调控植物中色素生产的组合物和方法

专利名称：调控植物中色素生产的组合物和方法
技术领域：
本发明属于植物中色素发育(development)的领域。
背景技术：
花青素色素的积累是水果质量的重要决定因素。色素为用户提供了基 本的品种区别并涉及到苹果的健康属性(Boyer and Liu, 2004)。花青素色素属于遍在的统称为黄酮类化合物的二级代谢产物的不同组。在植物中，黄酮类化合物涉及到包括防御在内的无数生物学功能，同时，被着色的花青素化合物尤其在植物/动物相互作用中作为引诱剂扮演了重要的生理学角色。包括花青素在内的全部黄酮类化合物的主要前体是丙二酸单酰辅酶A和对-香豆酰辅酶A。从这些前体查耳酮合成酶(CHS)合成出查耳酮，这是花青素生产和C15骨架建立的第一个关键步骤。查耳酮然后被查耳酮异构酶(CHI)异构化来生产查耳酮柑橘黄素，并且从那里，经由黄烷酮3[ 3]-羟化酶(F3H)的羟基化步骤转化柑橘黄素到二氢黄酮醇(dihydrofIavonon)。二氢黄酮醇被二氢黄酮醇(dihydrofIavonon) 4_还原酶(DFR)还原，产生白花色苷，然后白花色苷被白花色苷元加双氧酶(LDOX)转化成有色化合物anthocyanindin,同时最终的糖基化步骤被尿卩密唳二磷酸盐(UDP)-葡萄糖类黄酮3-邻-葡萄糖基转移酶(UFGT)所介导。花青素颜色的差异能归因于包括分子结构和羟基的类型和数目以及连接的糖和酸以及诸如PH值或超微结构的细胞环境在内的大量因素。在许多的花青素色素中，主要负责苹果皮中红色着色的色素是花青苷3-邻-半乳糖苷形式的花青素，并且在苹果的这个生物合成途径中的酶类已经被很好的描述(Kimet al.,2003,Plant Science 165，403-413;Honda et al.,2002,Plant Physiology andBiochemistry 40,955-962)。长久以来已经观察到,花青素类被升高来响应特定的环境、发育和病原刺激。在苹果中的研究已经证实了花青素积累的环境和发育调控。当水果遭受白光，或更显著地，UV光时，色素生物合成能被诱导，在其它物种中也观察到这个现象。而且，通过将所述水果进行低温储存，花青素水平能被提高。存在在苹果的发育方式中具有明显的花青素酶活性的花青素酶的同等诱导的证据，并且，依赖于品种，相关的着色在不熟的水果中增加并在成熟时再次增加。研究显示，在花青素途径中，存在通过同启动子元件复合的转录因子(TFs)的特定结合进行的高度特异的基因调控(Holton and Cornish, 1995，Plant Cell 7,1071-1083)。这个调控可能也扩展到诸如花青素运输蛋白的非途径基因。MYB TFs已经被显示在花青素的转录调控中扮演重要的角色。植物MYBs已经被牵涉到像二级代谢(包括所述花青素途径)、发育、信号传导和疾病抵抗力一样多样的控制途径(Jin and Martin, 1999，Plant Mol Biol, 41，577-585)。它们被包含单个或多个缺陷重复的结构保守DNA结合区域赋予特色；那些花青素途径相关的区域趋向于二重复(two-repeat) (R2R3)类别。调控也能在花青素生物合成途径早期或晚期对基因的谨慎的小组(discreet groups)特异。在紫苏(Perilla fruitescens)叶片中，TF驱动的调控已经在从CHS到结果的花青素蛋白运输基因的实际上所有的花青素生物合成的阶段中观察至1J，同时，在葡萄(Vitis vinifera)中,被MybA进行的特定调控被限定在蛋白生产的终点(UFGT)。在拟南芥属植物(Arabidopsis)中存在被分成24个亚组的大约140个R2R3MYBTFs (Stracke et al 2001, Current Opinion in Plant Biology,4，447-556)。花青素色素 I (PAPl)MYB 的生产(Borevitz et al.，2000，Plant Cell, 12，2383-2394)属于亚组 10(当Stracke et al.，2001的系统发育被使用时)并证明了同其它已知花青素调控子相比高度的氨基酸保守。PAPl在转基因拟南芥中过表达导致了花青素生物合成途径中从PAL到CHS 和 DFR 的大量基因的上调(Borevitz et al.，2000，Plant Cell, 12, 2383-2394; Tohgeet al. , 2005, Plant Journal, 42，218-235)。 一般地，MYBs同基础的螺旋环螺旋TFs (bHLH)紧密地相互作用，并且这个作用已经被广泛地研究其与黄酮类化合物生产的关系(Mol et al.，1996; Winkel-Shirley,2001)。范例包括玉米 ZmC MYB 和 ZmB bHLH 和牵牛花 AN2MYB 和 AN1/JAF13 bHLHs(Goff et al. , 1992 Genes Dev, 6, 864-875 ; Mol et al. , 1998, Trends in PlantScience, 3，212-217)。明显地，在不同物种中存在这个同等物的保守程度。然而，MYB_bHLH合作不总是必需的。来源于PAPl过表达的结果暗示,相似于玉米P MYB (Grotewold etal. , 2000Proc Natl Acad Sci USA, 97，13579-13584)和拟南芥 MYB12 (Mehrtens etal. , 2005 Plant Physiology，138，1083-1096)，PAPl 不需要过表达的 bHLH 共同调节因子来驱动花青素生产的大量增加。然而，进一步的研究显示，PAPl确实同bHLHs紧密地相互作用，这在体内实验中导致更强启动子(DFR)激活(Zimmermann et al. , 2004 PlantJ, 40，22-34)。更近期地，PAPl过表达线的整体的转录组学和代谢组学分析证实，PAPl上调 bHLH TT8 (At4g09820) 18 倍(Tohge et al.，2005，Plant J, 42，218-235)。这个对共同调控因子的依赖同高度保守的R2R3结合区域中的少量氨基酸改变相关，如在不依赖bHLH的玉米P和依赖bHLH的玉米ClMYBs间的对比所证明的，并足以定向不同种类的目标基因的激活(Grotewold et al. , 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97，13579-13584)。在本研究中，从Cl的R2R3区域到Pl的相应位置的仅6个氨基酸的替换导致了具有同Cl相似的依赖bHLH的行为的突变。更近期地，它被暗示，这可能是目标基因间允许MYBs区别的关键机理(Hernandez et al.，2004，J. Biol. CHem, 279，48205-48213)。这些关键的氨基酸在图 I中进行了标识。同PAPl相比，FaMYBl在草莓的后期发育过程中抑制了花青素的生物合成。不管这个改变的角色，FaMYBl分享了激活MYBs的同源性并能同诸如牵牛花ANl和JAF13的(激活)bHLH 相互作用(Aharoni et al.，2001，Plant J，28，319-332)。不管 PAP-样激活子和FaMYB-样抑制子的关键氨基酸残基一样,激活子倾向于属于亚组10而抑制子属于亚组17 (根据 Stracke et al)。额外水平的花青素调控涉及含有同MYB和bHLH蛋白形成复合物的WD40区域蛋白的蛋白的单独类别(如在 Ramsay and Glover, 2005, Trends in Plant Science, 10，63-70中回顾的)。范例包括牵牛花中的anl l(de Vetten et al. , 1997Genes Dev, 11，1422-1434)和拟南芥中的 TTGl (Walker et al.，1999，Plant Cell, 11，1337-1350)。花青素的转录控制可能被组织特异的调控(Kubo et at, 1999, Plant Cell, 11，1217-1226)和依赖于诸如冷、光和发育线索(cues)的刺激的可能不同的调控层次(Davuluri et al. , 2005, NatureBiotechnology, 23, 890-895)进一步并发。尽管对苹果花青素合成的激活和抑制的研究已经表明，截至目前，发育和环境调控，调控花青素合成的转录因子在这个物种或任何其它每年落叶的水果中是不同的。苹果中的花青素积累的控制是理解和处理水果颜色的关键问题。对施加这个控制的因子的鉴别提供了调节水果组织中起源于花青素的着色的程度和分布的工具。因此，本发明的目标是提供调控苹果物种中花青素生产的转录因子序列和/或至少提供给公众有用的选择。

发明内容
在第一方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，包括a)编码具有SEQ ID NO: 1-4和9_21或其变种的任何一种氨基酸序列的多肽的序列，其中的多肽或其变种是能调控植物中花青素生产的转录因子；b)具有长度至少为a)的序列的15个核苷酸的片段；c) a)的序列的互补序列；d) b)的序列的互补序列；e)在严格条件下能同a)的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。在一个实施方案中，分离的多聚核苷酸包含a)编码具有同SEQ ID NO: 1-4和9_21的任何一种氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中的多肽是能调控植物中花青素生产的转录因子；b)具有长度至少为a)的序列的15个核苷酸的片段；c) a)的序列的互补序列；d) b)的序列的互补序列；e)在严格条件下能同a)的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQ ID NO: I的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 4的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5_8、22_47和102的任何一种的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ IDNO =5-8,22-47和102的任何一种的编码序列至少70%的同一性。在进一步的实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5的编码序列至少70%的同一性。更优选、地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :5的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO :5的编码序列。在进一步的实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :6的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :6的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :6的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 6的编码序列。在进一步的实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :7的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :7的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :7的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO :7的编码序列。在进一步的实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :8的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :8的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :8的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 8的编码序列。在进一步的方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQ ID NO :5-8、22_47和102的任何一种核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列编码能调控植物中花青素生产的转录因子；b)具有长度至少为a)的序列的15个核苷酸的片段；c) a)的序列的互补序列；d) b)的序列的互补序列；e)在严格条件下能同a)的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 5的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 5的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 5的编码序列。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :6的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 6的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 6的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 6的编码序列。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :7的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 7的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 7的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 7的编码序列。
在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :8的序列至少70%的同一性。优选地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 8的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 8的序列。更优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 8的编码序列。在进一步的方面，本发明提供具有同编码含有选自SEQ ID NO :I到4和9到21的任何一种的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%序列同一性的分离的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸编码能调控植物中花青素生产的转录因子。在一个实施方案中，分离的多聚核苷酸具有同编码包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%的序列同一性。在进一步的实施方案中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 5的编码序列。在进一步的方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含a)编码具有同SEQ ID NO :1_4和9-21的任何一种氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中所述多肽是能调控在花青素生物合成途径中的基因的启动子的转录因子;b)具有长度至少为a)的序列的15个核苷酸的片段；
