一类新的纳米金复合底物T-Au的制备和用途的制作方法

专利名称：一类新的纳米金复合底物T-Au的制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类纳米金复合底物T-Au的制备及其在分子检测等领域的用途。
背景技术：
纳米金原指直径在I-IOOnm尺寸的微小金颗粒，一般以分散在水中溶胶形式存在，因此通常称为胶体金。胶体金具有表面积效应，小尺寸效应，微观量子隧道效应等独特的物理化学性质以及良好的生物相容性，非常适合于生物大分子的标记和检测。胶体金用于生物检测已有近一个世纪的历史，上世纪八十年代初免疫金银染色(immuno-gold-siver staining, IGSS)技术的出现是胶体金应用于生物技术的里程碑。该技术首先用胶体金标记待测抗体或抗原，然后在体系中引入银离子。小尺寸效应使胶体金颗粒具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而银颗粒又可以催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹胶体金颗粒积聚成团状银壳，形成几乎肉眼可见的黑色颗粒，用普通的电镜甚至肉眼即可观测。IGSS的检测成本远低于荧光检测和化学发光检测，与色原检测相比又显著提高了灵敏度，因此很快得到广泛应用。胶体金存在一些固有的缺点颗粒大小不一、易凝集、与生物分子以静电吸附结合，标记不稳定并且假阳性率高等。为了克服这些缺点，近年来美国Nanoprobes公司开发了一种新型的纳米金颗粒并命名为“Nanogold”，该颗粒是以一个包含大约67个金原子簇化合物为核心的复合体，通过位于其表面的金原子与三芳基磷配基或卤化物离子结合而形成稳定的纳米金分子，其中心粒径仅1.4·，表面不带电荷，在溶液中程离散状态。这种新型的纳米金与胶体金相比有诸多优点(1)颗粒小而且均勻一致、标记密度高、穿透性好; (2)经过特定基团修饰后可以与生物大分子以共价键结合，使得标记分子高度稳定；(3)颗粒表面不带电荷，因此不易凝集，适用于很宽的PH值范围和离子强度等等。由于Nanogold 有如此多的优点，因此迅速应用于原位杂交、免疫组化、Western等生物检测众多领域。生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和组织芯片等，是一项集合了生命科学、微电子学、物理学、化学和材料科学等众多学科的生物高新技术，是高效大规模获取核酸蛋白质等生物信息的重要手段，在基因表达谱研究、疾病分子检测和大规模药物筛选等众多领域具有广阔的应用前景。荧光检测法是生物芯片的常规检测方法，即荧光色素化合物(Cy3、Cy5 等)直接或间接标记在核酸或蛋白质分子上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。 该方法的最大缺点是检测仪器价格昂贵，从而限制了生物芯片的推广和应用，尤其是在中小型医疗机构的推广和应用。为了解决这个问题，近几年已经有研究小组将IGSS技术应用于基因芯片和蛋白芯片的可视化检测，从而避免使用荧光扫描仪，大幅降低了检测成本。其中基因芯片金标银染检测方法已经获得国家专利(一种基因芯片的纳米金标记银染检测方法，ZL专利号02113147.幻。该方法的缺点是检测灵敏度不高，不能完全满足疾病分子检测领域的要求，进一步提高可视化检测灵敏度是生物芯片推广应用中面临的重要课题。为了提高可视化检测灵敏度，本实验室将免疫组化中广泛应用的TSA技术与IGSS 相结合应用于生物芯片的检测。TSA(tyramine signal amplification，酪胺信号放大)由Bobrow等人于1989年首次提出的。信号放大分子酪胺是一个酚基化合物，可以作为HRP的作用底物。TSA的原理是在辣根过氧化物酶的催化下，大量连接半抗原的酪胺分子沉积。以基因芯片为例，TSA-IGSS的检测过程如下首先将点制了探针阵列的基因芯片与待检核酸样本杂交，然后依次加入链酶亲和素标记的HRP、生物素标记的酪胺、链酶亲和素标记的纳米金。最后加入银增强试剂显色。TSA-IGSS比IGSS的检测灵敏度提高10-100倍，目前已经申请专利(一种基因芯片的TSA-纳米金标记银染检测法，专利号200610135832. χ)。该方法的缺点是检测过程相对比较繁琐，能够找导致纳米金直接沉积的新的HRP底物是目前所需要解决的问题。

