蛋白质中赖氨酸丁烯酰化的鉴定方法及其亲和试剂研制的制作方法

专利名称：蛋白质中赖氨酸丁烯酰化的鉴定方法及其亲和试剂研制的制作方法
技术领域：
本发明涉及真核细胞中一种新型蛋白质翻译后修饰的鉴定方法及其相关亲和检测试剂的研制。具体而言，本发明涉及蛋白质赖氨酸丁烯酰化的鉴定方法及其蛋白亲和检测试剂的研制。蛋白质赖氨酸丁烯酰化是一种蛋白质翻译后修饰方式(简称PTM)。
背景技术：
蛋白质翻译后修饰调控着各种细胞学过程并与多种疾病发生、发展相关，是后基因组时代生命科学研究的主要对象之一。迄今为止，超过300多种蛋白质翻译后修饰方式被鉴定出来，这些修饰方式为了解蛋白质一级结构的多样化及其功能提供了更多的线索。 赖氨酸是已知的被核糖体编码的15个能发生共价修饰的氨基酸之一，其侧链所发生的多种共价修饰极大地拓展了蛋白分子网络的复杂性。赖氨酸侧链的富电性及亲核性使之易与多种亲电子的底物发生共价蛋白质翻译后修饰反应，包括甲基化、乙酰化、生物素酰化、泛素化及类泛素化等，它们在细胞的生理及病理过程中发挥着极其重要的功能。以组蛋白为例，已知组蛋白能够发生多种翻译后修饰，包括甲基化、乙酰化、泛素化、类泛素化及核糖基化等。组蛋白上发生的多种翻译后修饰称为“组蛋白标记”，它们通过调控基因表达及染色质的可塑性决定着组蛋白的功能。通过生物化学手段(Jemwein， et al. 2001)与质谱分析(Garcia, et al. 2007 ；Boyne, et al. 2006 ；Medzihradszky, et al. 2004)，组蛋白的翻译后修饰目前得到了广泛的研究。赖氨酸乙酰化是一种高丰度、可逆的、受到高度调控的翻译后修饰方式。尽管该修饰最初在组蛋白中被鉴定出来，随后的研究表明赖氨酸乙酰化广泛地存在于非组蛋白的蛋白底物上，如P53蛋白。蛋白质组学研究表明细胞内及多种细胞器中存在着丰富的赖氨酸乙酰化底物并发挥着多样化的功能，如细胞凋亡、代谢、基因转录和胁迫应答等。有意义的是，该修饰在线粒体蛋白及代谢通路的调控酶中广泛存在，表明赖氨酸乙酰化精细地调控着线粒体的功能和能量代谢过程。除了调控上述基本的生物学过程外，赖氨酸乙酰化及其调控酶(乙酰化酶与去乙酰化酶)也与衰老、肿瘤发生、神经退行性疾病、心血管疾病等重大疾病有着密切的内在关联。

发明内容
因此，本发明的专属目的之一在于提供一种亲和试剂用于检测在赖氨酸残基上形成的翻译后修饰方式。该目的可以通过开发出的一种蛋白亲和试剂，如抗体，特异性识别含有丁烯酰化赖氨酸的蛋白或多肽、而不充分识别不含有丁烯酰化赖氨酸的蛋白或多肽的抗体而实现。蛋白质类亲和试剂是指能够充分、并特异性识别及结合含有丁烯酰化赖氨酸的某类蛋白或多肽的任何蛋白或多肽，该类亲和试剂的的一个例子是抗体。此外，用于检测赖氨酸丁烯酰化修饰的某种亲和试剂能够从蛋白库中筛选获得，该蛋白库包括但不局限于噬菌体库与酵母库。本发明的另一目的在于提供一种方法去鉴定在赖氨酸残基上形成的翻译后修饰方式。该目的由包含以下几个步骤的鉴定过程而实现(a)获得包含有多肽的一种样品； (b)根据分子量的不同将样品中的多肽加以分离；(C)利用特异性识别含有丁烯酰化赖氨酸的多肽、而不充分识别不含有丁烯酰化赖氨酸的多肽的抗体去亲和结合一个或更多个分离的多肽；(d)检测抗体与多肽的结合，由此抗体与多肽的亲和结合表明该多肽中含有丁烯酰化赖氨酸。本发明具体实施过程中所采用的样品可能来自于不同条件下的活体组织或某一器官的临床体液，例如病理条件下或某种治疗处理。与此类似，对照样品可来自于健康条件下同一活体组织或器官的临床体液。在从样品准备组蛋白多肽过程中，需要加入相关的酶的抑制剂以防止不希望的降解发生。这些酶的抑制剂包括抑蛋白酶肽(TrasylolTM)、苯甲磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、丙氟磷(DIFP)、亮肽酶素、胃蛋白酶抑制剂、乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸、丁酸钠、曲古菌素A、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、Π^88、烟碱与Sirtinol。为了分离多肽，样品必须加热到一定温度以变性多肽但又不会显著地导致多肽的肽键断裂。在用亲和试剂去特异性结合多肽中的丁烯酰化赖氨酸时，被分离的多肽可以事先被固定化到一种固体基质上。该固体基质可以包括在一种检测试剂盒中。以不局限于本发明的例子说明，对亲和试剂(如抗体)与蛋白或多肽中一个或多个丁烯酰化赖氨酸组成的复合物可以通过免疫印迹的方法加以检测。正如本发明所属领域的、具备常规专业背景的人所理解，该检测方法包括阳性对照、阴性对照或两者兼备。正如本发明所具体体现，作为一种能够特异识别丁烯酰化赖氨酸的亲和试剂，如丁烯酰化赖氨酸抗体，可以从免疫的兔子所产生的血清中加以分离。抗体也可以是单克隆抗体或处于单链的可变区的形式。抗体包括能够特异性识别组蛋白Η2Α第36、118、119或 125位丁酰化赖氨酸的抗体；包括能够特异性识别组蛋白Η2Β第5、11、12、15、16、20、23或 34位丁酰化赖氨酸的抗体；包括能够特异性识别组蛋白Η3第4、9、18、23、27或56位丁酰化赖氨酸的抗体；包括能够特异性识别组蛋白Η4第5、8、12或16位丁酰化赖氨酸的抗体； 包括能够特异性识别组蛋白Hl第33、63、84、89、96、158或167位丁酰化赖氨酸的抗体。上述所列举的抗体仅以例证提供，并非仅限于本发明所指。根据本发明所描述的同样或相似的方法，或采用文献中已有的方法，识别其他赖氨酸丁烯酰化蛋白的抗体能够被该领域具备一般背景而无不当实验的人所制备。本发明属性的新颖特性由本公开专利所附属、并为本专利一部分的权利声明中体现出来。为了更好地理解本发明、发明运用优势及发明运用的特定目的，相关针对发明图示、发明描述的引用文献将被提供。在这些发明图示与发明描述中，本发明的具体实施方案因此而展现并被充分描述。