c) a)的序列的互补序列；d) b)的序列的互补序列；e)在严格条件下能同a)的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。在进一步的方面，本发明提供了分离的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQ ID NO :5-8、22_47和102的任何一种核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列编码能调控在花青素生物合成途径中的基因的启动子的转录因子；b)具有长度至少为a)的序列的15个核苷酸的片段；c) a)的序列的互补序列；d) b)的序列的互补序列；e)在严格条件下能同a)的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。在一个实施方案中，被调控的基因编码二氢黄酮醇(dihydroflavolon) 4_还原酶(DFR)0在另一个实施方案中，被调控的基因编码查耳酮合成酶(CHS)。在进一步的方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含a)编码SEQ ID NO :1_4和9_21的任何一种氨基酸序列的多肽变种的序列，其中所述多肽是能调控植物中花青素生产的转录因子，并且其中所述多肽包含SEQ ID NO=IOl的序列；b)具有长度至少为a)的序列的15个核苷酸的片段；c) a)的序列的互补序列；d) b)的序列的互补序列；e)在严格条件下能同a)的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。优选地，所述变种多肽衍生自蔷薇科物种。在进一步的方面，本发明提供分离多肽，其包含a)具有同选自SEQ ID NO :1_4和9_21任何之一的氨基酸序列至少65%同一性的序列，其中所述多肽是能调控植物中花青素生产的转录因子；或b)具有长度至少为a)的序列的15个氨基酸的片段。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 1的序列。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 2的序列。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 3的序列。在一个实施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 4的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :4的序列。在进一步的方面，本发明提供了编码本发明多肽的多聚核苷酸。在进一步的方面，本发明提供了抗本发明的多肽的抗体。在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的任何一种多聚核苷酸的遗传学构建物。在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的遗传学构建物的宿主细胞。 在进一步的方面，本发明提供了被遗传修饰来表达本发明的任何一种多聚核苷酸的宿主细胞。在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的遗传学构建物的植物细胞。在进一步的方面，本发明提供了被遗传修饰来表达本发明的多聚核苷酸的植物细胞。在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的植物细胞的植物。在进一步的方面，本发明提供了生产本发明的多肽的方法，所述方法包括培养包含本发明的遗传学构建物的宿主细胞的步骤。在进一步的方面，本发明提供了具有改变的花青素生产的植物细胞或植物，所述方法包含用遗传学构建物转化植物细胞或植物的步骤，所用的遗传学构建物包括a)至少一条编码本发明的多肽的多聚核苷酸；b)至少一条包含具有长度至少为a)的多聚核苷酸的15个核苷酸的片段的多聚核苷酸；或c)至少一条包含具有长度至少为a)的多聚核苷酸的15个核苷酸的互补序列的多聚核苷酸。在进一步的方面，本发明提供了生产具有改变的花青素生产的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用遗传学构建物转化植物细胞或植物的步骤，所用的遗传学构建物包括a)至少一条本发明的任何一个的多聚核苷酸。；b)至少一条包含具有长度至少为a)的多聚核苷酸的15个核苷酸的片段的多聚核苷酸，或c)至少一条包含具有长度至少为a)的多聚核苷酸的15个核苷酸的互补序列的多聚核苷酸d)至少一条能在严格条件下同a)或b)的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。在所述方法的一个实施方案中，所述构建物被设计来表达一对转录因子，并且所述构建物包含i)编码具有同SEQ ID NO :1、2和9_21的任何一条氨基酸序列至少65%同一性的MYB转录因子的多聚核苷酸序列；和ii)编码具有同SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列至少65%同一性的bHLH转录因子的多聚核苷酸序列。在进一步的实施方案中，在i)中的多聚核苷酸序列具有同SEQ ID NO :5、6、22_27和102的任何一条核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii)中的多聚核苷酸序列具有同SEQ ID NO :7或8的核苷酸序列至少70%的序列同一性。在进一步的实施方案中，在i)中的多聚核苷酸序列具有同SEQ ID NO :5、6、22_27和102的任何一条核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii)中的编码序列具有同SEQID NO :7或8的编码序列至少70%的序列同一性。在进一步的方面，本发明提供了用本发明的方法生产的植物。在进一步的方面，本发明提供了选择花青素生产被改变的植物的方法，所述方法包含检测植物中的本发明的多聚核苷酸的改变的表达。在进一步的方面，本发明提供了选择花青素生产被改变的植物的方法，所述方法 包含检测植物中的本发明的多肽的改变的表达。在进一步的方面，本发明提供了用本发明的方法选择的植物。在进一步的方面，本发明提供了选择被转化的植物细胞或植物的方法，所述方法包含下述步骤a)用本发明的能调控植物中花青素生产的多聚核苷酸或多肽转化植物细胞或植物；b)在所述植物细胞或植物中表达所述多聚核苷酸或多肽；和c)选择具有相对于其它植物细胞或植物而言增加了的花青素着色的植物细胞或植物，所述增加了的花青素着色表明所述植物细胞或植物已经被转化。优选地，本发明的能调控植物中花青素生产的转录因子和变种能调控选自但不限于花青素-3-葡糖苷、花青素-3-邻-芸香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin_3-戍糖苷的花青素的生产。优选地，通过本发明的方法生产或选择的具有改变的花青素生产的植物或植物细胞在选自但不限于cyanadin-3-葡糖苷酶、cyaniding-3-邻-芸香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin-3-戍糖苷的花青素的生产中发生改变。本发明的多聚核苷酸和多聚核苷酸变种能衍生自任何物种或能通过重组或合成方法进行生产。在一个实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自植物物种。在进一步的实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自裸子植物物种。在进一步的实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自被子植物物种。在进一步的实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自双子叶植物物种。本发明的多肽和多肽变种能衍生自任何物种，或能通过重组或合成方法进行生产。在一个实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自植物物种。在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自裸子植物。在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自被子植物。在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自双子叶植物。在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自单子叶植物。
本发明的植物细胞或植物能衍生自任何物种。在一个实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自裸子植物物种。
在进一步的实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自被子植物物种。在进一步的实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自双子叶植物物种。在进一步的实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自单子叶植物物种。优选的植物物种(对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物)包括选自包含但不限定于下述属的水果植物物种苹果属(Malus)、梨属(Pvrus)、李属(Prunis)、悬钩子属(Rubus)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、称猴桃属(Actinidia)、媪梓属(Cydonia)、柑橘属(Citrus)和越橘属(Vaccinium)。特别优选的水果植物物种是家苹果(Malus domestica)、美味称猴桃(Actidiniadeliciosa)、中华称猴桃(A. chinensis)、毛花称猴桃(A. eriantha)、软麥称猴桃(A. arguta)和上述四种称猴桃物种的杂交品种、桃(Prunis persica)、岭南梨(Pyrus L.)、悬钩子属(Rubus)、蔷薇属(Rosa)和草莓属(Fragaria)。优选的植物(对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物)也包括选自包含但不限定于下述属的蔬菜植物品种芸苔属(Brassica)、番茄属(Lycopersicon)和煎属(Solanum),特别优选的蔬菜植物品种为西红柿(Lycopersicon esculentum)和马铃薯(Solanum tuberosum)优选的植物(对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物)也包括选自包含但不限定于下述属的农作物植物品种大豆属(Glycine)、玉米属(Zea)、大麦属(Hordeum)和稻属(Oryza)。特别优选的农作物植物物种包括大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)。优选的植物(对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物)也包括那些蔷薇科的物种。优选的蔷薇科的属包括白胃I梅属(Exochorda)、臭樓属(Maddenia)、Oemleria、Osmaronia、扁核木属(Prinsepia)、李属(Prunus)、苹果亚科(Maloideae)、唐様属(Amelanchier)、石灰树属(Aria)、腺肋花楸属(Aronia)、木瓜属(Chaenomeles)、Chamaemespilus、棒属(Cormus)、枸子属(Cotoneaster)、山楂属(Crataegus) Osmaronia、扁核木属(Prinsepia)、李属(Prunus)、苹果亚科(Maloideae)、唐様属(Amelanchier)、Aria、腺肋花揪属(Aronia)、木瓜属(Chaenomeles)、Chamaemespilus、棒属(Cormus)、枸子属(Cotoneaster)、山楂属(Crataegus)、媪梓属(Cydonia)、牛筋条属(Dichotomanthes)、移属(Docynia)、Docyniopsis^ 批杷 属(Eriobotrya)、Eriolobus^ Heteromeles、Kageneckia、Lindleya、Malacomeles、苹果属(Malus)、欧楂属(Mespilus)、小石积属(OsteomeIes)、酸果木属(PeraphyIlum)、石楠属(Photinia)、假媪梓属(Pseudocydonia)、火棘属(Pyracantha)、梨属(Pyrus)、石斑木属(Rhaphiolepis)、花楸属(Sorbus)、红果树属(Stranvaesia)、Torminalis^ Vauquelinia^ 蔷薇亚科(Rosoideae)、芒剌果属(Acaena )、羽叶花属(Acomastyl is)、龙牙草属(Agrimonia)、羽衣草属(Alchemi I la)、Aphanes、Aremonia、Bencomia、Chamaebatia、Cliffortia、无尾果属(Coluria)、Cowania、Dalibarda、Dendriopoterium、仙女木 M (Dryas)^ 蛇莓属(Duchesnea)、Erythrocoma^Fallugia、蚊子虫草属(Filipendula)、草莓属(Fragaria)、路边青属(Geum)^ Hagenia、Horkelia、Ivesia、様棠花属(Kerria)、Leucosidea、Marcetella、Margyricarpus、Novosieversia，Oncostylus、Polylepis、委陵菜属(Potentilia)、蔷薇属(Rosa)、悬钩子属(Rubus)、地偷属(Sanguisorba)、Sarcopoterium、山莓草属(Sibbaldia)、五辧莲属(Sieversia)^ 太行花属(Taihangia)、Tetraglochin^ 林石草属(Waldsteinia)^ 蔷薇科地位未定(Rosaceae incertae sedis)、Adenostoma、假升麻属(Aruncus)、紫衫属(Cercocarpus )、Chamaebatiaria、地蔷薇属(Chamaerhodos )、美吐根属(Gillenia)、Holodiscus、Lyonothamnus、绣线梅属(NeiIlia)、Neviusia、风箱果属(Physocarpus)、Purshia、鸡麻属(Rhodotypos)、珍珠梅属(Sorbaria)、绣线菊属(Spiraea)和小米空木属(Stephanandra)o 优选的蔷薇科物种包括红柄白胃I梅(Exochorda giraldii)、Exochordaracemosa、Exochorda、红柄白鹽梅(Exochorda giraldii)、Exochorda racemosa、齿叶白鹽梅(Exochorda serratifolia)、臭樓(Maddenia hypoleuca)、Oemleria cerasiformis、Osmaronia cerasiformis、东北扁核木(Prinsepia sinensis)、齿叶扁核木(Prinsepiauni flora)、阿利根尼李子(Prunus al Ieghaniensis )、美洲李(Prunus americana)、Prunusandersonii、奇克索李(Prunus angustifolia)、Prunus apetala、Prunus argentea、山杏(Prunus armeniaca)、欧洲甜樓桃(Prunus avium)、Prunus bifrons、布里扬松杏(Prunusbrigantina)、Prunus bucharica、憐木樓(Prunus buergeriana)、山樓花(Prunuscampanulata)、加罗林桂樓(Prunus caroliniana)、红叶李(Prunus cerasifera)、酸樓桃(Prunus cerasus)、Prunus choreiana、那不勒斯李(Prunus cocomilia)、Prunuscyclamina^ 111 ^(Prunus davidiana)^Prunus debiIis^^(Prunus domestica)^(Prunus dulcis)、 ^ ^ (Prunus emasginata)^ Prunusfasciculata^ IM (Prunusferganensis)、Prunus fordiana、Prunus fremontii、灌木樓桃(Prunus fruticosa)、Prunus geniculata、麦李(Prunus glandulosa)、Prunus gracilis、灰叶稠李(Prunusgray ana)、郝图兰李(Prunus hortulana)、圣叶樓桃(Prunus i licifol ia)、豆樓(Prunusincisa)、阿富汗樓桃(Prunus jacquemontii )、郁李(Prunus japonica)、Prunuskuramica、桂樓(Prunus