专利名称：一种多肽液相合成方法
技术领域：
本发明涉及多肽的合成，特别是涉及一种多肽液相合成方法。
背景技术：
随着科技水平的提高和人类对多肽的重视与研发，越来越多的多肽药物被开发应用于临床，为提高人类健康水平和治疗、预防疾病，提供高效安全的新型药物和疫苗。随着人们对多肽药物的需求逐渐增加，对化学家，特别是药物化学家而言，如何高效合成廉价的多肽药物，是一个亟待解决的技术问题。多肽的化学合成已经成为获得多肽药物的最重要途径。目前，液相合成多肽是合成短肽及片段肽的非常高效廉价的制备手段，而结合固相合成和液相合成优点的片段缩合工艺，与液相合成多肽的方法相比，则更是廉价且高效。但是，采用传统的液相合成方法合成多肽时，除了必须使用保护氨基酸、缩合剂和反应溶剂 (一般为有机溶剂)之外，还需要使用大量有机溶剂用于反应后的处理，常用的有机溶剂包括石油醚、乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等，易污染环境。由于必须使用大量有机溶剂，不仅提高了多肽的生产成本，而且造成非常严重的环境污染，因此，如何降低液相合成多肽的成本和减少对环境的污染，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种多肽液相合成方法，能够大幅度降低多肽的生产成本，并减少因大量使用有机溶剂而对环境造成的污染。本发明提供的多肽液相合成方法，包括以下步骤将氨基酸衍生物置于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中缩合，将反应溶液加入水中，析出固体后，经过滤、洗涤、干燥，得到中间体，脱除所述中间体的氨基保护基后加入水中，并调节溶液酸碱性，将脱除氨基保护基的中间体析出，干燥；将所述脱除氨基保护基的中间体与待缩合的氨基酸衍生物置于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中缩合，然后重复上述过程，直至得到全保护多肽，再脱除所述全保护多肽的保护基，得到目标多肽。在上述技术方案中，所述中间体的氨基保护基包括叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)，采用三氟乙酸(TFA)脱除叔丁氧羰基(Boc)，采用哌啶和DMF的混合溶液脱除 9-芴甲氧羰基(Fmoc)。在上述技术方案中，将脱除叔丁氧羰基(Boc)后的反应溶液加入水中，再通过弱碱来调节溶液酸碱性，使脱除叔丁氧羰基(Boc)的中间体析出，然后过滤、洗涤、干燥。在上述技术方案中，将脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)后的反应溶液加入水中，再通过弱酸来调节溶液酸碱性，使脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)的中间体析出，然后过滤、洗涤、干燥。与现有技术相比，本发明的优点如下本发明避免大量使用有机溶剂进行反应后的处理，改用水作为析出保护多肽中间体的溶剂。本发明适用于规模化生产小分子多肽，不需大规模改变原有工艺，只需在合成环节中采用易溶于水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，在脱除氨基保护基的过程中，选用易溶于水的三氟乙酸(TFA)来脱除叔丁氧羰基(Boc)，选用哌啶和DMF的混合溶液来脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)。因此，本发明不仅能够大幅度降低多肽的生产成本，而且能够减少因大量使用有机溶剂而对环境造成的污染。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本发明实施例提供的多肽液相合成方法，包括以下步骤将氨基酸衍生物置于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)中缩合，将反应溶液加入水中，析出固体后，经过滤、洗涤、干燥，得到中间体，脱除所述中间体的氨基保护基后加入水中，并调节溶液酸碱性，将脱除氨基保护基的中间体析出，干燥；将所述脱除氨基保护基的中间体与待缩合的氨基酸衍生物置于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)中缩合，然后重复上述过程，直至得到全保护多肽，再脱除所述全保护多肽的保护基，得到目标多肽。