专利名称：抗b细胞淋巴瘤的双特异性抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及编码包含人源⑶19 抗体可变区与人源CD3抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的药物用途和该融合蛋白的治疗方法。
背景技术：
B细胞淋巴瘤是一种发病率较高的恶性肿瘤，严重危害人类健康，目前其抗体药物疗法已经被肯定，已有抗体药物如美罗华(Rituximab)等上市。针对B细胞淋巴瘤的抗体药物靶点主要是B淋巴瘤细胞特异表达增高的⑶分子，如⑶19、⑶20和⑶22等。针对这些⑶分子的抗体药物能够诱导B淋巴瘤细胞凋亡，从而达到治疗疾病的目的。免疫疗法也是一种比较常用的抗肿瘤治疗方法，其中细胞免疫在抗肿瘤方面具有十分重要的作用。免疫细胞中的τ淋巴细胞是杀伤肿瘤的重要细胞，其表面有CD3、白介素-2受体等表面分子。研究表明，CD3抗体和白介素-2配体可以有效地激活T淋巴细胞， 诱导其活化和增殖，从而提高杀伤肿瘤细胞的活性，这些已被应用于肿瘤的免疫疗法。然而，由于缺乏靶向肿瘤细胞的功能，因此激活的T淋巴细胞难以十分有效地富集于肿瘤部位，导致其杀伤肿瘤效能不足。因此，可以把CD3抗体等能够激活T淋巴细胞的分子与靶向 B淋巴瘤细胞的分子如CD19抗体融合，这样就能够有效地在B淋巴瘤细胞周围富集和激活 T淋巴细胞，从而大大提高了杀伤肿瘤细胞的效果。人体内天然抗体由重链和轻链组成，其中的重链和轻链可变区结构在抗原的识别中发挥关键作用。近年来人源抗体的出现，克服了原来鼠源抗体疗法引起的HAMA(Human antimousantibody)发生，大大提高了临床治疗效果。人源抗体相对与人源化的抗体相比， 不但具有全人的氨基酸序列，而且空间结构上也与人抗体结构一致，其免疫原性很低，因此比鼠源改造的人源化的抗体更有优势，具有极大的临床应用前景。鉴于此，本发明提供了一种双特异性抗体，其不但能够靶向B淋巴瘤细胞，而且能够激活T淋巴细胞，大大提高了杀伤B淋巴瘤细胞的效果。而且，此双特异性抗体为全人源蛋白序列，具有极低的免疫原性，极大地提高了本发明双特异性抗体的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种包含⑶19scFv和⑶3scFv的人源双特异性抗体蛋白，其在体内外都具有良好的生物活性和稳定性，能够结合CD19和CD3阳性的细胞，并且能够激活人T淋巴细胞，杀伤B淋巴瘤细胞。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体。该抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，由来自抗CD19抗体的可变区与抗CD3抗体的可变区构成，之间由一条连接肽(Linker)相连。其中，上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体中的CD19抗体可变区由轻链可变区 (VL)和重链可变区(VH)融合而成。⑶19抗体可变区可表示为⑶19scFv，⑶19抗体可变区的轻链可变区和重链可变区的排列方式，可以为VL-VH，也可以为VH-VL。进一步的，轻链可
3变区(VL)和重链可变区(VH)间由连接肽连接形成抗体可变区。常用的连接肽的氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS，可表示为(G4S)3。优选的，上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体中的CD19抗体可变区的氨基酸序列如 SEQID NO. 2 所示。其中，上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体中的CD3抗体可变区由轻链和重链融合而成。表示为CD3scFv。⑶3抗体可变区可表示为⑶3scFv，⑶3抗体可变区的轻链可变区和重链可变区的排列方式，可以为VL-VH，也可以为VH-VL。进一步的，轻链可变区(VL)和重链可变区(VH) 间由连接肽连接。常用的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，可表示为(G4S)3。优选的，上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体中的CD3抗体可变区的氨基酸序列如 SEQ IDN0. 4 所示。其中，上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体中连接肽的目的在于提供更好的柔韧性，以避免CD19scFv和CD3scFv或者在scFv内的轻链可变区和重链轻链可变区间形成结构上的空间位阻，因此连接肽氨基酸序列和长度均可以有一定的变化。常用的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，可表示为(G4S)3。进一步的，上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；或在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得的与SEQ ID No. 8所示的双特异性抗体的功能相同或相似的抗体。