laurocerasus)、Prunus Ieveilleana^ 葡萄牙桂樓(Prunuslusitanica)、斑叶稠李(Prunus maackii )、圆叶樓桃(Prunus mahaleb)、山杏(Prunusmandshurica)、沙滩李(Prunus maritima)、黑樓桃(Prunus maximowiczii)、Prunusmexicana^^(Prunus microcarpa)^(Prunus mira)^^(Prunus mume)、(Prunus munsoniana)、力口拿大李(Prunus nigra)、千岛樓(Prunus nipponica)、稠李(Prunus padus)、欧洲酸樓桃(Prunus pensylvanica)、碧桃(Prunus persica)、Prunuspetunnikowii、山樓桃(Prunus prostrata)、中国樓桃(Prunus pseudocerasus)、沙樓桃(Prunus pumila)、Prunus rivularis、中国李(Prunus salicina)、大山樓(Prunussargentii)、Prunus sellowii、野黑樓(Prunus serotina)、樓花(Prunus serrulata)、西伯利亚杏(Prunus sibirica)、红李(Prunus simonii )、剌李(Prunus spinosa)、剌叶稠李(Prunus spinulosa)、奥勒同州李(Prunus subcordata)、大叶早樓(Prunussubhirtella)、Prunustakesimensis、俄罗斯矮杏(Prunus tenella)、Prunus texana、毛樓桃(Prunus tomentosa)、Prunus tschonoskii、Prunus umbellata、霞樓花(Prunusverecunda)、美国稠李(Prunus virginiana)、Prunus webbii、东京樓(Prunus xyedoensis)、大叶樓(Prunus zippeliana)、李属 BSP-2004-1 (Prunus sp. BSP-2004-1 )、李属 BSP-2004-2 (Prunus sp. BSP-2004-2)、李属 EB-2002 (Prunus sp. EB-2002)、桤叶唐棣(Amelanchier alnifolia)、Amelanchier arborea、东亚唐様(Amelanchier asiatica)、巴川姆唐様(Amelanchier bartramiana)、力口拿大唐様(Amelanchier canadensis)、Amelanchier cusickii、Amelanchier fernaldii、Amelanchier florida、AmelanchierhumiIs、Amelanchier intermedia、平滑唐様(Amelanchier laevis)、Amelanchierlucida、 Amelanchier nantucketensis、 Amelanchier pumila、 Amelanchierquinti—martii、Amelanchier sanguinea、Amelanchier stolonifera、Amelanchierutahensis、Amelanchier wiegandii、Amelanchier x neglecta、巴川姆唐様 x 唐様属‘dentata’ (Amelanchier bartramiana x Amelanchier sp. ! dentata !)、唐様属‘dentata， (Amelanchier sp. f dentata ')、唐様属 ‘erecta， (Amelanchiersp. f erecta f )、唐様属 ‘erecta，x 光滑唐様(Amelanchier sp. f erecta f xAmelanchier laevis)、唐様属 iSerotina^ (Amelanchier sp. f serotina f )、Aria alnifolia、紫果腺肋花揪(Aronia prunifolia)、毛叶木瓜(Chaenomels cathayensis)、皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)、Chamaemespilus alpina、家棒(Cormus domestica)、细尖枸子(Cotoneaster apiculatus)、团花枸子(Cotoneaster lacteus)、租毛枸子(Cotoneaster pannosus)、Crataegus azarolus、Crataegus columbiana、白玉山植(Crataegus crus-galli)、Crataegus curvisepala、彩叶山植(Crataegus laevigata)、Crataegus mollis、单子山楂(Crataegus monogyna)、欧洲黑山楂(Crataegus nigra)、Crataegus rivularis、Crataegus sinaica、媪梓(Cydonia oblonga)、光叶牛筋条(Dichotomanthes tristaniicarpa)、 云南 移(Docynia delavayi)、Docyniopsistschonoskii、批杷(Eriobotrya japonica)、栎叶批杷(Eriobotrya prinoides)、Eriolobus trilobatus^HeteromeIes abutifolia、Kageneckia angustifolia、Kageneckiaoblonga、Lindleya mespiloides、Malacomeles denticulata、Malus angustifolia、花红(Malus asiatica)、山荆子(Malus baccata)、Malus coronaria、台湾林擒(Malusdoumeri)、Malus florentina、Malus floribunda、Malus fusca、垂丝海棠(Malushalliana)、河南海棠(Malus honanensis)、湖北海棠(Malus hupehensis)、Malusioensis、光叶跪东海棠(Malus kansuensis)、毛山荆子(Malus mandshurica)、西府海棠(Malus micromalus)、红肉苹果(Malus niedzwetzkyana)、沧江海棠(Malusombrophiila)、东方苹果(Malus oriental is)、西蜀海棠(Malus prattii )、揪子(Malusprunifolia)、苹果(Malus pumila)、撒氏海棠(Malus sargentii)、三叶海棠(Malussieboldii )、新疆野苹果(Malus sieversii )、野苹果(Malus sylvestris)、变叶海棠(Malus toringoides)、长圆果花叶海棠(Malus transitoria)、三裂叶海棠(MalustrilObata)、Malus tschonoskii、Malus x domestica、Malus x domestica xMalussieversii^ Malus x domestica x Pyrus communis、 小金 海棠(Malusxiaojinensis)、潰池海棠(Malus yunnanensis)、苹果属、西洋木瓜(Mespilusgermanica)^ 小石积(Osteomeles anthyllidifolia)、华西小石积(Osteomelesschwerinae)、Peraphyllum ramosissimum、红叶石楠(Photinia fraseri)、Photiniapyrifolia、卵叶石楠(Photinia serrulata)、毛叶石楠(Photinia villosa)、中华假媪梓(Pseudocydonia sinensis)、欧洲火棘(Pyracantha coccinea)、火棘(Pyracanthafortuneana)、豆梨(Pyrus calleryana)、Pyrus caucasica、西洋梨(Pyru scommunis)、Pyrus elaeagrifolia、杂交梨品种(Pyrus hybrid cultivar)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、柳叶梨(Pyrus salicifolia)、秋子梨(Pyrus ussuriensis)、白梨(Pyrus xbretschneideri)、石斑木(Rhaphiolepis indiCa)、美洲花揪(Sorbus americana)、白花花揪(Sorbus aria)、欧洲花揪(Sorbus aucuparia)、Sorbus californica、克什米尔花揪(Sorbus commixta)、湖北花揪(Sorbus hupehensis)、Sorbus scopulina、西伯利亚花揪(Sorbus sibirica)、Sorbus torminalis、红果树(Stranvaesia davidiana)、Torminalisclusii、Vauquelinia californica、Vauquelinia corymbosa、Acaena anserinifolia、Acaena argentea、灰蓝芒刺果(Acaena caesiiglauca)、Acaena cyIindristachya^Acaenadigitata、Acaena echinata、Acaena elongata、Acaena eupatoria、Acaena fisistipula、无刺芒刺果(Acaena inermis)、Acaena laevigata、Acaena latebrosa、Acaena lucida、Acaena macrocephala、Acaena magellanica、Acaena masafuerana、Acaena montana、 Acaena multif ida、新西兰芒朿丨J 果(Acaena novaezelandiae)、Acaena oval if olia^ Acaenapinnatifida、Acaenasplendens、Acaena subincisa、Acaena x anserovina、习习叶花(Acomastylis elata)、Acomastylis rossii、Acomastylis sikkimensis、欧洲龙牙草(Agrimonia eupatoria)、曰本龙牙草(Agrimonia nipponica)、Agrimonia parviflora、龙牙草(Agrimonia pilosa)、高山习习衣草(Alchemilla alpina)、Alchemilla erythropoda、习习衣草(Alchemillajaponica)、Alchemilla mollis、Alchemilla vulgaris、Aphanesarvensis、Aremoniaagrimonioides、Bencomia brachystachya、Bencomia caudata、Bencomia exstipulata、Bencomia sphaerocarpa、Chamaebatia foliolosa、Cliffortiaburmeana、Cliffortiacuneata、Ciffortia dentata、Ciffortia graminea、Cliffortiaheterophylla、Cl iffortianitidula^ Ciffortia odorata、Ciffortia ruscifolia、Cliffortia sericea、 Coluria elegans、 Coluria geoides、 Cowania stansburiana、Dalibarda repens、Dendriopoteriummenendezii、Dendriopoterium pulidoi、德拉蒙德仙女木(Dryas drummondii)、仙女木(Dryas octopetala)、皱果蛇莓(Duchesneachrysantha)、蛇毒(Duchesnea indica)、Erythrocoma triflora、Fallugia paradoxa、多叶蚊子草(Filipendula multi juga)裤叶蚊子草(Filipendulapurpurea)、旋果蚊子草(Filipendula ulmaria)、六辧绣线菊(Filipendula vulgaris)、智利草莓(Fragariachiloensis)、裂萼草莓(Fragariadaltoniana)、细梗草莓(Fragaria gracilis)、Fragariagrandiflora、Fragaria iinumae、廣香草毒(Fragaria moschata)、黄毛草毒(Fragarianilgerrensis)、Fragarianipponica、西藏草毒(Fragaria nubicola)、东方草毒(Fragariaorientalis)、五叶草莓(Fragaria pentaphylla)、野草莓(Fragaria vesca)、弗州草莓(Fragaria virginiana)、荷兰草毒(Fragaria viridis)、草毒(Fragaria x ananassa)、草莓属 CFRA538 (Fragaria sp. CFRA 538)、草莓属(Fragaria sp. )、Geum andicola、Geumborisi、保加利亚路边青(Geum bulgaricum)、Geum calthifolium、智利路边青(Geumchiloense)^ Geum geniculatum、Geum heterocarpum、Geum macrophyIlum、Geummontanum、Geum reptans、紫萼路边青(Geum rivale)、Geum schofieldii、Geumspeciosum、欧亚路边青(Geum urbanum)、Geum vernum、路边青属 ‘Chase 2507K’ (Geumsp. ! Chase 2507K/ )、Hagenia abyssinica、Horkelia cuneata、Horkelia fusca、Ivesiagordoni、 重辧様棠花(Kerria japonica)、Leucosidea sericea、Marcetellamaderensis、Marcetella moquiniana、Margyricarpus pinnatus、Margyricarpussetosus、Novosieversia glacials、Oncostylus cockaynei、Oncostylus liospermus、Potylepis australis、Polylepis besseri、Polylepis crista-gallic Polylepishieronymi、Polylepis incana、Polylepis lanuginosa、Polylepis multijuga、Polylepisneglecta、Polylepis pauta、Polylepis pepei、Polylepis quadrijuga、Polylepisracemosa、Polylepis reticulata、Polylepis rugulosa、Polylepis sericea、Polylepissubsericans、Polylepis tarapacana、Polylepis tomentella、Polylepis weberbaueri、无毛藤麻(Potentilla anserina)、Potentilla arguta、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、委陵菜(Potentilia chinensis)、薄叶皱叶委陵菜(Potentilla dickinsii)、Potentilla erecta、莓叶委陵菜(Potentilla fragarioides)、白毛金露梅(Potentillafruticosa)、Potentilla indica、Potentilla micrantha、多裂委陵菜(Potentillamultif ida)、雪白委陵菜(Potentilla nivea)、挪威委陵菜(Potentilla norvegica)、沼生委陵菜(Potentilla palustris)、总梗委陵菜(Potentilla peduncularis)、匍匍委陵菜(Potentilla reptans)、Potentilla salesoviana、狭叶委陵菜(Potentillastenophylla)、三齿委陵菜(Potentilla tridentata)、Rosa