专利名称：拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及ー种转录因子基因此/7的原核表达载体m^a-Dofl及其在制备Dofl重组蛋白中的应用。
背景技术：
Dof转录因子是植物特异性转录因子，从第一个Dof蛋白的cDNA序列在玉米中获得以来(Yanagisawa S，Izui K. 1993，J Biol Chem, 268:16028-16036)，许多单子叶和双子叶植物中的Dof蛋白基因被分离，如拟南芥、烟草、南瓜、马铃薯、大麦、小麦、水稻等(Yanagisawa S. 2002, Trends Plant Sci, 12:555-560)。研究表明，Dof转录因子在植物生长发育过程中參与多种生物学过程，其中包括參与光应答和碳氮代谢、种子发育和萌发、植物激素应答、微管系统发育等多个途径。研究发现，玉米Dof I 在拟南芥(Yanagisawa S，Sheen J. Plant Cell, 1998,10:75-89)和马铃薯中(Yanagisawa S, Izui K. J Biol Chem, 1993，268:16028-16036;Kumar R, Taware R. Mol Biol Rep, 2009，DOI 10.1007/s 11033- 008-9436-8)过量表达可促进与碳骨架合成有关酶表达的增加，进而參与光应答基因的表达调控。此外，玉米Dof家族的一类蛋白-PBF( Prolamin box Binding Factor)还可作为储存蛋白基因的反式作用因子，对种子储藏蛋白基因的转录进行调控(Mena M, et al. Plant J, 1998, 16:53-62)。小麦中的Dof基因在调控光应答基因方面起了重要作用，主要涉及ー些与光合以及鹿糖运输有关的基因(Tanaka MY, Takahata Y，Nakayama H，et al. Planta, 2009,DOI 10. 1007/s00425- 009-0979-2)。松树的PpDof5转录因子调控树木发育过程中氨同化必需的 GS 基因的表达(Rueda-Lopez M, Crespillo R, Canovas FM, et al. PlantJ, 2008, 56(1):73-85)。红薯的Dof蛋白基因通过负调控ー个液泡反转录酶基因
的表达进而影响块根的碳代谢水平(Isabel-LaMoneda I, DIaz I, Martinez M,et al. Plant J, 2003, 33:329-340)。水稻的Dof转录因子家族包括30个Dof基因，其中已知 Dof3 的 DNA 结合域可与 GARE (Gibberellic Acid Response Element)结合，參与赤霉素调控谷粒萌发中糊粉层水解酶基因的表达(Park DH, Lim PO, Kim JS, et al. PlantJ, 2003, 34:161 171),OsDof可能还參与病菌引起的抗氧化过程(Mou ZL, Fan WH, DongXN, Cell, 2003, 113: 935-944)并与光周期开花调控有关(Li DJ, Yang CH, Li XB, etal. Planta, 2009， 229: 1159 1169)。研究证明拟南芥Dof转录因子家族包括36个基因(Li javetzky D, CarboneroP，Vicente-Carbajosa J. BMC Evol Biol, 2003, 3:17), Yanagisawa 等研究发现玉米Dofl在拟南芥中过量表达可促进与碳骨架合成有关酶表达的增加，拟南芥的PEPC和丙酮酸激酶(PK)基因的表达均被激活，并且PEPC和PK的酶活性显著增加。伴随着葡萄糖含量的減少，ー些游离氨基酸，特别是谷氨酸含量提高，并且转Dofl基因的拟南芥植株中氮含量提高30%，在低氮条件下拟南芥生长也有所改善。拟南芥COGl基因编码ー个Dof转录因子，在光敏色素信号转到过程中作为PhyA和phyB信号途径的负调控子发挥作用，过量表达COGl降低了转基因拟南芥植株对红光和远红光的敏感性(Ward JM et al. Plant Cell,2005，17:475-485)。Dof转录因子0BP3也參与调控拟南芥光敏色素和隐花色素的信号转导(Iwamoto M, Higo K，Takano M. Plant Cell Environ, 2009, 32(5): 592-603)。Kang HG 等发现 Dof 蛋白会对生长素(Kang HG, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94: 7685-7690)和水杨酸(Kang HG. Plant J, 2000, 21:329-339)产生应答。此外，Dof转录因子也參与植物的微管组织形成(Pineau C，et al. Plant J, 2005, 44: 271-289;Konishi, et al. Plant and Cell Physiol, 2007, 48: S197—S197; Yong Guo, et al.The Plant Cell, 2009，21: 3518 - 3534)、种子萌发(Gualberti G, Papi M, BellucciL, et al. Plant Cell, 2002, 14: 1253 263)以及植物开花过程(Fabio Fornara, etal. Developmental Cell, 2009,17: 75 - 86)。
