专利名称：一种四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从何首乌的根茎中提取二苯乙烯苷单体的分离纯化工艺，属于天然产物分离提取技术领域。
背景技术：
血管性痴呆(Vascular Dementia, VD)是指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上，产生的以高级神经认知功能障碍为主的一组临床综合症，是继阿尔茨海默病后的引起痴呆的第二大原因。其临床表现为记忆障碍、认知缺损、人格改变、定向力丧失、行为异常、日常社交及生活能力低下等。根据流行病学调查显示，欧美国家VD约占老年期痴呆的20%，而在我国约占60% ;日本的VD患病率则达到 I.1% -3. 0%。随着世界范围老龄化进程加速，VD的发病率呈现出逐年上升的趋势，且随着年龄的增长而升高，甚至随着心血管疾病和中风的发病率的上升，VD将有可能成为引起痴呆的首要原因。由于血管性痴呆发病机制复杂，存在多致病因素，现有药物多为单靶点调控，存在着疗效不强或效果单一、副作用大等不足，难以真正满足治疗血管性痴呆的实际需要。因此，研发新的具有多功能的、高效低毒的VD治疗药物具有很强的迫切性和必要性。我国传统中医及抗衰老中药可挖掘的宝库很多，中药及其有效成分在防治VD方面具有潜在优势和良好的应用前景。何首乌(Polygonum multiflorum Thunb)为寥科多年生草本植物的块根，是我国传统的延年益寿的中草药。其主要的功效性成分二苯乙烯苷近年来成为研究的热点。二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG),化学名为2、
3、5、4’ -四羟基二苯乙烯-2-0-B-D-葡萄糖苷，结构为一种多酚类糖苷，结构式为
OH
JI J 削 OH I HCT —OH, 0
/
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TSG
文献报道了其多项生理功能抗氧化、清除自由基；抗肿瘤；降低胆固醇；抑制动脉粥样状硬化；保护肝脏；具有血管舒张作用；防治老年痴呆；提高记忆等功效。由于其疗效确切、副作用小，有望开发为治疗VD的一类化学新药。因此，研究从何首乌提取分离并得到高纯度的二苯乙烯苷具有非常重要的意义。四羟基二苯乙烯苷为多酚类糖苷类物质，强极性、存在敏感性基团(酚羟基)、易形成氢键、及极端条件的不稳定性等结构特点使得其分离纯化颇具有挑战性。目前已报道的分离纯化方法包括高效液相色谱法、各种层析法、结晶法等，然而高纯度的分离纯化一直处在实验室少量制备的水平，未见有适合工业化生产规模的制备工艺的报道。美国Chen(J.Agr.Food Chem.，1999，47，2226-2228)用 95% 乙醇提取，提取物溶解于水中，依次由已烷、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物依次经过反相硅胶柱，SephadexLH20柱，最后获得二苯乙烯苷纯品。 操作繁琐，成本较高，不适合工业化生产。日本Hata (药学杂志，1975，2，211-213)的提取方式为乙醚冷浸，继而用丙酮回流提取，丙酮提取液经柱层析等方法分离纯化后，放置冰箱中冷冻I个月得到的二苯乙烯苷。严秀珍等(上海第一医科大学学报，1981，2，123-126)采用乙醇回流，乙醇浸膏用乙醚抽提，余物经水、乙酸乙酯回流提取多次后，经硅胶、聚酰胺、活性碳等各种层析方法反复分离纯化得到薄层层析显示一个斑点的无定形物，使用各种有机溶剂尝试重结晶，均未得到结晶。后将该物质乙酰化，经乙酰化产物的波谱数据间接判断上述无定形物为四羟基二苯乙烯苷(TSG)。该方法操作繁琐，也没有TSG相关的纯度数据报道。吕丽爽等(中国发明专利CN101003554A)采用水或乙醇提取，浓缩液用聚酰胺或大孔树脂层析柱分离，将收集到的物质用溶剂重结晶法得到二苯乙烯苷晶体。该方法虽然可以得到TSG纯品，但鉴于二苯乙烯苷纯品获得有限，不足以对结晶的工艺条件进行系统优化。另外，多羟基化合物往往需要多次反复重结晶方能达到纯度要求，周期长、回收率低、不适合工业化生产。陆蕴茹等(中国发明专利ZL98120290. X)公开了从何首乌中提取分离TSG的方法，该方法将用于分离纯化的层析柱进行破坏性切割，共十个片段，再进行取样分离，过程繁琐，成本高，只适合实验室微量样品的制备。上述文献或专利方法都涉及到各种柱层析分离方法，众所周知，柱层析操作繁琐，一方面样品损失比较大，导致产率偏低，另一方面大量洗脱溶剂的使用使得成本增加，不适合大规模的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合大规模生产四羟基二苯乙烯苷的分离提纯工艺，该工艺操作简便，成本低廉，收率稳定，在保持低成本和高收率的同时，能够获得高纯度的四羟基二苯乙烯苷结晶，达到药用天然产物的要求，适合工业化生产。本发明的实现过程如下
