专利名称：一种腺病毒非结构蛋白免疫原、其抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及腺病毒领域，特别是可用于该病毒所致疾病的诊断领域的新的非结构蛋白免疫原以及相应的抗体和应用。
背景技术：
病毒的结构蛋白具有免疫原性并能激发较强的宿主免疫反应。然而，已有的研究也提示体液免疫和细胞免疫反应也可以由某些病毒的非结构蛋白激发。例如感染丙肝的患者体内具有NS3特异性抗体并可以利用重组NS3蛋白进行检测(参见:DiepolderHM, Zachoval R， Hoffmann RM, et al.， Possible mechanism involving T-1ymphocyteresponse to non—structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis Cvirus infection.Lancet,1995，346:1006-1007)。腺病毒(adenovirus,下文简称为Ad)可以引起广泛的人类疾病，包括呼吸道感染，胃肠炎、咽炎、角膜结膜炎、脑膜脑炎、急性出血性膀胱炎、肝炎等等。目前，已鉴定出58种不同的人腺病毒血清型，并根据免疫学、生物学和生化特征进一步划分为A-F六个组。腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-100nm。衣壳含有240个六邻体(hexon) >12个五邻体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋白，如V1、VII1、IX、IIIa和IVa2等。目前，腺病毒的诊断方法主要包括病毒的分离、血清学检测、病毒DNA检测以及酶联免疫吸附分析(ELISA)等。六邻体常被用于腺病毒的免疫学诊断，此外，纤毛的球状突起和蛋白IX也是进行腺病毒诊断的重要候选抗原(参见:Bauer U，Flunker G, Bruss K, et al.Detectionof antibodies against adenovirus protein IX， fiber， and hexon in human sera byimmunoblot assay.J Clin Microbiol 2005，43:4426-4433)。但是，目前尚未发现腺病毒的非结构蛋白具有免疫原性，并将其作为免疫原来制备抗体，从而进行腺病毒检测或者利用该非结构蛋白来检测腺病毒抗体。
发明内容
本发明是基于下述发现作出的:即腺病毒非结构蛋白，例如DNA结合蛋白(DNA-binding protein，DBP)，具有免疫原性。因而可以将其作为免疫原来制备抗体，并将其用于检测腺病毒抗体。因此，在本发明的第一方面，提供了一种腺病毒非结构蛋白，其中所述非结构蛋白具有免疫原性，并且其中所述非结构蛋白选自氨基酸序列包含序列2或4或者由所述序列组成的DNA结合蛋白和氨基酸序列包含序列6或由所述序列组成的蛋白(下文简称该蛋白为 117aa)。在本发明的第二方面，提供了一种核苷酸序列，其编码本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白。优选地，所述核苷酸序列包含序列1、3或5或其简并序列，或者由所述序列组成。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述载体包含本发明第二方面的核苷酸序列。在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，其包含本发明第三方面的表达载体。在本发明的第五方面，提供了一种抗体，其能够结合本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白。在本发明的第六方面，提供了本发明第五方面的抗体在制备用于检测受试者腺病毒感染的诊断剂中的用途。在本发明的第七方面，提供了一种用于检测受试者腺病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第五方面的抗体。在本发明的第八方面，提供了一种检测腺病毒抗体的方法，包括使本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白与受试者的样本相接触。在本发明的第九方面，提供了一种用于检测腺病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白。非结构蛋白例如DNA结合蛋白的表达先于结构蛋白例如六邻体蛋白的表达。利用这一特性，非结构蛋白可用于腺病毒感染的早期诊断。此外，在进行人群腺病毒感染的血清流行病学的筛查时，用结构蛋白并结合非结构蛋白进行检测可以提高筛查的敏感性。
