专利名称：白菜脱水转录因子BpDREB1基因序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物基因工程技术领域，涉及ー种白菜脱水转录因子BpDREBI的基因序列在制备转基因抗冻植物方面的应用。
背景技术：
非生物胁迫是影响植物生长发育以及作物产量、品质的重要环境因素。植物在长期的进化过程中形成了多种能够在逆境下生存的适应机制。逆境胁迫下，植物体通过一系列生理、生化以及分子水平上的改变，从而适应压力。迄今为止，已经在拟南芥中克隆了299个干旱诱导表达基因，213个高盐诱导表达基因，544个低温诱导表达基因，这些基因中 包括多个干旱、高盐、低温应答转录因子家族，这些转录因子基因通过与下游基因启动子区域的顺式作用元件发生特异性结合，激活或抑制下游多个抗逆基因表达，调节不同的生理过程，实现对逆境的耐受。另外，这些基因又可以进一歩划分为多个亚家族，如AP2/EREBP、MYB, NAC, MYK 和 ERF。DREB亚家族隶属于AP2/EREBP家族，含有ー个AP2结构域，通过与DRE/CRT顺式作用元件结合，调控大量压カ应答基因表达，例如rd29A、cor 15A, Kin I等，这些产物的综合作用可以提高植物对干旱、低温、高盐的抗逆性。目前，已经在油菜、玉米、大豆、大麦、水稻以及棉花等多种作物中克隆得到DREB基因。但这些DREB基因的保守序列并不完全相同，对逆境的调控类型、程度也存在差异。因此，对不同作物、不同类型的DREB基因进行研究对深入了解植物抗逆途径有着重要的意义。大白菜为中国秋季种植的重要蔬菜品种，秋季的突然低温会造成大白菜的冻害，造成大白菜強烈的脱水，产量降低，严重影响大白菜的品质。本研究用生物信息学方法结合PCR技术，在大白菜中克隆了ー个脱水应答转录因子基因，并对该基因的结构、推测的氨基酸序列、进化树等进行了分析，发现其属于DREB亚家族中Al亚族，进ー步研究表明，该基因受低温强烈诱导表达，转基因过表达发现它能明显提高拟南芥植株中可溶性糖等抵御冻害的有机物质含量。该研究为白菜抗低温分子机理研究提供依据，为转基因抗冻植物研究提供新的基因资源。
发明内容
本发明的目的是公开了白菜脱水转录因子BpDREBI基因序列在制备转基因抗冻植物方面的应用；所述的转基因抗冻植物为拟南芥。本发明人与2008年申请了白菜脱水转录因子BpDREBI的基因序列，申请号200810154003. 5，在此基础上本发明人进ー步进行了该基因在植物抗逆功能上的研究，通过基因的诱导表达模式分析显示，BpDREBI被低温強烈、迅速诱导表达，并对干旱胁迫也有一定程度的响应，但对高盐处理几乎没有响应。将该基因的编码区构建到表达载体上并转化拟南芥，过表达ガ的转基因拟南芥经低温诱导后，其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示ガ转录因子具有家族成员基因结构的特征，在低温、干旱应答途径中起重要作用，特别是在抵抗低温方面作用显著，因此，完成了本发明。白菜脱水转录因子BpDREBI的基因序列它属于DREB基因家族成员，该基因全长647bp,序列如下
I ATGCGATGACCTCATTTTCTGCCTTCTCTGAAATGTTGGGCTCCGAGTAC5I GAGTCTCCTACATTAAGCGGGGAGTATTGTCCGACGCTGGCCGCGAGCTGIOI TCCGAAGAAACCTGCGGGTCGGAAGAAGTTTCGGGAGACGCGTCACCCAAI5I TTTACAGAGGAGTACGTCTGAGAAACTCAGGTAAGTGGGTGTGTGAGGTG20I AGGGAGCCAAACAAAAAGTCTAGGATTTGGCTCGGTACTTTCTTAACCGC251 CGAGATCGCAGCTCGTGCTCACGACGTCGCCGCCATAGCCCTCCGCGGCA30I AATCAGCTTGTCTCAATTTTGCTGACTCGGCTTGGCGGCTCCGTATCCCG351 GAGACAACATGCCCCAAGGAGATTCAGAAGGCGGCTGCTGAAGCCGCCTT40I GGCTTTTCAGGCTGAGATAAATAATACGACGACGGATCATGGCCTGGACA45I TGGAGGAGACGATCGTGGAGGCTATTTTCACGGAGGAAAACAACGATGTG50I TTTTATATGGACGAGGAGTCCATGTTAGAGATGCCGGCCTTGTTGGCTAG551 TATGGCGGAAGGAATGCTTTTGCCGCCGCCGTCCGTACATTTCGGACATA601 ACTATGACTTTGACGGAGATGCTGACGTGTCCCTT TGGAGTTAATT