发明内容
本发明的目的利用化学方法，提供一类能使HRP直接催化纳米金颗粒沉积，从而显著提高金标记银染色可视化检测灵敏度的纳米金复合底物T-Au。本发明的另一目的在于提供所述的纳米金复合底物T-Au的制备方法。本发明的另一目的在于提供所述的纳米金复合底物T-Au在生物芯片等分子检测领域的用途。本发明的目的是通过如下技术方案实现的。本发明提供的能使HRP直接催化纳米金颗粒沉积的纳米金复合底物T-Au，该复合底物是Nanogold-NHS的NHS基团与化合物T形成酰胺键而得到的复合物。本发明提供所述的纳米金复合底物T-Au的制备方法，包括如下步骤1)制备取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/ μ L溶液；取化合物 T以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液、；将上述两种溶液混合，室温避光反应浊。即可得到纳米金复合底物T-Au。2)保存产物溶液以1 50稀释(稀释液lXPBS+0. 5%BSA+0. 05%吐温+0. 5%
硅胶)，稀释液4°C保存。本发明提供所述纳米金复合底物T-Au的用途。将T-Au应用于基因芯片和蛋白芯片的可视化检测并比较与IGSS、TSA-IGSS的检测灵敏度。本发明提供的纳米金复合底物T-Au的优势纳米金复合底物T-Au制取方法简单， 产物稀释后即可使用，HRP可直接催化纳米金复合底物T-Au从而导致大量纳米金颗粒沉积，与IGSS以及TSA-IGSS检测方法比较，该复合底物既可以实现生物芯片的高灵敏度可视化检测，又简化了操作步骤并且有利于实际操作。


图1 为纳米金复合底物T-Au的结构示意图。图2 化合物T的结构示意图。图3 :Tyr-Cy3荧光检测，T_Au、TSA_IGSS、IGSS可视化检测灵敏度比较结果及点阵布局。① IgGdOy g/mL)；② IgGQy g/mL)；③ IgG(0· 4 μ g/mL)；④ IgG (0· 08 μ g/mL)；图4 =T-Au用于蛋白芯片可视化检测结果及点阵布局。
IgG阳性对照；①BSA ； ②百日咳FHA ；③腮腺炎病毒NP蛋白。图5 =T-Au用于基因芯片可视化检测结果及点阵布局。 和①为标志列；②鼠疫杆菌特异性探针片断。图6 =Tyr-Cy3荧光检测与T-Au可视化检测比较结果及点阵布局。 和①为标志列；②和③炭疽杆菌特异性探针片断。图7:化合物T(酪胺，C12，C18，C24)与纳米金偶联所形成的几种纳米金复合底物可视化检测灵敏度比较结果及点阵布局。①IgG(10yg/mL)；②IgGQy g/mL)； ③ IgG(0. 4μ g/mL)；④ IgG (0. 08 μ g/mL)；⑤ IgG (0. 016μ g/mL)。图8 =IGSS, T-Au, TSA-IGSS蛋白芯片可视化检测流程图。 图9 :9a,9b,9c和9d为化合物T的结构式。
具体实施例方式实施实例1.纳米金复合底物T-Au的制备和保存1)制备取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/ μ L溶液；取化合物 T以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液；将上述两种溶液混合，室温避光反应浊。即可得到纳米金复合底物T-Au。2)保存产物溶液以1 50稀释(稀释液lXPBS+0. 5%BSA+0. 05%吐温+0. 5%
