Grant Press,BostonMass. ； ；Advanced Organic Chemistry, March 著(第 3 片K，1985, Wiley and Sons, NewYork)；和 Advanced Organic Chemistry, Carey 和 Sundberg 著(第 3 片反，Parts A andB，1990，Plenum Press, New York)。其他描述非天然氨基酸合成的出版物包括，例如，WO 2002/085923，名称为“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids(非天然氛基酸的体内引入)”，Matsoukas 等人，(1995) J. Med. Chem.，38，4660-4669 ;King，F.E. &Kidd, D. A. A. (1949) A New Syntnesis of Glutamine and of. gamma. -Dipeptiaesof Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc.，3315—3319 ；Friedman, 0. M. &Chatterji, R. (1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as ModelSubstrates for Anti-Tumor Agents. J. Am . Chem. Soc. 81，3750-3752 ;Craig，J. C.等人(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino) -1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem.53，1167-1170 ；Azoulayj M. , Vilmontj M. &Frappier,F. (1991)Glutamine analogues as PotentialAntimalarialsjEur. J. Med. Chem.26，201-5 ;Koskinen，A. M. P. &Rapoport，H. (1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationaily Constrained Amino AcidAnalogues. J. Org. Chem. 54，1859-1866 ；Christie, B. D. &Rapoport, H. (1985) Synthesisof Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine ；Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and IminiumIon Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859_1866;Barton等人，(1987) Synthesis of Novela -Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-andD- a -Amino-Adipic Acids, L- a -aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308 ;和 Subasinghe 等人，(1992)Quisqualicacid analogues:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acidderivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med.Chem. 35:4602-7。另外，参见 US 2004/0198637 和 US 2005/0170404，在此将其均全文并入作为引证。术语“氨基酸修饰”和“修饰”是指氨基酸序列中相对于另一氨基酸序列例如天然氨基酸序列的氨基酸置换、缺失或插入或其任意组合。在此，置换的变体是那些在天然CTLD序列中去除至少ー个氨基酸残基并在相同位置处插入不同的氨基酸的变体。置換可以是单一的，其中在分子中仅仅置換一个氨基酸，或者也可以是多重的，其中在同一分子中置換有两个或更多个氨基酸。具体提到CTLD中的ー个以上氨基酸置换是指其中每个单个的氨基酸置換可以发生在CTLD中任意氨基酸位置(包括连续和不连续的氨基酸位置)处的多重置換。类似地，具体提到CTLD中的ー个以上的氨基酸插入或缺失是指其中每个单个的氨基酸插入或缺失可以发生在CTLD中任意氨基酸位置(包括连续和不连续的氨基酸位置)处的多重插入或缺失。术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿着脱氧核酸链的脱氧核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核苷酸的顺序决定了沿着肽链的氨基酸的顺序。DNA序列由此编码氨基酸序列。任何上下文中使用的识别随机化多肽或核酸序列的术语“随机化”、“加以随机化”和“随机化的”以及任何类似的术语是指多肽或核酸序列或区段的系综(ensembles)，其中在多肽或核酸系综的不同成员之间，ー个或多个序列位置处的氨基酸残基或核苷酸可以不同，使得在每个这样的序列位置处出现的氨基酸残基或核苷酸可以属于一组氨基酸残基或核苷酸，其可包括所有可能的氨基酸残基或核苷酸或其任意严格亚型。该术语常用来指其中对于系综的每个成员可能的氨基酸残基或核苷酸的数目相同的系综，但是也可用来指其中系综的每个成员中可能的氨基酸残基或核苷酸的数目可以是适当整数范围内的任意整数的系综。现更详细地对本发明进行说明，在一方面，本发明涉及具有多聚结构域和至少ー个结合IL-23R的多肽结合单元的多肽。根据本发明，结合单元可以与多聚结构域在例如N-端或C-端连接。另外，在某些实施方式中，有利的是在单体的多聚结构域的N-端和C-端二者均连接有结合IL-23R的结合单元或两种不同的结合单元，从而提供包括6个能够结合IL-23R的结合单元的多聚多肽复合物。通常，本发明的多肽是非天然多肽，例如，多聚结构域和结合IL-23R的多肽序列的融合蛋白。非天然多肽也可以是其中天然氨基酸序列已经 通过氨基酸的添加、缺失或置換而改变的天然多肽。这些多肽的例子包括具有C-型凝集素样结构域(CTLD)的多肽，其中结构域的一个或多个环区已经如本文所述加以修饰。在本发明另一方面，结合IL-23R的多肽是与受体结合的天然多肽的区段或变体，其中当天然多肽、变体或区段与多聚结构域融合吋，融合蛋白不再是天然多肽。因此，本发明并没有将天然多肽、其区段或变体排除于本发明的融合蛋白的一部分之外。在这一方面的实施方式中，所述多肽是与IL-23R结合并防止通过IL-23途径进行信号传导的IL-23R拮抗剂。在一个实施方式中，多肽与IL23-R(SEQ ID NO:5)或其变体结合。本发明的多肽与IL-23R上防止结合天然IL-23配体的ー个或多个位点结合，从而防止受体被IL-23配体活化。另外，本发明的多肽不具有激动剂活性，不会活化IL-23杂ニ聚受体。在具体的实施方式中，多肽并不特异性地结合IL_12Ri3 1或IL_12Ri3 2。因此，在治疗组合物中使用本发明的多肽对于某些治疗可以防止不希望发生的阻断IL-12活性的后果。在各个方面，本发明的単体多肽包括至少两个区段能够与其他多聚结构域形成多聚复合物的多聚结构域，以及与IL-23R结合的多肽序列。与IL-23R结合的序列可以与多聚结构域在结构域的N-端、在C-端或者在N-端和C-端两端结合。在一个实施方式中，N-端处与IL-23R结合的多肽与在三聚结构域C端处与IL-23R结合的多肽不同。在一个实施方式中，与IL-23R结合的第一多肽在三聚结构域的N-端和C-端中的一端相融合，其为炎症调节子的第二多肽在三聚结构域的N-端和C-端中的另一端融合。如本领域技术人员理解，不是多肽的调节子可以与三聚结构域以共价或非共价方式连接。除炎症调节子之外，还可以有其他的多肽和非多肽治疗剂与三聚模块连接。对于癌症的治疗，合意的是将本发明的多肽靶向肿瘤环境，以更有效地防止IL-23对肿瘤细胞的肿瘤促进作用。因此，本发明的另一方面包括在结构域的一端(N端或C-端中的ー个)上的具有结合IL-23R的多肽的多聚结构域，以及在另一端(N端或C-端中的另ー个)上的与肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)结合的多肽。与TAA或TSA结合的结构域可以是多肽，例如例子CTLD，单链抗体，或者任何类型的与所需靶标特异性结合的结构域。在一具体的方法中，死亡受体激动剂的活性可以通过设计具有通过IL-23R结合多肽介导的结合活性的分子而提高，上述多肽在三聚结构域的一端将药物驱动至癌结实处的炎症位点，在三聚结构域的另一端允许死亡受体特异性多肽的聚集。在各个方面，多肽以低干与IL-23R的亲和カ与死亡受体结合。更具体地，结合IL-23R的多肽可以相对结合死亡受体的多肽高至少2倍，例如2,2. 5、3、3· 5、4、4· 5、5、10、15、20、50和100倍的亲和カ结
