专利名称：小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY80的克隆及其应用。
背景技术：
近年来土壤盐溃化及水资源短缺是制约农业生产的ー个全球性问题。盐害与干旱不仅严重影响植物的生长发育，造成作物减产，而且使生态环境日益恶化(Saibo et al.，Annals of Botany, 2009, 103 (4) : 609-623)0因此，提高作物的抗旱和/或耐盐能力已经成为现代作物育种工作急需解决的关键问题之一。分离克隆耐盐基因，培育耐盐新品种已成为全世界的研究热点之一。小麦是重要的农作物，克隆耐盐、抗旱基因，培育耐盐、抗旱小麦新品种已成为当前ー个十分迫切的任务。
目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的的进展。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，可以使转基因植物的抗盐能力提高(Chinnusamy et al. , Crop science, 2005, 45:437-448·)。转录因子在基因表达和环境胁迫响应中起着关键的调控作用。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的转录因子。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力(Nakashima K. , Plant Physiology, 2009, 149: 88 - 95·)。WRKY是ー个转录因子家族，其成员广泛參与植物的正常生长发育和对各种环境胁迫的响应过程。转基因研究实验表明过表达ー些WRKY转录因子基因可提高转基因植株的耐盐和耐旱性。例过表达大 的GmWRKY54基因可使转基因拟南介的耐盐和耐旱性提闻 (Zhou et al. , Plant Biotechnology Journal, 2008，6，486-503.)。将大麦的//FfSXTJS转入牧草可提高转基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al. , Molecular Breeding,2010, 25: 419 - 432.)。AtWMY25、AtWRKY33过表达拟南芥也增加了对盐胁迫的耐受性。目前有关小麦WRKY转录因子在耐盐方面的研究还非常有限，Niu et al研究表明过表达
和可提高转基因拟南芥的耐盐和耐旱性(Niu et al.，Plant cell andenvironment, 2012)。进ー步克隆小麦耐盐、旱相关基因，通过基因工程培育小麦耐盐、耐旱新品种非常重要。
发明内容
本发明的目的在于，提供了首次从小麦中分离出ー个耐盐、抗旱的WRKY转录因子基因，命名为7 / ァ洲。将该基因连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株提尚。本发明的技术方案为一个耐盐、抗旱的WRKY转录因子基因TaWRKY80的cDNA序列如SEQ ID No. I所示,氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本发明小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80的制备方法首先根据小麦的基因芯片表达谱数据选出在小麦幼苗根中受盐胁迫显著上调表达的WRKY转录因子基因(探针)，然后根据探针序列设计基因特异性引物，进ー步从小麦根的全长cDNA文库中克隆其全长cDNA，最后转化到拟南芥中进行功能研究。I.引物设计
根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrky2: 5丨-CTTAGGGAATTTTGCCACACTCTTTG-3'，与文库的 Y 端锚定引物 NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’进行配对，以小麦幼苗根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。2. PCR反应体系(50μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文库 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至终体积50 μ I
94°C 预变性 3min ;94°C变性 45sec，58°C复性 lmin，72°C延伸 2min，循环 35 次；72°C延イ申5min。3. 1%琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测后发现在IOOObp处有一条目的条带(图I)。4.扩增片段的回收、与T载体的链接 对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。PCR产物与pGEM-T (Promega)载体连接,连接体系为
回收的PCR产物7μ1
10 X Τ4连接酶缓冲液 μ
pGEM-T 载体(50ng/ μ I) μ
T4DNA 连接酶(3U/ μ I) (Takara) μ于4°C冰箱连接过夜。5.回收片段的克隆与测序
用CaCl2法制备大肠杆菌DH5a (购自天为时代生物公司)感受态细胞，42°C水浴热激法进行转化。向转化后培养Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混匀，用涂布器将其均匀涂到含有氨苄青霉素的平板上，37°C恒温倒置培养过夜，待出现明显单菌落时将平板拿出。根据所用pGEM-T载体克隆位点两端的T7启动子和SP6启动子序列设计通用引物T7，SP6对重组克隆进行PCR鉴定。PCR 程序94°C 预变性 IOmin ;94°C变性 lmin，58°C复性 lmin，72°C延伸 ImirUM环35次；72°C延伸5min ；
PCR扩增产物用1%琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见SEQ ID No. I。小麦耐盐、抗旱基因洲在培育耐盐、抗旱植物中的应用。尤其是在普通小麦、玉米和水稻植物中的应用。
本发明的有益效果是将小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株提高。