由于Dof蛋白有多种特性，因此加强了人们对于Dof蛋白的深入研究，利用这个转录因子的过量表达可用于改善农作物代谢的遗传操作。Dofl蛋白特异性抗体是检测植物中Dofl蛋白表达水平的有效工具。目前尚未有含有拟南芥转录因子Dofl基因原核表达及制备Dofl抗体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥转录因子Dofl的原核表达载体(pET32a-ito/7 )，该载体含有17启动子和终止子，细菌核糖体结合位点和以及ー个由6个氨基酸组成的组氨酸标签His-Tag和Dofl基因cDNA全长序列。本发明中Dofl基因上游有17启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ガ0/7基因的起始密码子上游有ー个由6个氨基酸组成的组氨酸标签His-Tag。本发明载体中的ル/7基因来源于拟南芥thaliana,生态型Col)的cDNA，在GenBank中的登录号为NM_104048. 3。本发明另一目的是将拟南芥基因特异cDNA片段的原核表达载体应用在制备Dofl重组蛋白和特异肽段中。利用本发明提供的载体转化大肠杆菌(BL21)，可实现Dofl蛋白的高水平表达，回收分泌到细胞质中的Dofl蛋白，可用于Dofl特异抗体的制备。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案
I、Dofl基因的cDNA片段的扩增
从GenBank中查找拟南芥色素调控蛋白基因的编码区基因序列，并设计序列如下的一对引物
Dofl5 :5’ -CACCATGGATCTGACGTCAGC-3，，划线处为酶切位点Afcol，
Dofl3 :5’ -GTCGACTCAATTCTTCTCCATTCTGTTC-3，,划线处为酶切位点 SalI,
对拟南芥(Arabidopsis thaliana, ecotype, Columbia)的总 RNA 进行 RT-PCR,得到Dofl的编码区全长。2、原核表达载体pET32a_ito/7的构建
(I)回收并纯化ガ0/7的编码区基因片段，并将其连接到pMDlS-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD18-ito/l。
(2)使用AfcoI和Sal\对质粒pMD18_ito/l和pET32a进行双酶切分别获得ガo/7基因和pET32a载体片段，电泳后分别进行回收，然后连接、转化，获得重组质粒pET32a-ito/7。3,Dofl基因的重组蛋白诱导条件的优化
原核表达载体pET32a-ito/7用热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用IPTG进行诱导表达重组蛋白，并对表达时间、IPTG浓度和温度条件进行优化，确定重组蛋白的最优表达条件。实验结果显示该蛋白的最优表达条件为为ImMIPTG 于 28°C诱导 6h。本发明的技术优点及效果
从植物体中已鉴定出一系列Dof转录因子基因，參与调控植物多个生理生化过程中相关基因的表达，对其进行遗传操作可改善农作物的品质和抗性。本发明以拟南芥cDNA为模板，克隆出ガ0/7转录因子基因全长，构建其原核表达载体pET32a-ito/7，该载体含有17启动 子，细菌核糖体结合位点和一个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆菌BL21可实现Dofl蛋白的高水平表达，回收分泌到细胞质中的Dofl蛋白，制备的抗血清，一方面可用于植物体内Dofl表达水平的检测，为后期通过遗传操作研究Dofl蛋白的生理功能和分子功能的研究奠定基础；另一方面为其他的转录因子表达水平的检测提供了一种技术手段。本方法首次公开了拟南芥转录因子基因原核表达及制备Dofl蛋白抗体。
图I是本发明中拟南芥总RNA的电泳检测示意图，其中1-2泳道均为所提拟南芥总 RNA。图2是本发明中此/7基因的TA克隆策略示意图。图3是本发明Dofl基因的扩增和TA克隆电泳检测示意图，其中A是以拟南芥RNA为底物反转录成cDNA进行RT-PCR，M A mk/Hindlll ;1_3 -.Dofl的RT-PCR扩增产物；B是重组质粒pMD18-ito/7的电泳检测，M :正对照(分子量为3. 3 kb的质粒)；1_2 :重组质粒pMDl8-Dofl ；C是重组质粒pMD18-ito/7的PCR检测，M DL2000 ；1 :正对照(以拟南芥cDNA为模板的PCR产物)；2-3 以pMD18-ito/7质粒为模板用Dof 15和Dof 13引物扩增的PCR产物；D是重组质粒pMD18-ito/7的酶切检测，M DL2000 ；1~2 =AfcoI和Sall双酶切产物。