ム
ロ ο具有IL-23R-结合多肽和TAA或TSA革巴向剂(targeting agent) 二者的三聚复合物的适应症包括非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、卵巣癌、肾癌、胰腺癌、肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髄瘤、乳癌、前列腺癌、黑色素瘤、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤。另ー方面，与IL-23受体特异性结合的多肽包含在CTLD的环区中。多肽可以是IL-23多肽的一部分，或者可以是如本文提供识别的序列。在这一方面，序列包含在CLTD的环区中，并且CTLD在结构域的N-端或C-端直接地或者通过适当的连接基(linker)与三聚结构域融合。另外，本发明的多肽可以包括在N-端和C-端中的另一端融合的第二 CLTD结构域，其中CTLD的序列和/或其对于IL-23R的亲和カ可以相同或不同。在该方面的一变化形式中，多肽在三聚结构域終端中的一端具有结合IL-23R的多肽，并在另ー终端处具有CLTD。多肽的ー个、两个或三个可以是含有至多6个特异性IL-23R结合单元的三聚复合物的一部分。与IL-23R结合的多肽序列对于IL-23R的结合亲和力可以大约等于天然IL-23对于IL-23R的亲和力。在某些实施方式中，本发明的多肽对于IL-23R的结合亲和力大于或小于天然IL-23对于相同IL-23R的结合亲和力。本发明的多肽可以在天然IL_23(pl9)序列中包括一个或多个氨基酸突变，或者包括对于IL-23R有选择性结合亲和力、但对IL-12Ri3 I或IL-12Rβ 2没有的序列。例如，当这些结合单元对IL-23R的结合亲和力与天然IL-23相比较近似相等(不变)或更大(增加)、并且结合单元对IL-12Ri3 I或IL-12Ri3 2的结合亲和力与天然IL-23序列相比较更小或几乎消除时，出于本文的目的，结合单元的结合亲和カ视作对于IL-23R有“选择性”。在另一例子中，结合单元对于IL-23R的亲和カ小于IL-23对于受体的亲和力，但如果其对于IL-23R的亲和カ大于其对于IL-12Ri3 I或IL_12Ri3 2的亲和力，结合单元对于受体仍具有选择性。本发明优选的IL-23R选择性拮抗剂对IL-23R的结合亲和力相比较于IL_12Ri3 I或IL-12Ri3 2将高至少5倍，优选至少10倍，再更优选地，对IL-23R的结合亲和力相比较于IL-12RP I或IL-12RP 2将高至少100倍。拮抗剂各自的结合亲和力可以通过本领域已知的ELISA、RIA和/或BIAcore检测来測定，并与天然IL-23或其一部分的结合特性相比较。本发明优选的IL-23R选择性拮抗剂将至少在ー种类型的哺乳动物细胞中不抑制IL-12信号传导，这种信号抑制可以通过已知的技术方法例如ELISA来測定。在ー实施方式中，IL-23R拮抗剂包括抗体或抗体片段。在本发明的上下文中，术语“抗体”用来描述天然的、或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。由于抗体可以许多种方式修饰，术语“抗体”应当理解成涵盖了任何具备具有所需受体特异性的结合结构域的特异性结合単元或物质。因此，该术语涵盖了抗体片段、衍生物、功能等效物(equivalent)和抗体的同源物，包括有包括天然的或者全部或部分合成的免疫球蛋白结合结构域的任何多肽。因此，包括有与另ー多肽融合的包括免疫球蛋白结合结构域或等效物的嵌合分子。该术语还涵盖了任何具有作为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的多肽或蛋白质，例如抗体模拟型。这些可以来自天然来源，或者它们可以部分地或全部合成产生。抗体的例子是免疫球蛋白同型及其同型亚类；包括抗原结合结构域例如Fab、Fab’、F(ab' )2、scFv、Fv、dAb、Fd的片段；和双价小分子抗体(diabodies)。在另一方面，本发明涉及三个多肽的多聚复合物，每个多肽均包括多聚结构域和至少ー个与IL-23R结合的多肽。在ー实施方式中，多聚复合物包括具有选自以下多肽的多聚结构域的多肽与人四联蛋白三聚结构単元具有相当大同源性的多肽，或其他的包括甘露糖结合蛋白(MBP)三聚结构域、胶原凝集素颈区多肽以及其他的多肽。多聚复合物可以由任何本发明的多肽构成，其中多聚复合物的多肽包括能够彼此缔合形成多聚物的多聚结构域。因此，在一些实施方式中，多聚复合物是由具有相同氨基酸序列的多肽构成的均多聚复合物。在其他实施方式中，多聚复合物是由具有不同氨基酸序列(例如不同的多聚结构域和/或不同的与IL-23R结合的多肽)的多肽构成的杂多聚(heteromultimeric)复合物。此外，杂多聚复合物可以包括治疗剂和IL-23R拮抗剂。而且，在一方面，本发明涉及防止表达IL-23R的细胞中IL-23R活化的多肽的制备·方法。该方法包括以下步骤(a)选择与IL-23R特异性结合的第一多肽；(b)将第一多肽移植到四联蛋白CTLD的ー个或两个环区内，以形成第一结合决定子(determinant)，或者直接将多肽与四联蛋白三聚结构域融合；和(c)将第一 CTLD与四联蛋白三聚结构域的N-端或C-端中的ー个融合。在该方法一具体实施方式
中，与IL-23R结合的多肽不与IL-12R3 I或IL-12R0 2結合。四联蛋白CTLD具有至多5个环区，其中可以插入IL-23R结合单元，或者如本文所述通过从随机化文库中选择来识别。因此，当本发明的多肽包括CTLD吋，多肽可以具有至多5个通过CTLD与三聚结构域连接的IL-23R结合单元。每个结合単元可以相同或不同。在本发明多肽的另一方面，三聚结构域的一端可以连接有受体拮抗剂，第二端可以连接有ー种或多种治疗剂。如本领域技术人员所理解，治疗剂可以直接连接或者通过适当的连接基连接。对于免疫疾病、癌症或其他疾病，这些治疗剂可以通过与拮抗剂相同的方式作用，或者以不同的方式作用。除了与多肽的ー个终端结合以外，治疗剂还可以经由与三聚结构域中侧链的肽键或者经由与半胱氨酸残基的键与三聚结构域共价连接。也可以使用其他将治疗剂与模块共价偶联的方式，例如，如US 6，190，886所示，在此将其并入作为引证。对IL-23R有特异性的多肽序列的识别在一方面，IL-23R特异性结合成员可以通过选择与受体特异性结合的文库成员来从随机多肽文库中获得。几个用于展示具有推定配体结合位点的系统是已知的。这些系统包括卩遼菌体展不(例如，丝状卩遼菌体fd[Dunn (1996), Griffiths和Duncan (1998), Marks等人(1992)]，卩遼菌体lambda[Mikawa等人(1996)])、真核病毒展示(例如杆状病毒[Ernst等人(2000)])、细胞展示(例如，细菌细胞[Benhar等人(2000)]、酵母细胞[Boder和Wittrup (1997)]和哺乳动物细胞[Whitehorn等人(1995)]的展示、核糖体连接的展示[Schaffitzel等人(1999)]和质粒连接的展示[Gates等人(1996)]。
另外，在此将US2007/0275393并入作为引证，其具体描述了实现用于生成CLTD文库的展示系统的方法。通常的方法包括(I)如果所选择CTLD的3D结构信息可获得，參考所选择CTLD的3D结构识别环区的位置，或者，如果该信息不可获得，通过与已知序列的序列对比识别β2、β3和β 4链的序列位置，通过识别对应于β2和β 3共有序列単元的序列単元和β 4链特征辅以进一歩的确认，亦如上文所述；(2)在有或者没有在先插入靠近编码β 2、β 3和β 4的序列的核酸内切酶限制位点的蛋白质展示载体系统中亚克隆编码选择对的CTLD的核酸片段；和(3)将编码所选择CTLD环区的ー些或全部的核酸片段用由许多种核酸片段组成的系综的随机选择的成员置换，所述许多种核酸片段在插入到编码接收框架的核酸环境(context)之后将会将编码原始环区多肽片段的核酸片段用随机选择的核酸片段置換。每个克隆的编码新的多肽取代原来的环区段或整个环区的核酸片段将会在其 新的序列环境内确定的读框中被译码。可以形成发挥均三聚蛋白质作用的复合物，其阻断天然IL-23结合并活化IL-23R。但是，必须首先识别具有IL-23R结合活性的肽。为实现这一点，可以使用具有已知结合活性的肽，或者通过从展示文库中筛选识别的另外的新的肽。可获得几种不同的展示系统，例如但不限于噬菌体、核糖体和酵母展示。为了选择新的具有结合活性的肽，可以构建文库并筛选结合IL-23R，或作为单独的单体CTLD结构域，或单独的在噬菌体表面上展示的肽。一旦已识别出具有IL-23R结合活性的序列，随后将这些序列移植到人四联蛋白的三聚结构域上，以生成能够结合IL-23R的可能的蛋白质治疗剂。在这些噬菌体展示文库和三聚结构域构成物的构建中，可以使用四种主要策略。第一种策略是构建和/或使用随机肽噬菌体展示文库。随机线性肽和/或构建成ニ硫键限制的环的随机肽将分别展示在噬菌体颗粒的表面上，并通过噬菌体展示“淘选”选择结合所需的IL-23R。获得具有IL-23R结合活性的肽克隆之后，将这些肽移植到人四联蛋白的三聚结构域上，或者移植到CTLD结构域的环内，然后移植到三聚结构域上，并对拮抗剂活性选择进行筛选。