专利名称：重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于牛分支杆菌感染检测的新型试剂盒及方法。
背景技术：
牛结核病(BovineTuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的ー种人畜共患的慢性传染病，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染也可引起。世界各国均有发生，危害十分严重，给畜牧业带来巨大的经济损失和贸易限制，目前世界范围内约有5000万头牛感染了结核病，毎年因此损失30多亿美元。该病能通过未经巴氏消毒的奶及奶制品、接触污染的气溶胶或者动物尸体等传染给人，从而严重威胁着公共卫生安全及人类健康，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指出“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控 制是不会成功的。”目前，ー些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5. 83%和5. 43%ο近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达10. 18%以上，甚至更高。牛結核菌素皮内变态反应试验(GB/T 18646)为世界动物卫生组织(OIE)规定的牛结核病检验的标准方法。结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified proteinderivatives, PPD)，是将牛型或禽型分枝杆菌菌株接种适宜培养基培养，收获培养物，经灭活、滤过除菌、提纯或浓缩制成，其实际上是牛型或禽型分枝杆菌菌株在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中广泛存在，致使pro检验的特异性较差，在实际检测时容易出现假阳性，而且pro生产エ艺复杂，生产过程中需要培养具有毒力的牛分枝杆菌，很难保证其安全性及各批次间pro质量的稳定。90年代后期国外发展起来的以PF1D为抗原的Y-干扰素(interferon-Y, IFN- Y )释放试验明显提高了牛分枝杆菌检测的灵敏性，其原理为致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN- Y，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-Y的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了結核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，已在澳大利亚、新西兰等国家进行了大量的田间试验，目前国外已将该类牛结核病检测试剂盒商品化，并被OIE所推荐使用，但因使用PH)作为刺激原，在实际使用过程中不可避免出现假阳性。为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性祀(The early secretedantigenic target6ku protein, ESAT-6)、MPB-64、MPB-70、MPB-63、热休克蛋白 65 (Heatshock protein 65, HSP-65)、抗原 85B (antigen 85B, Ag_85B)、IOkDa 的培养滤液抗原(IOkDa culture filtrate antigen, CFP-10)等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称“鸡尾酒法”)作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)检测,通过检测牛血清中相应的抗体水平进行牛结核病的血清学检测，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想，特别是感染早期及免疫低下者常出现假阴性。因此，研究更加敏感、特异的牛结核病新型检测抗原和检测方法，是控制牛结核病当务之急。本发明人通过基因重组技术表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，并将其进行组合，使得刺激原克服了 Pro的缺点，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。用多个重组蛋白进行组合作为刺激原替代PF1D进行皮内变态反应实验和IFN-Y释放试验进行了反复研究，将两种方法结合，很好地提高了实验特异性的同时，也克服了单ー抗 原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的新型试剂及方法。本发明的发明原理为由于在皮内变态反应和Y-IFN释放试验中使用传统的PPD作为刺激原时，存在着成分复杂，特异性差的缺点，而现有用来替代pro作为刺激原的重组牛结核杆菌蛋白的敏感性不理想。本发明尝试用这些重组蛋白或其混合物替代pro作为刺激原，检测牛分枝杆菌感染。首先，本发明提供了一种重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，其中包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，所述重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN- Y。其中所述三种重组蛋白分别具有SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。本发明中，三种重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的混合比例为I 2 Γ2 广2，包括但不限于I 1 :1、2 2 1和I 1 :2，其中优选为I 1 :1。