一种四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，包括以下步骤
(1)何首乌经乙醇提取得到浸提液，除去乙醇溶剂得褐色浸膏；
(2)褐色浸膏加乙醚冷浸处理，并除去乙醚层；
(3)乙醚冷浸处理后的浸膏加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，旋去乙酸乙酯得粗产品；
(4)粗产品加碱液调节pH为8-10,再用乙酸乙酯萃取，向萃取后的水层中加入环己烧和乙醇，旋蒸除去溶剂得TSG盐粗品；
(5)TSG盐粗品用乙醇或异丙醇重结晶，然后加水溶解，调节pH至5.5-7. 0，再用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯得TSG纯品。TSG纯品用高效液相色谱检测纯度大于99%。
上述四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺步骤(I)中，何首乌经乙醇超声提取得到浸提液。上述四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺步骤(2)中，褐色浸膏加乙醚浸泡处理
0.5-3小时，出去大黄素、大黄素甲醚等杂志。上述四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺步骤步骤(3)中，乙醚冷浸处理后的浸膏加水溶解，过滤除去不溶性杂质后再用乙酸乙酯萃取至酯层无吸收点为止。上述四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺步骤步骤(4)中，粗产品用lmol/L氢氧化钠调节PH为9，用乙酸乙酯萃取至酯层无吸收点为止。加入的环己烷和乙醇与水层中的水 形成三元共沸物，加入的环己烷和乙醇与水层中水三者体积比为70%:7%:23%。上述四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺步骤步骤(5)中，用盐酸或醋酸调节pH至
5.5-7. O。本发明的优点与积极效果
1、从何首乌中提取有效成分时最好采用超声波法，该方法无需加热，操作简便快捷，提取率高，周期短；
2、在纯化过程中采用将TSG经简单的化学转变成盐，TSG成盐后在水中溶解性好且稳定，在该步骤用有机溶剂抽提大部分杂质，简化分离提纯步骤；
3、利用盐类化合物易结晶的特点，重结晶时易于和其它杂质分离、获得高纯度TSG；
4、本发明避免了各种繁琐的柱层析，合成工艺大为简化，整体工艺条件温和，不使用有毒有害溶剂，适合工业化生产。
图I为本发明提取流程图。
具体实施例方式如图I所示，将何首乌块茎粉碎，过筛80目，用工业乙醇超声提取，提取液旋干得褐色浸膏，用乙醚冷浸萃取。乙醚萃取过的醇浸膏加水溶解，过滤，除去不溶性杂质，滤液用乙酸乙酯萃取，蒸除溶剂得到粗产物。用适当的碱调pH至8-10，乙酸乙酯萃取除杂质，留置水层，加入乙醇和环己烷形成三元共沸物蒸除水，得到TSG盐粗品。用乙醇重结晶，得到TSG盐白色晶体，将其溶于水，用酸调pH到5. 5-7. 0，乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，蒸除溶剂得到TSG纯品，高效液相色谱测其纯度，可达99%。实施例I
称取何首乌粉末100g(80目)置于烧杯中，加入工业乙醇200mL，超声提取10分钟，静置，分离上清液，旋去溶剂得褐色浸膏。在褐色浸膏中，加入乙醚浸泡，0.5 h后过滤除去醚层。乙醚冷浸处理后的浸膏，加水分充分溶解，过滤除去不溶性杂质。滤液用乙酸乙酯萃取至酯层再无吸收点为止。收集酯层旋去溶剂得褐色粗产品。粗产品用lmol/L氢氧化钠调节pH=9，乙酸乙酯萃取至酯层无吸收点为止。留置水层。在水层中加入环己烷，乙醇与水形成共沸物，(三者体积比为70%: 7%: 23%，沸点为62. 10C )旋去全部溶剂得TSG盐粗品。将粗品用乙醇重结晶，得TSG盐白色晶体。TSG盐白色晶体用水溶解，IM HCl调节pH=6. 5，乙酸乙酯萃取，合并有机层，加入无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干得TSG纯品4. 3g，高效液相色谱测的纯度大于99%。 实施例2