其中，所述中间体的氨基保护基包括叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)， 采用三氟乙酸(TFA)脱除叔丁氧羰基(Boc)，采用哌啶和DMF的混合溶液脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)。将脱除叔丁氧羰基(Boc)后的反应溶液加入水中，再通过弱碱来调节溶液酸碱性，使脱除叔丁氧羰基(Boc)的中间体析出，然后过滤、洗涤、干燥。将脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)后的反应溶液加入水中，再通过弱酸来调节溶液酸碱性，使脱除9-芴甲氧羰基 (Fmoc)的中间体析出，然后过滤、洗涤、干燥。反应过程的具体实施通式如下1号保护氨基酸+2号保护氨基酸一在二甲基甲酰胺(DMF)中缩合一全保护二肽溶液一加入纯水中析出全保护二肽(固体)一过滤洗涤得到全保护二肽(纯化的保护二肽)一干燥，脱除全保护二肽的氨基保护基一脱除氨基保护基的侧链保护二肽溶液一加入纯水中并用弱酸(或弱碱)调节溶液酸碱性使侧链保护二肽析出完全一过滤洗涤得侧链保护二肽一干燥，与3号保护氨基酸缩合一过程循环一得全保护多肽一脱除保护基一多肽下面通过4个实施例来详细阐述本发明的具体应用。实施例1、本发明在混合酸酐法合成胸腺五肽中的应用。步骤101:合成二肽。将21. 7g (IOOmmol)叔丁氧羰基缬氨酸(Boc-Val-OH)溶解在 IOOml DMF 中，-15 °C下加入30g(300mmol)N-甲基吗啉(NMM)后，滴加20. 4g(150mmol)氯甲酸异丁酯(ClCC^iBu)，搅拌反应30分钟后，加入39. 7g(110mmol)酪氨酸(卞醚)卞酯(H2N-Tyr (OBzl) -OBzl)，搅拌反应并撤去冷浴，用液相色谱HPLC检测反应完全 (Boc-Val-OH消耗完全)。将反应液在搅拌下徐徐加入2000ml冷水中搅拌20分钟，待产物析出完全，抽滤，滤饼用IOOml水洗涤两次，转入500ml圆底烧瓶中，在50°C下真空干燥4小
时，得5Ig粉状固体全保护二肽(Boc-Val-Try (OBzl) -OBzl)，收率91 %，纯度97% (面积归一)。步骤102:合成三肽。将50g全保护二肽(Boc-Val-Try(OBzl)-OBzl)溶解在50ml三氟乙酸中，室温下搅拌，反应至完全，将反应液在搅拌下徐徐加入IOOOml水中，然后在持续搅拌下慢慢加入36g碳酸钠至pH 7。抽滤，滤饼用50ml 5%碳酸氢钠水溶液洗涤两次后，40°C下真空干燥得40g粉状固体脱除氨基保护基的二肽(H2N-Val-Try (OBzl) -OBzl)，收率97%。将40g(124mmOl)N-叔丁氧羰基(卞酯)天冬氨酸溶解在IOOmlDMF中，加入 37g (372mol) NMM,冷却至-15°C，搅拌下慢慢滴入 33. 8g (248mmol) ClCC^iBu,搅拌反应 30 分钟后，将40g(87mmol)脱除氨基保护基的二肽(H2N-Val_Try (OBzl)-OBzl)溶解在50ml DMF 中，搅拌并徐徐升温至室温(21°C )。监测反应完全(H2N-Val-Try(OBzl)-OBzl消耗完全) 后，加入持续搅拌着的2000ml水中，搅拌20分钟，抽滤，滤饼用IOOml水洗涤两次，50°C下真空干燥4小时。得61. 2g白色粉状固体全保护三肽(BoC-ASp(0Bzl)-Val-Try (OBzl)-O Bzl)，收率 91.8%，纯度 95%。步骤103 合成四肽。将60g(78mmol)全保护三肽溶解在60ml三氟乙酸中，室温下搅拌反应至完全，将反应液在搅拌下徐徐加入IOOOml水中，然后在持续搅拌下，慢慢加入43g碳酸钠至pH 7。 抽滤，滤饼用80ml5%的碳酸氢钠水溶液洗涤两次后，40°C下真空干燥过夜得49. 8g粉状固体脱除氨基保护三肽(H2N-Asp (OBzl) -Val-Try (OBzl) -OBzl)，收率 95. 4%。将35. 