本发明还提供了编码上述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体的核苷酸序列。进一步的，编码抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体的核苷酸序列(1)核苷酸序列为SEQ ID NO. 7所示；或者为SEQ ID NO. 7的简并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与(1)中的核苷酸序列编码功能相同或相似的抗体。本发明还提供了含有上述编码抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体的核苷酸序列的基因载体。该载体可选自质粒或病毒。本发明还提供了含有上述基因载体的宿主细胞。该宿主细胞可选自真核细胞或原核细胞。本发明另外还提供了上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体在制备抗B细胞淋巴瘤药物中的应用。本发明另外还提供了一种抗B细胞淋巴瘤药物组合物，是由上述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体为活性成分。当然，其可以添加药用辅料。所述抗B细胞淋巴瘤药物组合物的剂型可以是注射剂、粉针剂、冷冻干燥剂等常用剂型。进一步的，上述抗B细胞淋巴瘤药物组合物还包括至少一种其他的抗B细胞淋巴瘤药物。上述抗B细胞淋巴瘤药物组合物还可以用于和其他治疗方法一起治疗B细胞淋巴瘤，所述其他治疗方法选自化学疗法、放射疗法、基因疗法。本发明设计并构建了一种含有⑶19scFv和⑶3scFv的双特异性抗体，使其具有足够的靶向性和生物活性。更重要的是，此双特异性抗体具有全人源序列，有效地避免了临床治疗应用中的HAMA发生，从而能够更有效地减少了耐药现象的发生，提高了药物的利用效率和治疗效果。人体内的天然抗体是由重链和轻链组成，其中重链可变区和轻链可变区结构对于抗原的结合特别重要。本发明的研究表明，由重链可变区和轻链可变区组成的融合蛋白 (即单链抗体)仍然具有良好的抗原结合活性。此单链抗体分子量仅约25kD，体积仅为天然抗体的1/6，因此具有较好的组织渗透能力。天然抗体可变区是由重链可变区和轻链可变区两条肽链组成的异二聚体，而scFv是由重链可变区和轻链可变区组成的融合单链，可能会形成空间位阻，难以形成有效的抗原结合构象。因此，需要在重链可变区和轻链可变区之间插入一条柔性连接肽，从而保证单链抗体能够形成正确的空间构想，具备有效的抗原结合活性。此外，为保证双特异性抗体的两个不同的scFv具有各自的抗原结合活性，还需在两个scFv之间插入一条柔性连接肽，以此避免两个scFv之间可能形成的空间位阻。为了能够有效纯化本发明的双特异性抗体，本发明在双特异性抗体的N端融合了 His6和Flag标签蛋白，由于Flag标签氨基酸序列(DYKDDDDK)包含有肠激酶(EK酶)的酶切位点DDDDK，因此可在利用His6和Flag标签纯化蛋白后，进一步利用EK酶切掉His6和 Flag标签，以获得不含标签蛋白的双特异性抗体。本发明的双特异性抗体的设计也可以用于其他抗肿瘤抗体的scFv与CD3scFv融合，所形成的双特异性抗体一方面可以发挥靶向肿瘤细胞的作用，另一方面可以激活T淋巴细胞，从而发挥其杀伤肿瘤靶细胞的作用。本发明描述的双特异性抗体可通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如 《分子克隆》第三版(Jowph Sambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。所用的 ⑶19单链抗体、⑶3单链抗体和连接肽可分别是1.⑶19人源抗体的可变区，表示为⑶19scFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2 所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2.⑶3人源抗体的可变区，表示为⑶3scFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4 所示，编码核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。3. CD19scFv和CD3scFv之间的所用的连接肽，表示为(G4S) 3，氨基酸序列如序列表中SEQ IDN0. 6所述，编码核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。上述双特异性抗体的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。所需编码⑶19scFv 和⑶3scFv的DNA序列分别来自天然的人源⑶19和⑶3抗体。将编码上述scFv的DNA序列用PCR获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或DNA片段。