专利名称：一种齐考诺肽的固相合成方法
技术领域：
本发明涉及一种齐考诺肽的固相合成方法。
背景技术：
齐考诺肽(ziconotide)，商品名为Prialt，开发与上市厂商是美国Elan公司， 2005年1月首次在美国上市，2005年2月获欧盟许可。适应症主要有对啮齿类动物急、 慢性和神经病性疼痛模型具有强效镇痛作用，可安全有效的缓解恶性和非恶性疼痛病人的疼痛，包括鸦片类药物治疗无效的病人，且耐受性良好，还用于部分其他镇痛治疗疗效差的严重慢性疼痛患者。药效优于其他镇痛产品，鞘内注射时其镇痛功效比吗啡强1000倍，且不会出现使用吗啡时的副反应，如呼吸抑制和产生耐药性。其特点是需要鞘内给药，可通过血脑屏障而发挥药效。药理作用表现为结合并阻断脊髓背角浅层内的初级伤害感受性传入神经上的N-型钙通道，从而阻止初级传入神经末梢兴奋性神经递质的释放，对抗伤害感受。药代动力学表现为药物进入全身循环后，被组织中的肽酶或蛋白酶降解为多肽片段和游离氨基酸，极少量随尿液排泄。副作用表现为剂量依赖性的心血管系统反应，如心率缓慢和直立性低血压；中枢神经系统反应，眩晕、眼球震颤、共济失调、兴奋、幻觉、镇静和昏迷等，在停用药物几天后消失。不存在耐受和成瘾现象，是非阿片类镇痛药物。齐考诺肽是ω -芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于海螺(Conus magus) 体内，是由25个氨基酸组成的阳离子多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基(这是此肽合成的主要难点)，分子量为沈39. 12。它是特异性/选择性的N型电压敏感性钙通 M (N-type voltage-sensitive calcium channels, N-type VSCCs) [fill 齐[J，)(寸
尤其是阿片受体没有明显的亲和力。上述齐考诺肽的一条合成路线[1]如下该方法使用经典的Fmoc-固相合成法，以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，以HOBt和N，N, - 二异丙基碳二亚胺为缩合剂依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，室温搅拌反应2. 5小时反应得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组 Cys分别由Trt、Acm、Mob保护，不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保护基保护。将线性全保护肽树脂溶于的三氟乙酸/ 二氯甲烷室温反应20分钟脱去Trt保护基，过滤后加入水/己腈/DMSO (体积比10 15 1)，用稀氨水调节pH至8，室温下搅拌反应一小时，得到齐考诺肽一环肽树脂。在得到的一环肽树脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室温反应2小时，洗涤过滤得到齐考诺肽二环肽树脂。将得到的二环肽树脂溶于溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇(体积比80 :8:8: 4)混合溶液中， 室温反应3小时，过滤后溶于水中，调pH至8，双氧水存在下室温反应一小时，冷乙醚沉淀得到粗肽，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。整个合成过程反应流程如
图1所示。上述合成路线具有合成步骤繁琐的缺点。而且该技术是在固相条件下完成前两个二硫键的氧化，重复难度很大。
齐考诺肽的合成路线11[2]该方法以氨基树脂为固相载体，用HATU、HOAt, TMP为缩合剂与Fmoc-Cys (Acm)缩合得到Fmoc-Cys (Acm)-氨基树脂。该树脂肽与F-moc氨基酸在H0Bt、DIC作用下生成全保护的线性全保护肽，其中全部Cys侧链均用Acm保护。使用TFA/苯甲醚/苯甲硫醚/乙二硫醇(90 :5:3:幻切下树脂，得到Cys侧链含有Acm的齐考诺肽线性粗肽。将粗肽脱盐，然后用TFA-anisole溶解，加入TI (TFA) 3反应得到不含保护基的线性齐考诺肽。酸性条件下空气氧化得到齐考诺肽，纯化得到精肽，总收率在30%以上。整个合成过程反应式如图2所示。齐考诺肽的合成路线II具有二硫键的连接准确率低、产率低的缺点，总产率仅为 30%。最后的分离纯化也有很大难度。参考文献[1]路杨，李新宇·齐考诺肽的固相合成方法中国，200710301598. 8[P]· 2009-04-22.[2]宓鹏程，李红玲，马亚平，袁建成.一种齐考诺肽制备的方法中国， 200910188686. 0[P], 2010-05-19.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种步骤精简且收率高的齐考诺肽的固相合成方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种齐考诺肽的固相合成方法，该方法包括如下步骤(1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys(l-16、 8-20、15-25)分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys 连接不同的保护基；(2)将步骤(1)得到的线性全保护肽树脂中的树脂进行切割，切割的同时脱去除 Cys (Acm)和Cys (tBu)的其它所有氨基酸的侧链保护基，得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的线性肽；(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，同时脱除Cys(Acm)中的Acm 保护基并形成第二对二硫键，得到二环肽；(4)脱除步骤(3)得到的二环肽中的Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到含三对二硫键的齐考诺肽。所合成的齐考诺肽具有如下结构