7g (86mmol) N-叔丁氧羰基(2_ 氯苄氧羰基)赖氨酸(Boc-Lys (2-C1-Z) -OH) 溶解在100ml DMF中，加入26g (260mmol) N-甲基吗啉(NMM)，冷却至-15°C，搅拌下慢慢滴入23. 5g(172mmol)氯甲酸异丁酯(ClCC^iBu)，搅拌反应30分钟后将48g(72mmol)脱除氨基保护三肽(H2N-Asp (OBzl) -Val-Try (OBzl) -OBzl)溶解在60mlDMF所得的溶液加入，搅拌并徐徐升温至室温(20°C )。用液相色谱监测反应完全(H2N-Asp (OBzl)-Val-Try (OBzl)-O Bzl消耗完全)后，加入持续搅拌着的2500ml水中，搅拌20分钟，抽滤，滤饼用IOOml水洗涤两次，50°C下真空干燥4小时，得70. 3g白色粉状固体全保护四肽(Boc-LysO-Cl-Z)-As P(OBzl)-Val-Try (OBzl)-OBzl)，收率 94. 9%，纯度 96%。步骤104 合成五肽。将70g(66mmol)全保护四肽溶解在90ml三氟乙酸中，室温下搅拌反应至完全，将反应液在搅拌下徐徐加入IOOOml水中，然后在持续搅拌下慢慢加入碳酸钠65g至pH值为7。抽滤，滤饼用80ml 5%碳酸氢钠水溶液洗涤两次后，40°C下真空干燥过夜，得56. 2g 粉状固体脱除氨基保护四肽(H2N-Lys (2-C1-Z) -Asp (OBzl) -Val-Try (OBzl) -OBzl)，收率 88. 6%，纯度 94. 6%。将24. 2g(68mmol)N-苄氧羰基(硝基)精氨酸(Z-Arg(NC^)-OH)溶解在 60ml DMF中，加入20. 5g (200mmol) N-甲基吗啉(NMM)，冷却至-15 °C，搅拌下慢慢滴入 13. 9g(102mmOl) ClCC^iBu,搅拌反应30分钟后将55g(57mmol)脱除氨基保护四肽(H2N_Ly s (2-C1-Z) -Asp (OBzl) -Val-Try (OBzl) -OBzl)溶解在 80ml DMF 所得的溶液加入，搅拌并徐徐升温至室温(22°C )。监测反应完全(H2N-Lys(2-Cl-Z)-Asp (OBzl)-Val-Try (OBzl)-OBz 1消耗完全)后，加入持续搅拌着的2000ml水中，搅拌20分钟，抽滤，滤饼用IOOml水洗涤两次，50°C下真空干燥4小时，得67. Ig白色粉状固体全保护五肽(Z-Arg (N02)-Lys Q-Cl-Z) -Asp (OBzl)-Val-Try (OBzl)-OBzl)，收率 90. 6%，纯度 97%。将67g(51mmol)全保护五肽悬浮在1000ml甲醇和200ml醋酸混合溶剂中，加入7g 10%钯碳，置入2L高压反应釜中，通氢气(10kg/cm2)，氢化反应至原料消耗完全。泄压，滤除催化剂，母液减压浓缩至^K)ml，冷却至室温，在剧烈搅拌下缓缓加入预先冷却至0°C的2000ml乙醚中，析出粗肽，抽滤，真空干燥(25°C)过夜，得33. 4g块状固体，产率95. 0%，纯度 89%。(4)纯化将30g粗肽溶解在60ml醋酸中，用制备高效液相色谱纯化(参数 100 X 250mm C18，10 μ，监测波长2Mnm，梯度洗脱2 %乙腈 40 %乙腈，30分钟)。收集纯品馏分，减压浓缩至20 25mg/ml，冻干，得22g白色雪状固体胸腺五肽纯品，总收率 32. 3%，纯度 98. 6%。实施例2、本发明在DIC(N，N' - 二异丙基碳二亚胺)法合成胸腺五肽(Fmoc法) 中的应用。步骤201:合成二肽。将30g(88mmol)N-芴甲氧羰基缬氨酸(Rnoc-Val-OH)在 200mlDMF 中与 11. 9g(88mmol)2-羟基苯并二氮唑(HOBt)及 13. 3g (106mmol) N, N ‘ -二异丙基碳二亚胺(DIC)在-5 °C下反应30分钟，然后加入31. 0g(106mmol)酪氨酸(叔丁氧基)叔丁酯(H2N-Try(0tBU)-0tBU)，搅拌下徐徐升温至室温，反应2小时后监测反应完全(Fmoc-Val-ΟΗ消失)，将反应液加入1500ml水中，析出全保护二肽(固体， Fmoc-Val-Try (OtBu) -OtBu)，过滤洗涤、干燥，得无水的全保护二肽。