第二种构建噬菌体展示文库和三聚结构域构成物的策略包括获得来源自CTLD的结合物(binder)。通过对曬菌体表面上展示的人四联蛋白的CTLD支架内5个不同环中的一个或多个中的蛋白质进行随机化，可以建立文库。可以通过噬菌体展示淘选来选择结合IL-23R。获得具有表现出IL-23R结合活性的肽环的CTLD克隆之后，然后可以将这些CTLD克隆移植到人四联蛋白的三聚结构域上，并对拮抗剂活性进行筛选。第三种构建噬菌体展示文库和三聚结构域构成物的策略包括采取已知的具有结合IL-23R能力的序列并将其直接移植到人四联蛋白的三聚结构域上，对结合活性进行筛选。第四种策略包括使用具有已知IL-23R结合能力的多肽，首先通过产生新的在肽的侧面接有随机化氨基酸或/和在多肽内具有随机化选择的氨基酸的文库提高其结合性，然后通过噬菌体展示选择提高的结合性。在获得亲和力提高的结合物之后，可以将这些肽的结合物移植到人四联蛋白的三聚结构域上，并对拮抗剂活性进行筛选。在该方法中，最初的文库可以如(以上)第一种策略那样构建成噬菌体颗粒表面上展示的游离肽，或者可以如上述第二种策略那样构建成CTLD支架内的限制环。在获得亲和力提高的结合物之后，可以进行如下将这些肽移植到人四联蛋白的三聚结构域上，并对拮抗剂活性进行筛选。可以使用在N-端消除至多16个残基(V17)或者在C-端变化的三聚结构域模型(version)。称作 Trip V[SEQ ID NO:60],TripT[SEQ ID N0:61]、TripQ[SEQ ID NO :62]和TripK[SEQ ID NO:59]的C-端变异(參见图2)使得CTLD结构域独有地呈递在三聚结构域上。TripV、TripT, TripQ代表CTLD分子直接融合在三聚结构域上而没有任何结构上的柔性，但其将CTLD分子回转1/3，从TripV回转至TripT，并从TripT回转至TripQ。这是由于以下事实这些氨基酸的每ー个都处在α-螺旋转角中，完整的转角需要3. 2aa。在第一、第二、第三和第四种策略中对于结合选择的游离肽可以移植到任意上述的三聚结构域模型上。然后可以对导致的融合进行筛选，看那种肽和取向的组合给出最好的活性。限制在四联蛋白CTLD环内的对结合选择的肽可以移植到全长三聚结构域上。下文对四种策略进行更具体的说明。尽管这些策略集中于噬菌体展示，但也可以使用其他等效的多肽识别方法。策略I多肽展示文库试剂盒，例如，但不限于New England Biolabs Ph.D.卩遼菌体展示多肽文库试剂盒是市售的，可以购买用于新的和新型的具有IL-23R结合活性的肽的选择。可获得3种形式的New England Biolabs试剂盒Ph. D. _7肽文库试剂盒，其含有长度为7个氨基酸的线性随机肽，文库大小为2. 8xl09独立克隆；Ph. D. -C7C ニ硫键限制肽文库试剂盒，其含有构建成具有长度为7个氨基酸的随机肽的ニ硫键限制环，文库大小为I. 2xl09独立克隆；和Ph. D. -12肽文库试剂盒，其含有长度为12个氨基酸的线性随机肽，文库大小为2. 8xl09独立克隆。另外可选地，可以从头构建具有含有类似于这些试剂盒的随机氨基酸的类似文库。使用NNK或NNS策略生成随机核苷酸用于构建，其中N代表4种核酸碱基A、C、G和T的等量混合物。K代表G或T的等量混合物，S代表G或C的等量混合物。可以在噬菌体或噬菌粒展示载体系统中将这些随机化的位置克隆到Gene III蛋白质上。NNK和NNS策略均包括了所有20种可能的氨基酸和ー个终止密码子，编码的氨基酸的频率稍有不同。由于细菌转化效率的限制，生成用以噬菌体展示的文库大小为上述那些的级别，因此可以生成含有至多7个随机化氨基酸位置的肽，并且仍包括了理论组合(207=1. 28xl09)的全部所有组成成分。可以使用NNK或NNS策略构建更长的肽文库，但是由于细菌转化的要求，实际的噬菌体展示文库大小可能不会覆盖与这些长度相关的所有可能的理论氨基酸组合。因此在涉及更大/更长的随机肽的情况下核糖体展示文库可能是有利的。对于ニ硫键限制文库，使用类似的NNK或NNS随机核苷酸策略。但是，随机位置两侧连有半胱氨酸氨基酸残基，以允许形成ニ硫桥键。N端的半胱氨酸常常之前有另外的氨基酸例如丙氨酸。此外，对于任何上述的随机肽文库，由若干甘氨酸残基组成但不限于此的柔性连接基可以充当肽和基因III蛋白质之间的间隔区。策略2图4和5所示的人四联蛋白CTLD含有5个环(4个LSA中的环和I个包括LSB的环)，其可以变化成使得CTLD与不同的蛋白质靶标结合。可以将随机氨基酸序列置于这些环的ー个或更多个中，以生成从中可以选择具有所需结合特性的CTLD结构域的文库。可以使用(但不限干)以上策略I中所述的NNK或NNS完成这些文库的构建，所述文库含有限制在人四联蛋白CTLD五个环的任意或全部内的随机肽。可以将7种随机肽插入到TN CTLD的环I中的方法的单个例子如下。可以在无模板PCR反应中使用引物IX for (SEQ ID NO:)和IX rev2 (SEQ ID NO:)进行PCR，以产生片段A，可以在单独的无模板PCR反应中使用引物BstXlfor (SEQ ID NO:)和PstBssRevC(SEQ ID NO:)，以产生片段B。PCR可以使用高保真性聚合酶或taq混合和标准PCR热循环条件进行。然后可以将这两种重叠的片段纯化，并与外部引物Bglforl2 (SEQID NO:5)和PstRev (SEQ ID NO:6) 一起使用，以通过PCR产生所需的DNA片段。用限制酶Bgl II和PstI消化，或者当使用其他引物时用其他适合的限制酶消化，使得可以进行含有TNCTLD的环或其ー些部分的片段的凝胶分离。然后可以将该提纯的片段连接到类似地消化的噬菌体展示载体中，例如pPHCPAB(SEQ ID NO: 150)或pANA27 (SEQ ID NO: 164)，其含有与Gene III融合的限制修饰的CTLD(參见图6)。
可以类似地如上所述通过用随机化氨基酸取代对其他环进行修饰。环内规定氨基酸用随机化氨基酸取代并不限于任何指定的环，也不限于环的原始大小。类似地，不要求对环的全部取代，对于任何环都可以进行部分取代。在一些情形中，环内ー些原始氨基酸，例如图7所示的钙配合氨基酸的保留可以是合意的。在这些情形中，用随机化氨基酸置換可以对于环内较少的氨基酸进行，以保留钙配合氨基酸，或者可以向环添加额外的随机化氨基酸，以增加环的整体大小并仍保留这些钙配合氨基酸。可以通过将环区例如环I和2或环3和4合并到ー个更大的取代环中来容留和测试非常大的肽。此外，可以使用其他CTLD，例如但不限于MBL CTLD来代替四联蛋白CTLD。可以使用与上文所述类似的方法将肽移植到这些CTLD中。在本发明的各个示例性方面中，结合IL-23R的多肽可以使用基于CTLD骨架的组合肽文库和编码文库多肽的核酸序列的文库来识别，其中多肽的CTLD已经根据几个示例性方案进行修饰，仅出于识别目的将这些方案标记为方案(a)至(h)在一方面，本发明提供组合肽文库，以及编码文库多肽的核酸序列文库，其中多肽的CTLD已经根据几个方案进行修饰，仅出于识别目的将这些方案标记为方案(a)至(j)。每个方案在此更具体地加以说明，修饰至少如下(a)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括在环I中插入至少ー个氨基酸，以及环I内至少五个氨基酸的随机置换；(b)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环I内至少五个氨基酸的随机置換，以及环2内至少三个氨基酸的随机置換；(c)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环I内至少七个氨基酸的随机置換，以及环4中至少ー个氨基酸的插入；(d)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环3中至少ー个氨基酸的插入，以及环3内至少三个氨基酸的随机置換；(e)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括将两个环合并成单个环的修饰，其中两个合并的环是环3和环4 ;(f)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环4中的至少ー个氨基酸插入，以及环4内至少三个氨基酸的随机置換；(g)在CTLD的环区段A(LSA)和环区段B(LSB)中五个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环3内至少五个氨基酸的随机置換，以及环5内至少三个氨基酸的随机置换；(h)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环3中的至少ー个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸的插入；(i)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括以下的混合(I)环3中的至少六个氨基酸的随机置换和(2)环3中的至少六个氨基酸的随机置換和至少ー个氨基酸插入；和(j)在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个或环区段B(LSB)中的环5中的至少四个或更多个氨基酸插入。