abietina、Rosa abyssinica、剌蔷薇(Rosa acicularis)、草地玫瑰(Rosa agrestis)、白蔷薇(Rosa alba)、白蔷薇 x 荆剌蔷薇(Rosa alba x Rosa corymbifera)、大花密剌蔷薇(Rosa altaica)、阿州蔷薇(Rosaarkansana)、野地玫瑰(Rosa arvensis)、本香花(Rosa banksiae)、弯剌玫瑰(Rosabeggeriana)、哈德逊湾玫瑰(Rosa blanda)、硕荀蔷薇(Rosa bracteata)、复伞房蔷薇(Rosa brunonii)、Rosa caesia、力口州蓄薇(Rosa californica)、犬蓄薇(Rosa canina)、卡罗莱纳蓄薇(Rosa Carolna)、月季(Rosa chinensis)、Rosa cinnamomea、Rosacolumnifera、荆棘蔷薇(Rosa corymbifera)、山木香(Rosa cymosa)、山剌玫(Rosadavurica)、马尔密迪玫瑰(Rosa dumalis)、Rosa ecae^Rosaeglanteria^Rosa elliptica、腺果蔷薇(Rosa fedtschenkoana)、异味蔷薇(Rosa foetida)、Rosa foliolosa、法国蔷薇(Rosa gallica)、Rosa gallica x Rosa dumetorum、巨花蔷薇(Rosa gigantea)、瑞道特玫瑰(Rosa glauca)、卵果蔷薇(Rosa heInae)、软条七蔷薇(Rosa henryi )、黄蔷薇(Rosahugonis)、蔷薇杂交品种(Rosa hybrid culivar)、Rosa inodora、Rosa jundzillii、金樓子(Rosa laevigata)、疏花蔷薇(Rosa Iaxa)、光叶蔷薇(Rosa luciae)、重辧五月玫瑰(Rosa majalis)、深山蔷薇(Rosa marretii)、伞花蔷薇(Rosa maximowicziana)、Rosamicrantha、毛叶广东蔷薇(Rosa mollis)、Rosa montana、射香玫瑰(Rosa moschata)、华西蔷薇(Rosa moyesii)、多荀蔷薇(Rosa multibracteata)、多花玫瑰(Rosa multiflora)、Rosa nitida、香水月季(Rosaodorata)、沼泽玫瑰(Rosa palustris)、高山玫瑰(Rosa pendulina)、小檗蔷薇(Rosapersica)、Rosa Phoenicia、宽剌蔷薇(Rosa platyacantha)、樓草蔷薇(Rosa primula)、Rosa pseudoscabriuscula、繅丝花(Rosa roxburghii)、甜石南(Rosa rubiginosa)、玫瑰(Rosa rugosa)、山蔷薇(Rosa sambucina)、长青玫瑰(Rosasempervirens)、絹毛蔷薇(Rosa sericea)、纯叶蔷薇(Rosa sertata)、刚毛玫瑰(Rosasetigera)、Rosa sherardii、Rosa sicula、密刺蓄薇(Rosa spinosissima)、Rosastellata、平花山地玫瑰(Rosa stylosa)、Rosa subcanina、Rosa subcollina、Rosasuffulta、Rosa tomentella、被域毛玫瑰(Rosa tomentosa)、Rosa tunquinensis、苹果蔷薇(Rosa villosa)、维吉尼亚玫瑰(Rosa virginiana)、光叶蔷薇(Rosa wichurana)、小叶蔷薇(Rosa willmottiae)、伍兹氏蔷薇(Rosa woodsii) ；Rosa x damascena、Rosaxfortuniana、Rosa x macrantha、黄剌玫(Rosa xanthina)、蔷薇属(Rosa sp.)、粗叶悬钩子 Rubus alceifolius、美国黑莓(Rubus allegheniensis)、Rubus alpinus、周毛悬钩子(Rubus amphidasys)、北悬钩子(Rubus arcticus)、Rubus argutus、西南悬钩子(Rubusassamensis)、Rubus australis、Rubus bifrons、欧洲木莓(Rubus caesius)、欧洲木莓 x复盆子(Rubus caesius x Rubus idaeus)、无剌小黑莓(Rubus canadensis)、Rubuscanescens、Rubus caucasicus、兴安悬钩子(Rubus chamaemorus)、山莓(Rubuscorchorifolius)、牛叠肚(Rubus crataegifolius)、沙黑莓(Rubus cuneifolius)、美味悬钩子(Rubus deliciosus)、Rubus divaricatus、捕圆悬钩子(Rubus ellipticus)、Rubusflagellaris、 黑莓(Rubus fruticosus)、Rubus geoides、Rubus glabratus、Rubusglaucus、Rubus gunnianus、Rubus hawaiensis、Rubus hawaiensis x Rubus rosifolius、 硬毛黑莓(Rubus hispidus)、Rubus hochstetterorum、_ 草叶悬钩子(Rubushumulifolius)、复盆子(Rubus idaeus)、高梁泡(Rubus lambertianus)、Rubuslasiococcus、白皮糖莓(Rubus leucodermis)、絹毛悬钩子(Rubus lineatus)、Rubusmacraei、Rubus maximiforrnis、Rubus minusculus、Rubus moorei、大乌泡(Rubusmultibracteatus)、Rubus neomexicanus、Rubus nepalensis、Rubus nessensis、雪露毒(Rubus nivalis)、红泡剌藤(Rubus niveus)、Rubus nubigenus、黑树莓(Rubusoccidentalis)、香莓(Rubus odoratus)、Rubus palmatus、茅莓(Rubus parviflorus)、茅莓(Rubus parvifolius)、Rubus parvus、黄泡(Rubus pectinellus)、Rubus pedatus、Rubus pedemontanus、Rubuspensilvanicus、多腺悬钩子(Rubus phoenicolasius)、Rubuspicticaulis、柔毛黑莓(Rubus pubescens)、Rubus rigidus、Rubus robustus、Rubusroseus、空心泡(Rubusrosifolius)、Rubus sanctus、Rubus sapidus、石生悬钩子(Rubussaxatilis)、Rubussetosus、美莓(Rubus spectabilis)、Rubus sulcatus、灰白毛莓(Rubustephrodes)、三花悬钩子(Rubus trianthus)、三色莓(Rubus tricolor)、Rubus trifidus、Rubus trilobus、南露莓(Rubus trivialis)、偷叶黑莓(Rubus ulmifolius)、黑草莓(Rubus ursinus)、Rubus urticifolius、Rubus vigorosus、悬钩子属 JPM-2004 (Rubussp. JPM-2004)、Sanguisorba albiflora、高山地偷(Sanguisorba alpina)、Sanguisorbaancistroides、Sanguisorba annua、美洲地偷(Sanguisorba canadensis)、矮地偷(Sanguisorba filiformis)、白山地偷(Sanguisorba hakusanensis)、Sanguisorbajaponensis、小地偷(Sanguisorba minor)、 Sanguisorba obtusa、地偷(Sanguisorbaofficinalis)、小白花地偷(Sanguisorba parviflora)、大白花地偷(Sanguisorbastiulata)、细叶地偷(Sanguisorba tenuifolia)、Sarcopoterium spinosum、山莓草(Sibbaldia procumbens)、Sieversia pentapetala、Sieversia pusilla、缘毛太行花(Taihangia rupestris)、Tetraglochin cristatum、Waldsteinia fragarioides、欧洲林石草(Waldsteinia geoides)、Adenostoma fasciculatum、Adenostoma sparsifolium、假升麻(Aruncus dioicus)、 Cercocarpus betuloides、 Cercocarpus ledifolius、Chamaebatiaria millefolium、直立地蔷 薇(Chamaerhodos erecta)、Gilleniastipulata、 美吐 根(Gillenia trifoliata)、Holodiscus discolor、Holodiscusmicrophyllus、Lyonothamnus floribundus、川康绣线梅(Neillia affinis)、矮生绣线梅(Neillia gracilis)、中华绣线梅(Neillia sinensis)、疏花绣线梅(NeilliasparsifIora)、西康绣线梅(Ne illia thibetica)、毛果绣线梅(Neillia thyrsiflora)、东北绣 线梅(Neillia uekii)、Neviusia alabamensis、Physocarpus alternans、Physocarpus arnurensis、太平洋风箱果(Physocarpus capitatus)、Physocarpusmalvaceus、山风箱果(Physocarpus monogynus)、美国风箱果(PhysocarpusopulifoIius)、Purshia tridentata、鸡麻(Rhodotypos scandens)、高丛珍珠梅(Sorbariaarborea)> 东北珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)、Spiraea betulifolia、麻叶绣线菊(Spiraea cantoniensis)、 Spiraea densiflora> 粉花绣线菊(Spiraea japonica)、Spiraea nipponica、菱叶绣线菊(Spiraea x vanhouttei)、绣线菊属(Spiraea sp.)、中国小米空木(Stephanandra chinensis)、小米空木(Stephanand ra incisa)和日本小米空木(Stephanandra tanakae)。特别优选的蔷薇科的属包括苹果属、梨属、榲梓属、李属、枇杷属和欧楂属。特别优选的蔷薇科物种包括家苹果、野苹果、西洋梨、沙梨、白梨、榲梓、中国李、红叶李、碧桃、枇杷、扁桃、欧洲甜樱桃、西洋木瓜和欧洲李。更特别优选的蔷薇科的属包括苹果属和李属特别优选的蔷薇科物种包括家苹果和红叶李。术语“植物”包括整株植物、植物的任何部分、植物的繁殖体和后代。术语“繁殖体”指能用在有性或无性生殖或繁殖中的植物的任何部分，包括种子和插穗。


本发明参照附图将能被更好的理解图I :显示了 MdMYBlO (SEQ ID NO :1)和 MdMYB9 (SEQ ID NO :2)同已知的来源于各种物种的花青素MYB调控因子在R2R3结合区域的比较。箭头标明有助于在拟南芥bHLH共同因子相互作用中涉及的基序的特定氨基酸残基(Zimmermann et al.，2000);这些相同的残基是MdMYBlO和MdMYB9中暗示相似的蛋白质-蛋白质相互作用的证据。图2:显示了显示拟南芥和苹果MYB TFs间关系的系统发育分析。箭头显示了在花青素MYB调控因子亚组10中位于AtPAPl的下一个的MdMYBlO的位置。已知的花青素调控因子用灰点表示，图中包括的用黑点表示的其它基因是显示MdMYBlO作用是对该MYB进化枝特异和不是对整体MYBs特异的阴性对照。图3 (A):显示了红地(Red Field)苹果和太平洋玫瑰(Pacific Rose)苹果的皮层、果皮和叶片中的如列在图右手侧的从CHS到UFGT的苹果花青素生物合成基因的qPCR分析数据。X 轴数字指如下内容；1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB, 5、146DAFB，6、红地苹果OP叶片和7、太平洋玫瑰苹果叶片。
图3 (B):显示了贯通在如图3 (A)中显示的发育阶段I到5的苹果果实(红地OP在上列，太平洋玫瑰苹果在下列)的切片。同太平洋玫瑰苹果相比，红地OP苹果的增加的着色明显可见。图4 :显示了 MdMYB 10、MdbHLH3和MdbHLH33的表达分析。(A)在红地苹果(皮层、果皮和叶片)和太平洋玫瑰苹果(皮层、果皮和叶片)中的MdMYBlO的RT-PCR分析和(B)MdMYB 10、MdbHLH3和MdbHLH33的相应的qPCR数据。凝胶泳道和X轴数字如下1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB, 5、146DAFB，6、红地苹果叶片和7、太平洋玫瑰苹果叶片。图5 :显示了双重荧光素酶实验显示了以LUC比REN的比率表示的启动子活性，其中，活性的增加同MYB TFs同/不同bHLH TFs组合的相对于REN的LUC的增加进行平均；(A)拟南芥TT4 (CHS)-Luc启动子，(B)拟南芥TT3 (DFR)-Luc启动子。0:单独的MYB，1:MYB+AtTT8,2 MYB+MdbHLH3, 3 :MYB+MdbHLH33。图6 :显示了烟草中短暂实验的数据。(A)显示了以a7b*比率显示的用Minolta比色计测量的颜色测量数据。朝向正值的转变表明了从绿色到红色的颜色变化。(i) MdMYB10+MdbHLH3, (ii)单独的 MdMYBlO。(B)显示了显示用20x (左)和40x (右)的MdMyblO+MdbHLH3浸润的烟草叶片组织中花青素(更黑的灰色)积累模式的显微影像。比例尺代表50微米。图7 :显示了显示用MdMYB10+MdbHLH3浸润的(A)烟草花瓣和(B)烟草叶片的HPLC痕量(traces)。I、花青苷_3_葡糖苷，2、矮牵牛素_3_半乳糖苷，3、花青苷-3-邻-芸香糖苷。在对照的烟草叶片中没有观测到峰(数据未显示)。图8 :显示了 MdMyblO多肽序列和MdMYBlO的多肽变种以及参考的AtPAPl (也称为AtMYB75)的蛋白序列比对。AtMYB75在GenBank数据库中的登入号是CAB09230。所述比对使用Clustal W算法进行创立(Thompson et al.，1994)。图9 :显示了 MdMyblO多肽序列、MdMYBlO的多肽变种和参考的AtPAPl间的％序列同一性。所述表格显示了包括在图8中的序列的所有可能的序列组合的％同一性值。图10 :显示了在烟草短暂转化实验中At-DFR基因启动子被同苹果bHLH TFs组合的MdMYBlO和PcfMYBlO (PcfMYBlO的变种)的激活影响了 At-DFR基因启动子的活性。双重荧光素酶实验显示了以DFR启动子荧光素酶(LUC)比35S海肾(REN)的比率表达的启动子活性，其中活性的增加同相对于REN的LUC的增加相平均。MYB转录因子(Md MYB10、PcfMYBlO和MdMYB8 (_ve对照)同bHLH转录因子Md bHLH3和MdbHLH33的组合的效应被显示。显示的误差条是6个重复反应的均值土S.E。图11 :显示，MdMYBlO在苹果细胞和/或植物中的过表达提高了花青素生产。(A)(i)显示了着色的愈伤组织细胞。A (ii)显示了用35S-MdMYB10转化的苹果植物(左)和空载体对照植物(右)。与空载体对照相比，用35-MdMYB10 (左)转化的植物清楚地显示了强烈的着色。(B)显示了 35S-MdMYB10苹果叶片(顶部的线条)和空载体对照(底部的线条)的抽提物的花青素轮廓。在520nm波长处由HPLC痕量鉴定的峰；cy-gal，花青苷-3-半乳糖苷，具有更低痕量的cy-glu,花青苷-3-葡糖苷和cy-pent,花青苷_3_戍糖苷。
