胸腺肽α1的固相合成工艺的制作方法

专利名称：胸腺肽α1的固相合成工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽的合成和纯化方法，尤其涉及胸腺肽α 1的固相合成工艺。
背景技术：
1977年，被称为“胸腺之父”的Allen Goldstein博士从胸腺肽第5组分中提取出其中最具免疫活性的成分胸腺肽α 1。胸腺肽α 1是一种生物反应调节剂(BRM)，由观个氨基酸残基构成，氨基酸序列如下N-乙酰化-L-丝氨酰-L-天冬氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-L-天冬氨酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-丝氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-苏氨酰-L-苏氨酰-L-赖氨酰-L-天冬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酰-L-谷氨酰-L-赖氨酰-L-赖氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-缬氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰-L-天冬酰胺。N末端被乙酰化，分子量为3108。主要存在于胸腺中，在脾、肺、肾、脑等其他组织中也有低水平存在。胸腺肽α 是一种免疫调节因子，在T淋巴细胞成熟和免疫功能方面有很大的作用，这些作用包括诱导分化的特异标志；促进干扰素Y (IFN-Y)、白介素 2(IL-2)及其受体表达；增强细胞在外源因子刺激时的生长；启动T淋巴细胞的成熟、刺激分泌干扰素及各种淋巴介素，以及增强自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性；促使骨髓产生的干细胞成长为能够特异识别抗原的功能T细胞，增加各种淋巴因子如α、β干扰素的分泌，从而有增强细胞免疫功能的作用。作为天然胸腺激肽的主要组分α 大致含量在整个胸腺肽组成中约占左右。胸腺肽α 与胸腺肽各单一组分间，或与胸腺肽整体比较，生物活性均为最高，其活性相当于胸腺肽的2000倍，相当于胸腺五肽的10到1000倍。胸腺肽α 1最早由意大利塞生公司(Sciclone)在1997年开发上市，药品名“日达仙”(Zadaxin)。作为一种细胞免疫剂增强剂，胸腺肽α 1受到医学界越来越多的重视。它对慢性乙型肝炎、重型病毒性肝炎、肿瘤、流行性乙型脑炎等疾病的治疗效果明显，副作用少，具有较高的临床研究价值和应用前景。在临床上主要用于①治疗慢性乙型肝炎；②在肿瘤治疗中的应用；③治疗重症肝炎；④治疗流行性乙型脑炎；⑤治疗外科感染性疾病。目前胸腺肽α 1的合成与制备的方法主要有两种，基因工程方法和化学固相合成方法。专利CN02125^57. X公布了一种利用生物工程技术将胸腺肽基因进行重组，在宿主细胞中表达重组基因获得胸腺肽融合体，再利用化学技术将融合体裂解和修饰的到胸腺肽 α 1的方法。专利CN200410077749. 2采用的方法是将胸腺肽α 1定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-T α 1，该质粒可以表达出硫氧还蛋白-胸腺肽α 1 融合蛋白，再经过一系列后处理和纯化可以得到胸腺肽α 。基因工程方法的缺点是表达量比较低，而且所需费用较高，很难实现产业化。《化学工业与工程》2001年18卷第6期 《胸腺素α 1的Fmoc固相合成法》描述了一种以王树脂为载体，用对称酸酐法和DCC-HOBt 缩合法合成胸腺肽α 1的方法。《化工学报》2004年第55卷第2期《胸腺素α 1的DIC固相化学合成与鉴定》描述了一种以王树脂为载体，以DIC-HOBt为氨基酸激活试剂合成胸腺肽α 1的方法。《南京工业大学学报》2004年第沈卷第2期《固相合成胸腺素α 1))中的合成方法也是采用王树脂为起始原料，但氨基酸激活试剂采用的是TBTU-HOBt。这几种化学固相合成方法采用的都是先进的Fmoc方法，并且均以王树脂为载体。不足之处是王树脂与Fm0c-Asn(Trt)-OH的结合比较困难，还存在切割的时候linker被切除连接在肽链上的副反应，会对收率有一定的影响。而且其方法中的氨基酸缩合剂TBTU-HOBt，DCC-HOBt, DIC-HOBt相对而言缩合效率不是很高，对于胸腺肽α 1这种比较长的肽，空间结构影响较大，会对收率造成影响，导致成本升高，不利于工业化生产。

发明内容