步骤202:合成三肽。将步骤201中得到的全保护二肽粉末溶解在IOOml 20%哌啶/DMF溶液中反应10分钟，脱除氨基保护基，监测反应完全，反应液加入IOOOml水中，析出固体脱除氨基保护二肽(H2N-Val-Try (OtBu)-OtBu)，过滤，滤饼用5%稀氨水洗涤，真空干燥过滤，得 30g白色粉状固体脱除氨基保护二肽(H2N-Val-Try (OtBu)-OtBu)，76mmol，收率86. 9%， 纯度95%。在100ml DMF中加入37. 5g(91mmol)N-芴甲氧羰基(叔丁氧基)天冬氨酸 (Fmoc-Asp (OtBu) -0H)与 12. 2g (91mmol) HOBt 及 17. 2g (136mmol) DIC 在-10°C下反应 50 分钟，然后加入30g(76mmol)脱除氨基保护二肽(H2N-Val-Try (OtBu)-OtBu)，搅拌反应并慢慢升温至室温，使反应完全(脱除氨基保护二肽消失)，将反应液加入IOOOml水中，析出全保护三肽(Fmoc-Asp (OtBu) -Val-Try (OtBu) -OtBu)，过滤，滤饼用50ml水洗涤两次，真空干燥4小时，将所得白色粉末溶解在IOOml 20%哌啶/DMF溶液反应脱除氨基保护基，反应液加入IOOOml水中，析出脱除氨基保护三肽固体(H2N-Asp (OtBu) -Val-Try (OtBu) -OtBu)，过滤，用5%氨水洗涤，干燥，得到无水的39. 2g白色粉末脱除氨基保护三肽(H2N-Asp (OtBu)-Val-Try (OtBu) -OtBu)，收率 91.5%，纯度 96 %。步骤203:合成四肽。38. 8g (83mmol) N-芴甲氧羰基(叔丁氧羰基)赖氨酸(Fmoc-Lys (Boc) -OH)溶解在 120ml DMF 中，_15°C下加入 11. 2g (83mmol) HOBt 及 15. 7g(124mmol) DIC 并搅拌反应 3 小时， 然后加入 39g(69mmol)脱除氨基保护三肽(H2N_Asp (OtBu)-Val-Try (OtBu)-OtBu)，搅拌反应并慢慢升温至室温，使反应完全，将反应液加入1500ml水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤，真空干燥6小时，得62. 3g(61mmol)白色粉末全保护四肽(Fmoc-Lys (Boc)-Asp (0 tBu)-Val-iTry (OtBu)-OtBu)，收率 88. 4%，纯度 95. 2%。将该白色粉末溶解在 IOOrnl 20% 哌啶/DMF溶液反应20分钟，反应液加入1500ml水中，析出的白色固体经抽滤，洗涤(5%氨水)，40°C下真空干燥过滤，得47. 2g白色粉末脱除氨基保护四肽(H2N-Lys (Boc) -Asp (OtBu )-Val-Try (OtBu) -OtBu)，收率 97.7%，纯度 95.1%。
步骤204:合成五肽。37g (70mmol) N-芴甲氧羰基精氨酸(Fmoc-Arg (Pbf) -OH)溶解在 100ml DMF 中，-10 °C 下加入 11. 4g(74mmol)H0Bt 及 13. 2g(106mmol)DIC 反应 3 小时，然后加入 47. Og (59. 3mmol)脱除氨基保护四肽(H2N-Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Val-Try (OtBu) -OtBu)， 缓缓升温至室温，使反应完全，将反应液加入1200ml水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用 IOOml水洗涤，35°C下真空干燥过滤，得70. 3g(54. Ommol)白色粉末全保护五肽(Fmoc-Arg ( Pbf) -Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Val-Try (OtBu) -OtBu)，收率 91.2%。将70g(53. 