本发明对所述三种重组蛋白及其混合物进行了皮内变态反应和IFN-Y释放试验，实验结果证明(I)本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于PPD作为刺激原的皮内变态反应试验和IFN-Y释放试验；(2)本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于单一重组蛋白；(3)重组蛋白混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于相同蛋白的串联共表达产物。在各种不同成分不同比例的重组蛋白混合物中，由CFP-10/ESAT-6、ΜΡΒ70和Ag85B的混合三种成分2: :1:1混合的混合物作为刺激原进行皮内变态反应时，能特异性的检测牛分枝杆菌感染牛，且敏感度较高，最小刺激量可达0. 3mgg/ml。另ー方面，本发明还提供了ー种试剂盒，其中包括本发明所述的诊断试剂和ELISA检测所需的试剂。所述ELISA检测所需试剂包括但不限于包被缓冲液、洗涤缓冲液、酶标板和辣根过氧化物酶标记兔抗牛ニ抗等。另ー方面，本发明还提供了用于制备重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂的引物，其中包括4对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5,第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7，第三引物对的核苷酸序列为SEQID N0:8和SEQ ID N0:9，第四引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11。另ー方面，本发明提供了所述引物在在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。另ー方面，本发明提供了ー种制备重组蛋白混合 介导的牛结核病诊断试剂的方法，该方法包括(a)PCR扩增获得的编码基因；(b)重组表达步骤(a)获得的编码基因得到3种重组蛋白；(C)将步骤(b)获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂。在一个实施方案中，所述制备方法步骤(a)中PCR扩增所用4对引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 至 SEQ ID NO: 11 所示。在一个实施方案中，所述制备方法步骤(b)中得到的三种重组蛋白的具有分别具有 SEQID NO: I、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列。在一个实施方案中，其中步骤(C)中的混合比例混合比例为广2 Γ2 :广2，包括但不限于I :1 :1、2 2 1和I :1 :2，其中优选为2 1 :1。另ー方面，本发明提供了一种牛结核病诊断方法，该方法包括下述步骤(a)剃毛后測量牛颈部上1/3处皮肤厚度；(b)向測量部位施用权利要求I至3任一项所述的诊断试剂；(b) 72小时后，再测皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。在本发明的ー个具体实施方案中，所述诊断方法包括下列步骤a)在牛的颈部上1/3处剃毛，并用游标卡尺测量该部位的皮肤厚度；b)在剃毛部位用Iml注射器皮内注射O. Iml终浓度为O. 5mg/ml的本发明所述的重组蛋白混合物；c)注射72h后，游标卡尺測量注射部位的皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。该方法的判断标准为当皮厚差小于2mm时判定为阴性,皮厚差> 2mm时判定为牛分枝杆菌感染阳性。另ー方面，本发明还提供了一种牛结核病诊断方法，该方法包括a)采集抗凝血，加入细胞培养板山)然后向上述细胞培养板中加入本发明所述的，37°C下共孵育24小时；c)收集上层血浆作为待检样品，用ELISA方法检测血浆样品中牛IFN-Y的释放水平。本发明的优点本发明的检测牛分枝杆菌感染的新型检测试剂具有特异性高、生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉、可标准化生产等优点，本发明的新型牛分枝杆菌检测试剂盒及方法克服了牛分枝杆菌血清学检测方法和以pro为刺激原的皮内变态反应及IFN-Y释放试验的不足，具有较强的的特异性和敏感性，因此可用于牛结核病的临床检測。
图I.牛分枝杆菌特异性蛋白PCR扩增产物电泳結果。泳道M DL2000plus分子量Marker ;泳道I :CFP-10/ESAT_6串联基因产物；泳道2 :MPB70PCR扩增产物；泳道3 Ag85BPCR扩增产物。图2.重组蛋白SDS-PAGE电泳結果。泳道I :CFP_10重组蛋白纯化产物；纯化产物对照；泳道2 ESA-6重组蛋白纯化产物；泳道3 :串联表达的CFP10/ESAT6重组蛋白纯化产物泳道4 pET-32a(+)空载体标签蛋白(PET)纯化产物；泳道5 MPB70重组蛋白纯化产物；泳道6 Ag85B重组蛋白纯化产物。
图3.重组蛋白MPB70和Ag85B作为CFP-10和ESAT-6的补充抗原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，I代表CFP10/ESAT6、MPB70和Ag85B以等比例混合作为刺激原；2代表CFP-10/ESAT-6串联蛋白。图4.三种重组蛋白以不同混合方式作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，组合I代表CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B以2:1:1混合；组合2代表CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B等比例混合。图5.重组蛋白混合物的剂量筛选結果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差。图6.载体标签蛋白PET作为皮内变态反应试验刺激原检测結果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，PET代表载体标签蛋白。