本发明的目的是对现有的固相合成技术进行优化，解决胸腺肽α 1合成工艺中存在的一些问题，提供一种收率更高、成本更低、有利于实现产业化的胸腺肽α 1的固相合成工艺以及一种胸腺肽α 1粗肽的纯化方法。本发明提供一种胸腺肽α 1的固相合成方法，该方法包括下列步骤(1) NH2-Asn (Trt) -CTC 树脂的制备；⑵AA(1-27)-Asn(Trt)28-CTC 树脂的合成；⑶Ac-AA(1-27)-Asn28(Trt)-CTC 树脂的制备；(4)用裂解剂制备胸腺肽α 1粗肽；(5)胸腺肽α 1粗肽的纯化。上述步骤O)固相合成中使用用氨基酸激活试剂HATU和NMM。上述步骤(3)中乙酸酐和吡啶的摩尔用量均为树脂取代摩尔数的20倍。上述步骤的裂解液，为三氟乙酸/ 二巯基乙醇/水的混合液，配制方法如下 三氟乙酸二巯基乙醇水=90 5 5的体积配制，然后在-10°C的条件下预冷12小时。裂解切肽是在室温下反应2. 5-3小时。沉降粗肽时用的乙醚体积是裂解试剂的10倍，沉降完成后用离心的方法对粗肽进行洗涤浓缩。上述步骤( 纯化采用两次纯化，所用色谱柱用不同的反相C18填料。优选的本发明的固相合成方法，包括下列步骤(1) NH2-Asn (Trt) -CTC树脂的制备Fmoc-Asn (Trt) -CTC树脂加入至反应器中，加入DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，除去液体，然后向反应器中加入哌啶/DMF 溶液进行反应，反应完毕抽去液体，用DMF洗涤，再加入哌啶/DMF溶液，搅拌反应后抽除，用 DMF洗涤，洗去脱下的Fmoc保护基。(2)AA(1_27)-Asn(Trt)28-CTC 树脂的合成取 Fmoc-Glu(OtBu)_0H，HATU,溶于 DMF 中，加入冷却的NMM，激活后加入到反应器中反应，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入DMF洗涤，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽α 1氨基酸序列，把不同的氨基酸依次进行偶联直至最后Fmoc-Ser (tBu)-OH偶联完毕，偶联完毕之后，再用哌啶/DMF脱去 Fmoc 保护，得到 AAa-27)-Asn (Trt) 28_CTC 树脂。⑶Ac-AA(1-27)-Asn28 (Trt)-CTC 树脂的制备AA(1^)-Asn (Trt) 28_CTC，乙酸酐，口比啶，DMF混合均勻后加入至反应器中反应，抽滤除去溶液；依次加入DMF洗涤，DCM洗涤，MeOH 洗涤，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α 1肽树脂。(4)树脂肽裂解制备粗肽裂解液，肽树脂冰浴下混合反应；然后过滤除去树脂，滤液加入到冰乙醚中沉降，分离制得胸腺肽α 1粗肽。(5)胸腺肽α 1粗肽的纯化以TFA溶液为流动相Α，乙腈为流动相B ；色谱系统采用反相C18，采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液。合并所有含量在90 %以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化。以磷酸溶液为流动相Α，乙腈为流动相B ；色谱系统采用反相C18采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98. 5%纯化液。合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，进行下一步脱盐纯化。以注射用水为流动相Α，乙腈为流动相B ；色谱系统采用反相C18填料柱，取第二次纯化得到的目的肽，采用梯度洗脱，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束。合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 1精制液用微孔滤膜精密过滤，冻干。本发明胸腺肽α 1的固相合成工艺已经纯化方法具有以下优点(1)本发明采用了 Fmoc策略，此方法操作简便，反应条件更温和，副反应少，在合成过程中避免了剧毒、强腐蚀性的氟化氢，既提高了反应的选择性，又使操作简单、安全，更易实现自动化，并且大大减轻了环保压力。(2)以Fm0c-Asn(Trt)-CTC树脂为合成其实原料，解决了王树脂与 Fmoc-Asn(Trt)-OH结合困难，易发生副反应的难题，提高了反应收率，降低了生产成本，更适合于工业化生产。(3)氨基酸激活试剂采用的是缩合效率更高的HATU，HATU可有效地促进有空间位阻的酰胺键的形成，对于胸腺肽α 1这种较长的肽可以减少空间结构对反应的影响，进而提高收率。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1 :AAa-27)-ASn (Trt) 28_CTC 树脂的合成称取替代度为0. 60mmol/g 的 Fmoc-Asn(Trt)-CTC 树脂 66. 7g GOmmol)，加入至反应器中，加入500ml DMF,打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，搅拌溶胀30分钟后停止，抽滤除去液体。然后向反应器中加入20%的哌啶/DMF溶液(脱帽液)500ml，在氮气保护下搅拌反应5分钟，抽去液体，用500ml DMF洗涤2次。再加入500ml脱帽液，搅拌反应 10分钟后抽除，用500ml DMF洗涤8次，洗去脱下的Fmoc保护基。称取Fmoc-Glu (OtBu) -OH 68g，HATU 60. 8g，溶于500ml DMF中，冰浴下加入冷却的NMM 26. 