8mmol)全保护五肽与哌啶/DMF溶液反应，脱除氨基保护基，将反应液加入水中，析出脱除氨基保护五肽(H2N-Arg (Pbf) -Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Val-Try (OtBu)-OtBu)，过滤洗涤，干燥，再将脱除氨基保护五肽与150ml三氟乙酸反应，室温下搅拌反应2 小时，脱除所有保护基，反应液加入1500ml乙醚中，析出白色胶状固体，用乙醚洗涤3次，离心沉淀，所得固体在室温下真空干燥过夜，得30. Ig(44. 2mmol)白色块状的胸腺五肽粗肽 (H2N-Arg-Lys-Asp-Val-Try-0H)，收率82. 1 %，纯度85%。将该胸腺五肽粗肽溶解在140ml 醋酸中，用制备高效液相色谱纯化，冻干，得21. 3g(31. 3mmol)雪状白色固体胸腺五肽纯品 (H2N-Arg-Lys-Asp-Val-Try-0H)，总收率四· 6%，纯度 98. 3%。实施例3、本发明在片段法合成胸腺肽α K28肽)中的应用，合成胸腺肽α 1的 1 5 片段(Fmoc-Ser (OBzl) -Asp (OBzl) -Ala-Ala-Val-OH)。步骤301 制备二肽叔丁酯(H2N-Ala-Val_0tBu)。31. Ig (IOOmmol) N-芴甲氧羰基丙氨酸(Rnoc-Ala-OH)溶解在 150ml DMF 中，_5°C 下加入 20. 2g(150mmol)H0Bt 及 18. 9g(150mmol)DIC 反应，然后加入 19. Ig(IlOmmol)缬氨酸叔丁酯(H2N-Val-0tBu)，搅拌反应3小时，反应完全(Fmoc-Ala-OH消失)，将反应液加入1500ml水中，析出全保护二肽(Fmoc-Ala-Val-OtBu)，过滤洗涤，干燥，得白色粉状固体 42. lg(90mmol)，收率90%，纯度95%。将该白色粉状固体溶解在100ml 20%哌啶/DMF反应完全，反应液加入1000ml水中，析出固体二肽叔丁酯(H2N-Ala-Val-0tBu)，抽滤，滤饼用5%稀氨水50ml洗涤两次，真空干燥过夜，得21. 2g(86mmol)白色粉状固体二肽叔丁酯 (H2N-Ala-Val-0tBu)，收率 95 %，纯度 95 %。步骤302 制备三肽叔丁酯(H2N-Ala-Ala-Val_0tBu)。在100ml DMF 中溶解 32. Ig(103mmol)N-芴甲氧羰基丙氨酸(Rnoc-Ala-OH)，然后冷却至-10°c，加入 20. 8g(154mmol)H0Bt 和 19. 4g(154mmol)DIC 反应 30 分钟后，加入 21. 0g(85mmol) 二肽叔丁酯(H2N-Ala-Val-0tBu)，搅拌下徐徐升温至室温，3小时后反应完全。将反应液加入1500ml水中析出全保护三肽(Fmoc-Ala-Ala-Val-OtBu)，抽滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得到43. Ig(SOmmol)白色粉状固体，收率94%。将该白色粉状固体溶解在100ml 20%哌啶/DMF溶液反应，反应完全后加入2000ml水中析出，抽滤，滤饼用5%稀氨水洗涤，真空干燥过夜，得到24. 9g(78. 9mmol)三肽叔丁酯(H2N-Ala_AIa-Val-OtBu)，收率 98%。步骤303 制备四肽叔丁酯(H2N_Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-OtBu)。将42. 3g(96mmol)芴甲氧羰基(苄基)天冬氨酸(Fm0c-Asp(OBzI)-OH)溶解在 130ml DMF 中，冷却至 _10°C后加入 16g(118mmol)H0Bt 和 14. 9g(118mmol)DIC 搅拌反应 40 分钟，然后加入三肽叔丁酯(H2N-Ala-Ala-Val-0tBU)粉末，搅拌反应并缓慢升温至室温，4小时后监测反应完全。反应液加入2000ml水中析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥过滤，得到 52g(70mmol)粉状白色固体全保护四肽(Fmoc-Asp (OBzl)-Ala-Ala-Val-OtBu)，收率88.6%，纯度93%。将该粉状白色固体溶解在IOOml 20%哌啶/DMF反应40分钟，反应液加入水中析出固体，抽滤，滤饼用水洗涤后真空干燥过夜，得到35. 