在编码上述双特异性抗体的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证双特异性抗体能够从细胞中分泌。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。本发明双特异性抗体发挥作用的区段为两个独立的scFv，因此在保证scFv完整的情况下，scFv两端的氨基酸序列和长度可以有一定的变化而不减弱其生物活性，它们都属于本发明的范畴。本发明双特异性抗体中scFv中轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的排列方式，可以是VL-VH，也可以是VH-VL，两个scFv的排列方式可以是⑶19scFv_⑶3scFv，也可以是 CD3scFv-CD19scFv，它们都属于本发明的范畴。本发明双特异性抗体内部连接肽的目的在于提供更好的柔韧性，以避免CD19scFv 和CD3scFv形成结构上的空间位阻，因此连接肽氨基酸序列和长度均可以有一定的变化， 它们都属于本发明的范畴。在完成含编码上述双特异性抗体的DNA序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些双特异性抗体的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等。由于原核细胞表达双特异性抗体容易形成包涵体，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达双特异性抗体的哺乳动物细胞有多种，例如CHO细胞、293细胞、NSO细胞、COS细胞等，它们都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述双特异性抗体基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。一种较佳的蛋白表达方法是利用稳定转染的宿主细胞表达。例如，用含有新霉素 (Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株；又例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR) 基因的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX) 的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株。哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如昆虫细胞、酵母、细菌等也可以用于表达本发明的双特异性抗体，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是容易形成包涵体，因此需要进一步蛋白复性。由于本发明的双特异性抗体含有His和Flag标签，因此双特异性抗体表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中的双特异性抗体蛋白浓度，也可以用镍柱或免疫亲和层析法来纯化所表达的双特异性抗体。此外，与其它蛋白纯化方法如离子交换层析等联合使用，可进一步纯化本发明的双特异性抗体。从重组体培养液中获得相应的双特异性抗体后，可以用细胞ELISA和流式细胞术来检测其对CD19和CD3的结合活性，实验结果表明，本发明的双特异性抗体能够结合CD19 阳性的细胞如Raji细胞，也能够结合CD3阳性的细胞如Jurkat细胞，因此本发明所构建的双特异性抗体可以有效靶向B淋巴细胞和T淋巴细胞。应用纯化方法获得高纯度的双特异性抗体后，可在体外检测其对T淋巴细胞的激活作用，还可利用体外细胞模型和体内动物模型来检测其对B细胞淋巴瘤生长的抑制作用。在体外实验中，可用MTT等方法检测本发明双特异性抗体对CD3表达阳性的外周血T 淋巴细胞的增殖作用，或用MTT等方法检测其对D19表达阳性的淋巴瘤细胞如Raji细胞的生长抑制作用。在体内实验中，上述CD19阳性的肿瘤细胞可以用来构建小鼠肿瘤模型，肿瘤模型可通过腹背侧皮下、腹腔、尾静脉等方法构建，以用于观察双特异性抗体的抗肿瘤或抗转移实验。本发明的双特异性抗还可以病毒载体来运载和表达，这些病毒载体包括但不 P艮 1 _ _ 本(adenoviral vectors) > 1 ^； ^ ^ ΙΦ (adeno-associated viral vectors)、反转录病毒载体(retroviral vectors)、单纯疱疫病毒载体(herpes simplexvirus-based vectors)、t曼病毒载体(lentiviral vectors)。本发明还提供了含有本发明双特异性抗体和药用载体的药物组合物。该药物组合物可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。本发明的药物组合物，其中还包括任何一种或几种其它的具有协同作用的抗肿瘤药物，所述组合物可以和其它治疗方法一起治疗肿瘤，所述其它治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法。本发明的有益效果在于提供了一种人源的⑶19scFv-⑶3scFv双特异性抗体，可以结合CD19和CD3阳性的细胞，并且能够激活人T淋巴细胞，从而达到突出的抗B细胞淋巴瘤的作用，具有很好的应用前景