图7.重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合物作为皮内变态反应试验刺激原检测牛结核阴性牛結果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B以2:1:1混合作为刺激原，蛋白终浓度为O. 3mg/ml。图8.重组蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合物(重组蛋白浓度为O. 3mg/ml)作为皮内变态反应试验刺激原临床检测結果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，左图代表检测的40头结核病阴性牛数据，右侧图为30头结核病阳性牛数据。下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任ー专利、专利申请和出版物在此引入作为參考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如SambiOOk等人，分子克隆实验室手册' (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例实施例I重组质粒的构建I. I牛分枝杆菌基因组DNA的提取用M. bovis Vallee III菌株(购自中国兽医药品监察所)培养物，參照细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒(购自北京博大泰克基因技术有限责任公司)说明书所述方法进行。I. 2引物的设计根据GenBank 中 M. bovis AF2122/97 基因组 DNA(登录号为 BX248333)的 ESAT-6、CFP-10和MPB70、Ag85B基因序列设计特异性引物，上游引物携带Bam H I酶切位点，下游引物携帯Hind III酶切位点，引物由上海生エ生物技术有限公司合成，序列见表1(下划线处为保护性碱基及酶切位点)。表I PCR引物名称、序列及扩增产物的大小
权利要求
1.一种重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，所述重组蛋白混合物由三种重组蛋白组成，所述三种重组蛋白分别具有SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的氨基酸序列。
2.权利要求I所述的重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，其中所述三种重组蛋白的混合比例为I 2:1 2:1 2。
3.权利要求2所述的重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断试剂，其中所述三种重组蛋白的混合比例为I :1 :1或2 :2 :1或I :1 :2。
4.ー种试剂盒，其中包括权利要求I至3任一项所述的诊断试剂和ELISA检测所需的包被缓冲液、洗涤缓冲液、酶标板和辣根过氧化物酶标记鼠抗牛IFN-Y单抗等试剂。
5.用于制备权利要求I至3任一项所述诊断试剂的引物，其中包括4对引物，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO: 11所示。
6.ー种制备权利要求I至3任ー项所述诊断试剂的方法，该方法包括(a)PCR扩增获得重组蛋白编码基因，其中PCR扩增使用权利要求5所述的引物；(b)重组表达步骤(a)获得的编码基因得到所述重组蛋白；(C)将步骤(b)获得的重组蛋白混合得到所述诊断制剂。
7.权利要求6所述的制备方法，其中步骤(b)重组表达使用的宿主为大肠杆菌。
8.权利要求6或7所述的制备方法，其中步骤(c)中重组蛋白的混合比例为广2Γ2 I 2。
9.一种重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法，其中包括(a)用权利要求I至3任ー项所述的诊断试剂对待检血液样品进行处理；(b)用ELISA方法測定处理后血液样品上层血浆中IFN-Y的释放水平。
10.一种重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法，其中包括(a)剃毛后測量牛颈部上1/3处皮肤厚度；(b)向測量部位施用权利要求I至3任ー项所述的诊断试剂；(b)72小时后，再测皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。
全文摘要
本发明属于免疫检测领域。本发明提供了重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂。所述试剂包括作为特异性刺激原的重组蛋白混合物，该重组蛋白混合物能够刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应。利用本发明所述检测试剂建立的皮内变态反应试验与PPD皮内变态反应试验相比，具有更高的特异性，可区分牛分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染，因此可有效用于牛结核病的临床检测。
文档编号C07K14/35GK102692509SQ20121014713
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者侯绍华, 朱鸿飞, 袁维峰, 贾红, 郭晓宇, 鑫婷 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所