硅胶)，稀释液4°C保存。2.纳米金复合底物T-Au用于可视化检测灵敏度评价1) Tyr-Cy3荧光检测，IGSS、TSA-IGSS、T-Au可视化检测灵敏度比较芯片制备在醛基修饰的玻璃片上点制不同浓度的IgG(10yg/mL，2yg/mL， 0.4yg/ml,0. 08 μ g/mL)，在4°C下放置12h后用封闭液(1 XPBS+25%小牛血清)封闭2h， 然后用PBST(lXPBS+0. 5%吐温)洗三次晾干，4°C保存备用。Tyr-Cy3荧光检测流程取已制备好的芯片依次加入HRP标记的抗人IgG抗体(二抗，1 5000)和Tyr-Cy3 (1 500)，每步反应条件为37°C温育30min并用PBST洗涤三次， 荧光扫描显色观察结果。IGSS的检测流程取已制备好的芯片加入Nanogold标记的抗人IgG抗体(二抗， 1 500)37°C温育30min并用PBST洗涤三次，然后加入银增强试剂(A液+B液)显色。TSA-IGSS的检测流程取已制备好的芯片依次加入HRP标记的抗人IgG抗体(二抗，1 5000)、生物素标记的酪胺(1 500)、链酶亲和素标记的Nanogold(1 50)，每步反应条件为37°C温育30min并用PBST洗涤三次，然后加入银增强试剂(A液+B液)显色。T-Au的检测流程取已制备好的芯片依次加入HRP标记的抗人IgG抗体(二抗， 1 5000)和T-Au (1 400)，每步反应条件为37°C温育30min并用PBST洗涤三次，然后加入银增强试剂(A液+B液)显色。结果显示纳米金复合底物T-Au可视化检测灵敏度与Tyr_Cy3荧光检测、TSA-IGSS 可视化检测灵敏度相当，比IGSS可视化检测灵敏度高(10-20)倍3.纳米金复合底物T-Au蛋白芯片检测中的应用芯片制备在醛基修饰的玻璃片上点制I gG (10 μ g/mL)阳性对照；白喉毒素 (50 μ g/mL)；百日咳 FHA(125 μ g/mL)；风疹病毒 El 蛋白(0. 5mg/mL) ；HBsAg(0. 5mg/mL)； 乙脑病毒E蛋白(lmg/mL)；腮腺炎病毒NP蛋白(lmg/mL) ；BSA(lmg/mL)阴性对照。在4°C下放置12h后用封闭液(1 X PBS+25 %小牛血清)封闭2h，然后用PBST (1 X PBS+0. 5 %吐温)
洗三次晾干4°C保存备用。蛋白芯片检测流程取已制备好的芯片依次加入样本血清(1 5稀释)、HRP标记的抗人IgG抗体(二抗，1 5000) ,T-Au (1 400)，每步反应条件为37°C温育30min并用 PBST洗涤三次，然后加入银增强试剂(A液+B液)显色。结果显示纳米金复合底物T-Au可应用于蛋白芯片可视化检测，并且可以同时检测血清中的不同抗体。5.纳米金复合底物T-Au基因芯片检测中的应用在醛基修饰的玻璃片上点制相应探针微阵列，在4°C干燥环境下放置24h后备用。 取已制备好的基因芯片与鼠疫杆菌核酸样本扩增PCR产物杂交(用于扩增的模板浓度为 104CFU/mL，引物生物素标记)，于45°C杂交反应lh，处理之后备用。检测流程取已杂交好的芯片加入HRP标记链酶亲和素(1 500)37°C温育30min 后用PBST洗涤三次，然后加入T-Au (1 400) 37°C温育30min后用PBST洗涤三次，加入银增强试剂(A液+B液)显色。6.基因芯片Tyr-Cy3荧光显色与纳米金复合底物T-Au可视化显色比较在醛基修饰的玻璃片上点制相应探针微阵列，在4°C干燥环境下放置24h后备用。 取已制备好的基因芯片与炭疽杆菌核酸样本扩增PCR产物杂交(用于扩增的模板浓度为 104CFU/mL，引物生物素标记)，于45°C杂交反应lh，处理之后备用。Tyr-Cy3荧光检测流程取已杂交好的基因芯片加入HRP标记链酶亲和素 (1 500)37°C温育30min后用PBST洗涤三次，然后加入Tyr-Cy3(l 500)，37°C温育 30min后用PBST洗涤三次，荧光扫描显色观察结果。纳米金复合底物T-Au用于基因芯片可视化检测流程取已杂交好的基因芯片加入HRP标记链酶亲和素(1 500)37°C温育30min后用PBST洗涤三次，然后加入 T-Au (1 400)，37°C温育30min后用PBST洗涤三次，然后加入银增强试剂(A液+B液)显色。7.化合物T (酪胺，C12，C18，C24)与纳米金偶联所形成的几种纳米金复合底物可视化显色灵敏度比较化合物T (C12，C18，C24)的合成化合物T(C12)的合成取137mg酪胺以乙腈溶解，取己二酸活泼酯408mg以二氯甲烷溶解，取23aiig己二胺以甲醇溶解。将酪胺溶液滴加到己二酸活泼酯溶液中室温反应池。将反应产物溶液滴加到己二胺甲醇溶液中，室温反应池，停止反应，将产物柱层析(乙酸乙酯甲醇，4 1 ；Rf = 0. 5)分离纯化即可得化合物T (C12)。