4g(68mmol)四肽叔丁酯(H2N-Asp (OtBu)-Ala_Ala-VaI-OtBu)，收率 97. 1%,纯度 92%。步骤304 制备五肽片段(Fmoc-Ser (OBzl) -Asp (OBzl) -Ala-Ala-Val-OH)。34g(82mmol)芴甲氧羰基(苄基)丝氨酸(Fmoc-Ser (OBzl)-OH)溶解在 IOOml DMFJnA 16. 6g(123mmol)H0Bt，溶液冷却至-10°C后加入 15. 5g (123mmol) DIC 反应，搅拌反应1小时，然后加入四肽叔丁酯(H2N-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-OtBu)固体，搅拌反应并缓缓升温至室温，继续反应3小时后监测反应完全。将反应液加入2000ml水中析出白色固体， 抽滤，滤饼用水洗涤，真空干燥12小时后得到57g(62mmol)干燥固体全保护五肽(Fmoc-S er (OBzl)-Asp (OBzl)-Ala_Ala-VaI-OtBu)，收率 91. 1%,纯度 91 %。将该干燥固体溶解在 IOOml三氟乙酸中反应1小时，反应液加入水中析出固体，抽滤，滤饼用水洗涤三次，真空干燥48小时，得到51. 8g(59. 9mmol)白色粉状固体五肽片段(Fmoc-Ser (OBzl) -Asp (OBzl) -A la-Ala-Val-OH)，收率96.6%，纯度90%。该白色粉状固体五肽片段用于合成胸腺肽α 。实施例4、本发明在合成美容多肽阿基瑞林(六肽) (Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-ME)中的应用。步骤401:合成二肽。16g(50mmol)叔丁氧羰基(硝基)精氨酸(Boc-Arg (N02)-0H)溶解在 50ml DMF 中， 加入IOg(IOOmmol)NMM，冷却至-15°C，缓慢滴力口 14g(IOOmmol) ClC02%i，搅拌反应1小时后，加入25g(115mm0l)硝基精氨酰胺(H2N_Arg (而幻-NH2)，搅拌下徐徐升温至室温再反应 4小时，反应完全，反应液加入IOOOml水中析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤后真空干燥， 得到 22g(42. 4mmol)白色粉末全保护二肽(Boc-Arg(N02)-Arg(N02)-NH2)，收率84. 8%。将 22g全保护二肽二肽溶解在50ml三氟乙酸中反应1小时，反应液加入水中，用浓氨水调节溶液PH至8 9，析出白色固体，抽滤，滤饼用5%稀氨水洗涤后真空干燥过夜，得到很易碾碎的白色固体 16g(38. 2mmol)脱除氨基保护二肽(H2N_Arg (N02)-Arg (N02)-NH2)，收率 90%。步骤402:合成三肽。12g (48. 7mmol)叔丁氧羰基(硝基)精氨酸(Boc-Gln-OH)溶解在 50ml DMF 中，加入 10g(100mmol)NMM，冷却至-15 °C，缓慢滴加 Hg(IOOmmol)Cia^iBu,搅拌反应 1 小时后，加入16g脱除氨基保护二肽(H2N-Arg (N02) -Arg (N02) -NH2)，搅拌下徐徐升温至室温再反应5小时，反应完全，反应液加入IOOOml水中析出灰白色固体全保护三肽 (Boc-Gln-Arg (N02) -Arg (N02) -NH2)，抽滤，滤饼用水洗涤后真空干燥，得到21g灰白色粉末全保护三肽，33. 3mmol，收率86. 4%。将2Ig全保护三肽溶解在50ml三氟乙酸中反应1 小时，反应液加入水中，用浓氨水调节溶液PH至8 9，析出白色固体脱除氨基保护三肽 (H2N-Gln-Arg (N02) -Arg (N02) -NH2)，抽滤，滤饼用5 %稀氨水洗涤后真空干燥过夜，得到 16. 4g (30. 2mmol)脱除氨基保护三肽(H2N-Gln_Arg (N02) -Arg (N02) -NH2)，收率 90. 7 %。步骤403:合成六肽。将25g(39mmol)三肽片段(Ac-Glu (Cffizl)-Glu (Cffizl)-Met-OH)(预先合成)溶解在 50ml DMFdOml DMS0)中，力卩入 10g(100mmol)NMM，冷却至-15 °C，缓慢滴加Hg(IOOmm0I)Cia^iBu,搅拌反应1. 