图1显示组蛋白翻译后修饰位点的鉴定策略及鉴定结果。(A)HeLa细胞中组蛋白翻译后修饰位点的鉴定策略。提取的组蛋白分别采取溶液内酶解无化学丙酰化反应(方法 1)、溶液内酶解后经化学丙酰化反应(方法2)、化学丙酰化反应后经酶解(方法3)以及经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行胶内酶解。经方法1与方法2所获得的酶解多肽样品进一步进行等电聚焦分离以产生12个多肽组分。(B)根据(A)所描述方法得到的组蛋白多肽经质谱分析所获得的多肽序列覆盖率。(C)本发明中所鉴定的组蛋白翻译后修饰位点的列表汇总。me 单甲基化；me2 双甲基化；me3 三甲基化；fo 甲酰化；ac 乙酰化；oh 轻基化；cr 丁烯酰化。(D)本发明中所鉴定的组蛋白翻译后修饰位点的图示汇总。 蛋白序列中相关氨基酸残基的位置编号见序列下方。灰色与无色标注框分别表示组蛋白的氨基端及内部球状核心域。(E)本发明所鉴定的人HeLa细胞及小鼠胚胎成纤维细胞中组蛋白赖氨酸丁烯酰化位点的示意图。所有鉴定的赖氨酸丁烯酰化位点由红色并带下划线标注。已报道的赖氨酸乙酰化位点由蓝色标注。图2显示短链赖氨酸酰基化(A)以赖氨酸乙酰化转移酶(KATs)为催化酶、乙酰辅酶A为辅因子的赖氨酸乙酰化反应的化学结构及反应示意图以及假定中的以丁烯酰化辅酶A为辅因子的赖氨酸丁烯酰化反应的化学结构及反应示意图。(B) 丁烯酰基团与乙酰基团的球-棍模型。处在一个平面上的丁烯酰基团的一个氧原子与四个碳原子的刚性三维排列示意图(左)。丁烯酰基团的两个烯族碳原子以黄色表示。与丁烯酰基团的化学结构不同，乙酰基的四面体CH3能够旋转(右)。(C)乙烯乙酰赖氨酸(vinylacetyllysine)、甲基丙火希赖MSI (methacryllysine)与环丙g酸赖(cyclopropanecarboxyllysine)的化学结构。(D) 丁烯酰辅酶A的代谢通路。丁烯酰辅酶A由丁酰辅酶A或戊二酰辅酶A被氧化为乙酰辅酶A经多反应步骤产生。图3显示赖氨酸丁烯酰化多肽PEPAKcrSAPAPK的确认与验证(丁烯酰化赖氨酸以 Kcr表示)。(A,B,C)来自提取的体内组蛋白Η2Α多肽(A)，对应的人工合成多肽(B)、及上述两种多肽的混合肽(C)PEPAKSAPAH(的高解析度二级质谱分析图谱。经鉴定该多肽的其第五位赖氨酸有+68. 0230Da的质量位移。上述三种类型的多肽产生完全一致的二级质谱电离片断及相同的前离子质量。Inset表明前离子质量。(D)体内PEPAK+68. 0230SAPAPK 肽段，对应的人工合成赖氨酸丁烯酰化多肽、及上述两种多肽的混合肽的萃取离子色谱图 (XICs)。利用反相高效液相色谱柱的nano-HPLC/MS/MS分析，上述多肽表现出同样的共洗脱特性。图4显示组蛋白赖氨酸丁烯酰化的免疫印迹检测。(A)利用斑点免疫印迹对赖氨酸丁烯酰化抗体的特异性检测。通道对五种多肽库的斑点免疫印迹实验检测赖氨酸丁烯酰化抗体的特异性，每种多肽库的用量如图所示。每种多肽库含有13个氨基酸残基 (CXXXXXKXXXXXX)，C表示半胱氨酸，X表示除半胱氨酸之外的其余19个氨基酸的混合氨基酸，第七位残基为固定的未修饰的赖氨酸残基(K)、或丙酰化赖氨酸残基(Kpr)、或丁酰化赖氨酸残基(Kbu)、丁烯酰化赖氨酸残基(Kcr)。(B)利用牛血清白蛋白衍生物的免疫印迹对赖氨酸丁烯酰化抗体的特异性检测。100纳克牛血清白蛋白、100纳克赖氨酸乙烯乙酰化牛血清白蛋白、100纳克赖氨酸基丙烯化牛血清白蛋白与100纳克赖氨酸丁烯酰化牛血清白蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行免疫印迹实验检测赖氨酸丁烯酰化抗体的特异性。(C)免疫印迹及竞争性实验对赖氨酸丁烯酰化抗体特异性的检测。Img 提取的人HeLa细胞组蛋白用赖氨酸丁烯酰化抗体进行免疫印迹实验检测赖氨酸丁烯酰化信号。抗体事先与未修饰的赖氨酸多肽库、赖氨酸基丙烯化多肽库或赖氨酸丁烯酰化多肽库竞争性孵育。(D)免疫印迹及竞争性实验对赖氨酸丁烯酰化抗体特异性的检测。Img提取的人HeLa细胞组蛋白用赖氨酸丁烯酰化抗体进行免疫印迹实验检测赖氨酸丁烯酰化信号。抗体事先与未修饰的赖氨酸多肽库、赖氨酸乙酰化多肽库、赖氨酸丁烯酰化多肽、赖氨酸丙酰化多肽库或赖氨酸丁烯酰化多肽库竞争性孵育。