具体实施例方式在本说明书中作出的针对专利说明书、其它外部文档或信息的其它来源的参考，其通常的目的是为讨论本发明的特点提供背景知识。除非特别指明，否则对这样的外部文档的参考不被解释为承认，这样的文档或信息的这样的来源，在任何权限内，是已有技术，或形成本领域公知常识的部分。术语包含和其语法上的同义词是指“至少部分由……组成”。多聚核苷酸和片段如本文所用，术语“多聚核苷酸”指任何长度但优选为至少15个核苷酸的单链或双链脱氧核苷酸或核苷酸多聚体，并且包括，作为非限制性的范例，基因的编码和非编码序列、正义和反义序列互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、mRNA前体、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的自然出现的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。本文提供的多聚核苷酸序列的“片段”是能同目标靶子特异杂交的连续核苷酸的 子序列，例如，至少15个核苷酸长的序列。本发明的片段包含本发明的多聚核苷酸的连续核苷酸的15个核苷酸，优选地至少20个核苷酸，更优选地至少30个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸和最优选地至少60个核苷酸。多聚核苷酸的片段能以反义、沉默基因、三螺旋或核酶技术或以包括在微阵中的引物、探针进行使用，或用于本发明的基于多聚核苷酸的选择方法。术语“引物”指通常具有游离3’OH基的同模板杂交并用于引发同目标互补的多聚核苷酸的聚合的短多聚核苷酸。术语“探针”指在基于杂交的实验中用来检测同所述探针互补的多聚核苷酸序列的短多聚核苷酸。所述探针可能包含如本文定义的多聚核苷酸的“片段”。多肽和片段如本文所用，术语“多肽”包含氨基酸残基被共价肽键连接的包括全长蛋白质的任何长度的但优选地至少5个氨基酸的氨基酸链。本发明的多肽可能是被纯化的天然产物，或可能部分或完全通过使用重组或合成技术进行生产。所述术语可能指多肽、诸如二聚体或其它多聚体的多肽的聚集物、融合肽、多肽片段、多肽变种或其衍生物。多肽的“片段”是指执行生物活性所需的和/或提供所述多肽三维结构的功能的多肽的子序列。所述术语可能指能执行上述酶活性的多肽、诸如二聚体或其它多聚体的多肽聚集物、融合肽、多肽片段、多肽变种或其衍生物。如本文公开的，用于所述多聚核苷酸或多肽序列的术语“分离的”是用来指从它们的天然细胞环境中移去的序列。分离的分子可能通过包括生物化学、重组和合成技术在内的任何方法或方法的组合而获得。术语“重组的”指从在它的天然环境中包围它的序列移去和/或同在它的天然环境中不存在的序列重组的多聚核苷酸序列。“重组的”多肽序列通过从“重组的”的多聚核苷酸序列的翻译而生产。关于本发明的衍生自具体属或种的多聚核苷酸或多肽的术语“衍生自”指，所述多聚核苷酸或多肽具有同在所述属或种中天然发现的多聚核苷酸或多肽相同的序列。衍生自具体属或种的所述多聚核苷酸或多肽因此可能被合成地或重组地生产。变种如本文中所用，术语“变种”指不同于具体鉴定的序列的多聚核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被删除、取代或加入。变种可能是自然发生的等位变种或非自然发生的变种。变种可能来源于相同的种或来源于其它种并且可能包括同源物、类似物和直系同源物。在某些实施方案中，本发明的多肽变种和多肽具有同本发明的多肽或多肽的生物活性相同或相似的活性。关于多肽和多肽的术语“变种”包括如本文定义的所有形式的多肽和多肽。多聚核苷酸变 种变种多聚核苷酸序列优选地显示至少50%、更优选地至少51%、更优选地至少52%、更优选地至少53%、更优选地至少54%、更优选地至少55%、更优选地至少56%、更优选地至少57%、更优选地至少58%、更优选地至少59%、更优选地至少60%、更优选地至少61%、更优选地至少62%、更优选地至少63%、更优选地至少64%、更优选地至少65%、更优选地至少66%、更优选地至少67%、更优选地至少68%、更优选地至少69%、更优选地至少70%、更优选地至少71%、更优选地至少72%、更优选地至少73%、更优选地至少74%、更优选地至少75%、更优选地至少76%、更优选地至少77%、更优选地至少78%、更优选地至少79%、更优选地至少80%、更优选地至少81%、更优选地至少82%、更优选地至少83%、更优选地至少84%、更优选地至少85%、更优选地至少86%、更优选地至少87%、更优选地至少88%、更优选地至少89%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%的同本发明的序列的同一性。同一性通过具有至少20个核苷酸位置、优选地至少50个核苷酸位置、更优选地至少100个核苷酸位置和最优选地通过本发明的全长多聚核苷酸的对比窗而发现。多聚核苷酸序列同一性能以下述方法进行测定。使用bl2seq中的BLASTN (来自BLAST套件程序，版本2. 2. 5 [2002年11月])将所述目标多聚核苷酸序列同候选多聚核苷酸序列进行比较(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999)，"Blast 2sequences_anew tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMSMicrobiolLett. 174:247-250),公众可从 NCBI (ftp://fp. ncbi. nih. gov/blast/)获得所述程序。除了低复杂度部分过滤(filtering of low complexity parts)应当被关闭外，bl2seq的默认参数被使用。多聚核苷酸序列的同一性通过使用下述unix命令行参数进行检查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p blastn 参数-F F 关闭了低复杂度部分过滤。参数-P选择合适的序列配对算法。所述bl2seq程序在命令行“Identities=”中以相同核苷酸的数目和百分比报告序列同一性。多聚核苷酸同一性也能通过使用通用序列比对程序测定候选和目标多聚核苷酸序列间的重叠的全部长度而进行计算(例如，Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. (1970)J. MoL Biol. 48，443-453)。Needleman-Wunsch通用比对算法的完整工具可在EMBOSS程序包中的针(needle)程序中发现(Rice, P. Longden, I. and Bleasby,A. EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000,vol 16, No6. pp. 276-277)，所述程序包可从 http: //www. hRmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/)获得。欧洲生物信息学研究所服务器也提供执行两个序列间的EMBOSS-针(needle)通用比对的在线工具，网址为http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/0
可选地，计算两个序列间的最佳通用比对而没有末端空位罚分的GAP序列能被使用。GAP 在下述文章中进行了描述Huang, X. (1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。本发明的多聚核苷酸变种也包括那些显示了同一种或更多种明确鉴定的序列的相似性的序列，该序列可能保留那些序列的功能等价物并且，该序列不能被适当地认为已经随机发生。关于多肽的这样的序列相似性可能通过使用公开可得的bl2seq程序进行测定，所述程序可从NCBI的BLAST程序套件(版本2. 2. 5 [2002年11月])(fp//ftp ncbinihgov/blast/)中获得。多聚核苷酸序列的相似性可能通过使用下述unix命令行参数进行检查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p tblastx 参数-F F 关闭了低复杂度部分过滤。参数-P选择合适的序列配对算法。该程序发现序列间具有相似性的区域并为每一个这样的区域报告“E值”，所述“E值”是预期的一个人可以期望在含有随机序列的固定参考大小的数据库中看到的这样的偶然匹配的次数的数目。该数据库的大小在 bl2seq程序中通过默认进行设定。对于比一小的多的小的E值，所述E值近似于这样的随机匹配的几率。当同任何一种具体鉴定的序列比较时，变种多聚核苷酸序列优选地显示小于I X 10_6、更优选地小于I X 10_9、更优选地小于I X 10_12、更优选地小于I X 10_15、更优选地小于I X 10_18、更优选地小于I X 10_21、更优选地小于I X 10_3°、更优选地小于I X 10_4°、更优选地小于I X 10_5°、更优选地小于I X 10_6°、更优选地小于I X 10_7°、更优选地小于I X 10_8°、更优选地小于I X 10_9°和最优选地小于I X 10_1CI°的E值。可选地，本发明的变种多聚核苷酸在严格条件下同特定多聚核苷酸序列或其互补序列杂交。术语“在严格条件下杂交”和其语法上的同义词指多聚核苷酸在确定的温度和盐浓度条件下同目标多聚核苷酸分子(诸如固定在诸如Souther blot或Northern blot等DNA或RNA印记上的目标多聚核苷酸分子)杂交的能力。在严格条件下杂交的能力能通过在较低严格条件下初始杂交然后增加严格条件到期望的严格条件下的杂交进行测定。关于长度大于大约100个碱基的多聚核苷酸分子，典型的严格的杂交条件是低于天然双链的解链温度(Tm)不超过25-30°C (例如，10°C )(通常参见，Sambrook etal.,Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring HarborPress ；Ausubel et al. , 1987, Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing,)。超过100个碱基的多聚核苷酸分子的Tm能通过公式Tm=81. 5+0. 41%(G+C-log(Na+)进行计算(Sambrook et al. , Eds, 1987, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy,1962, PNAS 84:1390)。对于长度超过大约100个碱基的多聚核苷酸的典型的严格条件将是诸如在6X SSC、0. 2%SDS的溶液中预洗；在65°C、6X SSC、0. 2% SDS过夜杂交；然后在IX SSC、0. 1% SDS的溶液中在65°C下洗涤30分钟，洗涤两次，和在0. 2X SSC、0. 1% SDS的溶液中在65°C下洗涤30分钟，洗涤两次。关于具有少于100个碱基的多聚核苷酸分子，范例性的严格的杂交条件是低于Tm5-10°C。平均而言，长度低于100个碱基对的多聚核苷酸分子的Tm被降低大约(500/寡核苷酸长度)°c。关于称为妝核酸(PNAs)的DNA 模拟物(Nielsen et al. , Science. 1991Dec6; 254 (5037) : 1497-500)，其Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA杂交物的Tm值，并能通过使用在 Giesen et al. , Nucleic Acids Res. 1998 Nov I; 26 (21) : 5004-6 中描述的公式进行计算。具有少于100个碱基的DNA-PNA杂交物的范例性的严格的杂交条件是低于Tm值 5-10。。。本发明的变种多聚核苷酸也包括不同于本发明的序列但，作为遗传密码简并性的结果，编码具有同被本发明的多聚核苷酸编码的多肽相似活性的多肽的多聚核苷酸。不改变所述多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默突变”。除了 ATG (甲硫氨酸)和TGG (色氨酸)夕卜，相同氨基酸的其它的密码子可能通过人工识别技术进行改变，例如，优化密码子在特定 宿主生物中的表达。导致在被编码的多肽序列中的一个或多个氨基酸保守替换而没有显著改变其生物活性的多聚核苷酸序列改变也包括在本发明中。技术人员将知道制备表型沉默的氨基酸替换的方法(参见例如，Bowie et al.，1990，Science 247，1306)。归因于被编码的多肽序列中的沉默突变和保守替换的变种多聚核苷酸可能通过使用公众可得的bl2seq程序经由如前面所述的tblastx算法进行测定，所述程序来自NCBI的 BLAST 程序套件(ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast)(版本 2. 2. 5 [2002 年 11 月])。多肽变种关于多肽的术语“变种”包括天然发生地、重组地和合成地生产的多肽。变种多肽序列优选地显示至少50%、更优选地至少51%、更优选地至少52%、更优选地至少53%、更优选地至少54%、更优选地至少55%、更优选地至少56%、更优选地至少57%、更优选地至少58%、更优选地至少59%、更优选地至少60%、更优选地至少61%、更优选地至少62%、更优选地至少63%、更优选地至少64%、更优选地至少65%、更优选地至少66%、更优选地至少67%、更优选地至少68%、更优选地至少69%、更优选地至少70%、更优选地至少71%、更优选地至少72%、更优选地至少73%、更优选地至少74%、更优选地至少75%、更优选地至少76%、更优选地至少77%、更优选地至少78%、更优选地至少79%、更优选地至少80%、更优选地至少81%、更优选地至少82%、更优选地至少83%、更优选地至少84%、更优选地至少85%、更优选地至少86%、更优选地至少87%、更优选地至少88%、更优选地至少89%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%的同本发明的序列的同一性。同一性通过具有至少20个氨基酸位置、优选地至少50个氨基酸位置、更优选地至少100个氨基酸位置和最优选地通过本发明的全长多肽的对比窗而发现。多肽序列同一性能以下述方法进行测定。使用bl2seq中的BLASTP (来自BLAST套件程序，版本2. 2. 5 [2002年11月])将所述目标多肽序列同候选多肽序列进行比较，公众可从NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)获得所述程序。除了低复杂度部分过滤(filtering of low complexity parts)应当被关闭外，bl2seq的默认参数被利用。多肽序列同一性也可能通过使用通用序列比对程序比对候选和目标多肽序列间的重叠的全部长度而计算。如上面所讨论的，EMBOSS-needle (来自http:/www. ebi.ac. uk/emboss/align/)和 GAP(Huang, X. (1994)On Global Sequence Alignment. ComputerApplications in the Biosciences 10，227-235.)也是计算多肽序列同一性的合适的通用序列比对程序。优选的计算多肽序列同一性的方法基于通过使用Clustal W比对待比较序列(Thompson et al 1994, Nucleic Acid Res 11(22)4673-4680)。本发明的多肽变种也包括那些显示了同一种或更多种明确鉴定的序列的相似性的序列，该序列可能保留那些序列的功能等价物并且，该序列不能被适当地认为已经随机发生。关于多肽的这样的序列相似性可能通过使用公开可得的bl2seq程序进行测定，所述程序可从 NCBI 的 BLAST 程序套件(ftp: //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)(版本 2. 2. 5 [2002年11月])中获得。多肽序列的相似性能通过使用下述unix命令行参数进行测定bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F -p blastp当同任何一种具体鉴定的序列比较时，变种多肽序列优选地显示小于IX 10_6、更优选地小于IX 10_9、更优选地小于I X 10_12、更优选地小于I X 10_15、更优选地小于I X 10_18、更优选地小于1X10_21、更优选地小于1X10_3°、更优选地小于1X10_4°、更优选地小于I X 10_5°、更优选地小于I X 10_6°、更优选地小于I X 10_7°、更优选地小于I X 10_8°、更优选地小于I X 10_9°和最优选地小于I X 10_1CI°的E值。参数-F F关闭了低复杂度部分过滤。参数-P选择合适的序列配对算法。