5小时后，加入16g脱除氨基保护三肽 (H2N-Gln-Arg (N02) -Arg (N02) -NH2)，搅拌下徐徐升温至室温再反应8小时，反应完全，将反应液加入 1500ml 水中，析出全保护六肽(Ac-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Met-Gln-Arg(N02) -Arg(N02)-NH2)，抽滤，滤饼用水洗涤后，真空干燥，得到^g(25. 2mmol)灰白色固体全保护六肽，收率 80%，纯度 82%。将 25g(21.6mm0l)全保护六肽(Ac-Glu (OBzl)-Glu (OBzl) -Met-Gln-Arg(N02)-Arg(N02)-NH2)溶解在甲醇醋酸混合溶剂(600ml甲醇，IOOml醋酸) 中，用钯碳催化加氧，脱除保护基，得到目标产物，用乙醚析出粗肽。用大孔树脂纯化，得到 13g(14. 6mmol)满足需求的纯化肽(Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2)，总收率四.2%， 纯度91%。 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
权利要求
1.一种多肽液相合成方法，其特征在于包括以下步骤将氨基酸衍生物置于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中缩合，将反应溶液加入水中，析出固体后，经过滤、洗涤、干燥，得到中间体，脱除所述中间体的氨基保护基后加入水中，并调节溶液酸碱性，将脱除氨基保护基的中间体析出，干燥；将所述脱除氨基保护基的中间体与待缩合的氨基酸衍生物置于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中缩合，然后重复上述过程，直至得到全保护多肽，再脱除所述全保护多肽的保护基，得到目标多肽。
2.如权利要求1所述的多肽液相合成方法，其特征在于所述中间体的氨基保护基包括叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)，采用三氟乙酸(TFA)脱除叔丁氧羰基(Boc)， 采用哌啶和DMF的混合溶液脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)。
3.如权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于将脱除叔丁氧羰基(Boc)后的反应溶液加入水中，再通过弱碱来调节溶液酸碱性，使脱除叔丁氧羰基(Boc)的中间体析出，然后过滤、洗涤、干燥。
4.如权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于将脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc) 后的反应溶液加入水中，再通过弱酸来调节溶液酸碱性，使脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)的中间体析出，然后过滤、洗涤、干燥。
全文摘要
本发明公开了一种多肽液相合成方法，涉及多肽的合成，该方法包括以下步骤将氨基酸衍生物置于N，N-二甲基甲酰胺中缩合，将反应溶液加入水中，析出固体后，经过滤、洗涤、干燥，得到中间体，脱除所述中间体的氨基保护基后加入水中，并调节溶液酸碱性，将脱除氨基保护基的中间体析出，干燥；将所述脱除氨基保护基的中间体与待缩合的氨基酸衍生物置于N，N-二甲基甲酰胺中缩合，然后重复上述过程，直至得到全保护多肽，再脱除全保护多肽的保护基，得到目标多肽。本发明避免大量使用有机溶剂进行反应后的处理，改用水作为析出保护多肽中间体的溶剂，能大幅度降低多肽的生产成本，并减少因大量使用有机溶剂而对环境造成的污染。
文档编号C07K1/06GK102199188SQ20111005193
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者刘大学 申请人:兰州凯博生物化学技术有限公司