关于方案(a)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的LSA中四个环的至少ー个中或者在LSB的环中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环I中的至少ー个氨基酸插入和环I内至少五个氨基酸的随机置換。在组合文库该方面的某些实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白吋，CTLD还具有精氨酸-130的随机置換。对于人四联蛋白CTLD以外的CTLD，该肽位于C-端方向上紧邻着环2的C-端肽处。例如，在小鼠四联蛋白中，该肽是Gly-130。在组合文库该方面的某些实施方式中，当CTLD来自人或小鼠四联蛋白时，CTLD包括环4中的赖氨酸-148换成丙氨酸的置換。在某些实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD时，氨基酸修饰包括环I中的两个氨基酸插入和环I内至少五个氨基酸的随机置換。在其他实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD并且CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I中的至少ー个氨基酸插入、环I内至少五个氨基酸的随机置換，并且包括精氨酸130的随机置換。在一个具体实施方式
中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD并且CTLD来自人四联蛋白吋，氨基酸修饰包括环I中的两个氨基酸插入、环I内五个氨基酸的随机置换以及精氨酸130的随机置換。在ー个具体实施方式
中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD并且CTLD来自小鼠四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I中的两个氨基酸插入、环I内五个氨基酸的随机置换以及亮氨酸130的随机置換。在方案(a)的任何实施方式中，氨基酸修饰可以进ー步包括亮氨酸-148换成丙氨酸的置換。因此，在组合文库该方面的ー个具体实施方式
中，CTLD包括环I中的两个氨基酸插入、环I内至少5个氨基酸的随机置換、精氨酸-130或位于C-端方向上在外部紧邻着环2处的其他氨基酸的随机置換以及环4中的赖氨酸-148换成丙氨酸的置換。关于方案(b)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的LSA中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环I内至少五个氨基酸的随机置换和环2内至少三个氨基酸的随机置換。在方案(b)的组合文库该方面的某些实施方式中，当CTLD来自四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I内至少五个氨基酸的随机置換、环2内至少三个氨基酸的随机置換、精氨酸-130或位于C-端方向上在外部紧邻着环2处的其他氨基酸的随机置換。在某些实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD并且CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I内至少五个氨基酸的随机置換、环2内至少三个氨基酸的随机置換，并且包括精氨酸130的随机置換。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD并且CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I内五个氨基酸的随机置換、环2内三个氨基酸的随机置换以及精氨酸130的随机置換。在某些其他实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD并且CTLD来自小鼠四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I内至少五个氨基酸的随机置換、环2内至少三个氨基酸的随机置換，并包括亮氨酸130的随机置換。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD并且CTLD来自小鼠四联蛋白时，氨基酸修饰包括环I内五个氨基酸的随机置换、环2内三个氨基酸的随机置换和亮氨酸130的随机置換。在方案(b)的任何实施方式中，氨基酸修饰可以进ー步包括赖氨酸-148换成丙氨酸的置換。因此，在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环I内至少五个氨基酸的随机置换、环2内至少三个氨基酸的随机置換、以及精氨酸-130或位于C-端方向上在外部紧邻着环2处的其他氨基酸的随机置换以及环4中的赖氨酸-148换成丙氨酸的置換。
关于方案(C)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环I内至少七个氨基酸的随机置换和环4中的至少ー个氨基酸插入。在组合文库该方面的某些实施方式中，组合文库的多肽成员进ー步包括环4内至少两个氨基酸的随机置換。在该方面某些其他实施方式中，氨基酸修饰包括环4内的三个氨基酸插入，并任选地进ー步包括至少两个氨基酸的随机置換。在一个实施方式中，氨基酸修饰包括环I内至少七个氨基酸的随机置換、环4中的至少三个氨基酸插入以及环4内至少两个氨基酸的随机置換。在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环I内七个氨基酸的随机置換、环4中的三个氨基酸插入以及环4内两个氨基酸的随机置換。关于方案(d)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环3中的至少ー个氨基酸插入和环3内至少三个氨基酸的随机置換。在某些实施方式中，当组合文库具有方案(d)的修饰CTLD时，氨基酸修饰可以进一歩包括环4中的至少ー个氨基酸插入，并且可以进一歩包括环4内至少三个氨基酸的随机置換。在对于方案(d)描述的任何实施方式中，氨基酸修饰可以包括环3中的三个氨基酸插入。在对于方案(d)描述的任何实施方式中，氨基酸修饰可以包括环4中的三个氨基酸插入。因此，在某些实施方式中，氨基酸修饰包括环3内至少三个氨基酸的随机置換、环4内至少三个氨基酸的随机置换、环3中的至少ー个氨基酸插入和环4中的至少ー个氨基酸插入。在某些实施方式中，氨基酸修饰包括环3内至少三个氨基酸的随机置换、环4内至少三个氨基酸的随机置换、环3中的至少三个氨基酸插入和环4中的至少三个氨基酸插入。在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环3内三个氨基酸的随机置換、环4内三个氨基酸的随机置換、环3中的三个氨基酸插入和环4中的三个氨基酸插入。在任何所述的实施方式中，当CTLD是四联蛋白时，氨基酸修饰可以进ー步包括赖氨酸-148换成丙氨酸或在环4中的随机置換。
关于方案(e)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括将两个环合并成单个环的修饰，其中两个合并的环是环3和环4。在某些实施方式中，当组合文库的成员具有方案(e)的修饰CTLD时，氨基酸修饰包括环3内至少六个氨基酸的随机置换和环4内至少四个氨基酸的随机置換。在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环3内六个氨基酸的随机置换和环4内四个氨基酸的随机置换。在方案(e)的任何实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰可以进一歩包括脯氨酸-144的随机置换。在ー个具体实施方式
中，当CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰包括环3内六个氨基酸的随机置换、环4内四个氨基酸的随机置换和脯氨酸144的随机 置換，导致合并的环3和4氨基酸序列，包括，例如，NWEXXXXXXX XGGXXXN(SEQ ID NO:)，其中X是任意氨基酸，并且其中氨基酸序列SEQ ID NO:形成单个环区。因此，在ー个具体实施方式