该程序发现序列间具有相似性的区域并为每一个这样的区域报告“E值”，所述“E值”是预期的一个人可以期望在含有随机序列的固定参考大小的数据库中看到的这样的偶然匹配的次数的数目。对于比一小的多的小的E值，所述E值近似于这样的随机匹配的几率。没有明显改变其生物活性的所述多肽序列的一个或多个保守替换也被包括在本发明中。技术人员将知晓制备表型沉默氨基酸替换的方法(参见例如，Bowie etal,1990,Science 247, 1306)。构建物、载体及其元件术语“遗传构建物”指通常是双链DNA的多聚核苷酸分子，其可能已经被插入另外的诸如但不限于cDNA分子的多聚核苷酸分子(插入物多聚核苷酸分子)。遗传构建物可能包含支持转录所述插入物多聚核苷酸分子并且可选地翻译所述转录物到多肽的必需元件。所述插入物多聚核苷酸分子可能衍生自宿主细胞，或可能衍生自不同的细胞或生物体和/或可能是重组的多聚核苷酸。一旦处于宿主细胞内，所述遗传构建物可能会整合入宿主染色体DNA。所述遗传构建物可能被连接到载体。术语“载体”指通常是双链DNA的多聚核苷酸分子，其被用来运输所述遗传构建物到宿主细胞。所述载体可能能在诸如E. coli的至少一种另外的宿主系统中复制。术语“表达构建物”指包括支持转录所述插入物多聚核苷酸分子并且可选地翻译所述转录物到多肽的必需元件的遗传构建物。表达构建物典型地包含(5’到3’方向)a)在所述构建物将被转化入的宿主细胞内起作用的启动子，b)待表达的多聚核苷酸,和c)在所述构建物将被转化入的宿主细胞内起作用的终止子。术语“编码区”或“开放阅读框”(ORF)指能在适当调控序列的控制下生产转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的正义链。所述编码序列被5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在而鉴定。当“编码序列”被插入到遗传构建物中时并且当“编码序列”被可操作地连接到启动子和终止子序列时，“编码序列”能被表达。“可操作地连接”指，所述待表达的序列(sequenced)被置于包括启动子、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、抑制子和终止子的调控元件的控制下。术语“非编码区”指处于翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这些序列也分别以5’ UTR和3’ UTR指代。这些区域包括转录起始和终止以及调控翻译效率所必需的元件。终止子是终止转录并在被翻译序列下游的基因的3’非翻译末端发现的序列。终止子是mRNA稳定性的重要决定因素并在某些情况下被发现具有空间调控功能。术语“启动子”指位于所述编码区上游的调控基因转录的非转录顺式调控元件。启动子包含指定转录起始位点和诸如TATA框的保守框以及被转录因子结合的基序的顺式起始元件。“转基因”是从一种生物体获取并通过转化被引入到不同生物体的多聚核苷酸。所述转基因可能衍生自相同物种或同所述转基因被引入的生物体所属的物种不同的物种。“转基因植物”指含有作为遗传操作或转化结果的新遗传物质的植物。所述新遗传物质可能衍生自与产生转基因植物的物种相同或与之不同的植物。“反向重复”是被重复的、其中所述重复的第二个一半是互补链的序列，例如(5，)GATCTA......TAGATC (3 ’ )(5，)CTAGAT......ATCTAG (3，)只要在所述重复区域间具有3-5碱基对的间隔区，通读转录将产生经历互补碱基配对来形成发卡结构的转录物。术语“调控花青素生产”要包括增加和减少花青素生产。优选地，该术语指增加花青素生产。可能被调控的花青素包括但不限于cyanindin-3-葡糖苷、cyaniding-3-邻-芸香糖苷、cyanadin-3-半乳糖苷和cyanadin_3-戍糖苷。术语“改变本发明的多聚核苷酸或多肽的表达”或“改变的本发明的多聚核苷酸或多肽的表达”要包括相应于本发明的多聚核苷酸的基因组DNA被修饰从而导致本发明的多聚核苷酸或多肽的改变的表达的情况。所述基因组DNA的修饰可能是通过遗传转化或其他的本领域已知的诱导突变的方法而进行。所述“改变的表达”能与信使RNA和/或产生的多肽的量的增加或减少有关，并可能由于多聚核苷酸或产生的多肽的序列的改变而产生多肽的改变的活性。申请人:已经鉴定了来源于苹果分别编码多肽(SEQ ID NO :1到4)的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO :5到8)，这些序列是能调控植物中花青素生产的转录因子。申请人还鉴定了编码SEQ ID NO 1的多肽变种(SEQ ID NO 9到21)的SEQ ID NO 5的多聚核苷酸变种(SEQ ID N0:22到47)。所述多聚核苷酸和多肽间关系的概要可在表3(序列概要)中发现。本发明提供了包含所述多聚核苷酸序列的遗传构建物、载体和植物。本发明也提供了包含本发明所述遗传构建物和载体的植物。本发明提供了相对于合适的对照植物其花青素色素生产发生改变的植物。本发明提供了具有增加的和减少的花青素色素生产的植物。本发明也提供了生产所述植物的方法和选择所述植物的方法。合适的对照植物可能包括相同物种和变种的未转化植物或用对照构建物转化的、相同物种和变种的植物。本发明组合物的用途包括具有增加的花青素着色水平的水果或其它植物部分的生产，例如，具有红色果皮和或红色果肉的苹果的生产。本发明也提供通过选择具有增加的花青素色素的植物细胞和植物选择转化的植物细胞和植物的方法，所述增加的花青素色素指明所述植物被转化来表达本发明的多聚核苷酸或多肽。分离或生产多聚核苷酸的方法本发明的多聚核苷酸分子能通过使用本领域普通技术人员所知的各种技术进行分离。用例子进行说明，这样的多肽能通过使用在Mullis et al. , Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, Birkhauser中描述的聚合酶链反应(PCR)(将其引入本文作为参考)进行分离。如本文定义的，本发明的多肽能使用衍生自本发明的多聚核苷酸序列的引物进行扩增。 分离本发明的多聚核苷酸的进一步的方法包括具有本文创立的作为杂交探针的序列的多肽的全部或部分的使用。将标记的多聚核苷酸探针同固定在诸如硝酸纤维素滤纸或尼龙膜的固体支持介质上的多聚核苷酸进行杂交的技术能用来筛选基因组或cDNA文库。范例性的杂交和洗涤条件是在5. OX SSC、0. 5%十二烷基磺酸钠、IX Denhardt’s溶液中于65V杂交20小时；在I. OX SSC、1% (w/v)十二烷基磺酸钠溶液中洗涤(于55°C洗涤三次，每次20分钟)，和在0.5 X SSC、1% (w/v)十二烷基磺酸钠溶液中于60°C可选地洗涤一次(20分钟)。可选的进一步的洗涤(20分钟)能在0. IX SSC、1% (w/v)十二烷基磺酸钠溶液中于60°C的条件下进行。本发明的多聚核苷酸片段可能通过诸如限制性内切酶消化、寡核苷酸合成和PCR扩增等本领域著名的技术进行生产。部分的多聚核苷酸序列可能以本领域著名的方法使用来鉴定相应的全长多聚核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法、5’ RACE (Frohman MA, 1993，MethodsEnzymoI. 218:340-56)和基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。进一步地，用例子进行说明，使用基于已知区域的引物的反向PCR支持获得位于本文公开的多聚核苷酸序列的两端的未知序列(Triglia et al. , 1998, Nucleic Acids Res 16，8186,引入本文作为参考)。所述方法使用多个限制性酶来在基因的已知区域中产生合适的片段。所述片段然后通过分子内连接进行环化并用作PCR模板。分歧引物(divergent primers)从已知区域设计而来。为了完全地组装成全长的克隆，标准的分子生物学方法能被使用(Sambrook et al. , Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring HarborPress, 1987)。当从特定物种生产转基因植物时，用衍生自该物种的序列转化这样的植物可能是有益地。所述的益处可能是改善公众对在产生转基因生物中的物种间转化的关注。此外，当基因的下调是所期望的结果时，利用同所述植物中的序列相同(或至少是高度相似的)的序列可能是必需的，对该基因而言，降低的表达是所期望的。因为这些以及其它的原因，能鉴定和分离在多个不同植物物种中的特定基因的直系同源物是可期望的。变种(包括直系同源物)可能通过所描述的方法进行鉴定。鉴定变种的方法
物理方法变种多肽可能通过使用基于PCR的方法进行鉴定(Mullis et al.，Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, Birkhauser)。典型地，用来通过PCR扩增本发明的多聚核苷酸分子变种的引物的多聚核苷酸序列可能基于编码相应的氨基酸序列的保守区域的序列。可选地，本领域技术人员所熟知的库筛选方法可能被使用(Sambrook etal. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.Cold Spring HarborPress, 1987)。当鉴定所述探针序列的变种时，相对于当精确无误的序列匹配被寻找时所需的条件，其杂交和/或洗涤的严格条件将典型地被降低。多肽变种也可能通过物理方法进行鉴定，例如，通过使用抗本发明的多肽的抗体筛选表达文库(Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. ColdSpring Harbor Press, 1987)或在这样的抗体的帮助下将多肽从天然来源中鉴定出。基于计算机的方法包括多聚核苷酸和多肽变种的本发明的变种序列也可能通过本领域技术人员所熟知的基于计算机的方法通过使用公众域序列比对算法和序列相似性搜索工具来搜索序列数据库(公众域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)而进行鉴定。参见例如，Nucleic Acids Res. 29: l-lOand 11-16，2001中在线资源的例子。相似性搜索检索和比对针对同待分析序列相比较的序列(即查询序列)。序列比较算法使用打分矩阵来为每一条比对序列赋予总体的分数。用于鉴定序列数据库中变种的范例性的程序族是包括BLASTN、BLASTP, BLASTX,tBLASTN 和 tBLASTX 的 BLAST 程序套件(版本 2. 2. 5 [2002 年 11 月])，公众可从(ftp: //ftp.ncbi. nih. gov/blast/)或从美国马里兰州贝塞斯达市38A栋8N805房间的国家医学图书馆国家生物技术信息中心(NCBI)获取。NCBI服务器也提供使用所述程序来筛选大量公众可得的序列数据库的工具。BLASTN比较核苷酸查询序列和核苷酸序列数据库。BLASTP比较氨基酸查询序列和蛋白序列数据库。BLASTX比较在所有阅读框中被翻译的核苷酸查询序列和蛋白序列数据库。tBLASTN比较蛋白查询序列和在所有阅读框中动态翻译的核苷酸序列数据库。tBLASTX比较核苷酸查询序列的六读码框翻译和核苷酸序列数据库的六读码框翻译。所述BLAST程序可能以默认参数使用或所述参数可能按改进筛选所需而改变。包括BLASTN、BLASTP和BLASTX的BLAST算法族的使用在出版物Altschul etal. ,NucleicAcids Res. 25:3389-3402，1997 中进行了描述。被BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法产生的被被查询序列产生的对一个或多个数据库序列的“击中序列数”(hits)比对和鉴定了序列的相似部分。击中序列数以相似性的程度和序列重叠的长度的顺序排列。对数据库序列的击中序列数通常代表了仅是被查询序列的序列长度的部分的重叠。BLASTN,BLASTP,BLASTX,tBLASTN 和 tBLASTX 算法也为比对产生“期望”(Expect)值。期望值(E)表明当搜索含有随机连续序列的相同大小的数据库时人们能“期望”随机看到的击中的数目。期望值用作决定所述对数据库的击中是否表明真的相似性的显著性阈值。例如，指定到多聚核苷酸击中数的0. I的E值被解释为意味着，在被筛选的数据库大 小的数据库中，人们可能期望看到具有简单随机地相似分值的序列的被比对部分的0. I匹配。对于被比对和匹配部分具有0. 01或更低的E值的序列，通过使用所述BLASTN、BLASTP、BLASTX, tBLASTN或tBLASTX算法在那个数据库中发现随机匹配的可能性是1%或更低。一组相关序列的多序列比对能用 CLUSTALW(Thompson, J. D. , Higgins, D. G. andGibson,T.J. (1994)CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penaltiesand weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg. fr/BioInfo/Clustalff/Top. html)或 T-COFFEE (Cedric Notredame, DesmondG. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee:A novel method for fast and accurate multiplesequence alignment, J. Mol. Biol. (2000)302:205-217))或 PILEUP 进行，这些算法使用渐进(progressive)配对比对。(Feng and Doolittle, 1987，J. Mol. Evol. 25，351 )。模式识别软件应用可用于发现基序或标记序列。例如，MEME(用于基序引出的多重Em, Multiple Em for Motif Elicitation)在一组序列中发现基序标记序列，和MAST (基序比对和搜索工具，Motif Alignment and Search Tool)使用这些基序来鉴定查询序列中 的相似或相同基序。MAST结果以具有适当统计数据和发现的基序的可视概观的系列比对的形式提供。MEME和MAST在圣地亚哥的加利福尼亚大学开发。PR0SITE (Bairoch and Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583;Hofmannetal.，1999，Nucleic Acids Res. 27，215)是鉴定从基因组或cDNA翻译而来的未鉴定蛋白的功能的方法。PR0SITE数据库(www. expasy. orR/prosite)含有生物学上重要的模式和轮廓并被设计以便它能同适当的计算机工具共同使用来指定新的序列到已知的蛋白家族或来测定已知的结构域在所述序列中存在(Falquet et al. , 2002, Nucleic AcidsRes. 30，235)。Prosearch是能用给定序列模式或标记搜索SWISS-PR0T和EMBL数据库的工具。因为编码能调控植物中色素生产的转录因子的本发明的变种多聚核苷酸的功能，转录因子能被检测调控已知花青素生物合成基因的表达(例如实施例4)的这个能力或能被检测它们的调控色素生产的能力(例如实施例5和6)。分离多肽的方法包括变种多肽的本发明的多肽可能通过使用本领域著名的肽合成方法进行制备，例如使用固相合成技术的定向肽合成(例如Stewart et al. , 1969, in Solid-PhasePeptide Synthesis, WH Freeman Co,加利福尼亚圣弗朗西斯科)或自动化合成,例如使用应用生物系统431A肽合成仪(加利福尼亚，福斯特市)。所述多肽的突变形式也可能在这样的合成过程中生产。本发明的多肽和变种多肽也可能通过使用本领域著名的各种技术从天然来源中纯化而来(例如，Deutscher, 1990，Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to ProteinPurification, X可选地，本发明的多肽和变种多肽可能在合适的宿主细胞中重组表达并按下面讨论的方法从所述细胞中分离而来。生产构建物和载体的方法本发明的遗传构建物包含一条或多条本发明的多聚核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多聚核苷酸，并可能是对转化有用的，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。本发明的遗传构建物要包括如本文定义的表达构建物。