5ml，激活10分钟后加入到反应器中，在15°C 25°C下反应2. 5-3小时，以茚三酮显色法检测为准。然后抽滤除去反应液，加入400ml DMF洗涤3次。遵循多肽固相合成方法的一般规律，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽a 1氨基酸序列，依次把其余的26个氨基酸偶联至CTC树脂上，直至最后 Fmoc-Ser (tBu) -OH偶联完毕。然后用脱帽液脱去Fmoc保护，得到kh^-ksn (Trt) 28_CTC 树脂。实施例2 :Ac-AA(1"27)-Asn28 (Trt) -CTC 树脂的制备配制乙酰化溶液乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMFlOOOml，混合均勻后加入至反应器中，在氮气保护下反应M小时，然后后抽滤除去乙酰化溶液。依次加入IOOOmlDMF洗涤6 次，1500ml DCM洗涤3次，1000ml MeOH洗涤3次，每次洗涤5分钟。转出树脂，减压干燥， 得到胸腺肽α 1肽树脂Μ2. 2g。实施例3 树脂肽裂解制备粗肽(1)配制三氟乙酸/ 二巯基乙醇/水=90 5 5(v/v)裂解液MOOml，在-10°C 下预冻1 1。(2)置对2.28肽树脂于圆底烧瓶中，冰浴下冷却，加入已经预冻好的裂解液 MOOml，加入完成后撤除冰浴，室温下搅拌反应2. 5小时。然后过滤除去树脂，滤液加入到 10倍体积冰乙醚中。沉降5小时。4000转/分钟离心洗涤8次。转出沉淀，减压干燥，制得胸腺肽α 1粗肽73. 5g。实施例4 胸腺肽α 1粗肽的溶解将73. 5g粗肽研磨至粉末状，然后加入735ml纯水搅拌20分钟。滴加氨水将溶液 PH值调至6. 5-7.0之间，用纯水定容至4L，然后用0.45 μ m微孔滤膜过滤。滤液用1.0% TFA水溶液调pH值至2. 0-2. 5之间，再用0. 45 μ m微孔滤膜过滤。实施例5 胸腺肽α 1粗肽的纯化(1) 一次纯化以0. 1 % TFA溶液为流动相Α，乙腈为流动相B ；制备液相色谱系统采用10 μ m的反相C18 (41. 4X 250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5%的乙腈，平衡 15分钟，进样。采用梯度洗脱0 2min，5% 5%;2 42min，17% 23%;42 48min， 50% 50%。出峰时间在37min左右。分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液。合并所有含量在90%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化。(2) 二次纯化以0. 2%磷酸溶液(用氨水调pH至6. 5)为流动相A，乙腈为流动相B ；制备液相色谱系统采用5μπι的反相C1W41. 4X250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/ min,以5%的乙腈，平衡15分钟。取第一次纯化得到的目的肽收集液，进样。采用梯度洗脱 0 2min，5% 5%;2 32min，9% 15%;32 40min，40% 40%。出峰时间在 25min 左右。分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%。峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98. 5%纯化液。合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化。(3)脱盐以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B ；准备制备液相色谱系统，采用10 μ m的反相C18 01. 4X 250mm)填料柱，紫外检测器设定220nm，调流速40ml/min，先以80%的乙腈， 平衡10分钟，然后以2%的乙腈，平衡15分钟。取第二次纯化得到的目的肽收集液，进样。 采用梯度洗脱0 15min，5% 5% ;15 65min，5% 40%。主峰出现时开始收集至无峰出现时结束。合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 精制液660ml。(4)冻干取脱盐后的的胸腺肽α 1精制液，用0.22μπι微孔滤膜精密过滤，分装不锈钢盘冻干。制得胸腺肽α 1纯品25. 3g，产品总收率20. 3%。和现有技术比较产品总收率达到20%以上，而现有制备方法得到的总收率为 10 15%。和现有技术比较经过二次纯化及脱盐冻干的产品纯度可以达到99%以上，大于用现有制备和纯化方法得到的胸腺肽α 1的纯度(98% )。本发明中，缩略语的解释如下
权利要求
1.一种胸腺肽α 1的固相合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)NH2-Asn (Trt) -CTC 树脂的制备；(2)AA(1-27)-Asn (Trt) 28_CTC 树脂的合成；(3)Ac-AA(1"27)-Asn28(Trt) -CTC 树脂的制备；(4)用裂解剂制备胸腺肽α1粗肽；(5)胸腺肽α1粗肽的纯化。