图1.⑶19-⑶3双特异性抗体的结构模式图。图 2. CD19scFv-CD3scFv/pcDNA3. 1 (+)重组载体示意图。图3.重组载体双酶切鉴定。1，重组载体；2，载体经HindIIIAhoI双酶切；M，分子 Marker0图4.免疫印迹检测CHO细胞分泌表达双特异性抗体。1，未转染的CHO细胞培养上清；2 稳定转染的CHO细胞培养上清。图5.亲和层析获得高纯度的双特异性抗体蛋白。1，纯化前；2，纯化后。图6.流式细胞术检测双特异性抗体对Raji的结合效应。A，PBS ；B, CD19scFv-CD3scFv(10ug/ml)。图7.流式细胞术检测双特异性抗体对Jurkat的结合效应。A，PBS ；B, CD19scFv-CD3scFv(10ug/ml)。图8.本发明双特异性抗体对T淋巴细胞的激活作用G^1)。图9.本发明双特异性抗体对Raji细胞的体外生长抑制作用。(T细胞与Raji细胞数目比为10 1 ；96h)。图10.本发明双特异性抗体抑制小鼠体内移植瘤的生长的实验结果，纵坐标为肿瘤体积。1 :PBMC+PBS ;2 :PBMC+CD19scFv-CD3scFv(0. lug) ;3 PBMC+CD19scFv-CD3scFv(Iug) ；4 =PBS ；5 :CD19scFv_CD3scFv(Iug)。图11.双特异性抗体抑制小鼠体内移植瘤的生长从而延长延长荷瘤小鼠的生存时间的实验结果，横坐标为时间，纵坐标为小鼠数目。1 :PBMC+PBS ；2 PBMC+CD19scFv-CD3scFv (0. lug) ；3 :PBMC+CD19scFv-CD3scFv (lug) ；4 :PBS ；5 CD19scFv-CD3scFv(lug)。图12.本发明双特异性抗体对小鼠重要脏器的组织的影响。结果表明其对小鼠重要脏器的组织形态无明显影响。
具体实施例方式以下实例对本发明所涉及的双特异性抗体的构建、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容和用途并不仅限于实例的范畴。
实施例一克隆编码双特异性抗体的DNA序列及构建重组载体本发明中编码双特异性抗体的基因片段可以通过经典的分子生物技术获得，并且该基因序列可针对哺乳表达系统优化，以便得到更佳的表达量。双特异性抗体基因片段与相应的表达载体重新连接可获得重组载体，以适应哺乳细胞的表达和筛选。1、获得编码⑶19-⑶3双特异性抗体的基因片段本发明中的人源CD19抗体可变区基因和人源CD3抗体可变区基因分别是通过筛选全人源抗体库所得(全人源抗体库构建方法可Sl^derlind E， et al. Recombininggermline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibodylibraries. Nat Biotechnol. 2000 Aug ； 18(8) :852-6.等已知技术实现)。本优选实施例所构建的双特异性抗体的结构见附图1。本发明的双特异性抗体由⑶19scFv和⑶3scFv融合而成，在⑶19scFv与⑶3scFv之间有一包含连续3个(GGGGS) 重复序列的连接肽。双特异性抗体N端加上了白介素2(ILD的分泌信号肽以及和His6和 Flag标签，不但能够保证其分泌到哺乳细胞外，而且还能够利用亲和层析纯化，并能够进一步利用EK酶切除标签而只保留活性双特异性抗体蛋白。本发明中CD19-CD3双特异性抗体基因片段是通过上述几个片段由拼接PCR扩增所得。2、表达双特异性抗体重组载体的构建编码本发明优化融合蛋白的基因克隆是由上述包括信号肽的双特异性抗体片段通过HindIII和XhoI酶切位点插入到质粒载体pcDNA3. 1(+) (Invitrogen公司)的HindIII 和)(h0I酶切位点所得(见图2)。该重组质粒利用CMV启动子来表达融合蛋白，并包含SV40 的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保证其表达最佳的表达量。该重组质粒还包括氨苄青霉素 (Ampicillin)抗性基因以利于在细菌中的复制，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于稳定转染细胞的筛选。将编码所述双特异性抗体的重组质粒转化E. coli (DH5 α )后加入LB 培养基培养过夜，以获取大量重组质粒的拷贝，用质粒提取试剂盒(Qiagen公司)提取质粒后进行酶切和测序鉴定(见图3)，所获得的编码双特异性抗体的DNA序列如SEQ ID Ν0. 7 所示。实施例二本发明双特异性抗体在细胞中的表达和纯化本发明中双特异性抗体是在CHO细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用镍柱亲和层析的方法纯化所得。1、双特异性抗体在CHO细胞中的瞬时表达获得高纯度编码双特异性抗体的重组质粒后，利用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒anvitrogen公司)将重组质粒转染CHO细胞(ATCC)，在无血清培养基中培养三天后收集CHO细胞上清液，可以用免疫印迹检测双特异性抗体的表达(见图4)。