中，组合文库的多肽成员包括序列NWEXXXXXXX XGGXXXN (SEQ ID NO:)，其中X是任意氨基酸，并且其中氨基酸序列SEQ ID NO:由合并的修饰环3和环4形成单个环。关于方案(f)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环4中的至少ー个氨基酸插入和环4内至少三个氨基酸的随机置換。在某些实施方式中，氨基酸修饰包括环4中的四个氨基酸插入。在一个实施方式中，氨基酸修饰包括环4中的至少四个氨基酸插入和环4内至少三个氨基酸的随机置换。在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环4中的四个氨基酸插入和环4内三个氨基酸的随机置換。关于方案(g)，组合文库的多肽成员包括修饰的环3和修饰的环5，其中修饰的环3包括五个氨基酸残基的随机化，修饰的环5包括三个氨基酸残基的随机化。在一个实施方式中，组合文库的多肽成员包括修饰的环3、修饰的环5和修饰的环4，其中对环4的修饰取消了血纤维蛋白溶酶原的结合。例如，当组合文库具有方案(g)的修饰CTLD、并且CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰可以进一歩包括调节CTLD血纤维蛋白溶酶原结合亲和カ的环4中的一个或更多个氨基酸修饰，例如，赖氨酸148置换成丙氨酸。因此，在某些实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰包括环3中至少五个氨基酸残基的随机置換、环5中至少三个氨基酸残基的随机置换和环4中赖氨酸148换成丙氨酸的置換。在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环3中五个氨基酸残基的随机置换和环5中三个氨基酸残基的随机置換，在另一具体实施方式
中，当CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰进一歩包括环4中赖氨酸148换成丙氨酸的置換。关于方案(h)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括至少ー个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸插入。在某些实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰可以进一歩包括调节CTLD血纤维蛋白溶酶原结合亲和カ的环4中的一个或更多个氨基酸修饰，例如，赖氨酸148置换成丙氨酸。在某些实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白时，组合文库的成员具有环3中的至少ー个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸的插入，以及环4中的赖氨酸148换成丙氨酸的置换。在ー个具体实施方式
中，氨基酸修饰包括环3中一个氨基酸残基的随机置换和六个氨基酸的插入。在ー个具体实施方式
中，当CTLD来自人四联蛋白时，组合文库的成员具有环3中的至少ー个氨基酸的随机置换和六个氨基酸的插入，以及环4中赖氨酸148换成丙氨酸的置換。在任意这些实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白时，置換中的一个是异亮氨酸140的置換。关于方案(i)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括环3中六个氨基酸的随机置换和环3中六个氨基酸的随机置換和一个氨基酸插入的混合。在一个实施方式中，该混合进ー步包括环3中的六个氨基酸的随机置换和两个氨基酸插入。因此，在一个实施方式中，氨基酸修饰包括环3中六个氨基酸的随机置換、环3中六个氨基酸的随机置換和一个氨基酸插入以及环3中六个氨基酸的随机置換和两个氨基酸插入的混合。在方案(i)的任何实施方式中，当CTLD来自人四联蛋白时，氨基酸修饰进ー步包括环4中赖氨酸148换成丙氨酸的置換。关于方案(i)，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的氨基酸修饰，其中氨基酸修饰包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中或者在环区段B(LSB)中的环5中的至少四个或更多个氨基酸插入。在其中组合文库包括对环4的一个或更多个氨基酸修饰(单独地或者与对CTLD其他区域的修饰组合)的实施方式中，某些修饰被设计成維持、调节或消除CTLD的金属离子结合亲和力。这些修饰影响CTLD的血纤维蛋白溶酶原结合活性(參见。例如，Nielbo等人，Biochemistry, 2004，43 (27)，pp 8636 - 8643 ;或 Graversen 1998)。文库的多肽成员可以包括CTLD的四个LSA环和LSB环(环5)的任意组合的ー个或更多个氨基酸修饰(例如，通过插入、取代、扩展或随机化)。因此，在本文所述各个实施方式的任一当中，随机化CTLD可以包括LSB环区的环(环5)中的一个或更多个氨基酸修饰，其为单独地或者与LSA环区(环1-4)的任何ー个、两个、三个或四个环中的ー个或多个氨基酸修饰组合。在一方面，本发明提供包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员的组合多肽文库，其中随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中四个环的至少ー个中的一个或更多个氨基酸修饰，以及在环区段B(LSB)中环(环5)中的一个或更多个氨基酸修饰，其中一个或更多个氨基酸修饰包括LSB氨基酸残基的随机化。根据在此所述的各个实施方式，组合文库的多肽成员可以在CTLD的环区(LSA和LSB)中的任意两个、三个、四个或五个环中具有一个或更多个氨基酸修饰(例如，对两个环、对三个环、对四个环、或对全部五个环的随机氨基酸修饰的任意随机组合)。组合文库的多肽成员可以进一歩包括对环区外部的CTLD区域，例如在α-螺旋或链中的氨基酸修饰(參见，例如图I)。在本发明进一步的实施方式中，CTLD环区可以延伸到以下非限定性实施例中详细说明的示例性构成物之外。在一方面，本发明还提供编码根据任ー上述方面和实施方式的组合多肽文库的多肽的核酸分子文库。在该方面一个实施方式中，本发明提供编码文库的多肽的核酸序列文库，其中多肽的CTLD已经根据方案(a)至(j)进行修饰。
如以下实施例中更充分地说明，已经通过ー种或更多种修饰方案(a)至(h)识别出许多种具有优选结合特性的多肽，包括，例如，SEQ ID N0S: 133-141，如图8所示。策略3在另一策略中，可以将结合IL-23R的已知多肽作为游离线性肽或作为使用半胱氨酸的ニ硫键限制环直接克隆到三聚结构域的N或C端末端上。也可以将能够结合IL-23R的单链抗体或结构域抗体克隆到三聚结构域的任一末端上。另外，可以将具有已知结合特性的肽直接克隆到TN CTLD环区的任ー个当中。用于作为ニ硫键限制环或作为抗体互补决定区的肽可以相当顺从于重新定位于人四联蛋白CTLD的环区中。对于所有这些构成物，作为单体结合，以及作为三聚物结合并阻断活性，当与三聚结构域融合时则可以进行測定。策略4在一些情形中，直接克隆具有结合活性的肽可能还不够，可要求进ー步的优化和 选择。例如，可以将已知与IL-23R结合的肽，例如但并不限于上文所述的那些肽移植到人四联蛋白的CTLD中。为了选择这些用于选择的肽的最优呈递，可以随机化一个或更多个侧翼(flanking)氨基酸，然后进行用于结合的噬菌体展示选择。而且，还可以将单独表现出有限或弱结合性的肽移植到含有另ー额外环的随机化的CTLD文库的环的ー个中，然后再次通过噬菌体展示选择提高的结合性和/或特异性。此外，对于通过晶体结构识别的多肽，其中特异性相互作用/结合氨基酸是已知的，可以考察非结合氨基酸的随机化，然后通过噬菌体展示选择提高的结合性和受体特异性。识别为造成结合的原因的IL-23配体区域还可以跨物种考察。可以保留保守氨基酸，同时可以对非物种保守位置的随机化和选择进行试验。处理方法本发明另一方面涉及防止表达IL-23R的细胞中IL-23R的活化的方法。该方法包括使细胞与本发明的IL-23R结合多肽接触，所述多肽包括三聚结构域和至少ー个特异性结合IL-23R的多肽。在该方面的一个实施方式中，该方法包括使细胞与本发明的三聚复合物接触。IL-23R结合多肽可以是IL-23R (或杂ニ聚受体)的拮抗剂，或者可以与IL-23R结合，使得可以将与上述三聚结构域有关的治疗剂局部输送至肿瘤、至炎症位点或者其他合意的呈递IL-23R的位置。在另一方面，本发明涉及通过给予被试者治疗有效量的IL-23R拮抗剂来治疗患有免疫疾病或肿瘤的被试者，上述拮抗剂包括多肽，该多肽具有三聚结构域和至少ー个特异性结合IL-23R的多肽。在该方面的一个实施方式中，该方法包括给予被试者本发明的三聚复合物。本发明的另一方面涉及组合疗法。本发明还提供包括IL-23R拮抗剂和治疗剂的制剂。据信这些制剂将会特别适合用于储存以及用于治疗给药。制剂可以通过已知技术制备。例如，制剂可以通过凝胶过滤柱上的缓冲液过滤来制备。在此所述的IL-23R拮抗剂和治疗剂可以在许多种治疗应用中使用。在这些应用当中有各种癌症的治疗方法。IL-23R拮抗剂和治疗剂可以根据已知方法给药，例如作为推注(bolus)或通过一段时间内连续输注的静脉内给药、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、ロ服、局部或吸入途径。任选地，给药可以通过使用各种市售装置的微泵输注进行。