图I :7 腸D撕基因全长cDNA序列的扩增結果。M :DNA分子量marker。图2 :不同处理条件下TaWRKY80基因在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT-PCR表达分析，TaActin为内參。图3 :构建的植物表达载体pCAMBIA_superl300/TaWRKY80的酶切验证結果。图4 :转基因拟南介株系的表型鉴定，
4-A :不同处理条件下对照及转基因拟南芥株系的表型，
CK为正常生长条件，
4-B至4-G :不同处理条件下对照及转基因株系植株根长统计結果，
图5 :正常生长条件下转基因株系与未转基因对照株系中脯氨酸含量的測定。
具体实施例方式实施例I、TaWRKY80基因cDNA序列的克隆
I.引物设计
根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrky2: 5丨-CTTAGGGAATTTTGCCACACTCTTTG-3'，与文库的 Y 端锚定引物 NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’进行配对，以小麦幼苗根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。2. PCR反应体系(50 μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文库 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至终体积50 μ I
94°C 预变性 3min ;94°C变性 45sec，58°C复性 lmin，72°C延伸 2min，循环 35 次；72°C延イ申5min。3. I %琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测后发现在IOOObp处有一条目的条带(图I)。4.扩增片段的回收、与T载体的链接
对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。PCR产物与pGEM-T (Promega)载体连接,连接体系为
回收的PCR产物7μ1
10 X Τ4连接酶缓冲液 μ
pGEM-T 载体(50ng/ μ I) μ T4DNA 连接酶(3U/ μ I) (Takara) μ于4°C冰箱连接过夜。5.回收片段的克隆与测序
用CaCl2法制备大肠杆菌DH5a (购自天为时代生物公司)感受态细胞，42°C水浴热激法进行转化。向转化后培养Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混匀，用涂布器将其均匀涂到含有氨苄青霉素的平板上，37°C恒温倒置培养过夜，待出现明显单菌落时将平板拿出。根据所用pGEM-T载体克隆位点两端的T7启动子和SP6启动子序列设计通用引物T7，SP6对重组克隆进行PCR鉴定。
PCR 程序94°C 预变性 IOmin ;94°C变性 lmin，58°C复性 lmin，72°C延伸 IminJM环35次；72°C延伸5min ；
扩增产物用1%琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见SEQID No. I。实施例2、不同处理条件下TaWRKY80基因的表达分析 I.材料处理
小麦山融3号的种子室温萌发，I周后去掉胚乳，用Hangload液体培养基继续培养I周进行胁迫处理。盐胁迫在Hangload液体培养基中添加NaCl至终浓度为200mM ；
ABA处理培养基中添加ABA至终浓度为100 μ M ;
不同条件下处理0、0. 5、3、12、24，48小时后分别取幼苗的叶片和根系，提取各种材料的总RNA。2.小麦总RNA提取
Trizol法提取RNA。PMgrose凝胶电泳检测提取的RNA质量，紫外分光光度计检测提取的RNA浓度。3.第一链cDNA的合成
采用PrimeScript RT-PCR KU，反应步骤按操作手册进行。4. RT-PCR反应及电泳
1.以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下 TaAct-S: 5' - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3/
TaAct-A: 5' - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3/
WRTl:5/ -CTGACGAGGGACCCCAGCTTCAAG-3'，
W2 5' -CTTAGGGAATTTTGCCACACTCTTTG-3'
2.PCR体系
ddH204. 7 μ I
10X buffer2 μ I
Primerl (2 μ Μ)I μ I
Primer2 (2 μ Μ)I μ I
dNTP (IOmM each)O. 2 μ I
rTaq polymerase (5U/μ I) O. I μ I 逆转录cDNA模板I μ ITotal Volume10 μ I
3. PCR程序
94 °C 5min ;根据基因表达量不同设置 25 30 cycles, 94 °C 20s, 57 °C 60s, 72 °C45s ；72°C 5min。4. I %琼脂糖凝胶电泳。结 果见图2。实施例3、TaWRKY80过表达植物表达载体的构建
植物表达载体pCAMBIA-superl300是含有35S启动子和NPT II基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶油al位点。根据基因TaWRKY80的cDNA序列，设计包含完整 ORF 的基因特异性引物 W20RF-1: 5’ -TCTAGAATGGATCCATGGGTCAGCAGC-3’ (xbal),W20RF-2: 5’-GAGCTCCCTACCTAACTTGATCAAACTTGC-3’ (SacI)。用该对引物扩增 7 / ァ洲的cDNA序列。然后用限制性内切酶油al ,SacI酶切载体pCAMBIA-superl300和扩增的目的基因TaWRKY80序列。完全酶切的载体和目的基因经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收，连结，转化大肠杆菌DH5a，PCR检测阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，酶切验证，构建获得植物表达载体 pCAMBIA-superl300/TaWRKY80。步骤如下