生产和使用遗传构建物和载体的方法在本领域中是公知的并通常在Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed.Cold Spring HarborPress,1987;Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing, 1987)中进行了描述。生产包含多聚核苷酸、构建物或载体的宿主细胞的方法本发明提供了包含本发明的遗传构建物或载体的宿主细胞。宿主细胞可能衍生自，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。包含本发明的诸如表达构建物的遗传构建物的宿主细胞在本领域著名的方法中对重组生产本发明的多肽的是有用的(例如，Sambrook et al.，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987;Ausubel etal. , CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)。这样的方法 可能涉及在适当的培养基中在适于或有助于本发明的多肽的表达的条件下培养宿主细胞。可能会可选地分泌到培养物中的表达的重组多肽可能然后被从培养基、宿主细胞或培养物培养基中用本领域著名的方法分离(例如，Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology,Vol 182,Guide to Protein Purification)。生产包含构建物和载体的植物细胞和植物的方法本发明进一步提供包含本发明的遗传构建物的植物细胞和被修饰来改变本发明的多聚核苷酸或多肽的表达的植物细胞。包含这样的细胞的植物也形成了本发明的一个方面。在色素生产上发生改变的植物的生产可能通过本发明的方法而获得。这样的方法可能涉及用被设计来改变能调控在这样的植物细胞和植物中的色素生产的的多聚核苷酸或多肽的表达的本发明的构建物来转化植物细胞和植物。这样的方法也包括用本发明的构建物和一个或多个其它的设计来改变一个或更多个多肽或能调控在这样的植物细胞和植物中的色素生产的多肽的表达的构建物的组合来转化植物细胞和植物。用多肽转化植物细胞、植物和其部分的方法在下述文献中进行了描述Draper etal.,1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory ManualBlackwell Sci.Pub. Oxford, p. 365;Potrykus and Spangenburg, 1995, Gene Transfer toPlants. Springer-Verlag,Berlin.;和 Gelvin et al. , 1993, Plant Molecular Biol.Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht。包括转化技术的转基因植物的综述在Galun andBreiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London 中提供。植物遗传操作的方法大量植物转化策略是可获得的(例如，Birch, 1997，Ann Rev Plant Phys PlantMol Biol, 48,297).例如，在多聚核苷酸/多肽被正常表达时，策略可能被设计来增加多聚核苷酸/多肽在植物细胞、器官中和/或在特定发育阶段的表达，或在多聚核苷酸/多肽不能正常被表达时，策略被设计来在细胞、组织、器官中和/或特定发育阶段异常表达多聚核苷酸/多肽。表达的多聚核苷酸/多肽可能衍生自将被转化的植物物种或可能衍生自不同的植物物种。转化策略可能被设计来降低多聚核苷酸/多肽在被正常表达时在植物细胞、组织、器官或在特定发育阶段的表达。这样的策略称为基因沉默策略。
在转基因植物中用于基因表达的遗传构建物典型地包括驱动一条或更多条克隆的多聚核苷酸表达的启动子、终止子和检测(detest)遗传构建物在被转化植物中存在的选择性标记序列。适用于本发明构建物的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中是有作用的并包括细胞_、组织-和器官-特异的启动子、细胞周期特异的启动子、时间启动子、诱导型启动子、在大多数植物组织中有活性的组成型启动子和重组启动子。启动子的选择将依赖于所期望的克隆的多聚核苷酸在时间和空间上的表达。所述启动子可能是那些同目标转基因正常相关的启动子，或衍生自 其它植物、病毒和植物病原性细菌和真菌的基因的启动子。在没有不恰当的实验下，本领域的技术人员将能通过使用包含本发明的多聚核苷酸序列的遗传构建物选择适用于修饰和调控植物特性的启动子。组成型植物启动子的例子包括CaMV 35S启动子、胆脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子和来自于玉米的UbiI启动子。在特定组织中有效并应对内部发育信号或外部无生命或有生命的应激的植物启动子在科学文献中进行了描述。范例性的启动子被进行了描述，例如在WO 02/00894中，将其引入本文作为参考。在植物转化遗传构建物中普遍使用的范例性的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S终止子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶或章鱼肉碱合成酶终止子、玉米(Zea mays)醇溶蛋白基因终止子、水稻(Oryza sativa) ADP葡糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯(Solanum tuberosum) PI-II终止子。在植物转化中普遍使用的选择性标记包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(phophotransferase) II基因(NPT II)、赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite (AgrEvo)和 Basta (Hoechst)抗性的 phosphinothricin 乙酸基转移酶(bar 基因)和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。包含可能用于植物和植物组织中启动子表达分析的报告基因(表达对于宿主而言是外来的、通常是酶活性和/或可视信号(例如荧光素酶、GUS、GFP)的活性的编码序列)的遗传构建物的使用也是被考虑的。报告基因的文献在Herrera-Estrellaet al. , 1993,Nature 303,209，和 Schrott, 1995，In: Gene Transfer toPlants (Potrykus, T. , Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336 中进行了综述。基因沉默策略可能会聚焦于所述基因本身或影响被编码的多肽的表达的调控元件。“调控元件”在本文中以其最广泛可能的意思使用并包括同目标基因相互作用的其它基因。设计来降低或沉默本发明的多聚核苷酸/多肽的表达的遗传构建物可能包括本发明多聚核苷酸的反义拷贝。在这样的构建物中，所述多聚核苷酸被以与启动子和终止子相关的反义方向进行放置。“反义”多聚核苷酸通过逆变所述多聚核苷酸的多聚核苷酸或片段以使产生的转录物将对所述基因的mRNA转录物互补而获得，例如，5' GATCTA 3'(编码链)3' CTAGAT 5'(反义链)3' CUAGAU 5' mRNA 5' GAUCUCG 3'反义 RNA为基因沉默设计的遗传构建物可能也包括反向重复序列。‘反向重复序列’是所述重复序列的第二个一半是在互补链内重复的序列，例如，5' -GATCTA......TAGATC-3'3' -CTAGAT......ATCTAG-5'形成的转录物可能经历互补碱基配对来形成发卡结构。通常在所述重复区域间的至少3-5碱基对的间隔区是允许发卡形成所必需的。另一种沉默方法涉及靶向miRNA的转录等价物的小反义RNA的使用(Llave etal.，2002，Science 297，2053)。这样的相应于本发明的多聚核苷酸的小反义RNA的使用是特别考虑的。如本文中所用，术语遗传构建物也包括小反义RNA和其它影响基因沉默的这样的多肽。如本文定义的，用表达构建物进行的转化可能也通过名为正义抑制的过程产生基因沉默(例如，Napoli et al. , 1990, Plant Cell 2, 279; de Carvalho Niebel etal.，1995，Plant Cell，7，347)。在某些情况下，正义抑制可能涉及全部或部分编码序列的过表达但也可能涉及所述基因的诸如内含子或5’或3’非翻译区(UTR)的非编码区的表达。嵌合的部分正义构建物能用来协调沉默多个基因(Abbott et al.，2002，PlantPhysiol. 128(3) :844-53; Jones et al.，1998，Planta 204:499-505)。这样的用来沉默本发明的多聚核苷酸的表达的正义抑制的使用也是被考虑的。遗传构建物中为基因沉默设计的多聚核苷酸插入物可能对应于诸如启动子和/或内含子和/或5’或3’ UTR序列或相应基因的编码序列和/或非编码序列。其它的基因沉默策略包括显性负向途径和核酶构建物的使用(McIntyre, 1996, Transgenic Res, 5, 257)。转录前沉默可能通过所述基因本身或它的调控元件的突变而带来。这样的突变可能包括点突变、移码、插入、删除和替换。下述文献是披露能用来遗传转化下述植物物种的遗传转化方案的代表性出版物水稻(Alam et al. , 1999, Plant Cell Rep. 18，572)、苹果(Yao et al. , 1995, PlantCell Reports 14，407-412)、玉米(美国专利序列号 Nos. 5，177，010 和 5，981，840)、小麦(Ortiz et al.，1996，Plant Cell R印 15，1996，877)、番茄(美国专利序列号No. 5，159，135)、马铃薯(Kumar et al. , 1996 Plant J. 9，821)、木薯(Li et al. , 1996Nat. Biotechnology 14，736)、莴苣(Michelmore et al. , 1987, Plant Cell Rep. 6，439)、烟草(Horsch et al.，1985，Science 227，1229)、棉花(美国专利序列号 Nos. 5，846，797 和5，004，863)、草(美国专利 Nos. 5，187，073 和 6，020，539)、薄荷(Niu et al.，1998，PlantCell Rep. 17，165)、柑橘植物(Pena et al.，1995，Plant Sci. 104，183);葛缕子(Krens et al.，1997，Plant Cell Rep, 17，39)、香蕉(美国专利序列号 No. 5，792，935)、大豆(美国专利 Nos. 5，416，011,5, 569，834,5, 824，877,5, 563，04455 和 5，968，830)、菠萝(美国专利序列号No. 5，952，543)、白杨(美国专利No. 4，795，855)、普通单子叶植物(美国专利Nos. 5，591，616 和 6，037，522)、芸苔(美国专利 Nos. 5，188，958,5, 463，174 和 5，750，871)、谷物(美国专利 No. 6，074，877)、梨(Matsuda et al.，2005)、李子(Ramesh et al.，2006、Song and Sink 2005、Gonzalez Padilla et al.，2003)、草莓(Oosumiet al.，2006、Foltaet al.，2006)、玫瑰(Li et al.，2003)和悬钩子(Graham et al.，1995)。其它物种的转化也被本发明所考虑。合适的方法和方案在科学文献中可以获得。本领域已知的多个进一步的方法可能被用来改变本发明的核苷酸和/或多聚核苷酸的表达。这样的方法包括但不限于Tilling (Till et al. , 2003, Methods MolBiol, 2%，205)、所谓的 “Deletagene” 技术(Li et al.，2001，Plant Journal 27(3), 235)和诸如合成的锌指转录因子的人工转录因子的使用(例如，Jouvenot et al.，2003, GeneTherapy 10,513)。此外，祀向特定多肽的抗体或其片段也可能在植物中表达来调控该多肽的活性(Jobling et al.，2003，Nat. Biotechnol, 21 (1)，35)。转座子标签途径也可能被应用。此外，同本发明的多肽相互作用的多肽可能通过诸如相位展示的技术(DyaxCorporation)进行鉴定。这样的相互作用的多肽可能在植物中表达或应用到植物来影响本发明的多肽的活性。上述改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达的每一种方法的使用都是 被特别考虑的。选择植物的方法也提供了选择具有改变的色素生产的植物的方法。这样的方法涉及检测植物中的本发明的多聚核苷酸或多肽的改变的表达。为了提高花青素含量，这样的方法可能在改变的色素生产可能不必是可视的幼龄或早期发育阶段来应用来加快培育程序。诸如信使RNA的多聚核苷酸的表达被经常用作相应多肽表达的指示物。测定多聚核苷酸的表达的范例性的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和斑点印记分析(Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold SpringHarbor Press, 1987)。因此，如本文定义的，本发明的多聚核苷酸或其部分在鉴定具有改变水平的花青素的植物的方法中是有用的探针或引物。本发明的多肽可能在设计来鉴定这样的植物的杂交实验中用作探针或在基于PCR的实验中用作引物。可选地，抗体可能被产生来抵抗本发明的多肽。产生和使用抗体的方法在本领域是标准的方法(参见例如Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow A Lane, Eds, ColdSpring Harbour Laboratory, 1998)。这样的抗体可能被用在检测调控植物花朵大小的多肽的改变的表达的方法中。这样的方法可能包括ELISA (Kemeny, 1991, A PracticalGuide to ELISA, NY Pergamon Press)和Western分析(Towbin & Gordon, 1994, J ImmunolMethods, 72, 313)。这些分析多聚核苷酸或多肽表达和选择具有改变的表达的植物的方法在设计来生产具有改变的色素生产的变种的传统的培育程序中是有用的。植物本发明的植物可能被栽培并且被自交或同不同的植物植株进行杂交并且产生的具有期望的表型特征的杂交体可能被鉴定。二或更多代植物可能被栽培来确保目标表型特征是稳定保持和遗传的。从这样的标准培育方法产生的植物也形成本发明的一个方面。现在，本发明将参考下述非限制性实施例进行解释。实施例I :用于编码调控色素生产的转录因子的多聚核苷酸的分离的恰当苹果组织和发育阶段的鉴定材料和方法实时(qPCR)表达分析苹果在2003-2004年从春季(十月)经过夏季到(三月)的苹果季的6个时间点从HortResearch果园的苹果树上(新西兰纳尔逊)进行收集十月(盛花期后7天,DAFB)、^
月(40DAFB)、十二月(67DAFB)、一月(102DAFB)、二月(130DAFB)和三月(146DAFB)。RNA 被从所述果实(分别从相同的果树而来的6个果实、皮和皮层)和2个基因型的叶片分离而来(改自Chang et al.，1993的方法)；白色果肉的商品化的家苹果品种变种Sciros (太平洋玫瑰(Pacific Rose) ,衍生自噶拉和华丽苹果间的杂交)和红色果肉的家苹果品种变种红地，品种‘红地’的自花授粉幼苗(‘狼河’(WolfRiver)和家苹果变种Niedzwetzkyana的杂交)(Brooks and Olmo, 1972)。对于第一个发育水果时间点，十月(7DAFB),从皮层成功地切除果皮是不可能的并且来源于这个样品的数据已经被排除。在第一链cDNA合成(每一个样品重复三次然后三次的结果被混合)前用DNase处理，然后按照厂商说明书使用寡dT进行合成(Transcriptor, Roche Applied Science)。编码苹果花青素路径酶和调控因子的基因通过在HortResearch EST数据库的同源性鉴定,并且，在可能的异型体的情况下，选择按照表达轮廓和文库组织进行制备。相应于这些基因的基因特定引物使用Vector NTI版本9. 0. 0 (www. invitroRen. com)按照一套严格的标准进行设计,从而使通用反应条件的应用成为可能。为了检查反应的特异性，RT-PCR被按照厂商说明书进行使用(Platinum Taq, Invitrogen)。每一对引物的序列和相关的登入号在下面的表I中补充显示。表IDNA扩增和分析使用LightCycler系统(Roche LightCycler I. 5)进行。所有的