给予IL-23R拮抗剂的有效剂量和时间表可以根据经验确定，进行这种确定在本领域的技术范围内。可以采用单次或多次剂量。目前据信单独使用拮抗剂的有效剂量或量可以是姆天大约lug/kg至大约100mg/kg体重或更多的范围。剂量的种间标度(scaling)可以根据本领域已知的方式进行，例如，如Mordenti等人，Pharmaceut.Res. ,8:1351(1991)中所公开。当采用IL-23R拮抗剂的体内给药时，正常的剂量可以从姆天大约10ng/kg变化到至多100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选大约I μ g/kg/天至10mg/kg/天，其取决于给药的路径。对于具体剂量和输送方法的指导提供于文献中(參见，例如U.S. Pat.Nos. 4，657，760; 5, 206，344; or 5，225，212)。本领域技术人员将会认识到，不同的制剂将会对于不同的治疗化合物和不同的疾病有效，例如，靶向ー种器官或组织的给药可能需要以不同于另ー器官或组织的输送。本领域技术人员将会理解，IL-23R拮抗剂必须给药的剂量将取决于以下因素而变化例如，将要接收IL-23R拮抗剂的哺乳动物、给 药路径以及给予哺乳动物的其他药物或疗法。预计在该方法中还可以采用额外的疗法。ー种或更多种其他疗法可以包括但不限于，给予放射疗法、细胞因子、生长抑制剂、化疗剂、细胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法呢基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂和依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂或任何其他本领域已知的提高癌细胞被IL-23R拮抗剂杀灭的易感性的药剂。用于化疗剂的制剂和剂量时间表可以根据制造商的说明书使用，或者由熟练从业者根据经验确定。用于该化疗的制剂和剂量时间表还见述于Chemotherapy ServiceEd. , M. C. Perry, ffilliams&ffilkins, Baltimore, Md. (1992)。化疗剂可以在给予 Apo2L 变体之前或之后给予，或者可以与其同时给予。本发明的多肽和治疗剂(和ー种或更多种其他疗法)可以同时(同吋)或顺序给予。在具体的实施方式中，同时给予本发明的非天然多肽或其多聚(例如三聚)复合物和治疗剂。在另ー实施方式中，在给予治疗剂之前给予多肽或三聚复合物。在另ー实施方式中，在给予多肽或三聚复合物之前给予治疗剂。给药之后，可以在体外对经处理的细胞进行分析。在已经有体内处理的情形中，可以熟练从业者公知的各种方式对经治疗的哺乳动物进行监控。例如，可以对肿瘤组织进行病理学考察以检测细胞死亡，或者可以分析血清用于免疫系统反应。药物组合物在再另ー个方面，本发明涉及包括治疗有效量的本发明的多肽以及药学可接受载体或赋形剂的药物组合物。如本文所用，“药学可接受载体”或“药学可接受赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂和生理学可相容的类似物。药学可接受载体或赋形剂的例子包括以下的ー种或更多种水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、こ醇和类似物以及其组合。在任何情况下，优选地在组合物中其包括等渗齐U，例如，糖，多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。也可以包括药学可接受的物质，例如润湿量或微量的辅助物质，例如提高抗体或抗体部分的存放时间和有效性的润湿或乳化齐U、防腐剂或缓冲剂。任选地，可以包括崩解剂，例如交联聚こ烯基吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。除赋形剂之外，药物组合物还可以包括以下的ー种或更多种载体蛋白质例如血清白蛋白、缓冲剂、结合剤、甜味剂和其他调味剂；着色剂和聚こニ醇。
组合物可以是许多种形式，例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(如可注射溶液和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸药、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式将取决于既定的给药途径和治疗应用。在一个实施方式中，组合物是可注射或可输注液体的形式，例如类似于用抗体对人进行被动免疫使用的那些形式。在一个实施方式中，给药方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)、在一个实施方式中，通过静脉内注射或输注给予多肽(或三聚复合物)。在另一实施方式中，通过肌肉内或皮下注射给予多肽或三聚复合物。其他适合用于该药物组合物的给药途径包括，但不限于，直肠、透皮、阴道、透粘膜或肠内给药。治疗组合物通常是无菌的，而且在制造和存储条件下稳定。组合物可以配置成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。无菌可注射溶液可以通过以下方法制备将所需量的适当溶剂中的活性化合物(即多肽或三聚复合物)与以上所列成分的一种或组合混合，之后根据需要，进行过滤灭菌。通常，分散液通过以下方法制备将活性化合物混合到含有基础分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌载体中。在制备无菌可注射溶液用的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由其预先无菌过滤的溶液生成活性成分加上额外所需成分的粉末。适当的流动性可以通过以下方法保持例如，使用涂层例如卵磷脂，在分散液的情况下保持所需的粒径，以及使用表面活性剂。可注射组合物的延时吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现。可用于治疗本文所述疾病的制品，例如包括IL-23R拮抗剂和治疗剂的试剂盒至少包括容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由许多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器上或者与其联接的标签指示用于治疗所选择疾病的配方。制品可以进一步包括有包括药学可接受缓冲剂例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液的容器。其可以进一步包括从商业和使用者角度而言合意的材料，包括其他具有使用说明书的缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和的药品说明书。制品还可以包括有具有其他上述活性药剂的容器。典型地，在制剂中使用适量的药学可接受盐，以使制剂等渗。药学可接受载体的例子包括盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制剂的PH有选为大约6至大约9，更优选大约7至大约7. 5。本领域技术人员显而易见的是，取决于例如给药途径和IL-23R拮抗剂和治疗剂的浓度，某些载体可以是更优选的。治疗组合物可以通过将具有适当纯度的所需分子与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，0sol，A.编著· (1980))混合来制备，其为冻干制剂、水溶液或水悬浮液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，其包括缓冲剂，例如Tris、HEPES, PIPES、磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八碳烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或卞醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯及吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨、酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，例如钠；和/或表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。这些载体的其他例子包括离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白质，例如人血清白蛋白，缓冲物质，例如甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯及吡咯烷酮和基于纤维素的物质。用于局部或者基于凝胶的形式的载体包括多糖，例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素钠、聚乙烯机吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物,聚乙二醇和木腊醇(wood wax alcohols)。