(I)质粒pCAMBIA-superl300空载体和目的基因片断油al单酶切 酶切体系如下
SacI2 μ I
Xbal2 μ I
pCAMBIA-super 1300 载体(或目的基因片段)10 μ I
IOXBuffer M2 μ I
ddH20 To40 μ I
于37°C恒温水浴锅酶切3小时以上。(2)酶切产物的电泳与回收
酶切完成后，以I X TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行I %琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下经酶切的pCAMBIA-SUper1300载体大片段和目的基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。(3)连接
经酶切的pCAMBIA-SUper1300载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4的比例进行4°C连接过夜。(4)转化
连接产物热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固体平板上37°C培养16小时左右。(5)重组子的鉴定
PCR检测阳性克隆，提取阳性克隆质粒，对质粒进行油al和SacI双酶切验证，完成载体构建(图3)。将构建好的载体pCAMBIA-superl300/TaWRKY80转化农杆菌菌株GV3101，转化拟南芥进行基因功能分析。实施例4、基因的功能分析——拟南芥转化、筛选及表型分析 (O拟南芥的种植将野生型拟南芥种子用7. 5%次氯酸钠溶液(包括7. 5%次氯酸钠和O. 01% Triton-X100)消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于MS平板上，于4° C春化2_3天。然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，23° C培养,16/8 h光周期,光强30-40 μ moIm-2 s_l ;待植株开花后,到去其主枝顶端,促进侧枝发展。在到枝后的4_6天内，进行农杆菌转化。(2)拟南芥转化
把200 ml菌液倒入浅盘中。将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动沾花30 sec-1 min0取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿。将托盘置暗处培养24 ho然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟。(3)阳性植株的筛选T0代种子用7. 5%次氯酸钠溶液(包括7. 5%次氯酸钠和O. 01% Triton-XlOO)消毒后，点播在MS选择培养板(30 mg/L潮霉素)上。于4°C下春化 2-3天。移入培养室中培养。大约10天左右，挑选潮霉素抗性植株(长出真叶1-2对，根伸长至培养基中)并移栽到营养钵中。培养直至种子成熟。同样方法筛选Tl代种子得到T2代植株。并在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单拷贝插入独立株系，并获得纯合T3代株系进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定。(4)转基因拟南芥的表型鉴定①拟南芥的种植
T3代单拷贝纯合拟南芥株系的种子用7. 5%次氯酸钠溶液(包括7. 5%次氯酸钠和
0.01% Triton-X 100)消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5_6次，点播于MS平板上，于4° C春化2-3天，然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，23° C培养，16/8 h光周期，光强 30-40 μ molm_2 s_l。②胁迫处理
将萌发5天的拟南芥幼苗(对照及转基因株系)小心移栽到营养土中，或转移到分别含有IOOmM NaCl、150mM甘露醇、IOmM LiCl、5yM ABA和对照MS培养基平板上，竖直培养一周观察表型。结果表明正常培养条件下转基因拟南芥比未转基因对照具有较好的生长势，生物量增加(图4A)。在不同处理条件下，转基因的拟南芥植株的根系明显长于未转基因对照株系(图4-B至4-G)。(5)脯氨酸含量的测定 I标准曲线的绘制
(I)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100 μ g。(2)系列脯氨酸浓度的配制取6支干净试管，分别加入0,0. 1,0. 25,0. 5,0. 75、
1.Oml的100ug/ml标准脯氨酸溶液然后分别加入10、9. 9,9. 75,9. 5,9. 25,9. Oml蒸馏水，混匀，即可配成O、I. 0,2. 5,5. 0,7. 5、10ug/ml系列梯度脯氨酸溶液。分别取各浓度标准脯氨酸溶液2ml，加入2ml3%磺基水杨酸、2ml冰こ酸、和4ml2. 5%茚三酮溶液，置沸水浴中反应60min,冷却后,各加入4ml甲苯萃取红色物质。静置后，取甲苯相在520nm下测定吸光度值，以脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2植物组织中国脯氨酸的提取
选取不同干旱条件下的植物功能叶片lg，用4ml3%磺基水杨酸溶液研磨成浆状，匀浆液转入离心管中，在沸水浴中提取lOmin。冷却后。3000g离心lOmin，取上清液定容至5ml备用。3样品中脯氨酸含量的测定
取2ml脯氨酸提取液，加入2ml蒸馏水，再加2ml冰こ酸和4ml2. 5%茚三酮溶液，沸水中反应60min,冷却后各加入4ml甲苯萃取红色物质。静置后，取甲苯相在520nm下测定吸光度值
4结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml測定液中脯氨酸的含量(Xyg/2ml)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下脯氨酸含量(yg/g)=XXV/M
X :从标准曲线上查出的测定液中脯氨酸的含量 V:脯氨酸提取液总体积 M :植物材料质量