图4是本发明原核表达载体pET32a_ito/7的构建策略示意图。图5是本发明pMD18_ito/7与pET_32a质粒使用AfcoI和Sal\酶切结果电泳检测示意图，其中 M Trans 2K plus ;1_3 :pMD18_ito/7 质粒酶切结果；4_5 :pMD18_ito/7 质粒对照；6-8 pET-32a质粒酶切结果；9 :pET_32a质粒对照。图6是本发明pMD18_ito/7与pET_32a质粒使用AfcoI和Sall酶切后胶回收结果电泳检测图，其中M :Trans 2K plus ；1 :回收到的此/7片段；2 :回收到的pET_32a片段。图I是本发明pET32a_ito/7质粒的电泳检测示意图，其中1_5 pET32a_ito/7质粒。6: pET-32a质粒对照。图8是本发明pET32a_ito/7的PCR检测电泳图(引物使用Dofl5和Dofl3)，其中M =Marker ；1~2 :负对照(分别以ddH20和pET32a质粒为模板扩增的PCR产物)；3~7 以pET32a-ito/7质粒为模板的PCR扩增产物电泳检测图；8 :正对照(以pMD18_ito/7质粒为模板扩增的PCR产物)。
图9是本发明pET32a_ito/7的酶切电泳检测图，其中M =Trans 2K plus ；1 :使用AfcoI和5 /1的双酶切产物。图10是本发明BL21的菌液PCR检测电泳图(引物使用Dof 15和Dof 13)，其中M :Trans 2K plus ；1 :正对照(使用pMD18_ito/7质粒为模板扩增的PCR产物)；2_3 :使用转入m^a-Dofl的BL21菌液为模板扩增的PCR产物；4_5 :负对照(使用转入pET_32a的BL21菌液为模板扩增的PCR产物)；6 :负对照(使用pET-32a质粒为模板扩增得PCR产物)。图11是本发明总蛋白SDS-PAG电泳检测图，其中M =Protein Marker-0431 ；1 :转pET32a-ito/7 的 BL21 (未カロ IPTG 诱导)；2 :转 pET_32a 的 BL21 (未カロ IPTG 诱导);3_5 :转pET32a-ito/7 的 BL21 (37 °C, I mM IPTG 分别诱导 2，4，6 h) ;6 :转 pET_32a 的 BL21 (37°C，1 mM IPTG 诱导 4h) ;7-9 :转 pET32a-ito/7 的 BL21 (28 °C,1 mM IPTG 分别诱导 2，4，6h) ;6 :转 pET-32a 的 BL21 (28 °C,1 mM IPTG 诱导 4h)。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进ー步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。本实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等，各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯，仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所用引物序列均在上海生工合成，本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I :拟南芥总RNA的制备与检测
拟南芥总RNA的提取使用TRIzoL Reagent (RNA提取试剂，Invitrogen)试剂,对说明书方法稍做修改后进行。取全株幼嫩拟南芥0. I g,加入I ml的TRIzoL RNA提取液,混勻室温静置5 min,加入0.2 ml氯仿,振荡混勻,4 °C, 12000 rpm/min离心15 min。转移上清液，加入0.5 ml异丙醇,混勻室温放置10 min后12000rpm/min离心10 min。弃上清,75%的こ醇I ml清洗沉淀,4 °C, 7500 rpm/min离心5 min,真空干燥沉淀,用20 U I焦碳酸ニこ酷(DEPC)处理水溶解RNA，-20 V。取Iul RNA用I. 2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果(图I)说明提取到的RNA质量符合要求。 实施例2 :拟南芥cDNA的合成
用拟南芥总 RNA 为模板，使用 RevertAid -MuLV Reverse Transcriptase Kit (反转录试剂盒，Fermentas)进行 cDNA 的合成。取植物总 RNA 0. 1-0. 5 u g, Oligo (dT) 50ng,10 mM dNTP mix I u I,用DEPC处理水补足至9 yl，混匀后，短暂离心将其收集于管底，置于65で恒温干热加热器中加热5 min，冰浴10 min，加入反应混合物11 u I (10XRTBuffer 4u 1,25 mM MgCl2 4 u 1,0. I M DTT 2 u I, RNA 酶抑制剂 I y I )，混匀，短暂离心将其收集于管底，25で保温2 min，加入I RevertAicT-MuLV反转录酶，混匀25で保温20 min，然后42で保温70 min，冰浴10 min, -20で保存备用。实施例3 -.Dofl基因的扩增与TA克隆