本发明所述的白菜脱水转录因子BpDREBI基因序列，该基因含有编码213个氨基酸的开放读码，理论预测该蛋白的分子量为23kDa，序列如下
MTSFSAFSEMLGSEY
ESPTLSGEYCPTLAASC PKKPAGRKKFRETRHP I YRGVRLRNSGKffVCEV REPNKKSRIffLGTFLTA EIAARAHDVAAIALRGK SACLNFA D SAWRLR I P ETTCPKE IQKAAAEAAL AFQAEINNTTTDHGLDM EETIVEAIFT EE NNDV FYMD E E S ML E MPA LLAS MAEGMLLPPP SV H FG HN YDFDGDADVSLWS。
图I :BpDREBl基因的核苷酸和氨基酸序列；下画线AP2/EREBP结构域；虚线可能的核定位信号序列；*示終止密码子；
图2 DREB/CBF蛋白的多重序列比对； 图3 :白菜BpDREBI与DREB亚族中其他基因成员的系统谱系分析；
图4 :利用RT-PCR分析BpDREBI诱导表达模式；图5 :转基因拟南芥的PCR鉴定；M DL2000 Marker ；1 :以重组质粒为模板的阳性对照；2 :以野生型拟南芥为模板的空白对照；3 —17 :转基因拟南芥的PCR检测；
图6 :转基因拟南芥的生通指标检测；A :脑氣酸含量；B :可溶性糖含量；
图7 :转BpDREBI基因拟南芥植株在低温处理下的表型A :野生拟南芥对照，B :野生拟南芥低温处理，C :转基因植株低温处理。
具体实施例方式 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。实施例I I.材料与方法
1.1 植物材料培养及胁迫处理
白菜秋绿60(Chinese cabbage Qiulv60)种子由天津蔬菜研究所提供。种子消毒后,置于培养室，生长温度23°C,光照16h,黑暗8h,MS培养液培养7d后,将白菜幼苗分成4组,第ー组不加任何处理，作为对照；第ニ组将整株材料置于4°C冰箱低温处理；第三组将培养液按10%浓度加入PEG6000用于干旱处理；第四组将培养液按250mM浓度加入NaCl用于高盐处理。处理时间依次为2h、4h、8h、12h、24h、48h。分别提取上述材料总体RNA，_80°C冷冻备存。拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia生态型品种由浙江大学寿惠霞教授馈赠。拟南芥种子消毒后，经1/2MS培养基培养至四叶期后移至培养土中培养，定期浇水培养用于后续试验。基因的分离
按RNAiso Plus试剂盒说明书提取低温处理2h白菜叶片的总体RNA，取I μ g总体RNA为模板，用OligodT (18)为逆转录引物，在AMV作用下逆转录成cDNA。利用Bio-Edit软件将比对分析芥菜(EU136731. I)、油菜(AF499032. UAF084185. I)和萝卜(GQ866977. I)的 DREB 基因序列，设计并合成ー对引物，BpF :5’ ATGCGATGACCTCATTTTCT 3’，BpR :5’TAATAACTCCAAAGGGACAC 3’，进行PCR扩增，扩增体系cDNAl μ I,PCR缓冲液(10X )2· 5 μ I，MgCl2 (25mM) I. 5 μ l,dNTP (IOmM) Ιμ ，引物 F(IyM) 2. 5 μ 1，引物R(1 μ Μ) 2. 5 μ I, TaqE(5U/y L)0. 25 μ I, ddH20 13. 75 μ L· 反应条件为95°C 变性 5 分钟，95°C I 分钟，50°C60秒，72°C 2分钟，35个循环，72°C延伸5分钟。PCR产物经I. 0%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化后插入pGEM-Teasy载体，转化到DH5 α感受态细胞中，阳性克隆子送由上海生エ生物工程公司测序，测序结果提交NCBI GenBank进行同源性分析。白采叶片基因组DNA的提取