结果表明正常生长条件下转基因株系中脯氨酸的含量高于未转基因对照株系(图5)。
序列表 SQ ID No. I 〈110〉济南大学
〈120〉小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80及其应用
<141>2012-5-18
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211>1053
<212>cDNA
〈213〉小麦
〈221〉小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80基因 〈222〉 (I)…(1053)
<400>1
I ATGGATCCAT GGGTCAGCAG CCAGCCTTCG CTGAGCCTCG ATCTGCACGT CGGCCTCCCG 61 CCGATGGGGC ACCACCAGGC GGCGCCGATG GTGGCGCTGG CCAAGCCCAA GGTCCTCGTC 121 GAGGAGAACT TCATGCAGCT CAAGAAGGAC CCTGAGGTTG CGGTTCTTGA GTCGGAGCTA 181 CAGCGTGTGA GCGAGGAGAA CCGCCGCCTG GGCGAGATGC TCAGGGAGGT GGCCTCCAAG 241 TACGAGGCCC TGCAGGGCCA GTTCACCGAC ATGGTCACGG CCGGCGCCCA CGCCGGCGGC 301 AACAACAGCC ACTACAACAA CCAGCCGTCC TCCGCGTCGG AGGGCGGGTC GGTGTCGCCG 361 TCGAGGAAGC GCAAGAGCGA GGAGAGCCTC GGCACGCCGC CGCGGCCGTC GCAGCACCAG 421 CAGCAGCACT ACGCCGGCGG CCTCGCGTAC GCGGCGGCGC CGGACCAGGC GGAGTGCACG 481 TCGGGCGAGC CGTGCAAGCG CATCCGGGAG GAGTGCAAGC CCGTCGTCTC CAAGCGCTAC 541 GTCCACGCCG ACCCCTCCGA CCTCAGCCTG GTGGTGAAGG ACGGGTACCA ATGGCGCAAG 601 TACGGGCAGA AGGTGACCAA GGACAACCCC TGCCCCCGAG CCTACTTCCG CTGCTCCTTC 661 GCCCCCGGCT GCCCCGTCAA GAAGAAAGTG CAGAGGAGCG CCGAGGACAA GACCATACTG、721 GTGGCGACGT ACGAGGGCGA GCACAACCAC ACCCAGCCCC CGCCGTCGCA GCCGCAGCAG781 CAGAACGACG GCTCCGGCGC GGGCAAGAAC GCTGGGAAGC CGCCCCAGGC GCCGACTGCC841 ACGCCTCACC ACCCGCAGCA GCAGCACAAG CAGGAAGCGG CAGCGGCCGC CGTCAGCGGC901 GAGTCGGCCG TGGCGGCGTC CGAGCTGATC CGGCGCAACC TGGCGGAGCA GATGGCCATG961 ACGCTGACGA GGGACCCCAG CTTCAAGGCG GCGCTCGTCT CCGCGCTCTC CGGCCGGATC1021 CTCGAGCTAT CGCCGACCAG GGACATCAAT TAASQ ID No. 2〈110〉济南大学
〈120〉小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80及其应用
<141>2012-5-18
〈160〉 I
〈210〉 I
<211>350
<212>AA
〈213〉小麦
〈221〉小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80基因〈222〉 (I)…(350)
<400>1
IMDPffVSSQPS LSLDLHVGLP
21PMGHHQAAPM VALAKPKVLV
41EENFMQLKKD PEVAVLESEL
61QRVSEENRRL GEMLREVASK
81YEALQGQFTD MVTAGAHAGG 101NNSHYNNQPS SASEGGSVSP
121SRKRKSEESL GTPPRPSQHQ
141QQHYAGGLAY AAAPDQAECT
161SGEPCKRIRE ECKPVVSKRY
181VHADPSDLSL VVKDGYQffRK
201YGQKVTKDNP CPRAYFRCSF
221APGCPVKKKV QRSAEDKTIL
241VATYEGEHNH TQPPPSQPQQ
261QNDGSGAGKN AGKPPQAPTA
281TPHHPQQQHK QEAAAAAVSG
301ESAVAASELI RRNLAEQMAM
321TLTRDPSFKA ALVSALSGRI
341LELSPTRDIN *
权利要求
1.一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY80,其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No. I 所示。
2.如权利要求I所述的一种小麦耐盐、抗旱基因hrMT洲，其特征在于所述转录因子基因编码的蛋白质，其氣基酸序列为SEQ ID No. 2所不。
3.如权利要求I所述一种小麦耐盐、抗旱基因在培育耐盐植物中的应用。
4.如权利要求3所述的一种小麦耐盐、抗旱基因TamKY80的应用，其特征在于所述植物是普通小麦、玉米和水稻。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY80的克隆及其应用。本发明公开了一种小麦耐盐WRKY转录因子基因TaWRKY80及其在培育耐盐植物中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的耐盐能力提高。本发明的基因对培育耐盐植物(特别是作物)具有重要作用。
文档编号C07K14/415GK102703466SQ20121013556
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者田延臣, 秦余香 申请人:济南大学