此方法可用于快速地获取少量的双特异性抗体蛋白，其浓度可以用ELISA法定量检测，所用一抗可以为抗His6或Flag抗体。2、双特异性抗体在CHO细胞中的稳定表达将编码双特异性抗体的重组质粒用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒 (Invitrogen公司)转染CHO细胞，在无血清培养基中培养两天后加入新霉素，采用有限稀释法进行细胞克隆培养，大约14天后挑取新霉素抗性的细胞克隆进行细胞的扩大培养，并选取状态良好的细胞在液氮中冷冻保存。稳定转染后的CHO细胞可以在滚动细胞培养瓶中进一步扩大培养以生产大量的双特异性抗体蛋白，此方法可用于获取大量的双特异性抗体蛋白，其浓度可以用ELISA法定量检测，所用一抗可以为抗His6或Flag抗体。3、双特异性抗体的纯化包含双特异性抗体的细胞培养液可采用镍柱亲和层析的方法进行纯化(见图5)。 将镍层析柱以缓冲液平衡后，将超滤器浓缩过的CHO细胞培养液上清液进样，以A^O (nm) 进行监测，用清洗液洗至未结合的蛋白全部被洗脱，然后用洗脱液洗脱结合蛋白。纯化后的双特异性抗体可以用ELISA法检测浓度。包含双特异性抗体的洗脱液经脱盐纯化后可以冻干，冻干后可置于-20 V长期保存。实施例三本发明双特异性抗体与细胞的体外结合实验本发明的双特异性抗体在体外可以能够结合相应的靶细胞。本发明以Raji细胞作为CD19阳性的细胞，以Jurkat细胞作为CD3阳性的细胞，并以本发明中的双特异性抗体来检测其细胞结合活性。1、流式细胞术检测双特异性抗体与Raji细胞的结合活性双特异性抗体与Raji细胞混合于的牛血清白蛋白(BSA)和0. 02%叠氮钠的 PBS(染色缓冲液)中，至冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，然后与鼠抗His6 抗体至冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤后，与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗鼠抗体在染色缓冲液中冰上孵育30分钟。细胞用流动缓冲液洗涤2次，并用流式细胞仪 (ESP Elite, Coulter)进行分析，以平均对数荧光乘以阳性群体的百分数计算平均荧光强度。结果显示，本发明的双特异性抗体能够结合CD19阳性的Raji细胞(见图6)。2、流式细胞术检测双特异性抗体与Jurkat细胞的结合活性此实例过程与上述实例基本相同。双特异性抗体与Jurkat细胞至冰上孵育1小时后，用PBS缓冲液洗涤2次，然后继续与鼠抗His6抗体至冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤后，与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗鼠抗体在染色缓冲液中冰上孵育30分钟。细胞用流动缓冲液洗涤2次，并用流式细胞仪(ESP Elite,Coulter)进行分析，以平均对数荧光乘以阳性群体的百分数计算平均荧光强度。结果显示，本发明的双特异性抗体能够结合⑶3阳性的Jurkat细胞(见图7)。实施例四本发明双特异性抗体的体外肿瘤细胞生长抑制活性检测本发明利用外周血T淋巴细胞和Raji细胞作为细胞模型来检测双特异性抗体对 Raji细胞的体外生长抑制作用。1、双特异性抗体有效激活T淋巴细胞抽取健康自愿者的外周血，用T淋巴细胞分离液分离外周血T淋巴细胞。在96孔细胞培养板内接种τ淋巴细胞细胞(1 X IO4/孔，200ul)，将不同浓度的双特异性抗体加入到细胞培养孔。继续培养细胞48小时后，每孔加20ul浓度为5mg/ml的MTT噻唑蓝溶液。 继续孵育4小时后，吸弃细胞培养孔内的上清液，每孔加150ul 二甲基亚砜(DMSO)，振摇10 分钟，使结晶物充分融解。用酶联免疫检测仪测定各孔490nm波长的吸收值，绘制细胞生长曲线。结果显示，本发明的双特异性抗体能够有效激活T淋巴细胞(见图8)。2、双特异性抗体有效抑制Raji细胞的体外生长在96孔细胞培养板内接种Raji细胞(1 X IO4/孔，200ul)，待细胞贴壁后，按照T 淋巴细胞与Raji细胞10 1的比例，将外周血T淋巴细胞加入到培养板内，同时将不同浓
9度的双特异性抗体加入到细胞培养孔。继续培养细胞96小时后，每孔加20ul浓度为5mg/ ml的MTT噻唑蓝溶液。继续孵育4小时后，吸弃细胞培养孔内的上清液，每孔加150ul 二甲基亚砜(DMSO)，振摇10分钟，使结晶物充分融解。用酶联免疫检测仪测定各孔490nm波长的吸收值，绘制细胞生长曲线。结果显示，本发明的双特异性抗体能够有效诱发T淋巴细胞对Raji细胞的生长抑制(见图9)。实施例五本发明双特异性抗体对小鼠体内移植瘤生长抑制的检测本发明利用Raji细胞和人外周血单个核细胞PBMCs来接种SCID小鼠以检测双特异性抗体对Raji细胞的体内生长抑制作用，并观察重要脏器的组织形态。1、双特异性抗体可以抑制小鼠体内移植瘤的生长5-6周龄雌性非孕SCID小鼠(体重为18_20g/只)分为2组。一组腹背侧接种 Raji细胞(1 X IO5/只)，另一组腹背侧混合接种Raji细胞(1 X IO5/只)和非激活的人外周血单个核细胞PBMCs (IX IO6/只)。