2.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于步骤(1)中载体采用的为与氨基酸结合副反应少的CTC树脂。
3.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于步骤(2)中氨基酸激活试剂采用的是缩合效率更高的HATU和消旋化影响极低的ΝΜΜ。
4.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于步骤(3)乙酸酐和吡啶的摩尔用量均为树脂取代摩尔数的20倍。
5.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于步骤⑷的裂解剂是三氟乙酸/二巯基乙醇/水，按照90 5 5的体积配制而成，在-10°C预冷12小时，裂解切肽时将裂解液倒入预冷的乙醚中在室温下反应2. 5-3小时，沉降粗肽时乙醚体积用量是裂解试剂的10 倍，沉降完成后用离心的方法对粗肽进行洗涤浓缩。
6.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于步骤(5)中纯化方法采用的是两次纯化用不同的反相C18填料。
7.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)NH2-Asn(Trt) -CTC树脂的制备=Fm0c-Asn (Trt) -CTC树脂加入至反应器中，加入 DMF,打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，除去液体，然后向反应器中加入哌啶/DMF溶液进行反应，反应完毕抽去液体，用DMF洗涤，再加入哌啶/DMF溶液，搅拌反应后抽除，用 DMF洗涤，洗去脱下的Fmoc保护基，(2)AA(1^)-Asn(Trt)28-CTC树脂的合成取 Fmoc-Glu(OtBu)-0H，HATU，溶于 DMF 中，加入冷却的NMM，激活后加入到反应器中反应，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入DMF洗涤。按照胸腺肽α 氨基酸序列，重复以上的操作步骤，将其余沈个氨基酸依次偶联到树脂上，然后用哌啶/DMF脱去Fmoc保护，得到AA(1_27)-Asn(Trt)28_CTC树脂，(3)Ac-AA(^7)-Asn28(Trt)-CTC 树脂的制备AA(1-27)-Asn (Trt)28_CTC，乙酸酐，批啶，DMF 混合均勻后加入至反应器中反应，抽滤除去溶液；依次加入DMF洗涤，DCM洗涤，MeOH洗涤， 转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α 1肽树脂，(4)裂解制备粗肽裂解液，胸腺肽α1肽树脂冰浴下混合反应；然后过滤除去树脂，滤液加入到冰乙醚中沉降，分离制得胸腺肽α 1粗肽，(5)胸腺肽α1粗肽的纯化以TFA溶液为流动相Α，乙腈为流动相B ；色谱系统采用反相C18，采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化，以磷酸溶液为流动相Α，乙腈为流动相B ；色谱系统采用反相C18采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98. 5%纯化液，合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，进行下一步脱盐纯化，以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B ；色谱系统采用反相 C18填料柱，取第二次纯化得到的目的肽，采用梯度洗脱，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 1精制液用微孔滤膜精密过滤，冻干。
8.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1) AA(1-27)-Asn (Trt) 28_CTC 树脂的合成称取替代度为0. 60mmol/g的Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂66. 7g GOmmol)，加入至反应器中，加入500ml DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，搅拌溶胀30分钟后停止，抽滤除去液体，然后向反应器中加入20%的哌啶/DMF溶液(脱帽液)500ml，在氮气保护下搅拌反应5分钟，抽去液体，用500ml DMF洗涤2次，再加入500ml脱帽液，搅拌反应10分钟后抽除，用500ml DMF洗涤8次，洗去脱下的Fmoc保护基，⑵ AA(1_27)-Asn (Trt) 28-CTC 树脂的制备称取 Fmoc-Glu (OtBu)-OH 68g,HATU 60. 8g，溶于 500ml DMF 中，冰浴下加入冷却的 NMM 26. 5ml，激活10分钟后加入到反应器中，在15°C 25°C下反应2. 