化合物T(ClS)的合成取137mg酪胺以乙腈溶解，取十二烷二酸活泼酯508mg以二氯甲烷溶解，取23aiig己二胺以甲醇溶解。将酪胺溶液滴加到十二烷二酸活泼酯溶液中室温反应2h。将反应产物溶液滴加到己二胺甲醇溶液中，室温反应池，停止反应，将产物柱层析(乙酸乙酯甲醇，5 I5Rf = 0. 4)分离纯化即可得化合物T(ClS)。化合物T(C24)的合成取137mg酪胺以乙腈溶解，取十二烷二酸活泼酯508mg以二氯甲烷溶解，取400mg十二烷二胺以甲醇溶解。将酪胺溶液滴加到十二烷二酸活泼酯溶液中室温反应池。将反应产物溶液滴加到己二胺甲醇溶液中，室温反应池，停止反应，将产物柱层析(乙酸乙酯甲醇，5 I5Rf = 0. 6)分离纯化即可得化合物T (C24)。纳米金复合底物T-Au (酪胺，C12，C18，C24)的制备取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/μ L溶液；取化合物T(C12， C18，C24)以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液、；将上述两种溶液混合，室温避光反应浊。 即可得到纳米金复合底物T-Au (C12，C18，C24)。芯片制备在醛基修饰的玻璃片上点制不同浓度的IgG(10yg/mL，2yg/ml， 0· 4μ g/mL，0. 08μ g/mL，0. 016 μ g/mL)，在 4°C下放置 12h 后用封闭液(1 XPBS+25%小牛血清)封闭2h，然后用PBST(lXPBS+0. 5%吐温)洗三次晾干4°C保存备用。T-Au (酪胺，C12，C18，C24)的检测流程取已制备好的芯片加入HRP标记的抗人 IgG抗体(1 5000) 37°C温育30min后用PBST洗涤三次，然后在芯片不同区域内分别加入 T-Au (酪胺，1 400)，T-Au (C12，1 400) T-Au (C18,1 400) T-Au (C24,1 400)，37°C温育30min后用PBST洗涤三次，然后加入银增强试剂(A液+B液)显色。结果显示纳米金复合底物T-Au(酪胺，C12，C18，C24)用于生物芯片检测灵敏度相当。
权利要求
1.一类新的纳米金复合底物是由一分子Nanogold-NHS的NHS的基团与化合物T形成酰胺键而得到的化合物。如附图la，附图lb。
2.如权利要求1所述化合物T的结构式为附图2a，附图2b。
3.如权利要求2所述m= 2时T的结构为附图9a。m = 2，η = 4，t = 6时T的结构为附图9b。m = 2，n = 10, t = 6时T的结构为附图9c。m = 2，n = 10, t = 12时T的结构为附图9d。
4.如权利要求1所述的一类新的纳米金复合底物T-Au的制备方法，包括如下步骤 取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/ μ L溶液；取化合物T以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液；将上述两种溶液以1 10体积混合，室温避光反应浊。即可得到纳米金复合底物T-Au。产物4°C保存。
5.如权利要求1所述的一类新的纳米金复合底物T-Au可以应用于基因芯片、蛋白芯片等的高灵敏度检测，以及纳米金免疫诊断试剂的研制。
全文摘要
本发明涉及一类新的纳米金复合底物T-Au的制备方法及用途。纳米金复合底物是由Nanogold-NHS的NHS的基团与化合物T的氨基反应形成酰胺键而得到的化合物。其制备方法是将Nanogold-NHS与化合物T分别溶解后在室温下避光反应2h。产物4℃保存。纳米金复合底物T-Au在HRP催化下可导致大量纳米金颗粒沉积，可应用于生物芯片等的高灵敏度检测，以及新型免疫诊断试剂的研制。
文档编号C07F1/12GK102329331SQ20111008438
公开日2012年1月25日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者刘琪琦, 张敏丽, 张春, 王升启 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所