单独Raji接种组接受vehicle(PBS)或1 μ g双特异性抗体(CD19/CD3BsAb)处理；Raji和PBMCs混合接种组接受vehicle (PBS)、0· 1 μ g或 ι μ g双特异性抗体处理；处理方案为连续尾静脉注射7次(ι次/天，IOOuI/只)。肿瘤体积计算采用如下公式(宽径2X长径)/2。结果显示，本发明的双特异性抗体能够有效抑制Raji移植瘤的生长(见图10)，并且能够延长荷瘤小鼠的生存(见图11)。2、双特异性抗体对小鼠重要脏器的组织形态无明显影响取双特异性抗体治疗后的小鼠，处死后分离心、肝、脾、肺、肾等重要脏器，10%中性福尔马林固定M小时，梯度酒精脱水后进行石蜡包埋。采用组织切片和苏木素伊红(HE) 染色后，中性树胶封片，于显微镜下观察组织形态。结果显示，本发明的双特异性抗体对小鼠重要脏器的组织形态无明显影响(见图12)。上述实例表明，本发明的人源⑶19-⑶3双特异性抗体可以在CHO细胞中表达，能够进一步通过亲和层析纯化。所得到的双特异性抗体可以结合CD19阳性的Raji细胞和 ⑶3阳性的Jurkat细胞，并且可以激活人外周血T淋巴细胞，从而达到抗B细胞淋巴瘤的作用。具有很好的作用。
权利要求
1.抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，由来自抗CD19抗体的可变区与来自抗CD3抗体的可变区构成，之间由一条连接肽相连。
2.如权利要求1所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，其特征在于所述的CD19抗体可变区由轻链可变区和重链可变区融合而成。
3.如权利要求2所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，其特征在于所述的CD19抗体可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.如权利要求1所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，其特征在于所述的CD3抗体可变区由轻链可变区和重链可变区融合而成。
5.如权利要求4所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，其特征在于其所述的CD3抗体可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
6.如权利要求1 5任一项所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，其特征在于所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
7.如权利要求1 6任一项所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体，其特征在于(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得的与SEQ ID No. 8所示的双特异性抗体的功能相同或相似的抗体。
8.编码权利要求1 6任一项所述的抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的核苷酸序列，其特征在于(1)核苷酸序列为SEQ ID NO. 7所示；或者为SEQ ID NO. 7的简并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与(1)限定的核苷酸序列编码功能相同或相似的抗体。
10.含有权利要求8或9任一项所述核苷酸序列的基因载体。
11.含有权利要求10所述基因载体的宿主细胞。
12.权利要求1-7任一项所述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体在制备抗B细胞淋巴瘤药物中的应用。
13.抗B细胞淋巴瘤药物组合物，其特征在于由权利要求1-7任一项所述抗B细胞淋巴瘤的双特异性抗体为活性成分。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，还包括至少一种其他的抗B细胞淋巴瘤药物。
全文摘要
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及编码包含人源CD19抗体可变区与人源CD3抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的药物用途和该融合蛋白的治疗方法。本发明提供了包含人源CD19scFv-CD3scFv双特异性抗体蛋白，其能够结合CD19和CD3阳性的细胞，在体内外都具有良好的生物活性，并且能够激活人T淋巴细胞，杀伤B淋巴瘤细胞，具有良好的应用前景。
文档编号C07K16/46GK102250245SQ20111013908
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月26日 优先权日2010年5月27日
发明者勾蓝图, 杨莉, 杨金亮, 魏于全 申请人:四川大学