专利名称：一种从植物中同时提取1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇的方法
技术领域：
本发明涉及ー种同时提取分离I-脱氧野尻霉素、白藜芦醇的エ艺技术，具体涉及一种从桑叶中快速提取分离I-脱氧野尻霉素、白藜芦醇的エ艺技木，属于生物分离工程的技术领域。
我国桑树资源及产量均居世界首位，全国各地均有栽培。目前大部分地区将桑作为饲用栽培，毎年入冬后随着冬蚕饲养減少，大量桑叶都被废弃。桑叶味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效；在药理上具有抗炎、降血糖、降血脂、利尿等作用，这些药理活性归功于桑叶中的I-脱氧野尻霉素(DNJ)、白黎芦醇等成分，因而研究桑叶中的这两种成分的提取技术具有重要意义。同时，经研究白藜芦醇具有较明显的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗肝炎、抑制血小板凝集和血栓素B2的产生，也能够阻止低密度脂蛋白的氧化，具有潜在的防治心血管疾病、防癌、抗病毒及免疫调节作用，近日最新研究又一重大发现，白藜芦醇具有一定抗艾滋病病毒作用，这些发现使白藜芦醇身价百倍。目前世界上有十余个国家和地区在开发白藜芦醇原料及制剂，被喻为继紫杉醇之后的又一新的緑色抗癌药物，被人们广泛关注。国内植物提取物生产厂家甚多，大约有十余家，大部分出口。据有关资料统计表明，目前全球白藜芦醇市场需求量为100余吨，未来几年，需求量还有继续增加的趋势，而目前白藜芦醇的生产能力约50-60吨。迄今，全球糖尿病患者已达I. 3亿，且人数还在剧増。糖尿病已经成为继心血管病、肿瘤之后的第三号杀手，是世界三大公共卫生难题之一。据卫生部公布数据，2009年我国仅城市糖尿病患者已超过4100万，且平均毎年新增患者约150万。糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的常见病，临床以高血糖为主要标志，常见症状有多饮、多尿、多食以及消瘦等。糖尿病可引起人体多系统的损害、胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素的敏感性降低，还可引起机体内蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其中以高血糖为主要标志。目前还没有特效的药物能给予糖尿病有效的根治。近几年来，利用中药治疗糖尿病已再次成为研究的热点课题。在我国，自古以来中医就将桑叶作为治疗消渴症(糖尿病)的中药应用于临床。《本草纲目》记载桑叶“汁煎代茗，能止消渴”；“灸熟煎饮，代茶止渴”。近代医家也常将桑叶配伍于复方应用于临床，且每多获效。在东南亚的不少国家，桑叶一直作为民间治疗糖尿病的良药，含有桑叶提取物的饮料受到泰国人们特别是糖尿病患者的追捧，用桑叶泡脚治疗由糖尿病引起的下肢水肿成了越南和緬甸等国家人们的习惯。DNJ是ー种哌啶生物碱，化学名称是3，4，5_三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，其分子式是C6H13N04(结构式见图I)。作为葡萄糖的类似物，其环上的氮原子取代了原来的氧原子，由于结构上的相似性使得DNJ可以伪装成许多糖类酶促水解反应中的底物，竞争性抑制參与反应的糖苷酶活性，从而降低血液中葡萄糖的含量。糖苷酶可以催化许多生物反应，如糖蛋白翻译后的处理、碳水化合物的消化和糖聚合体的溶酶体代谢等。白黎芦醇是ー种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，有顺、反两种构型，其中反式是稳定结构，而且生物活性更加广泛。近些年来，国内外很多学者对DNJ和白藜芦醇的生物学功能进行了深层研究，结果表明DNJ作为糖苷酶抑制剂表现出优秀的抑制肿瘤转移、降血糖、抗炎、抗病毒等药理活性；白藜芦醇具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化等多方面有益于人体健康的生物活性。到目前为止，已在多种植物中发现了白藜芦醇，如葡萄科的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的落花生属，百合科的藜芦属，寥科的寥属等植物如虎杖、何首乌、葡萄、花生等。目前白藜芦醇主要从虎杖、葡萄皮和某些豆类中提取，来源极为有限。中国四川出产的中药虎杖中以甙的形式存在的白藜芦醇含量，理论值为葡萄皮的200倍。因此，公开号为CN99115156. 9、CN01126769. O、CN03147908. I 的中国专利介绍了