图5显示体内D4-丁烯酸酯同位素标记对赖氨酸丁烯酰化蛋白底物的确认(A) 丁烯酸酯处理下组蛋白赖氨酸丁烯酰化修饰的动态性。人胰腺癌细胞系Dul45分别在终浓度为0mM、50mM、IOOmM的丁烯酸酯下标记M小时，随后提取组蛋白用赖氨酸丁烯酰化抗体进行免疫印迹实验检测赖氨酸丁烯酰化信号。(B)从D4-丁烯酸酯标记样品中鉴定的 PEPAKD4-crSAPAH(肽段的二级质谱分析图谱。D4_、D3_与D2- 丁烯酰基团的混合物被用来鉴定D4- 丁烯酰化多肽。图6显示不同细胞类型中组蛋白赖氨酸丁烯酰化的检测。提取酵母、线虫、果蝇S2 细胞、小鼠胚胎成纤维细胞以及人HeLa细胞中的核心组蛋白，随后用赖氨酸丁烯酰化抗体进行免疫印迹实验检测提取样品中的赖氨酸丁烯酰化信号。图7显示赖氨酸丁烯酰化抗体对人HeLa细胞裂解液中赖氨酸丁烯酰化蛋白的检测.HeLa细胞在不含有或含有50mM的丁烯酸酯的DMEM培养基中培养12个小时。细胞经裂解后提取总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。赖氨酸丁烯酰化抗体进行免疫印迹实验以检测总蛋白中的赖氨酸丁烯酰化信号。图8显示位点特异性抗体对组蛋白HI23与K56 丁烯酰化修饰的免疫印迹检测。 提取的人HeLa细胞的组蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后用与赖氨酸未修饰或丁烯酰化修饰的序列特异性多肽竞争后的组蛋白H3K23与K56 丁烯酰化抗体进行免疫印迹检测。
具体实施例方式材料本发明中所用到的所有多肽用芴甲氧羰酰基-丁烯酰化赖氨酸-羟基 (Fmoc-Lysine (crotonyl)-0H)为原料合成。所有高纯度及分析纯化学品与Flag M2抗体购自 Sigma-Aldrich 公司(St. Louis, MO)。HA 抗体购自 Roche Diagnostics 公司 (Indianapolis, IN。根据已知的实验方法(Shechter et al. ,2007 ；Tateishi et al.， 2009)组蛋白分别从酵母、果蝇S2细胞(S2)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、高加索人肺胚胎成纤维细胞(IMR90)与 HeLa 细胞中提取。4，4，4，3-D4-丁烯酸(4，4，4，3-D4_crotonic acid)通过 D4_ 乙酸(D4-acetaldehyde ；Cambridge Isotope Laboratories, Andover, ΜΑ) 与丙二酸(malonic acid)为原料合成。多克隆赖氨酸丁烯酰化抗体(anti-Kcr)与赖氨酸乙酰化抗体(anti-Kac)由实验室自制，制备方法见下述。HeLa细胞中组蛋白的提取HeLa细胞中组蛋白的提取参照已知方法(Zhang et al.，2010)。HeLa细胞预先培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，经含有5mM的丁酸钠的磷酸盐缓冲液两次洗涤后，细胞被收集并用TEB裂解液裂解细胞(磷酸盐缓冲液含0.5% (v/v)Triton X-100, 2mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)，0.02% (w/v)叠氮化钠(NaN3))。离心去上清，沉淀经再次洗涤、离心后重悬在0.4N的硫酸中，4°C过夜。离心取上清，在上清中添加终体积20% (ν/ ν)的三氯乙酸，-20°C静置4小时沉淀组蛋白。组蛋白沉淀经离心收集，0.1%的丙酮-盐酸洗涤一次后，再用预冷的丙酮洗涤两次。室温风干后，提取的组蛋白溶于水中。组蛋白的溶液内酶解消化及化学衍生化组蛋白的溶液内裂解参照已知方法(Kim et al. ,2006 ；Luo et al.，2008)。组蛋白提取物及胰酶解组蛋白多肽的体外丙酰化反应参照已有文献的报道(Garcia et al., 2007a)。本发明中对提取了组蛋白采用了三种不同的蛋白裂解方式(i)溶液内酶解消化， 无体外化学丙酰化反应；( )溶液内酶解消化后，采用体外化学丙酰化反应；(iii)溶液内酶解消化前，采用体外化学丙酰化反应。等点聚焦分离酶解消化的组蛋白多肽用Agilent 31000FFGEL 分离仪(Agilent，Santa Clara, CA)按多肽等电点不同加以分离，分离方法参照仪器使用说明。每次等电聚焦分离实验将产生12个多肽组分。牛血清白蛋白的衍生物的合成5毫克的but-3-enonylic acid，或丁烯酸，或马丁烯酸与5毫克牛血清白蛋白在 4毫升的磷酸盐缓冲液中混合，随后加入25毫克的l-ethyl-3-(3-dimethylamin0pr0pyl) Carbodiimide(EDC)。该混合物在室温下搅动反应4小时以生成乙烯乙酰化牛血清白蛋白、 或丁烯酰化牛血清白蛋白、或基丙烯化牛血清白蛋白。未反应的EDC及其他小分子用凝胶过滤法从牛血清白蛋白衍生物中去除。被修饰的牛血清白蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以确认。固定化的丁烯酰化赖氨酸琼脂糖树脂的制备依据产品说明书描述，丁烯酰化的赖氨酸残基结合到AminoLink Plus Coupling树脂上(Pierce Biotechnology, Rockford，IL)。2毫升的树脂经磷酸盐缓冲液洗涤后重悬于6毫升的磷酸盐缓冲液中，随后与预先溶于2毫升磷酸盐缓冲液的2毫克丁烯酰赖氨酸混合并加入NaCNBH3至终浓度50mM。室温搅拌孵育6小时后，树脂用4毫升的磷酸盐缓冲液洗涤一次，随后用2毫升1. OM Tris -HCl,pH 7. 4室温封闭30分钟。树脂最后经10毫升的1. OM NaCl与4毫升的磷酸盐缓冲液依次洗涤。