U I j；l'
坫闪名丨卜:|4引物IScqIDNO:)反丨士jl物(Scq IDNCh )
GGAGACAACTGGAaAAGGACT COACATTQATACTGGTGTCTr CN944824 MdCHS GGAA(Sl)CA (82)
GGGATAACCTCGCOGCCAAA GCATCCATGCCGCMAOCTACA 麵繩 MdC (S3)A_
TO0AAGCTTeTGAG0ACTG^eCTCCTCCGATGGCAAATCAAA
CN491664 MdFSH
GT (ES)GA (86)
GATAGGGTTTGAGTTCAAGTATCTCCTCAGCA0CCTCAGT1T
AY227729 MdDFR (明賣_
CCAAGTGAAGCGGGTTGTGCT CAAAGCAGGCGGACAGGAGT AFl 17269 MdLDOX /om一，…
(89)AGC (90)
CCACCGCCCTTCCAAACACTCT CACCCTTATGTTACGCOQCAT
AFl 17267 MdUFGT
(91)QT (92)
TGCCTGQACTCGAGAGGAAGA CCTGITTCCCAAAAGCCTGTG MdMYBlO …—
CA <93)AA (94)
ATGTTnTGCGACGGAGAGAGCTAGQCGAGTGAACACCATAC
MdbHLH33 .,…
A (95)ATTAAAGG (96)
AGQGTTCCAQAAGACCACGCCTTGGATGTGGAGTGCTCGGAQ
CN934367 MdbHLH3A
T (97)A (98)
TGACCQAATGAGCAAGGAAATTACTCAGCTTTGGCAATCCAC CN938023 MdA ctin …一 MA " m、
TACT (99)ATC (100)反应均按照厂商方法用LightCycler FastStart SYBR Green Master MixCRocheApplied Science)进行。反应通过使用2 u I 5x Master Mix、0. 5 u M的每种引物、I u I稀释的cDNA和无核酶的水(RocheApplied Science)并使终体积为IOu I进行，同时进行三份反应。在每一个反应中均包括阴性水对照。下述热循环被用于所有的qPCR反应95°C预孵育5分钟，然后95°C (5秒)、60°C (5秒)和72°C (10秒)进行40个循环。在每一个退火步骤的末期测量荧光。扩增后，用在65°C到95°C熔解时获取的连续荧光数据进行熔解曲线分析。用LightCycler软件版本4分析原始数据并且表达用具有标称值I的作为校准的太平洋玫瑰苹果叶片样品来标准化到家苹果肌动蛋白(MdActin，登入号CN938023)。对于每一个基因，标准曲线用cDNA系列稀释产生并且产生的PCR效率计算结果(位于I. 839到
I.945间)被输入到相对表达数据分析中。 结果 生物合成酶的qPCR表达分析为了鉴定水果发育中花青素合成的转录调控是最大的阶段，主要的生物合成基因的表达分析被进行。在太平洋玫瑰苹果和红地苹果间的编码花青素生物合成基因的转录物水平的比较显示了惊人的不同。在实验的代表所述路径中大多数酶步骤的所有基因中，与在太平洋玫瑰苹果中发现的转录水平相比，红地苹果的转录水平在水果发育的所有阶段均显示了显著的提高(图3)。具有指明最高的转录物水平是在一月的时间点的一般模式的红地苹果生物合成基因的转录物丰度在果皮和皮层的整个水果发育阶段均被增强。这个格局模拟了在组织取样时被观测到的在发育早期(40DAFB)及然后再一次在仲夏(102DAFB)被观测到的具有最强烈着色的的着色程度，该水平然后被保持到夏末水果成熟时(图3b)。在水果发育过程中通常具有下降的表达的太平洋玫瑰苹果皮层组织中，所有花青素生物合成基因的均具有相对低的转录物水平。中等的活性在果皮中观察到，具有同水果成熟过程中的增强的着色水平并发的在发育中途的在102DAFB处的表达峰。在两种变种的叶片中的表达水平是明显的但相对的低且红地苹果和太平洋玫瑰苹果间的区别不明显。花青素生物合成酶转录物水平的qPCR分析结果被分析来测定相关的MYB转录因子分离的最适组织/时间点。我们选择显示了最高的花青素生物合成基因表达水平的来源于红地苹果皮层的组织。实施例2 :编码潜在调控苹果中色素生产的转录因子的多聚核苷酸的分离PCR通过使用来源于红地(一月时间点)皮层样品的cDNA和在基于各种物种的花青素调控因子的序列的R2R3结合区域设计的简并引物(具有32倍的简并性)进行。各种编码R2R3MYB区域的cDNAs被获得。来源于测序数据的结果揭示，通过使用5’ RACE(GeneRacer, Invitrogen)具有同花青素调控因子和全长序列的高度同一11"生的一种cDNA被获得。MdMYBlO cDNA的完整序列由重叠片段编译而来。为了比较来源于红地苹果的转录物，全长的cDNAs随后被从家苹果变种太平洋玫瑰苹果和史密斯祖母(Granny Smith)苹果分离而来。MdMYBll (亚组 IlMYB) (DQ074463)(根据 Stracke et al. 2001)也用相同的过程进行分离和测序。其它的候选转录因子从HortResearch EST标本分离而来拟南芥TT2的苹果同族体MdMYB9 (Nesi et al.，2001，AJ299452)和具有同已知花青素调控因子很少序列同源性的苹果MYB MdMYB80先前在其它物种中的研究已经表明，亚组10MYB可能是着色的关键决定因素。在公众可得的苹果EST数据库中(在2005年8月时具有185，000种核苷酸序列)，经过序列同源性比较，没有显示出同拟南芥PAPl和来源于其它物种的亚组10MYB高度同源性的MYB TF、被发现。在PCR后克隆的cDNAs的重叠序列比对显示，最好的候选者MdMYBlO同其它MYBTFs在R2R3区域并且具体地，同来源于其它物种的花青素调控因子分享了高度的同源性(图I)。MdMYBlO同拟南芥亚组10MYB、PAPl紧密相关，它们在R2R3结合区域具有77%的氨基酸同一性并整体具有58%的氨基酸同一性。对于拟南芥PAP2，这些氨基酸同一性百分比分别为75%和57%，同时对于其它物种，整体的同一性数字如下牵牛花AN260%，番茄ANT157%，玉米 C158% 和玉米 P 26%。所有这些MYB TFs均具有同bHLHs特定相互作用的氨基酸残基(Grotewold etal.，2000)。因此，这些共同因子的候选者均选自HortResearch EST数据库。在具有组成型bHLH型TF的巨大系统发育家族中，似乎被涉及到类黄酮生物合成调控中的命名为IIIf的更小的进化枝(Heim et al, 2003)是存在的。在这个进化枝内，两个来源于HortResearch
EST数据库的苹果TFs集成簇(数据未显示)。这些均被全长测序并给予识别符MdbHLH3(CN934367)(拟南芥TT8基因的假定同源物)和MdbHLH33 (Delila的假定同源物)(来源于金鱼草，Goodrich et al. , 1992)。种系发生苹果EST序列用载体、接口和低质量序列区域修饰并被上传到Vector NTI版本9. O. 0(www. invitrogen. com)0 EST 聚族相(EST clustering phase)通过使用 Vector NTIAlignX程序进行。比对然后以MSF格式文档被输出到GeneDoc版本2. 6. 002(http://www.psc. edu/biomed/genedoc/)中。通过在CLUSTALX (vl. 81)中使用默认设置重新排列输出的文档，进化树被产生(Thompson et al，1997)。使用PHYLIP软件包进行种系发生分析(Felsenstein, 1993)。Tree View (v. I. 6. 5)被用来展示产生的进化树(Page, 1996)或通过使用 MEGA 版本 2. I 产生环状进化树(circular trees) (Kumar et al, 2001 )0实施例3 =MdMyblO变种的鉴定从全部为蔷薇科物种的家苹果、野苹果(Ms，欧洲山楂果)、西洋梨(Pc，梨)、沙梨(Ppy梨，Nashi),白梨(Pb，梨，鸭梨)、榲梓(Co，榲梓)、中国李(Ps，日本李，洋李)、红叶李(Pcf，樱桃李)、碧桃(Ppr，桃)、枇杷(Ei，枇杷)、扁桃(Pd，杏)、欧洲甜樱桃(Pav，甜樱桃)、西洋木瓜(Mg，欧楂)、欧洲李(Pdm，普通李)、复盆子(Ri，红树莓)、山杏(par，杏)和乌荆子李(Pi，西洋李子)中收集组织。使用DNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN,目录号69104)按照厂商指导从每一种物种的叶片抽提基因组DNA (gDNA)，砂梨(Ppy梨，Nashi )和白梨(Pb，梨，鸭梨)除外，它们的基因组DNA从水果果皮中分离。使用在下面的表2中显示的引物的组合进行对来源于上述物种的gDNA的PCR(通过标准技术)。表权利要求
1.一种分离的多聚核苷酸,其选自 a)编码具有同SEQID NO :I的氨基酸序列至少69%同一性的多肽的序列，其中％同一性通过全长的所述氨基酸序列进行计算，其中所述多肽是能上调植物中花青素生产的转录因子；和 b)a)的序列的互补序列。
2.根据权利要求I所述的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO :1,9-17 和 19-21。
3.根据权利要求I所述的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO :1、15、16、18 或 19。
4.根据权利要求I所述的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO :1 和 15。
5.根据权利要求I所述的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO 1所示。
6.根据权利要求I所述的分离的多聚核苷酸，其中在a)中的序列如SEQID NO 5所示。
7.根据权利要求I所述的分离的多聚核苷酸，其中在a)中的序列是如SEQID N0:5所示的序列的编码序列。
8.一种分离的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸的序列如SEQ ID N0:5所示。
9.一种分离的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸具有SEQ ID NO :5所示序列的编码序列。
10.一种分离的多聚核苷酸，其选自 a)编码具有同SEQID NO :I的氨基酸序列至少69%同一性的多肽的序列，其中％同一性通过全长的所述氨基酸序列进行计算，并且其中所述多肽是能上调在花青素生物合成途径中的基因的启动子的转录因子；和 b)a)的序列的互补序列。
11.根据权利要求10的分离的多聚核苷酸，其中多肽的氨基酸序列选自SEQID NO U9-17 和 19-21。
12.根据权利要求10或11的多聚核苷酸，其中将被调控的基因编码二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)。
13.根据权利要求10或11的多聚核苷酸，其中将被调控的基因编码查耳酮合成酶(CHS)0
14.一种分离的多聚核苷酸,其选自 a)编码具有SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽变体的序列，其中所述多肽变体是能上调植物中花青素生产的转录因子，并且其中所述多肽变体包含SEQ ID NO=IOl的序列；和 b)a)的序列的互补序列。
15.—种分离的多肽,其选自 a)具有同SEQID NO :I的氨基酸序列至少69%同一性的序列，其中％同一性通过全长的所述氨基酸序列进行计算，其中所述多肽是能上调植物中花青素生产的转录因子，和 b)a)的序列的互补序列。
16.根据权利要求15的分离的多肽，其中所述多肽具有选自SEQID N0:l、9-17、和19-21的序列。
17.根据权利要求15的分离的多肽，其中在a)中的序列如SEQID NO 1所示。
18.—种编码权利要求15-17任一项的多肽的分离的多聚核苷酸。
19.一种抗权利要求15-17任一项的多肽的抗体。
20.—种分离的多聚核苷酸,其选自 a)能够在65°C下在0.2 X SSC、0. 1%SDS中与编码具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸杂交的核酸序列，其中所述核酸序列编码能上调植物中花青素生产的转录因子；和 b)a)的核酸序列的互补序列。
21.根据权利要求20的分离的多聚核苷酸，其中在a)中的核酸序列具有选自SEQIDNO :5,22-47 和 102 的序列。
22.根据权利要求20的分离的多聚核苷酸，其中在a)中的核酸序列具有选自SEQIDNO :5、34-37、40-23 和 102 的序列。
23.根据权利要求20的分离的多聚核苷酸，其中在a)中的核酸序列具有选自SEQIDNO :5、34、35 和 102 的序列。
24.包含权利要求1-14、18、和20-23的任一项的多聚核苷酸的遗传构建物。
25.包含权利要求24的遗传构建物的载体。
26.包含权利要求24的遗传构建物的宿主细胞。
27.被遗传修饰来表达权利要求1-14、18和20-23的任一项的多聚核苷酸的宿主细胞。
28.包含权利要求24的遗传构建物的植物细胞。
29.被遗传修饰来表达权利要求1-14、18和20-23的任一项的多聚核苷酸的植物细胞。
30.包含权利要求28或29的植物细胞的植物。
31.一种生产权利要求15-17的任一项的多肽的方法,所述方法包含培养包含权利要求24的遗传构建物的宿主细胞。
32.—种生产具有改变的花青素生产的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用遗传构建物转化植物细胞或植物的步骤，所述遗传构建物包括 a)至少一种编码权利要求15-17的任一项的多肽的多聚核苷酸； b)至少一种包含a)的多聚核苷酸的至少15个核苷酸长度的片段的多聚核苷酸；或 c)至少一种包含a)的多聚核苷酸的至少15个核苷酸长度的互补序列的多聚核苷酸。
33.一种生产具有改变的花青素生产的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用遗传构建物转化植物细胞或植物的步骤，所述遗传构建物包括 a)至少一种权利要求1-14、18和20-23的任一项的多聚核苷酸； b)至少一种包含a)的多聚核苷酸的至少15个核苷酸长度的片段的多聚核苷酸，或 c)至少一种包含a)的多聚核苷酸的至少15个核苷酸长度的互补序列的多聚核苷酸， d)至少一种能在严格条件下同a)或b)的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。
34.一种通过权利要求32或33的方法生产的植物。
35.一种选择花青素生产发生改变的植物的方法，所述方法包含检测植物的如权利要求1-14、18和20-23的任一项的多聚核苷酸的改变的表达。
36.一种选择花青素生产发生改变的植物的方法，所述方法包含检测植物的如权利要求15-17的任一项的多肽的改变的表达。
37.一种选择已经被转化的植物细胞或植物的方法，所述方法包含步骤 a)用权利要求1-14、18和20-23的任一项的编码能调控植物中花青素生产的多肽的多聚核苷酸转化植物细胞或植物； b)在植物细胞或植物中表达所述多肽；和 c)选择相对于其他植物细胞或植物而言具有增加的花青素着色的植物细胞或植物，其中所述增加的花青素着色表明所述植物细胞或植物已经被转化。
38.一种被权利要求35-37的任一项的方法选择的植物。
39.一种根据权利要求30、34和38的任一项的植物的植物部分、繁殖体、后代或种子。
全文摘要
本发明涉及编码能调控植物中花青素生产的新转录因子的多聚核苷酸和被编码的能调控植物中花青素生产的转录因子。本发明也涉及包含所述多聚核苷酸的构建物和载体，和宿主细胞、植物细胞和用所述多聚核苷酸、构建物和载体转化的植物。本发明也涉及生产具有改变的花青素生产的植物的方法和通过该方法获得的植物。
文档编号C07K16/16GK102703470SQ20121014733
公开日2012年10月3日 申请日期2006年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者A·阿兰, R·埃斯普利, R·海伦斯 申请人:新西兰植物和食品研究院有限公司