对于所有给药形式，传统的贮存(depot)形式都是适用的。这些形式包括，例如，微胶囊、纳米胶囊、脂质体、硬膏剂、吸入形式、鼻喷剂、舌下片剂和缓释制剂。用于体内给药的制剂应当是无菌的。在冻干和重构之前或之后通过无菌滤膜进行过滤可以实现这一点。制剂可以冻干的形式储存，或者如果全身给药在溶液中储存。如果以冻干形式储存，典型地将其与用于在使用时用适当稀释剂重构的成分组合制剂。液体制剂的例子是皮下注射用的装在单剂量小瓶中的无菌、澄清、无色未压缩溶液。·治疗制剂通常置于具有无菌存取口的容器中，例如，具有可通过皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。制剂优选地作为以下形式给药重复的静脉内(i.v.)、皮下(S.C.)、肌肉内(i.rn.)注射或输注，或者适合于鼻内或肺内输送的气溶胶制剂(对于肺内输送，参见，例如，EP 257,956)。在此公开的分子还可以缓释(sustained-release)制剂的形式给药。合适的缓释制剂的例子包括含有蛋白质的固体疏水聚合物的半透性基质(matrices)，该基质是有形制品的形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，如 Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res. , 15:167-277 (1981)和Langer, Chem. Tech. , 12:98-105 (1982)所述，或聚(乙烯基醇)，聚丙交酉旨(U. S. Pat.No. 3，773，919、EP 58，481)、L-谷氨酸和Y -L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers, 22:547-556(1983))、非可降解乙烯-乙酸乙烯基酯(Langer等人，见上)、可降解乳酸-乙醇酸共聚物，例如Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球)和聚_D_(-) _3_轻基丁酸(EP 133,988)。多肽的制造本发明的多肽可以在任何适当的标准蛋白质表达系统中通过在表达的多肽的条件下培养用编码多肽的载体转化的宿主来表达。优选地，表达系统是所需蛋白质可以很容易地从中分离的系统。作为常规事宜，原核表达系统是可用的，因为可以获得高的蛋白质收率，以及有效的提纯和重折叠策略。因此，选择合适的表达系统(包括载体和细胞类型)是本领域技术人员已知晓的。类似地，一旦选定本发明的多肽的一级氨基酸序列，本领域技术人员可以很容易地设计出合适的编码所需氨基酸序列的重组DNA构成物，其考虑到以下因素例如，所选宿主中的密码子偏倚性、对宿主中分泌信号序列的需求、在信号序列中引入蛋白酶切割位点和类似因素。在一个实施方式中，分离出的多核苷酸编码与IL-23R特异性结合的多肽和三聚结构域。在一个实施方式中，分离出的多核苷酸编码与IL-23R特异性结合的第一多肽，以及三聚结构域。在某些实施方式中，与IL-23R特异性结合的多肽和三聚结构域在单个连续的多核苷酸序列中编码(基因融合)。在其他实施方式中，与IL-23R特异性结合的多肽和三聚结构域由不连续的多核苷酸序列编码。因此，在一些实施方式中，至少一个与IL-23R特异性结合的多肽和三聚结构域作为分别的多肽表达、分离和提纯，并融合在一起形成本发明的多肽。这些重组DNA构成物可以框内插入到数个适合于所选择宿主的表达载体的任一个中。在某些实施方式中，表达载体包括控制重组多肽构成物的强启动子。当适用重组表达策略产生本发明的多肽时，可以使用合适的本领域公知的标准方法对生成的多肽进行分离和提纯，并任选地进行进一步的处理，例如冻干。标准技术可以用于重组DNA分子、蛋白质和多肽的产生，以及用于组织培养和细胞转化。参见，例如 Sambrook,等人(见下)或 Current Protocols in MolecularBiology (Ausubel 等人编著，Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994)。提纯 技术通常根据制造商说明书进行，或者使用例如以下文献中描述的常规方法如本领域通常实施或如本文所述进行Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989) 除非给出具体的定义，本文所述的关于实验室方法和涉及分子生物学、生物化学、分析化学和药物/制剂化学的技术的命名是本领域公知和常用的。标准技术可以用于生化合成、生化分析、药物制备、制剂和输送以及患者的治疗。应当认识到可以将柔性的分子连接基在特异性结合单元和三聚结构域之间插入并将其共价连接。在某些实施方式中，连接基是大约1-20个氨基酸残基的多肽序列。连接基可以小于10个氨基酸，最优选为5、4、3、2或I个。在某些情形中，9、8、7、或6个氨基酸可以是适合的。在可用的实施方式中，连接基基本上是非免疫原性的，不容易蛋白水解切割，并且不包括已知与其他残基相互作用的氨基酸(例如，半胱氨酸残基)。以下说明还涉及连接(以下称“缀合(conjugate))有一个或多个化学基团的多肽和三聚多肽的制造方法。适用于这种缀合物的化学基团优选没有显著的毒性和免疫原性。化学基团任选地选择成产生可以在适于储存的条件下储存和使用的缀合物。许多种可以缀合在多肽上的示例性化学基团是本领域已知的，包括，例如，碳水化合物，例如在糖蛋白上天然存在的那些碳水化合物，聚谷氨酸，以及非蛋白质聚合物，多元醇(参见，例如U. S. Pat. No. 6，245，901)。例如，多元醇可以在一个或多个氨基酸残基(包括赖氨酸残基)处缀合在本发明的多肽上，如以上WO 93/00109所公开。使用的多元醇可以是任何水溶性的聚(烷撑氧)聚合物，并且可以具有线性或支化的链。适合的多元醇包括在一个或多个羟基位置处用化学基团，例如具有I至4个碳原子的烷基取代的那些。典型地，多元醇是聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，因此，为便于描述，余下的讨论涉及其中所用多元醇是PEG的示例性实施方式，并且将多元醇缀合到多肽上的过程称作“聚乙二醇化(pegylation) ”。但是，本领域技术人员将会认识到，也可以使用在此对于PEG所述的缀合技术来采用其他的多元醇，例如，聚(丙二醇)和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。Apo-2L的聚乙二醇化中使用的PEG的平均分子量可以变化，典型地范围在大约500至大约30，000道尔顿(D)。优选地，PEG的平均分子量为大约1，000至大约25，000D,更优选大约1，000至大约5，000D。在一个实施方式中，聚乙二醇化用平均分子量为大约1，OOOD的PEG进行。任选地，PEG均聚物是未取代的，但其也可以在一端用氨基取代。优选地，烷基是C1-C4烷基，最优选为甲基。PEG制剂是市售的，通常，适用于本发明的这些PEG制剂是根据平均分子量出售的非均一制剂。例如，市售的PEG (5000)制剂)通常含有分子量轻微变化的分子，通常为±500D。本发明的多肽可以进一步使用本领域已知的技术来修饰，例如，与小分子化合物缀合(例如化疗剂)；与信号分子(例如荧光团)缀合；与特异性结合对(例如生物素/抗生蛋白链菌素、抗体/抗原)缀合；或者通过糖基化、聚乙二醇化或进一步与稳定化结构域(例如Fe结构域)融合来稳定。
许多种对蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的。缀合有PEG的蛋白质的制造方法包括美国专利第4，179，337,4, 935，465和5，849，535号中所述的方法。通常将蛋白质经由蛋白质的一个或更多个氨基酸残基与聚合物的反应性端基共价连接，其主要取决于反应条件、聚合物的分子量等。具有反应性基团的聚合物在此称作活化聚合物。反应性基团与蛋白质上的游离氨基或其他反应性基团选择性反应。PEG聚合物可以随机或位点特异性的方式与蛋白质上的氨基或其他反应性基团连接。但应当理解到，为取得最佳结果，所选择反应性基团的类型和量以及所采用聚合物的类型将取决于所采用的具体蛋白质或蛋白质变体，以避免反应性基团与蛋白质上过多特别活性的基团反应。由于不可以彻底避免这一点，推荐使用每摩尔蛋白质通常大约O. I至1000摩尔、优选2至200摩尔的活化聚合物，其取决于蛋白质浓度。每摩尔蛋白质活化聚合物的最终量是在优化蛋白质循环半衰期的同时保持最佳活性的平衡，如果可能的话。术语“多元醇”在此使用时泛泛地指多元醇化合物。例如，多元醇可以是任何水溶性聚(烷撑氧)聚合物，并可以具有线性或支化链。优选的多元醇包括在一个或更多个羟基位置处被例如具有I至4个碳原子的烷基取代的那些。典型地，多元醇为聚(烷撑氧)，优选聚乙二醇(PEG)。但是本领域技术人员会认识到，也可以使用在此对于PEG所述的缀合技术采用其他的多元醇，例如，聚丙二醇和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。