赖氨酸丁烯酰化抗体的制备抗赖氨酸丁烯酰化免疫球蛋白通过以赖氨酸丁烯酰化的牛血清白蛋白为抗原免疫10只兔子而获得。每只兔子经四次免疫注射。每只兔子采集五批次血清。经酶联免疫吸附测定，具有最高测定值的血清用于纯化抗赖氨酸丁烯酰化的抗体。制备的固定化的丁烯酰化赖氨酸琼脂糖树脂用于从兔血清中纯化抗赖氨酸丁烯酰化的抗体。约IOml的兔血清与2ml的丁烯酰化赖氨酸琼脂糖树脂过夜孵育。随后树脂依次用20ml含0. 5% NP-40的磷酸盐缓冲液、20ml磷酸盐缓冲液、6ml含0. 8M NaCl的磷酸盐缓冲液及6ml磷酸盐缓冲液洗涤。树脂上结合的抗体用0. IM glycine (pH 3.0)洗脱并立刻用1.0M Tris-HCKpH 8. 5)中和。洗脱的抗体在预冷的磷酸盐缓冲液中于4oC过夜透析。斑点印迹与免疫印迹分析用于检测所纯化抗体的质量。抗赖氨酸乙酰化抗体通过以赖氨酸乙酰化的牛血清白蛋白为抗原免疫兔子而获得。抗体纯化通过制备的乙酰化的赖氨酸琼脂糖树脂按上述方法进行。图7显示赖氨酸丁烯酰化抗体的实验结果利用赖氨酸丁烯酰化抗体的免疫印迹方法检测HeLa细胞中赖氨酸丁烯酰化修饰。本实验中，HeLa细胞培养在DMEM培养基中，培养基中添加或不添加丁烯酸酯(50mM)处理12个小时。细胞收集裂解后提取总蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后用赖氨酸丁烯酰化抗体进行免疫印迹分析。序列特异性的赖氨酸丁烯酰化抗体的制备
以组蛋白HI23的丁烯酰化抗体制备为例。组蛋白HI23 丁烯酰化的序列特异性抗体由CQLATKAARK为抗原免疫兔子而获得，其中C被半胱氨酸残基，带下划线的K为丁烯酰化的赖氨酸残基。兔子共被免疫4次，每只兔子共取5批次血清，选取具有最高ELISA测定值的血清用于纯化H;3K23 丁烯酰化的序列特异性抗体。赖氨酸丁烯酰化位点特异性抗体的纯化通过将抗原共价结合到树脂上进行。血清首先在20，OOOg下离心去除可能的蛋白颗粒。约10毫升血清和2毫升与含有丁烯酰化赖氨酸残基的多肽抗原共价偶联的树脂在纯化柱过夜孵育。树脂随后依次用20毫升的PBSN缓冲液(含0. 5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液)、6毫升磷酸盐缓冲液洗涤。树脂上结合的抗体用0. IM的氨基乙酸(pH 3. 0)洗脱并立即用1. OM的Tris-HCl (ρΗ8· 5)中和。洗脱的抗体在磷酸盐缓冲液中透析过夜。为去除抗体的非特异性结合，将赖氨酸未修饰的CQLATKAARK多肽偶联到树脂上，然后该树脂与所获得的抗体孵育以吸附抗体中的非特异性的成分。正如本发明常规专业背景的人所能理解，用其他的多肽抗原而不是本发明中所用的特定抗原， 如CQLATKAARK，或许亦能够获得令人满意的结果。多肽抗原的设计基于某蛋白中丁烯酰化赖氨酸的周边序列，该蛋白的丁烯酰化修饰能被本领域中具备一般技能背景的人所检测。利用同样的方法，本发明开发出了组蛋白H;3K56的丁烯酰化修饰抗体。抗体的制备及纯化与上述一致，除外所设计的抗原是针对组蛋白H3第56位赖氨酸的丁烯酰化修饰。尽管本发明的具体体现使用了赖氨酸丁烯酰化抗体，具备本发明常规专业背景的人可以使用相应的单克隆抗体或单链可变区(scFvs)重复本发明并获得满意的结果。图8显示序列特异性抗体的实验结果利用上述制备的抗体检测组蛋白H;3K23与 H3K56位的丁烯酰化修饰。本实验中，人HeLa细胞组蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，后用被非修饰的(K)或丁烯酰化的(Kcr)序列特异性多肽所竞争反应的抗体进行免疫印迹检测。利用赖氨酸丁烯酰化抗体对赖氨酸丁烯酰化多肽的亲和富集纯化的抗赖氨酸乙烯酰化抗体经4°C孵育4小时固定化到ftOtein A树脂上(GE Healthcare Biosciences,Pittsburgh,PA)。离心去除上清后，树脂用NTEN缓冲液洗涤三次 (50mM Tris .HCUpH 8. 0], IOOmM NaCl, ImM EDTA,0. 5% NP40) 经酶解消化的组蛋白多肽溶于NETN缓冲液中，然后与20微升固定化的赖氨酸乙烯酰化抗体-Protein A树脂4oC缓慢摇晃过夜孵育。树脂经3次NETN缓冲液洗涤及2次ETN缓冲液洗涤后(50mM Tris -HCl PH 8.0, IOOmM NaCl, ImM EDTA)，树脂上亲和富集的多肽用0. 1 %的三氟乙酸洗脱三次，每次50微升。洗脱液汇集后于旋转真空蒸发仪内真空干燥。多肽库的竞争性免疫印迹1微克的组蛋白提取物经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氯乙烯膜上(PVDF)。丁烯酰化赖氨酸抗体在分别与非修饰性抗原多肽库、乙酰化抗原多肽库、丙酰化抗原多肽库、丁酰化抗原多肽库、基丙烯化抗原多肽库与丁烯酰化抗原多肽库孵育后，与转移有组蛋白提取物的PVDF膜孵育以检测丁烯酰化赖氨酸的信号。组蛋白的溶液内酶解消化与化学衍生化组蛋白的胰酶解肽段通过三种方法获得⑴未经体外赖氨酸丙酰化的组蛋白多肽的获取。依前述方法获得的组蛋白重悬于50mM的碳酸氢铵溶液中(pH 8. 4)，然后按已报道的方法进行溶液胰酶裂解(Kim et al. ,2006 ；Luo et al.，2008)。