权利要求
1.一种齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、 Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基；(2)将步骤(1)得到的线性全保护肽树脂中的树脂进行切割，切割的同时脱去除 Cys (Acm)和Cys (tBu)的其它所有氨基酸的侧链保护基，得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的线性肽；(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，同时脱除Cys(Acm)中的Acm保护基并形成第二对二硫键，得到二环肽；(4)脱除步骤(3)得到的二环肽中的Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到含三对二硫键的齐考诺肽。
2.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中， 所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA树脂、Rink-Amide树脂、Rink-Amide-BHA树月旨、 Rink-Amide-AM 树脂或 Sieber 树脂。
3.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤⑴中，25个氨基酸的线性全保护肽树脂为H-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Arg( pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp (OtBu)-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Thr-Gly-Ser(tBu)-Cys(Acm)-A rg (pbf) -Ser (tBu) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt)-氨基树脂
4.根据权利要求1或2或3所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1) 中，按1 (1 5) (1 5) (1 5) 0 10)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Rnoc保护氨基酸、HoBt, HBTU和DIPEA，将Rnoc保护氨基酸、HoBt, HBTU和DIPEA溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后的氨基树脂，室温震荡反应0. 5 3小时连接Fmoc 保护氨基酸，连接下一个氨基酸之前Fmoc的脱除用哌啶的N，N 二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc 保护基2次，时间分别为3-5分钟和15-25分钟，每次连接上一个氨基酸和脱除Fmoc保护基后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤3-10次。
5.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(2)中，将三氟乙酸、苯甲硫醚、二巯基乙烷和苯甲醚按90 5 2.5 2.5的体积比混合，或者，将三氟乙酸、甲醇、水和三异丙基硅烷按体积比88 :5:5: 2混合，将步骤(1)得到线性全保护肽树脂加入上述两种混合液中的任意一种中，震荡反应0. 5 3小时后，将反应液注入冷乙醚中，沉淀，离心后收集沉淀，得到含Cys(Acm)和Cys (tBu)的线性肽。
6.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤 (2)得到的线性肽溶于乙酸，加入10倍摩尔量的12，室温搅拌反应1小时，然后加入水，反应完全后，加入抗坏血酸直到溶液变为无色，反应混合液冻干，得到二环肽。
7.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤中，将二甲基亚砜和苯甲醚溶于三氟乙酸配制成氧化溶液，将步骤C3)得到的二环肽加入上述氧化溶液中，室温震荡反应3-7小时，加水稀释后冻干，纯化后得到齐考诺肽。
全文摘要
本发明公开了一种齐考诺肽的固相合成方法，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，依次缩合反应连接25个保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基；切割树脂，同时脱去除Acm和tBu的其它所有氨基酸的保护基，得到含Acm和tBu的线性肽；氧化线性肽形成第一对二硫键，同时脱除Acm并形成第二对二硫键，得到二环肽树脂；脱除二环肽树脂中的tBu，同时环化形成第三对二硫键，得到齐考诺肽。本发明巧妙选用了Trt、Acm、tBu来分别保护三组Cys，提高了二硫键形成的准确率，然而切除树脂后仅仅通过两步反应完成了三对二硫键的依次形成，精简步骤的同时提高了产率。
文档编号C07K1/02GK102268082SQ20111013966
公开日2011年12月7日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者李梅兴, 董守良 申请人:江苏江神药物化学有限公司