图1示出通过二维电泳-免疫印迹分析获得的5型腺病毒(Ad5)和35型腺病毒(Ad35)感染的HEK293细胞中的差异表达蛋白。图1A至IH分别表示:正常HEK293细胞-抗Ad5猴血清、Ad5感染的HEK293细胞-抗Ad5猴血清、正常HEK293细胞-抗Ad5阳性健康人血清、Ad5感染的HEK293细胞_Ad5阳性健康人血清、正常HEK293细胞-抗Ad35猴血清、Ad35感染的HEK293细胞-抗Ad35猴血清、正常HEK293细胞-抗Ad35阳性健康人血清和Ad35感染的HEK293细胞-Ad35阳性健康人血清。结果表明，与正常细胞相比，感染Ad5的HEK293细胞有5个蛋白点进行差异表达，感染Ad35的HEK293细胞有7个蛋白点进行差异表达。图2示出5型腺病毒的重组DNA结合蛋白(Ad5 rDBP)和35型腺病毒的重组DNA结合蛋白(Ad35 rDBP)的免疫原性分析结果。Ad5rDBP和Ad35 rDBP利用杆状病毒表达系统进行表达、纯化获得，并将其分别利用阳性猴血清和健康人血清进行免疫印迹分析。图2A至2D分别为Ad5 rDBP-抗Ad5猴血清、Ad35 rDBP-抗Ad5猴血清、Ad5rDBP_Ad5阳性健康人血清和Ad35 rDBP-Ad35阳性健康人血清。结果表明，Ad5 rDBP和Ad35 rDBP与相应的猴血清及健康人血清均有较强的特异性反应。图3示出Ad5 rDBP和Ad35 rDBP反应的特异性。图A为小鼠抗Ad5 rDBP及抗Ad35 rDBP IgG抗体滴度的ELISA分析结果图。结果表明，重组蛋白Ad5 rDBP和Ad35 rDBP均诱导出较强的抗体，抗体滴度分别为1: 160，000和1: 160,000。图B为rDBP与相应小鼠抗-rDBP抗体特异性的免疫印迹分析结果图。结果表明，免疫小鼠血清在进行1: 5000稀释时，Ad5-rDBP和Ad35_rDBP均与相应的血清特异性地进行反应。图4A和图 4B分别示出Ad5 DBP和Ad35 DBP在HEK293细胞中的表达时相分析结果。结果表明，Ad5感染细胞12小时后即可以检测到DBP的表达，随着感染时间的延长，DBP的表达逐渐增加，至72小时达到最高水平。Ad35感染细胞12小时后，也检测到DBP的表达，在24小时表达量增加，在36，48和60小时均维持较高的水平，感染后72小时表达量逐渐下降。图5A和5B分别示出Ad5 DBP和Ad5六邻体蛋白在HEK293细胞中的表达时相分析结果。结果表明，Ad5感染细胞12小时后即可以检测到DBP的表达；而在Ad5感染细胞24小时后才可以检测到TK邻体蛋白的表达。序列说明序列1:Ad5 DBP的核苷酸酸序列序列2:Ad5 DBP的氨基酸序列序列3:Ad35 DBP的核苷酸序列序列4:Ad35 DBP的氨基酸序列序列5:Ad35 117aa的核苷酸序列序列6:Ad35 117aa的氨基酸序列
具体实施例方式本发明人意外地发现，腺病毒的非结构蛋白，例如DNA结合蛋白(DBP)和117aa，具有免疫原性，因而可以将其作为免疫原来制备抗体，并将其用于检测腺病毒抗体。基于此完成了本发明。因此，在本发明的第一方面，提供了一种腺病毒非结构蛋白，其中所述非结构蛋白具有免疫原性，并且其中所述非结构蛋白选自氨基酸序列包含序列2或4或者由所述序列组成的DNA结合蛋白和氨基酸序列包含序列6或由所述序列组成的蛋白，即117aa。在本申请中述及的“免疫原性”，是指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力，即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。在本申请中述及的“DNA结合蛋白”是指腺病毒的一种多功能蛋白，其在病毒DNA复制和调节病毒基因表达的过程中发挥重要作用。在本发明的第二方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白，例如DNA结合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列包含序列1、3或5或者其简并序列，或者由所述序列组成。在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述载体包含本发明第二方面的核苷酸序列。表达载体是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体的启动子通常与其受体同源，如以大肠杆菌为受体的表达载体，其启动子来源于大肠杆菌系统；在痘苗病毒中表达的启动子则来源于