利用CTAB法提取白菜叶片基因组DNA，用O. 75%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。用
I.2中引物和反应体系进行极的gDNA扩增，将产物进行克隆和测序并与极的cDNA序列进行比对，确定是否含有内含子。基因表达模式的半定量分析
用基因表达半定量法分析在不同诱导条件下的表达模式，以未经处理的白菜叶片RNA，不同处理的叶片RNA，经转录后得到的cDNA为模板，根据基因cDNA序列设计特异引物BpDREBIIF和BpDREBllR，进行PCR扩增，扩增体系如下cDNAly I, PCR缓冲液(10X ) 2· 5μ 1，MgCl2 (25mM) I. 5 μ I, dNTP (IOmM) I μ 1，引物 F(IyM) 2·5μ1，引物R(IyM) 2· 5μ 1，Taq E(5U/y L)0. 25μ 1，ddH20 13. 75 μ I。反应条件为95°C 变性 2 分钟，95°C I分钟，50°C 30秒，72°C 30秒，30个循环，72°C延伸5分钟。根据高山离子芥Actin 基因(GeneBank Accession No. AY825362)设讨对内參基因扩增引物Actin (F)5’ ATGCGATGACCTCATTTTCT 3’，Actin (R):5，TAATAACTCCAAAGGGACAC 3’，PCR 产物经 I. 0%琼脂糖凝胶电泳分析。植物表达载体pCAMBIA1301-BpDREBl的构建及拟南芥转化
为将目的基因转入拟南芥，首先，提取PCAMBIA1301质粒，通过汝7 II和访II双酶切该质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收9. 8Kb的大片段。然后，根据ガ基因的上下游序列设计ー对特异弓I物BpORF-F和BpORF-R扩增基因全长，并在引物的5’端分别引入汝ゾII和ガII酶切位点，以TA克隆的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，将 PCR扩增产物连接到pCAMBIA1301饱Bgl II和访II位点之间，构建过表达载体，命名为pCAMBIAl30I-BpDREBI。将经鉴定的重组质粒pCAMBIAl301-BpDREBI利用冻融法转化农杆菌GV3101，在抗性YEB平板上筛选转化菌株，选取经鉴定的转化菌株，利用花蕾浸染法转化拟南芥[24]。转基因拟南芥植株筛选、鉴定
利用农杆菌介导的转化方法转化拟南芥，收获TO代种子，将其播种于筛选培养基上进行抗性筛选；当植株转入土中生长后，分别剪取一小叶片，抽取核DNA后，进行PCR检测，上游引物为pCAMBIA1301质粒汝7 II切点上游240 bp的35S启动子区内序列35S-1 :5’ GCGATAAAGGAAAGGCCATCG 3’，下游引物为基因区段中一部分序列BpR-I :5’CACATCGTTGTTTTCCTCCGT 3’，扩增体系同I. 2。收集鉴定阳性植株的种子。Tl代种子用于后续研究。BpDREBI过表达拟南芥中可溶性糖以及游离脯氨酸含量分析
Tl代拟南芥种子播种于培养介质(培养土 蛭石珍珠岩=2:1:1)中培养3周，进行逆境胁迫，然后按照Zhang等(1990)的方法分别测定植株叶片可溶性糖、脯氨酸。以同样条件培养的野生型拟南芥作为对照。所得数据经SPSS17. O软件对两独立样本进行t检验分祈。结果
2.I BpDREBI基因的结构分析
利用生物信息学技术从40C处理2h的白菜叶片中分离到ー个新的DREB1/CBF类转录因子的cDNA，序列全长647bp，含有编码213个氨基酸的开放读码，理论预测该蛋白的分子量为23kDa，等电点5. 11。应用SMART软件分析发现，该基因具有典型的AP2/EREBP家族基因结构域(第49 107位之间)。另外，它的AP2/EREBP结构域中还有两个保守的氨基酸残基(V14和E19)，据报道这两个氨基酸残基在DREB亚族中是相对保守的。将该cDNA序列命名为 BpDREBI (GeneBank 登录号为 EF219470)(图 I)。经 NCBI/Blastn 分析发现，ガ与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。序列分析预测软件显示；该序列的第30-40区域的N端为碱性氨基酸富集区(PKKPAGRKKFRETRHP)，推測其可能为核定位信号。将基因没序列中预测的AP2区的氨基酸序列与其它已知的DREB1/CBF类蛋白序列进行比对，结果显示(图2)这些序列间氨基酸同源性较高，其中与油菜中CBF序列同源性更为接近。BpDREBI基因编码的氨基酸序列功能分析如下