ー种从中药虎杖中提取白藜芦醇的エ艺的方法，是将虎杖根粉碎，用こ醇提取；过大孔树脂柱，减压浓缩，萃取得白藜芦醇精品。这些专利都是以虎杖根为原材料进行提取白藜芦醇，目前由于虎杖资源溃乏，价格从原来的I元/kg涨到了 3. 5元/kg。原材料的成本急剧上·涨，98%白藜芦醇的价格从1600元/kg上涨到了 2800元左右/kg。公开号为CN200510040625. I的中国专利介绍了ー种从花生根提取白藜芦醇的生产方法，是将花生根粉碎，用こ醇提取；过大孔树脂柱，减压浓缩，萃取得白藜芦醇精品。虽然能缓解虎杖资源溃乏，但是白藜芦醇在花生中含量很低，成本比用虎杖根提取白藜芦醇的价格还要高，不利于エ业化生产。随着植物科学技术的发展，人们陆续在桑、野拓草、风信子、桔梗科植物中发现了 I-脱氧野尻霉素，并且以桑叶中的I-脱氧野尻霉素含量最高。在已公开的中国专利200710060127. 2,200810236144. 1,200710067498. 3 中涉及到提取分离 I-脱氧野尻霉素，但在分离过程中都用到了丙酮、氯仿、正己烷、ニこ胺等有毒、易燃的有机溶剤。由于I-脱氧野尻霉素和白黎芦醇主要应用于药品和食品行业，采用这些专利方法提取的I-脱氧野尻霉素和白黎芦醇产品对人类健康不利；另外在中国专利200910192542. 2中虽没有引入有毒试剂进行分离纯化，使用絮凝剂进行絮凝沉淀时间很长，I-脱氧野尻霉素和白黎芦醇在此过程中易损失，不利于提高其产率，再者所采用的エ艺过程复杂，生产条件要求高，产率低，不利于降低生产成本。I-脱氧野尻霉素在桑叶中含量最高，而且白藜芦醇和白藜芦醇甙在桑叶中也有一定含量，取材方便，分布广泛，价格便宜。因而，对桑进行综合深加工意义非凡，探索从桑中同时提取I-脱氧野尻霉素和白藜芦醇，其意义相当远大。
发明内容
本发明采用的技术方案包括干燥过后的桑叶经用水提、过滤、脱色后用树脂吸附、こ醇洗脱，干燥后制得DNJ纯品；桑叶水提后残渣经用こ醇溶液提取、过滤、减压浓缩、萃取、脱色结晶制得白藜芦醇纯品。本发明米用的微生物菌种，活性干酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为CGMCC No. 2. 502。因此，本发明提供一种从桑叶提取DNJ和白藜芦醇的方法，步骤包括
(I)粉碎干燥桑叶，并将桑叶、水按重量(kg)/体积比(L) = I : 1-2进行混合，カロ入一定量的酵母菌As2. 502，在30°C保温一定时间60h ；(2)86°C加热回流提取lh，过滤除渣后，减压浓缩至无こ醇味；(3)将浓缩液进行活性碳脱色，将脱色后溶液上LSA-10大孔吸附树脂柱，使用こ醇浓度为40-80 %，梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩到一定体积后室温过夜结晶和重结晶，得DNJ纯品。(4)将水提后的桑叶残渣与50%こ醇按重量(kg)/体积比(L) = I : 4-6进行混合，加热回流提取；(5)过滤除渣后，减压浓缩至无こ醇味；(6)将浓缩液用2-3倍体积的石油醚萃取，分离石油醚层并进行浓缩，直至获得干 燥物；(7)加入70%こ醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色；(8)向脱色后的溶液加入90%こ醇将溶液的こ醇浓度调至40%左右，室温过夜结
晶，得白藜芦醇纯品。在一个实施方案中，步骤I中加入酵母菌的量(kg)为桑叶重量(kg)的1/10-1/20左右。在一个实施方案中，步骤2和5的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤I次。在一个实施方案中，步骤4中所加入的50%こ醇、桑叶残渣，其体积(L)/重量(kg)比=5-10 : I。在另ー个实施方案中，步骤4中不加入50%こ醇，只加入颗粒活性碳脱色，颗粒度大于10目，再进行浓缩直至获得干燥物。在另ー个实施方案中，步骤6中石油醚萃取次数为2次。在另ー个实施方案中，步骤8中こ醇终浓度为40%左右。技术效果I、桑树种植容易，扦插、籽播均可，产量高、价格低，来源方便，后续资源有保障。使用桑叶作为虎杖等药材的替代，既大大提高了桑叶的利用效率，提高桑叶的附加值，又摆脱了对于虎杖等药材的依赖，完全缓解了市场对虎杖等药材的大量需求，同时又能对废弃桑叶充分利用，保护了虎杖等药用资源。2、本发明方法操作简单，极大的降低了 DNJ和白藜芦醇的生产成本，简化了生产过程。3、本发明所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的试剂回收常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。
图I脱氧野尻霉素和葡萄糖的结构
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例I :粉碎干燥桑叶100kg，加入水200L，加入IOkg的酵母菌As2. 502，在30°C保温一定时间60h，80°C加热回流提取lh，提取液经三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤后，减压浓缩至30L,加5kg颗粒活性碳进行脱色20min，脱色后溶液使用LSA-10大孔吸附树脂进行分离，先使用纯水的洗脱杂质，然后使用50%こ醇洗脱，收集こ醇洗脱液，减压浓缩至50L，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到214g DNJ样品。桑叶水提后残渣用50%こ醇550L，80°C加热回流提取2h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至70L (无こ醇味)，然后浓缩液用150L石油醚分两次萃取，合并石油醚层进行浓缩至50L，加4kg颗粒活性碳进行脱色20min，脱色后溶液再用90 %的こ醇40L，将