痘苗病毒。在一个优选的实施方案中，所述表达载体可以是例如哺乳动物细胞表达载体或杆状病毒表达载体。最优选地，所述表达载体 为Bac-to-Bac杆状病毒表达载体。Bac-to-Bac杆状病毒表达载体是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体、昆虫细胞为受体的表达系统。在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞包含本发明第三方面的表达载体。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞。最优选地，所述宿主细胞为high 5昆虫细胞。如上文所述以及下文更为详细的描述，腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白具有免疫原性。这为制备腺病毒抗体提供了另外的途径。另外，通过将下文实施例中给出的结构蛋白例如六邻体蛋白和非结构蛋白DNA结合蛋白的表达时相对比，可以发现，非结构蛋白例如DNA结合蛋白先于结构蛋白例如六邻体蛋白的表达，这提示在腺病毒感染机体后，非结构蛋白例如DNA结合蛋白将更早地引发免疫应答，产生抗体。基于此，可将其用于腺病毒感染的早期诊断。此外，在进行人群既往感染腺病毒的本底筛查时，用结构蛋白六邻体蛋白并结合非结构蛋白进行检测可以提高筛查的敏感性。在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体能够结合本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白。优选地，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。所述单克隆抗体可以通过例如杂交瘤细胞产生。所述多克隆抗体可以通过用本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白免疫动物获得。
在本发明的第六方面，提供了一种本发明第五方面的抗体在制备用于检测受试者腺病毒感染中的用途。在本发明的第七方面，提供了一种用于检测受试者腺病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含第五方面的抗体。优选地，所述试剂盒用于通过例如免疫印迹来检测腺病毒感染。在本申请中述及的“受试者”是指哺乳动物，但不限于此。优选地，受试者指人。正如上文所述和下文实施例部分详细记载，腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白先于腺病毒结构蛋白例如六邻体蛋白而表达。因此，在使用本发明第五方面的抗体即腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白特异的抗体或者本发明第七方面的试剂盒来检测腺病毒感染时，可以更早地检测到受试者是否被腺病毒感染。在本发明的第八方面，提供了一种检测腺病毒抗体的方法，包括使本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白与受试者的样本相接触。优选地，检测通过免疫印迹进行。优选地，以5型或35型腺病毒抗体为检测对象。优选地，所述样本为哺乳动物例如人的血液、血清等，但不限于此。在本发明的第九方面，提供了一种用于检测腺病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面的腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白。优选地，所述试剂盒用于通过例如免疫印迹来检测腺病毒抗体。优选地，所述腺病毒抗体为5型或35型腺病毒抗体。更优选地，所述腺病毒非结构蛋白选自氨基酸序列包含序列2或4或者由所述序列组成的DNA结合蛋白和氨基酸序列包含序列6或者由所述序列组成的117aa。从实施例部分可知，通过非结构蛋白例如DNA结合蛋白的腺病毒抗体检测与通过六邻体蛋白的腺病毒抗体检测相比，两者有具有明显的相关性，检测结果具有较好的一致性，并且前者较后者灵敏度更高。通过对腺病毒IgG抗体进行检测，就可以获得人群中腺病毒感染的血清流行病学的基本数据。实施例下面结合优选实施例并结合附图进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook, et al.New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法进行。实施例1 DBP作为腺病毒基因组编码抗原的鉴定将野生型Ad5 和 Ad35 分别以感染复数(multiplicity of infection, MOI) =5感染HEK293细胞，并置于37°C 5% CO2孵育I小时后，弃掉病毒接种液，补加DMEM维持液(含2%胎牛血清，I %谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)，置于37°C 5%CO2培养箱内培养。在感染后36小时，收集感染的HEK293细胞，用RIPA裂解缓冲液[25mMTris (pH 7.4), 150mM NaCl，I % NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS]进行裂解，获得总蛋白。