AP2/EREBP类转录因子有AP2亚族、RAV亚族、DREB亚族、ERF亚族和AL079349五个亚家族，该亚族又可以进ー步划分为六组(A1-A6)。利用Clustal W软件进行系统谱系分析发现，本研究中克隆的没基因与DREB亚族中Al组亲缘关系较近(图3)。BpDREBI基因的内含子分析
以基因组DNA为模板进行PCR扩增也获得大小相同的特异性条带，克隆、測序后发现基因碱基序列与BpDREBI相同，说明基因编码区内部不含有内含子。BpDREBI基因在逆境胁迫条件下的表达分析 为了进一步说明基因在逆境胁迫下的表达情况，利用半定量分析法分别检测了低温(4°C)、干旱(10%PEG)和高盐(250mMNaCl)条件下的基因表达。结果发现，在低温诱导下，ガ/7ガ_/ 紐7基因的表达在2h内迅速増加，高水平表达维持到48h后开始下降。干旱诱导下，4h内没表达量不断増加，4h达到高峰，随后下降，在24h又有升高的趋势。高盐诱导下，4h内没表达量略有增加，但趋势不明显，其它时间段表达量一直维持在本底水平。这说明，BpDREBI基因表达同时受低温、干旱这两种胁迫诱导，但被干旱诱导程度低于低温诱导程度(图4)。转基因植株的鉴定
经潮霉素筛选的土培拟南芥植株，分别剪取叶片，抽取核DNA，进行PCR检测，检测引物选用载体PCAMBIA1301上的上游引物35S-1取BpDREBI基因上的下游引物BpR-I.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，发现在8棵植株中扩增出了 750bp的目的片段，说明其为转基因植株。这些转基因植株用于进一歩分析(图5)。低温诱导下转基因植株的抗逆性分析
正常生长条件下，转基因拟南芥与野生型拟南芥中的脯氨酸和可溶性糖含量几乎相同。低温处理7d后，野生型和转基因拟南芥中的脯氨酸和可溶性糖含量都会明显升高，但转基因植株中的脯氨酸含量是野生型植株的3. 81倍(P〈0. 01)(图6A)，可溶性糖的含量是野生型的4. 41倍(P〈0. 01)(图挑\復BpDimBI转基因拟南芥较野生型植株具有更强的耐低温能力。图7是转BpDREBI基因拟南芥植株在低温处理下的表型，其中A为野生拟南芥对照，B为野生拟南芥低温处理15天的苗，C为转基因植株低温处理15天的苗。从图中可以看出，与A相比，野生型拟南芥低温处理下，叶片明显小而且颜色黄，苗的长势弱；而转BpDREBI基因的C长势与A相比非常接近，没有黄化叶片，显然比野生型的拟南芥抗低温能力得到很大提高。该基因的发现以及它在抗低温中的作用，将为植物抗逆育种提供新的基因资源。
权利要求
1.白菜脱水转录因子BpDREBl基因序列在制备转基因抗冻植物方面的应用；所述的转基因抗冻植物为拟南芥。
全文摘要
本发明涉及DREB类转录因子—BpDREB1(EF219470)。该基因序列全长647bp，推测编码蛋白含213个氨基酸，相对分子量为23kDa，理论等电点为5.11，与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明，BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示，BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达，并对干旱胁迫也有一定程度的响应，但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后，其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子具有家族成员基因结构的特征，在低温、干旱应答途径中起重要作用。
文档编号C07K14/415GK102676542SQ201210146319
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者刘晓颖, 张竞秋, 彭永康, 王振英, 陈丽媛 申请人:天津师范大学