Dofl基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首选从GenBank中查找此/7的编码区序列全长，并设计ー对引物，序列如下
Dofl5 :5’ -CACCATGGATCTGACGTCAGC-3’,
Dofl3 :5’ -GTCGACTCAATTCTTCTCCATTCTGTTC-3，,
5’端引物Dofl5 ，末端添加AfcoI位点；3’端引物Dof 13，末端添加5^1位点。用Dofl基因上下游特异性引物Dof 15和Dof 13作RT-PCR，在RT-PCR反应混合液中加入3 ill的cDNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物Dof 15和Dof 13，2. 5 u I dNTP(2. 5 mM，)0. 25ii I 的 Ex taq DNA 聚合酶(5 U/y I)和 2. 5 y I 的 IOXEx taq 酶反应缓冲液(日本宝生物)，加双蒸水使反应终体积为25iU。在PCR仪上于94°C加热2分钟，然后按照94で、30秒，55で、30秒，72で、45秒的程序进行30个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到AT77基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分萬Dofl的PCR扩增产物(图3A)，回收并纯化此/2编码区全长片段(600 bp)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒将其连接到pMD18_T (大连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5 a (购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳(图3B)，选取大小和理论值相符的重组质粒pMD18-ito/7做进ー步的PCR检测，用Dofl基因上下游特异性引物Dofl5和Dof 13作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出600 bp左右的此/7基因DNA片段(图3C)。根据阳性重组质粒pMD18-ito/7载体两端的多克隆位点，用AfcoI和Sall双酶切重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD18-ito/7产生2条带，一条为600bp左右的基因DNA插入片段，另一条为2. 7 kb的载体片段(图3D)，经序列分析证明该载体中的插入片段是的编码区全长片段。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD18_ito/7。实施例4 :原核表达载体pET32a_ito/7的构建
pET32a~Zto/7 的构建策略如图 4 所不，用 AfcoI (Fermentas)和 5 /1 (Fermentas)切开纯化的质粒载体pET32a (Novagen)和pMD18_ガo/7,通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段(图5)，从凝胶中回收pET32a被切割后产生的载体片段(5. 9kb)及pMD18_ito/7被切割产生的ガo/7基因的DNA片段(600 bp)(图6)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET32a片段和Dofl基因的DNA片段产生原核表达pET32a_ito/7。用连接反应混合物转化高效率(IO8)的大肠杆菌感受态(DH5 a，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100 u g/ml)的LB平板上，于37°C过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒(图7)，以ガ0/7基因上下游引物进行PCR扩增检测(图8)，连接成功的质粒载体pET32a-ito/7可扩增出大小为600bp饱DofI片段。使用AfcoI和5^1进行酶切重组质粒进行检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生的条带与预期结果相符(图9)。通过测序后再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a，挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒pET32a_ito/7。实施例5 m^a-Dofl的原核表达