(ii)组蛋白溶液内酶解消化后，进行体外化学丙酰化反应，该反应参照已有文献的报道(Garcia et al., 2007b)。为了获得衍生化的组蛋白多肽，3毫克胰酶裂解的组蛋白多肽溶于25微升的50mM 的碳酸氢铵溶液中(pH 8. 0)，随后加入600微升含50%丙酸酐的甲醇(ν/ν)，混合液的ρΗ 值用氢氧化铵快速调制8.0。51oC反应20分钟后在旋转蒸发器中使反应溶液蒸发干燥。为保证反应完全，上述实验过程重复两次。(iii)提取的组蛋白先进行体外丙酰化反应，随后胰酶裂解消化。组蛋白的体外丙酰化反应如上述，丙酰化的组蛋白随后在37oC环境下用胰酶进行过夜酶解。高效液相色谱-串联质谱(HPLC/MS/MQ分析与蛋白序列数据库搜索经干燥的多肽溶于3微升的HPLC溶剂A中(0. 1 %甲酸水溶液，ν/ν)。1微升的样品注射入 Nano-LC-ID plus HPLC 系统中(Eksigent Technologies，Dublin，CA)，该系统连接有自制的毛细管Jupiter C12柱(柱长10厘米，内径75微米；树脂颗粒大小4微米， 孔径 90 A;Phenomenex，St. Torrance, CA)。多肽用 2%到 80%梯度的 HPLC 溶剂 B (0. 甲酸乙腈溶液，ν/ν)按每分钟200纳升的流速按两小时工作时间洗脱出。洗脱出的多肽经离子化后用纳升电喷离子源的LTQ Orbitrap Velos质谱仪分析(ThermoFishei^cientific， San Jose, CA) 0全扫描式的高解析度一级电离谱(质荷比从350至1400)在锁定质量质荷比445. 120025、质荷比400、解析度R = 6000的Orbitrap获得，。随后20个具有最强离子化的一级电离片断在线形离子胼中按35%的碰撞激活解离能量进行二级电离片断化。数据依赖扫描的排除持续设定为36秒，排除范围设定值为质荷比士0.01%。二级电离数据通过非限制性序列比对算法PTMap加以分析(Chen et al.，2009)， 利用Mascot算法进行限制性、预先设定的蛋白质翻译后修饰类型的序列比对。对于非丙酰化的组蛋白，为了寻找多样化的翻译后修饰类型，蛋白序列数据库搜索的参数设定包括赖氨素单甲基化、赖氨酸双甲基化、赖氨酸三甲基化、赖氨酸甲酰化、赖氨酸乙酰化、精氨酸单甲基化、精氨酸双甲基化、酪氨酸羟基化、甲硫氨酸氧化与赖氨酸乙烯酰化(质量位移 +68. 02621Da)。对于先丙酰化反应、后胰酶裂解的组蛋白样品，设定的参数还包括了赖氨酸丙酰甲基化(质量位移+70.04187Da)与赖氨酸丙酰化。对于先胰酶裂解、后丙酰化反应的组蛋白样品，氨基端的丙烯化作为固定的修饰包括在设定的参数中。数据分析中其他的参数好包括6个允许的酶解不完全片断；前离子的IOppm的质量误差，碎片离子0. 6Da的质量误差；+1、+2与+3的电荷状态被赋予母离子。如果一个多肽产生多于一个肽谱，则具有最高Mascot或PTMap分析数值的肽谱被用来做手工分析。按已有文献报道，所有PTMap > 0. 8或Mascot > 20的多肽被用来做进一步的手工检验(Chen et al. . 2005)。高效液相色谱-串联质谱(HPLC/MS/MQ分析对赖氨酸丁烯酰化的确认组蛋白酶解肽段中的赖氨酸丁烯酰化多肽、对应的合成型赖氨酸丁烯酰化多肽以及上述两种多肽的混合物被注入到nano-HPLC系统中，随后用Orbitrap质谱仪进行高解析度的一级电离及二级电离分析。全扫描式一级电离在锁定质量质荷比445. 120025、质荷比 400、解析度R = 30000下获得，目标肽段的二级电离谱质荷比400、解析度R = 7500下获得。赖氨酸丁烯酰化多肽的鉴定组蛋白富含高比例的赖氨酸与精氨酸，因此，胰酶消化将产生相对较小且亲水性的多肽片断，其中一些由于不能驻留在C18RP-HPLC柱中而不能进行随后的质谱检测。该问题可以通过对酶解前或酶解后蛋白样品的氨基基团进行化学衍生化而解决(如酰氨的氨基端、未修饰及单甲基化赖氨酸的ε_氨基基团的丙酰化)。同样，在酶解前或酶解后，组蛋白的赖氨酸丙酰化将产生互补的多肽，这将增加质谱鉴定时的序列覆盖程度。此外，利用等电聚焦法分离的12个多肽组分将能进一步减少每次分析时的样品复杂性及提高检测的动态范围。本发明中，为了最大程度地提高序列覆盖率、检测的灵敏度及鉴定新的翻译后修饰位点，我们设计了综合性的实验策略去系统地鉴定组蛋白上的修饰方式。本发明中，我们采用了四种平行的方法获得组蛋白的酶解肽段，然后分别进行质谱分析(图1Α) :(i)组蛋白溶液内酶解消化，无体外化学丙酰化反应；(ii)组蛋白溶液内酶解消化后，采用体外化学丙酰化反应；(iii)丙酰化组蛋白，随后胰酶解；(iν)通过酶解单一组蛋白获得酶解肽段。我们利用一次能鉴别某一蛋白中所有可能的翻译后修饰方式的PTMap算法(Chen et al. ,2009)去分析所获得的组蛋白质谱分析数据。正如预期，对于进行了化学丙酰化反应的多肽，无论是酶解前或酶解后，质谱鉴定的多肽序列覆盖程度都显著的提高(图1B)。 在所采用的四个方法中，方法三(丙酰化组蛋白，随后胰酶解)对组蛋白Hl. 2达到了 100% 的序列覆盖，组蛋白H2A达到了 90. 7%的序列覆盖，组蛋白H2B达到了 94. 4%的序列覆盖。 方法四(通过酶解单一组蛋白获得酶解肽段)对组蛋白H3与H4达到了最佳的序列覆盖， 分别为87. 3%与82. 3%。综合数据后，我们取得了对组蛋白Hl. 