溶液的こ醇浓度调至40%，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到456g白藜芦醇样品。检测设备为AgilentllOO高效液相色谱仪，色谱柱为HypersilODS (250mmX 4. 6mm, 5 μ ),白藜芦醇的检测条件流动相为35 %こ腈的水溶液、检测波长为303nm、流速为lml/min、进样量为20 μ L ；DNJ经衍生试剂进行衍生后的液相色谱检测条件流动相为こ腈与O. I %醋酸体积比11/16、检测波长为254nm、流速为lml/min、进样量为20 μ L0 DNJ样品的纯度为98. 85%、白藜芦醇样品的纯度为98.95%。实施例2 粉碎干燥桑叶400kg，加入水200L，加入IOkg的酵母菌As2. 502，在30°C保温一定时间60h，80°C加热回流提取lh，提取液经三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤后，减压浓缩至30L,加15kg颗粒活性碳进行脱色20min，脱色后溶液使用LSA-10大孔吸附树脂进行分离，先使用纯水的洗脱杂质，然后使用50%こ醇洗脱，收集こ醇洗脱液，减压浓缩至150L，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到837g DNJ样品。桑叶水提后残渣用50%こ醇2700L，80°C加热回流提取2h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至100L (无こ醇味)，然后浓缩液用300L石油醚分两次萃取，合井石油醚层进行浓缩至80L，加IOkg颗粒活性碳进行脱色20min，脱色后溶液再用90%的こ醇64L，将溶液的こ醇浓度调至40%，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到I. 93kg白藜芦醇样品。按实施例I的检测方法进行检测DNJ样品和白藜芦醇样品，DNJ样品的纯度为99. 45%,白藜芦醇样品的纯度为99. 15%。
权利要求
1.本发明提供ー种从植物中同时提取DNJ和白藜芦醇的方法，步骤包括 (1)粉碎干燥桑叶，并将桑叶、水按重量(kg)/体积比(L)=I: 1-2进行混合，加入一定量的酵母菌As2. 502，在30°C保温一定时间60h ； (2)过滤除渣后，减压浓缩至无こ醇味； (3)将浓缩液进行活性碳脱色，将脱色后溶液上LSA-10大孔吸附树脂柱，使用こ醇浓度为40-80%，梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩到一定体积后室温过夜结晶和重結晶，得DNJ纯品。
(4)将水提后的桑叶残渣与50%こ醇按重量(kg)/体积比(L)= I : 4-6进行混合，加热回流提取；、 (5)过滤除渣后，减压浓缩至无こ醇味； (6)将浓缩液用2-3倍体积的石油醚萃取，分离石油醚层并进行浓缩，直至获得干燥物； (7)加入70%こ醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色； (8)向脱色后的溶液加入90%こ醇将溶液的こ醇浓度调至40%左右，室温过夜結晶，得白藜芦醇纯品。
2.根据权利要求I的方法，其中步骤I中加入酵母菌量(kg)为桑叶重量(kg)的1/10-1/20 左右。
3.根据权利要求I或2的方法，步骤2和5的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤，其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤I次。
4.根据权利要求I或2的方法，其中步骤6中石油醚萃取次数为2次。
5.根据权利要求I或2的方法，其中步骤8中こ醇终浓度为40%左右。
全文摘要
本发明主要涉及一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇的方法，大大地提高1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇得率和纯度。提出了一整套从桑叶分离提取得到高纯度的1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇，采用微生物转化、醇回流提取，膜过滤，浓缩，萃取，活性碳脱色后，通过控制结晶和重结晶条件分别得到1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇纯品。整个分离过程中对环境条件和设备要求不高，分离时间最短，纯度最高，对原材料的综合利用率最高；另外，分离材料易得便宜，分离操作过程简单，易控制，采用结晶和重结晶，纯化效率高，使用试剂无毒安全，成本低。
文档编号C07D211/46GK102731367SQ20121016299
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者唐忠海 申请人:长沙湘资生物科技有限公司