取约75yg总蛋白上样，利用pH3-10的预制胶条进行第一维等电聚焦电泳分离。电泳结束后，第一维电泳胶条利用平衡缓冲液[50mM Tris (pH 8.8)，6M尿素，20%甘油，2%SDS, I % DTT]平衡15分钟后，进行12% SDS-PAGE电泳。电泳结束后，其中一块二维电泳凝胶进行固定并用考马斯亮蓝R-250染色，进一步进行质谱分析。另一块相同的二维电泳凝胶转移至硝酸纤维素膜进行免疫印迹(Western blot)分析。野生型Ad5和Ad35总蛋白经过二维电泳后转至硝酸纤维素膜(Pali公司产品)进行免疫印迹。用5%脱脂奶封闭2小时后，与自制抗Ad5及Ad35猴血清(I: 1000)或Ad5及Ad35抗体阳性的健康人血清(I: 400)孵育过夜。膜经0.1 % PBST (0.1 % Tween 20-PBS)洗涤五次后，加入相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猴或抗人IgG 二抗(Sigma公司产品，货号分别为A2054和A8792)。用0.1 % PBST充分洗膜，用ECL检测系统检测(Thermo公司产品，货号:32209)。结果见图1。与正常细胞相比，感染Ad5的HEK293细胞有5个蛋白点进行差异表达，感染Ad35的HEK293细胞有7个蛋白点进行差异表达。
根据二维电泳和免疫印迹的结果，将感染Ad5和Ad35的HEK293细胞差异表达的蛋白分别从考马斯亮蓝染色的凝胶上切下，送北京蛋白质组研究中心利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/1nization Time of FlightMass Spectrometry, MALD1-T0F/T0F) (ABI4800 plus ；Applied Biosystems 公司产品)进行质谱检测，结果利用MASCOT 2.0软件进行分析。结果见表I和表2。鉴定出的Ad5免疫原性蛋白包括四个结构蛋白(六邻体、纤毛球形突起的F链、五邻体、蛋白VII前体)和一个非结构蛋白(DNA结合蛋白(DBP))。Ad35的免疫原性蛋白包括五个结构蛋白(六邻体、纤毛球形突起的F链、五邻体、蛋白VII前体、六邻体相关蛋白IX)和两个非结构蛋白(DNA结合蛋白(DBP)、117aa)。表1.利用免疫蛋白质组学方法鉴定的Ad5感染HEK293后差异性表达的蛋白
权利要求
1.一种腺病毒非结构蛋白，其中所述非结构蛋白具有免疫原性，并且其中所述非结构蛋白选自氨基酸序列包含序列2或序列4或者由所述序列组成的DNA结合蛋白和氨基酸序列包含序列6或由所述序列组成的蛋白。
2.一种核苷酸序列，其编码权利要求1的腺病毒非结构蛋白；优选地，所述核苷酸序列包含序列1、3或5或其简并序列，或者由所述序列组成。
3.—种表达载体，所述载体包含权利要求2的核苷酸序列；优选地，所述载体为哺乳动物细胞表达载体或杆状病毒表达载体，更优选Bac-to-Bac杆状病毒表达载体。
4.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求3的表达载体；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选为high 5昆虫细胞。
5.一种抗体，其能够结合权利要求1的腺病毒非结构蛋白；优选地，所述抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体。
6.权利要求5的抗体在制备用于检测受试者腺病毒感染的诊断剂中的用途；优选地，所述腺病毒为5型或35型腺病毒；优选地，所述受试者为哺乳动物，更优选人。
7.一种用于检测受试者腺病毒感染的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求5的抗体；优选地，所述试剂盒用于通过免疫印迹检测腺病毒感染；优选地，所述受试者为哺乳动物，更优选人。
8.—种检测腺病毒抗体的方法，包括使权利要求1的腺病毒非结构蛋白与样本相接触；优选地，所述样本为哺乳动物例如人的血液或者血清；优选地，所述样本为人的血清。
9.一种用于检测腺病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1的腺病毒非结构蛋白；优选地，所述试剂盒用于通过`免疫印迹检测腺病毒抗体。
全文摘要
本申请公开了一种具有免疫原性的腺病毒非结构蛋白例如DNA结合蛋白、该蛋白特异的抗体、以及它们的应用。
文档编号C07K14/075GK103242433SQ20121003322
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者王健伟, 郭丽, 吴成君 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所