2100%的序列覆盖，H2A 90. 7%的序列覆盖，H2B 100%的序列覆盖，H397%的序列覆盖，H487. 3%的序列覆盖。就我们所知，这是迄今为止所报道的组蛋白质谱分析中最高的序列覆盖率。利用述方法，我们在组蛋白中共鉴定出130个翻译后修饰位点，包括本发明中所列的观个赖氨酸丁烯酰化位点。余下的102个位点中包括了 39个以前未见报道的新的翻译后修饰位点，其中18个赖氨酸单甲基化位点、1个赖氨酸双甲基化位点、4个赖氨酸甲酰化位点、2个赖氨酸乙酰化位点、8个精氨酸单甲基化位点和6个酪氨酸羟基化位点(图 1C)。本发明中所鉴定的所有赖氨酸丁烯酰化位点和非丁烯酰化位点见图ID与图IE所示。所鉴定出的组蛋白翻译后修饰多肽的二级质谱图均按以前报道的方法经严格的手工检验(Chen et al.，2005)。利用对相应的人工合成的修饰性多肽的二级质谱分析，我们进一步确认了所有鉴定的赖氨酸丁烯酰化位点和10个新的非赖氨酸丁烯酰化的翻译后修饰位
点ο组蛋白中赖氨酸丁烯酰化位点的鉴定蛋白质翻译后修饰会引起修饰位点的结构及成分变化，并由此带来相应的分子量的改变。本发明中，组蛋白多肽中所鉴定的观个赖氨酸残基中带有+68Da的质量位移，该质量位移与以前所知的任何翻译后修饰方式均不对应(图1E)，暗示了一种新的未被报道的“组蛋白标记”的存在。为解析该修饰的结构，含有该修饰的一条多肽PEPAK+68SAPAPK(组蛋白H2B第5 位赖氨酸修饰)被用来做进一步分析。经对该多肽高解析度的一级质谱数据的手工分析 (前离子质量质荷比580. 8181)，我们确定该修饰的准确质量位移为+68. 0230Da。通过设置允许质量误差士0. OlDa(约9ppm，在所用质谱的质量精确度范围内)以及指定最多两个氮原子，根据质量位移，该修饰基团的组成为C4H50或H6N03，而C4H50(质量位移外加一个中子)是该修饰唯一可能的分子式。对于该分子的组成成分，总共有四种可能的结构丁烯酰化赖氨酸(图2A，2B)、乙烯乙酰赖氨酸(vinylacetyllysine)、基丙烯赖氨酸 (methacryllysine)与环丙；^酸赖M酸(cyclopropanecarboxyllysine)(图 2C)。由于丁烯酰辅酶A在丁酰辅酶A与乙酰辅酶A代谢通路是一种重要且高丰度的中间物(图2D)，我们因此认为该质量位移对应为赖氨酸丁烯酰化修饰合成多肽的二级质谱分析与高效液相色谱的共洗脱分析为了验证+68. 0230Da的质量位移由赖氨酸丁烯酰化引起，我们合成了修饰性的 PEPAKcrSAPAra多肽，并将其质谱分析的图谱与体内对应多肽的图谱比较。带有修饰性赖氨酸质量位移为+68. 0230Da体内多肽、具有与体内多肽同样序列的PEPAKcrSAPAPK的合成多肽、以及这两种多肽的混合物表现出完全一样的本体质量及高解析度的二级质谱图谱(图 3A至C)。此外，两种多肽的混合物在高效液相色谱/质谱分析中被共同洗脱下来(图3D)。 这些结果表明+68. 0230Da的质量位移很可能有赖氨酸丁烯酰化引起。免疫印迹与免疫荧光分析对赖氨酸丁烯酰化的确认为了进一步确认组蛋白中的赖氨酸丁烯酰化修饰，我们开发出了赖氨酸丁烯酰化。该抗体能特异性地识别带有丁烯酰化赖氨酸的多肽库，而不识别未修饰赖氨酸的多肽库、乙酰化赖氨酸多肽库、丙酰化赖氨酸多肽库与丁酰化赖氨酸多肽库(图4A)。该抗体的特异性也被利用化学修饰的赖氨酸丁烯酰化牛血清白蛋白、赖氨酸乙烯乙酰化牛血清白蛋白和赖氨酸基丙烯化牛血清白蛋白的免疫印迹分析所证明。这些实验表明赖氨酸丁烯酰化抗体仅识别赖氨酸丁烯酰化牛血清白蛋白，而不识别氨酸乙烯乙酰化牛血清白蛋白和赖氨酸基丙烯化牛血清白蛋白(图4B，C)。该抗体随后用于免疫印迹与免疫荧光实验中检测赖氨酸丁烯酰化信号。实验表明，该抗体能够检测出所有核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4及联结组蛋白Hl中的赖氨酸丁烯酰化信号。每一组蛋白中，赖氨酸丁烯酰化信号能够被带有赖氨酸丁烯酰化多肽库所竞争，而不能被未修饰赖氨酸的多肽库(图4C)、基丙烯化赖氨酸多肽库(图4C)、 乙酰化赖氨酸多肽库、丙酰化赖氨酸多肽库与丁酰化赖氨酸多肽库(图4D)所竞争。经五种相互独立方法的验证，即质谱分析、高效液相色谱的共洗脱、D4- 丁烯酸酯的标记、免疫印迹及免疫荧光，本发明确定了组蛋白中赖氨酸丁烯酰化修饰的存在。不同细胞类型中组蛋白赖氨酸丁烯酰化的检测利用本发明所使用的方法，我们进一步证实了赖氨酸丁烯酰化存在于其他类型真核细胞的组蛋白中。例如，我们在酵母、果蝇S2细胞、小鼠胚胎成纤维细胞以及人HeLa细胞的组蛋白中检测的赖氨酸丁烯酰化信号(图6)。利用赖氨酸丁烯酰化抗体的亲和富集实验与高效液相色谱-串联质谱分析，我们在小鼠胚胎成纤维细胞中鉴定出M个赖氨酸丁烯酰化位点(图1E)。因此，这些结果表明组蛋白赖氨酸丁烯酰化是真核细胞中一种进化保守的修饰方式。本发明提出了一个综合性的策略去系统地鉴定组蛋白的翻译后修饰(图1)。运用该策略，本发明独一无二地鉴定了人细胞内130个组蛋白翻译后修饰位点被鉴定出来，包括63个已知的和67个新的“组蛋白标记”位点(图1C)，其中酪氨酸羟基化和赖氨酸丁烯酰化为鉴定出了两种新的“组蛋白标记”。因此，本发明拓展了对真核细胞中组蛋白翻译后修饰类型及位点的认识，并且为研究组蛋白调控机理提供了技术平台理，为组蛋白调控相关疾病的治疗提供了方向。