5-3小时，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入400ml DMF洗涤3次。遵循多肽固相合成方法的一般规律，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽α 1氨基酸序列，依次把其余的26个氨基酸偶联至CTC树脂上，直至最后Fmoc-Ser (tBu) -OH偶联完毕。然后用脱帽液脱去Fmoc保护，得到 AA(1_27)-Asn (Trt) 28-CTC 树脂，(3)Ac-AA(1"27)-Asn28(Trt) -CTC 树脂的制备配制乙酰化溶液乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMFlOOOml,混合均勻后加入至含有 AA(1-27)-Asn (Trt) 28-CTC树脂的反应器中，在氮气保护下反应M小时，然后抽滤除去乙酰化溶液，依次加入1000ml DMF洗涤6次，1500ml DCM洗涤3次，1000ml MeOH洗涤3次，每次洗涤5分钟，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α 1肽树脂Μ2. 2g，(4)树脂肽裂解制备粗肽配制三氟乙酸/ 二巯基乙醇/水=90 5 5 (ν/ν)裂解液MOOml，在-10°C下预冻 12h，将M2. 2g肽树脂于圆底烧瓶中，冰浴下冷却，加入已经预冻好的裂解液MOOml，加入完成后撤除冰浴，室温下搅拌反应2. 5小时，然后过滤除去树脂，滤液加入到10倍体积冰乙醚中，沉降5小时，4000转/分钟离心洗涤8次，转出沉淀，减压干燥，制得胸腺肽α 1粗肽 73. 5g,(5)胸腺肽α1粗肽的溶解将73. 5g粗肽研磨至粉末状，然后加入735ml纯水搅拌20分钟，滴加氨水将溶液pH值调至6. 5-7. 0之间，用纯水定容至4L，然后用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液用1. 0% TFA水溶液调PH值至2. 0-2. 5之间，再用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，(6)胸腺肽α1粗肽的纯化一次纯化以0. TFA溶液为流动相Α，乙腈为流动相B ；制备液相色谱系统采用10 μ m的反相C18 (41. 4 X 250mm)填料，紫外检测器设定220nm,调流速60ml/min,以5 %的乙腈，平衡 15分钟，进样，采用梯度洗脱0 2min，5% 5% ；2 42min，17% 23% ；42 48min， 50% 50%，出峰时间在37min左右，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化， 二次纯化以0. 2%磷酸溶液(用氨水调pH至6. 5)为流动相A，乙腈为流动相B ；制备液相色谱系统采用5 μ m的反相C18 01. 4X 250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min， 以5%的乙腈，平衡15分钟，取第一次纯化得到的目的肽收集液，进样，采用梯度洗脱0 2min，5% 5% ;2 32min，9% 15% ；32 40min，40 % 40%，出峰时间在 25min 左右，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98. 5%纯化液，合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈， 脱盐以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B ；准备制备液相色谱系统，采用10 μ m的反相 C18 (41. 4 X 250mm)填料柱，紫外检测器设定220nm，调流速40ml/min，先以80 %的乙腈，平衡10分钟，然后以2%的乙腈，平衡15分钟，取第二次纯化得到的目的肽收集液，进样，采用梯度洗脱0 15min，5% 5%; 15 65min，5% 40%，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 1精制液 660ml, 冻干取脱盐后的的胸腺肽α 1精制液，用0. 22 μ m微孔滤膜精密过滤，分装不锈钢盘冻干， 制得胸腺肽α 1纯品25. 3g。
全文摘要
本发明涉及胸腺肽α1的固相合成工艺，该工艺步骤如下(1)NH2-Asn(Trt)-CTC树脂的制备；(2)AA(1-27)-Asn(Trt)28-CTC树脂的合成；(3)Ac-AA(1-27)-Asn28(Trt)-CTC树脂的制备；(4)用裂解剂制备胸腺肽α1粗肽；(5)胸腺肽α1粗肽的纯化。
文档编号C07K14/575GK102286091SQ201110186259
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者张海涛, 徐岩, 曹翊婕, 李会成, 李郑武, 王丽娜, 王孝文, 葛存慧, 陈玉军, 高晶, 齐岩 申请人:哈药集团技术中心, 哈药集团生物工程有限公司