本发明的多元醇包括那些本领域公知的多元醇和那些可公开获得的，例如有市售来源的多元醇。而且，三聚结构域的N-端或C-端可以连接有其他的半衰期延长分子，其包括血清白蛋白结合肽、IgG-结合肽或结合FcRn的肽。应当注意到，本文所使用的小节标题仅仅出于组织目的，绝不应当理解为对所述内容进行限制。在此出于所有目的将本文引用的所有参考资料均全文并入作为引证。以下实施例仅仅是对本发明某些实施方式的说明，不应理解为对本发明加以限制，本发明由所附权利要求限定。实施例以下实施例中讨论的载体(pANA)源自之前所述的载体[参见US 2007/0275393]。一些载体序列在序列表中提供，本领域技术人员将能够得出在此说明书中提供的载体。PPhCPAB噬菌体展示载体(SEQ ID NO: 150)具有gill信号肽编码区，其已用连接基与编码ALQT(等)的hTN序列融合。CTLD区的C-端经由连接基与其余的gill编码区融合。在CTLD区内，产生核苷酸突变，该突变不改变编码蓄力，但产生适合于克隆含有改变的环区的PCR片段的限制位点。这些限制位点之间的环区部分被除去，使得所有的文库噬菌体将只表达重组体而不表达野生型四联蛋白。类似地设计鼠TN CTLD噬菌体展示载体。这些载体的另一实施方式是pANA27(SEQ ID NO: 164)，其中基因III C-端区已经被平截，并且hTN编码序列末端处的可抑制终止密码子已经被改变成编码谷氨酰胺。以类似的方式构建鼠载体pANA28(SEQ ID NO:165)。实施例I文库构建环I的突变和延长人四联蛋白的核苷酸和氨基酸序列以及环1、2、3、4和5(LSB)的位置示于图9中。对于人四联蛋白C-型凝集素结合结构域的1-2延长文库(“人1-2X”)，环I的编码序列修改成编码表2中所示的序列，其中五个氨基酸AAEGT(SEQ ID NO:)被七个由核苷酸NNK NNKNNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:)编码的随机氨基酸置换；N表示A、C、G或T ;K表示G或Τ。紧随环2之后的氨基酸精氨酸也通过在编码链中使用核苷酸NNK被完全随机化。将该氨基酸随机化是因为精氨酸与环I中的氨基酸接触，可能限制环I的随机化能达成的构象。此外，环4的编码序列改变成编码丙氨酸(A)而不是赖氨酸148(Κ)，以取消血纤维蛋白溶酶原结合，其已经显示依赖于环4的赖氨酸(Graversen等人，1998)。表2人四联蛋白(TN)环区的氨基酸 括号表示不视作环一部分的相邻氨基酸X=任意氨基酸
权利要求
1.一种多肽，其包括三聚结构域和至少一种与人IL-23R结合且不活化IL-23杂二聚受体的多肽序列。
2.根据权利要求I所述的多肽，其中所述多肽与人IL-12RPI或人IL-12RP 2中的至少一个不结合。
3.根据权利要求I所述的多肽，其中所述多肽与天然的人IL-23竞争结合人IL-23R。
4.根据权利要求I所述的多肽，其中所述三聚结构域包括在26、30、33、36、37、40、41、42、45、46、47、48、49、50和51位置处具有至多5个氨基酸置换的人四联蛋白三聚结构域(SEQ ID NO: 108)的多肽，其中三聚结构域形成三聚复合物。
5.根据权利要求I所述的多肽，其中所述三聚结构域包括选自以下的三聚多肽 hTRAF3[SEQ ID NO:_]、hMBP[SEQ ID NO:_]、hSPC300[SEQ ID NO:_]、hNEMO[SEQ ID NO:_]、hcubilin[SEQ ID NO:_]、hThrombospondins[SEQ ID NO: J 和人 SP-D 颈区，[SEQ IDNO:_]、牛 SP-D 颈区[SEQ ID N0:_]、大鼠 SP-D 颈区[SEQ ID N0:_]、牛胶固素颈区[SEQID NO: J ;牛胶原凝集素颈区[SEQ ID NO: J ;和人SP-D颈区[SEQ ID N0:_]o
6.根据权利要求I所述的多肽，其中所述人IL-23R包括SEQID N0:5。
7.根据权利要求I所述的多肽，其中所述至少一种与IL-23R结合的多肽与所述三聚结构域的N-端和C-端中的一端相连接，并且还包括位于所述N-端和C-端中另一端的炎症调节子。
8.根据权利要求I所述的多肽，其中所述至少一种与IL-23R结合的多肽包括C型凝集素样结构域(CLTD)，并且其中CTLD的环区段A或环区段B的环1、2、3或4中的一个包括与IL-23结合的多肽序列。
9.根据权利要求7所述的多肽，其中所述CTLD的多肽序列选自SEQID NO: 133,134,135、167、137、138、139、140 和 141。
10.根据权利要求I所述的多肽，其中所述与IL-23R结合的多肽与所述三聚结构域的N-端和C-端中的一端相连接，并且还包括位于N-端和C-端中另一端的炎症调节子。
11.根据权利要求I所述的多肽，其具有连接在N-端和C-端中的每一端上的与IL-23R结合的多肽，其中N-端处的多肽与C-端处的多肽是相同的或不同的。
12.根据权利要求I所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。
13.根据权利要求I所述的多肽，其中所述与IL-23R结合的多肽位于所述三聚结构域的N-端和C-端中的一端，并且还包括位于N-端和C-端中的另一端的与肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)结合的多肽序列。
14.根据权利要求I所述的多肽，其还包括与所述多肽共价连接的治疗剂。
15.一种三聚复合物，其包括三个如权利要求I所述的多肽。
16.根据权利要求15所述的三聚复合物，其中所述三聚结构域是四联蛋白三聚结构单元
17.一种防止在表达IL-23R的细胞中IL-23R被IL-23活化的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求15所述的三聚复合物接触。
18.—种药物组合物，其包括如权利要求16所述的三聚复合物和至少一种药学可接受的赋形剂。
19.一种治疗被试者中的免疫疾病的方法，其包括给予动物如权利要求18所述的药物组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其还包括同时或依序给予所述被试者炎症调节剂。
21.一种治疗动物中的癌症的方法，其包括给予对此有需求的被试者如权利要求18所述的药物组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其还包括同时或依序给予动物至少一种化疗剂或细胞毒剂。
23.根据权利要求I所述的多肽的制备方法，其包括 a)选择与IL-23R结合的第一多肽；和 b)将所述第一多肽与所述多聚结构域的N-端或C-端中的一端相融合。
24.根据权利要求23所述的方法，其还包括 a)选择其为炎症调节剂的第二多肽序列；和 b)将所述第二多肽与所述多聚结构域的N-端或C-端中的另一端相融合。
25.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤(a)中所述多肽经选择与IL-12RPI或IL-12RP 2中的至少一个不结合。
26.一种防止在表达IL-23R的细胞中的IL-23R的活化的多肽复合物的制备方法，其包括使三个根据权利要求23所述的多肽三聚。
27.—种介导免疫相关疾病的多肽的制备方法,其包括 a)生成包括CTLD的多肽的文库，所述CTLD包括至少一个随机化环区； b)从所述文库中选择第一多肽，其与IL-23R结合，但与IL-12RPI或IL-12R0 2中的至少一个不结合。
28.根据权利要求27所述的方法，其还包括(c)将所选择的多肽与多聚结构域的N-端或C-端连接。
29.一种与天然人IL-23竞争结合天然IL-23R的多肽，其中所述多肽不活化天然人IL-23R，并且与IL-12RP I或IL-12R0 2中的至少一个不结合。
30.根据权利要求30所述的多肽，其中所述多肽是在环区段A中的环1、2、3或4中的一个中或在环区段B中被修饰以结合IL-23R的CTLD。
31.根据权利要求30所述的多肽，其包括选自SEQID NO: 133、134、135、167、137、138、139、140和141的多肽。
32.—种分离的编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括如权利要求I所述的多肽。
33.一种载体,其包括如权利要求32所述的多核苷酸。
34.一种宿主细胞，其包括如权利要求34所述的载体。
全文摘要
结合IL-23R的多肽，其包括具有多聚例如三聚结构域的多肽和与IL-23R结合的多肽序列。多聚结构域可以源自人四联蛋白。IL-23R结合多肽抑制IL-23R被天然IL-23活化，可以用作许多种免疫相关疾病和癌症的治疗剂。描述了选择多肽和制备多聚复合物的方法。
文档编号C07K14/47GK102686606SQ201080056230
公开日2012年9月19日 申请日期2010年2月10日 优先权日2009年10月9日
发明者A.克雷茨-罗梅尔, D.奥尔迪恩, E.陈, K.鲍迪施, M.冈萨雷斯, M.卡波尔, M.维尔德 申请人:阿纳福公司