尽管在此图示和描述了本发明的较佳实施例，但在不偏离本发明的设计思想和范围的前提下，本领域内的普通技术人员还可作多种省略、修改和替代设计。因此，应当理解， 本发明以图示方案描述为例，但并不限于此。参考文献1. Chen，Y.，Chen，W.，Cobb, Μ. H.，and Zhao，Y. (2009). PTMap—a sequence alignment software for unrestricted, accurate, and full-spectrum identification of posttranslational modification sites.Proc Natl Acad Sci USA 106.761-766.2. Chen，Y.，Kwon, S. W.，Kim, S. C.，and Zhao，Y. (2005). Integrated approach for manual evaluation of peptides identified by searching protein sequence databases with tandem mass spectra. J Proteome Res 4. 998-1005.3. Chu, F.，Nusinow, D. Α.，Chalkley, R. J.，Plath，K.，Panning，B.，and Burlingame, A. L. (2006). Mapping post-translational modifications of the histone variant MacroH2Al using tandem mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 5， 194-203.4. Cosgrove,M. S. ,Boeke, J. D.，and Wolberger, C. (2004). Regulated nucleosome mobility and the histone code. Nat Struct Mol Biol 11. 1037-1043.5. Garcia，B. A.，Mollah，S.，Ueberheide，B. M.，Busby, S. A.，Muratore, Τ. L， Shabanowitz, J.，and Hunt，D. F. (2007a). Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc 2. 933-938.6. Garcia, B. A. ， Pesavento, J. J. ， Mizzen, C. A. ， and Kelleher, N. L. (2007b). Pervasive combinatorial modification of histone H3in human cellss. Nat Methods 4. 487-489.7. Garcia, B. A. , Shabanowitz, J. , and Hunt，D· F· (2007c). Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol 11，66-73·8. Johnson, L. ,Mollah, S. , Garcia, B. A.，Muratore，T. L , Shabanowitz, J.，Hunt， D. F. , and Jacobsen,S. E. (2004). Mass spectrometry analysis of Arabidopsis histone H3reveals distinct combinations of post-translational modifications. Nucleic Acids Res 32. 6511-6518.9. Kim, S. C. ， Sprung, R. ， Chen, Y. ， Xu, Y. ， Ball, H. ， Pei， J. ， Cheng, Y. ， Kho, Y.，Xiao，H.，Xiao，L，et al. (2006). Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Mol Cell 23.607-618.10. Kouzarides,T. (2007). Chromatin modifications and their function. Cell 128,693-705. Luo, H·，Li，Y·，Mu, J. J.，Zhang，J.，Tonaka，T.，Hamamori，Y.，Jung，S. Y.， Wang，Y.，and Qin，J. (2008). Regulation of intra-S phase checkpoint by ionizing radiation(I R)-dependent and I R-independent phosphorylation of SMC3. J Biol Chem 283,19176-19183.
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权利要求