选取确认正确的pET32a-ito/7质粒，转化大肠杆菌BL21，具体步骤为将2 ul纯化质粒加入感受态大肠杆菌BL21 100 ill中，冰浴20 min后，42°C热刺激45 S，冰浴10 min ;カロA 900 u I SOC液体培养基，37°C、200 rpm摇床培养60 min ； 10000 rpm离心Imin ;在超净台上吸去上清，剩约100 时，用枪吸打混匀，转入带有Amp抗性的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取单克隆，接种于添加Amp的LB液体培养基中，37°C，180 rpm摇床过夜培养。以ガo/7基因上下游引物进行菌落PCR扩增检测，转化成功的阳性克隆可发现600bp的Dofl条带(图10)。挑取确定转化成功的含有pET32a_ito/7的BL21大肠杆菌菌株接种于含有Amp的LB液体培养基中，37で过夜培养后，取500 ill菌液于盛有50 ml液体LB培养基中，37で、180 rpm摇床培养2 h左右，测定菌液OD值到0. 6-0. 8。之后，取出2 ml菌液后，将剩余菌液中添加IPTG (使用终浓度为I mM)诱导，分别于37°C和28°C条件下，180 rpm摇床培养，每隔两小时取一次样品，使得样品分别为ImM IPTG诱导2，4，6 h。将取得的菌液4°C，12000 rpm 离心 2 min,弃上清后，使用 I ml Washing Buffer (10% 甘油，100 mM Tris-HCl(pH7. 4))清洗2次，加入100 ul ddH20，超声破碎至溶液澄清，4で，12000 rpm离心2 min后加入25 ul 5XLoading Buffer,沸水浴中煮沸10 min, -20 °C保存用于蛋白分析。实施例6 :原核表达载体pET32a_ito/7的SDS-PAGE电泳检测
分别分离胶(8 ml ddH20 ；10 ml Solution A :30% 丙烯酰胺储存液；5. 3 ml SolutionB 1. 5 M Tris (pH8. 8),0. 4% SDS ；0. 25 ml 10% 过硫酸铵；0. 013 ml TEMED 溶液)和浓缩胶(6. 3 ml ddH20 ；1. 6 ml Solution A :30% 丙烯酸胺储存液；2. I ml Solution C :0. 5 MTris(pH6. 8),0. 4% SDS ；0. 13 ml 10% 过硫酸铵；0. 018 ml TEMED 溶液)，每种样品取 10 ul上样，电压100 V，电流70-90 mA，电泳结束后，取出分离胶，加入染色液(0.25g考马斯亮蓝溶解于90ml甲醇水(1:1)和IOmL冰醋酸溶液中过滤出去颗粒物质)染色30min,之后使用脱色液(90%甲醇,2%冰醋酸)脱色60 min,去除染色液,加入蒸懼水,摇床45 rpm脱色至条带清晰。可见有Dofl的特异性条带出现，而未加IPTG诱导的pET32a-ito/7菌液，以及添 加了 IPTG培养的由pET32a空载体转化的BL21菌液中没有此条带产生(图11)，当用I mMIPTG诱导6小时后Dofl蛋白表达量最高。
权利要求
1.拟南芥ガo/7基因特异cDNA片段的原核表达载体，其特征在于含有17启动子和终止子，细菌核糖体结合位点、ー个由6个氨基酸组成的组氨酸标签和ガ0/7特异cDNA片段。
2.根据权利要求I所述的拟南芥基因特异cDNA片段的原核表达载体，其特征在于-.Dofl基因的上游有17启动子和细菌核糖体结合位点RBS，17启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ガ0/7基因片段的起始密码子上游是ー个由6个氨基酸组成的组氨酸标签序列His-Tag。
3.根据权利要求I的拟南芥此/7基因特异cDNA片段的原核表达载体，其特征在于转录因子基因ガo/7的cDNA来源于拟南芥，其在GenBank登录号为NM_104048. 3。
4.权利要求I的拟南芥ガ0/7基因特异cDNA片段的原核表达载体在制备Dofl重组蛋白和特异肽段中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达转录因子的原核表达载体pET32a-Dof1。该载体是含有拟南芥转录因子基因(Dof1)的原核表达专用载体。本发明使用RT-PCR的方法从模式植物拟南芥中克隆出Dof1基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中表达，在IPTG诱导乳糖操纵子时在EcoliBL21中过量表达，表达的重组蛋白质分泌到细胞质中，不形成包涵体，分离得到的重组蛋白质，可作为抗原用于Dof1抗体制备。
文档编号C07K14/415GK102643851SQ20121012772
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者李昆志, 潘丽峰, 王艺霖, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学