称取何首乌粉末500g (80目)置于烧杯中，加入工业乙醇超声提取10分钟，静置，分离上清液，旋去溶剂得褐色浸膏。在褐色浸膏中，加入乙醚浸泡，0.5 h后过滤除去醚层。乙醚冷浸处理后的浸膏中，加水充分溶解，过滤除去不溶性杂质。滤液用乙酸乙酯萃取至酯层再无吸收点为止。收集酯层旋去溶剂得褐色粗产品。粗产品用lmol/L碳酸氢钠调节pH=8. 5，乙酸乙酯萃取至酯层无吸收点为止。留置水层。在水层中加入环己烷，乙醇与水形成共沸物，旋去溶剂，得TSG盐粗品。将粗品用异丙醇重结晶，得TSG盐白色晶体。TSG盐白色晶体、用水溶解，醋酸调节PH=6. 0，乙酸乙酯萃取，合并有机层，加入无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干得TSG纯品21. Ig,高效液相色谱测的纯度大于99%。
权利要求
1.一种四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于包括以下步骤 (1)何首乌经乙醇提取得到浸提液，除去乙醇溶剂得褐色浸膏； (2)褐色浸膏加乙醚冷浸处理，并除去乙醚层； (3)乙醚冷浸处理后的浸膏加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，旋去乙酸乙酯得粗产品； (4)粗产品加碱液调节pH为8-10,再用乙酸乙酯萃取，向萃取后的水层中加入环己烧和乙醇，旋蒸除去溶剂得TSG盐粗品； (5)TSG盐粗品用乙醇或异丙醇重结晶，然后加水溶解，调节pH至5.5-7. 0，再用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯得TSG纯品。
2.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于TSG纯品用 高效液相色谱检测纯度大于99%。
3.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于步骤(I)中，何首乌经乙醇超声提取得到浸提液。
4.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于步骤(2)中，褐色浸骨加乙醚冷浸处理0. 5-3小时。
5.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于步骤(3)中，乙醚冷浸处理后的浸膏加水溶解，过滤除去不溶性杂质后再用乙酸乙酯萃取至酯层无吸收点为止。
6.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于步骤(4)中， 粗产品用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液调节PH为9，用乙酸乙酯萃取至酯层无吸收点为止。
7.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于步骤(4)中，加入的环己烷和乙醇与水层中的水形成三元共沸物。
8.根据权利要求7所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于加入的环己烷和乙醇与水层中水三者体积比为70%:7%:23%。
9.根据权利要求I所述的四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺，其特征在于步骤(5)中，用盐酸或醋酸调节PH至5. 5-7. 0。
全文摘要
本发明公开了一种从何首乌的根茎中提取二苯乙烯苷单体的分离纯化工艺，何首乌先经乙醇提取得到浸提液，除去乙醇溶剂得褐色浸膏，褐色浸膏加乙醚冷浸处理并除去醚层，乙醚冷浸处理后的浸膏加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集酯层，旋去溶剂得褐色粗产品，粗产品加碱液调节pH为8-10，再用乙酸乙酯萃取，萃取后的水层中加入环己烷和乙醇，旋蒸除去溶剂得TSG盐粗品，再经酸化、乙酸乙酯萃取得纯品。本发明避免了各种繁琐的柱层析，合成工艺大为简化；整个工艺条件温和，不使用有毒有害溶剂，适合工业化生产。
文档编号C07H1/08GK102659863SQ201210136568
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月6日 优先权日2012年5月6日
发明者何炜, 张俊娜, 张旭, 张邦乐, 王四旺, 王宝龙 申请人:中国人民解放军第四军医大学