1.一种检测某一“组蛋白标记”的方法，其特征在于，该方法包括(a)从一种组蛋白中准备多肽混合物；(b)按分子量的差异分离多肽；(c)用一种能够特异性结合含有一个丁烯酰化赖氨酸残基多肽的亲和试剂去分离多肽；(d)检测上述亲和试剂与上述多肽结合形成的复合物的存在，并由此说明组蛋白赖氨酸丁烯酰化“组蛋白，，标记的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和试剂为一种抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抗体制备的步骤包括(a)用含有一个丁烯酰化赖氨酸残基的蛋白多肽在一个时间段内免疫哺乳动物；(b)收集被免疫哺乳动物的血清；(c)利用丁烯酰化赖氨酸共价结合的树脂选择性地富集血清。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抗体是用常规方法制备的单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抗体是一单链可变区形式的一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行步骤(c)之前，分离的多肽被固定化到一个固体基质上。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行步骤(c)之前，亲和试剂固定化到一个固体基质上。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和试剂能特异性结合组蛋白H2A上第 36、118、119或125位赖氨酸上的丁烯酰化修饰。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和试剂能特异性结合组蛋白H2B上第 5、11、12、15、16、20、23或34位赖氨酸上的丁烯酰化修饰。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和试剂能特异性结合组蛋白H3上第4、9、18、23、27或56位赖氨酸上的丁烯酰化修饰。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和试剂能特异性结合组蛋白H4上第5、8、12、或16位赖氨酸上的丁烯酰化修饰。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和试剂能特异性结合组蛋白Hl上第 33、63、84、89、96、158或167位赖氨酸上的丁烯酰化修饰。
13.分离的抗体，其特征在于，能够特异性地结合含有一个丁烯酰化赖氨酸残基的一个蛋白或一个多肽。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，抗体是一种单克隆抗体。
15.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，抗体是一单链可变区形式的一种。
16.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，抗体制备的步骤包括(a)用含有一个丁烯酰化赖氨酸残基的蛋白多肽在一个时间段内免疫哺乳动物；(b)收集被免疫哺乳动物的血清；(c)利用丁烯酰化赖氨酸共价结合的树脂选择性地富集血清。
17.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，蛋白是指第36、118、119或125 位赖氨酸丁烯酰化的组蛋白H2A。
18.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，蛋白是指第5、11、12、15、16、20、 23或34位赖氨酸丁烯酰化的组蛋白H2B。
19.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，蛋白是指第4、9、18、23、27或56 位赖氨酸丁烯酰化的组蛋白H3。
20.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，蛋白是指第5、8、12、或16位赖氨酸丁烯酰化的组蛋白H4。
21.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，蛋白是指第33、63、84、89、96、 158或167位赖氨酸丁烯酰化的组蛋白HI。
22.根据权利要求13所述的分离的抗体，其特征在于，蛋白是指组蛋白H2A，H2B,H3， H4 或 Hl。
全文摘要
一种方法及相关的亲和试剂用于检测新颖的“组蛋白标记”。该新颖的“组蛋白标记”是指组蛋白上赖氨酸残基上的丁烯酰化修饰。检测方法的步骤包括(a)从一种组蛋白中准备多肽混合物；(b)按分子量的差异分离多肽；(c)用一种能够特异性结合含有一个丁烯酰化赖氨酸残基多肽的亲和试剂去分离多肽；(d)检测上述亲和试剂与一条或多条多肽结合形成的复合物的存在，并由此说明组蛋白赖氨酸丁烯酰化“组蛋白”标记的存在。该亲和试剂可能是从哺乳动物血清中纯化的抗体、单克隆抗体或单链的可变区。
文档编号C07K16/06GK102375065SQ201110141188
公开日2012年3月14日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者赵英明 申请人:杭州景杰生物科技有限公司