专利名称：大豆生育期e1-b3a基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及大豆生育期el_b3a基因及其编码蛋白。
背景技术：
El基因位于着丝点附近，自Bernard (1971)年报道以来，人们一直没有克隆出其功能基因。由于该基因位于近着丝点(pericentromeric region),遗传重组率较低，不利于采用图位克隆法克隆出该基因，在发明专利名称ー种大豆生育期El基因及其编码蛋白，专利申请号为201210112662.9中，公布出El基因序列及其相应的蛋白序列后，证明大豆生育期El基因具有強烈抑制大豆开花的生理功能。其蛋白质序列虽然并不能鉴定出B3结构域，但是与B3结构域基因具有远缘的关系。B3结构域基因是ー类较为保守的植物特有的 转录因子，一般只有100-120氨基酸，常与其他结构域共同起作用。B3结构域中含有与DNA相结合的特殊位点，一般与DNA分子的大沟起作用。在含有B3结构域的蛋白质对抗逆性反应、植物的生长与发育等诸多方面起重要作用。同吋，El基因具有ー个核定位信号，其特征为亲核蛋白一般都含有的能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品种中，其El基因的突变如何影响着大豆生育期(开花期及成熟期)是ー个非常重要的科学问题，目前还没有在分子水平上的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供了大豆生育期el_b3a基因及其编码蛋白。本发明的大 生育期el-b3a基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本发明的大豆生育期el_b3a基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本发明的大豆生育期el_b3a基因是大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)的突变型基因。本发明的有益效果本发明是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进ー步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表ー类新型的基因家族，我们已证实El基因可以代表着El位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本发明对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-b3a基因，其对大豆生开花具有促进作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174区域存在着ー个与B3结构域远缘相似的区域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336处发生3个碱基突变及在337 338处有2个碱基缺失，在蛋白质的C未端发生移码，在氨基酸序列中fill处与大豆生育期基因El相同，112^147处为错位氨基酸序列，因移码(frameshift)而形成了終止子(见Seq ID No :2)，而且在148位产生了终止密码子，因而本发明的大豆生育期el_b3a基因在氨基酸65位从苏氨酸改变为异亮氨酸，改变了大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)的B3结构域的完整性，从而使大豆开花提前，说明El基因中类似于B3的结构域的改变，引发了大豆El基因功能的改变。具有该基因的品种烟黄3号表现为早花特性。
图I为el_b3a电泳图，其中，I号为中黄13,2号为合丰55,3号为Jack,4号为烟黄3号,5号为垦丰18,6号为合丰50 ；图2具el_b3a基因的大豆品种烟黄3号在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后45天照片，其中，箭头所指的是已开放的大豆花朵；图3具大豆生育期El基因的大豆品种Harosoy-El在长日照16小时光照/8小时 黑暗条件下，出苗后45天的照片。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的大豆生育期el_b3a基因的突变基因序列如序列表 Seq IDNo 1 所示。本实施方式是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大 中具有典型的Β3基因结构域基因，本基因是代表ー类新型的基因家族，我们已证实EI基因可以代表着EI位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-b3a基因，其对大豆生开花具有促进作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174区域存在着ー个与B3结构域远缘相似的区域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336处发生3个碱基突变及在337 338处有2个碱基缺失，在蛋白质的C未端发生移码，在氨基酸序列中fill处与大豆生育期基因El相同，112^147处为错位氨基酸序列，因移码(frameshift)而形成了終止子(见Seq ID No :2)，而且在148位产生了终止密码子，因而本实施方式的大豆生育期el_b3a基因的氨基酸65位从苏氨酸改变为异亮氨酸，改变了大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的B3结构域的完整性，从而使大豆开花提前，说明El基因中类似于B3的结构域的改变，引发了大豆El基因功能的改变。具有该基因的品种烟黄3号表现为早花特性。
具体实施方式
ニ 本实施方式的大豆生育期el_b3a基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本实施方式是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大 中具有典型的Β3基因结构域基因，本基因是代表ー类新型的基因家族，我们已证实EI基因可以代表着EI位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-b3a基因，其对大豆生开花具有促进作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174区域存在着ー个与B3结构域远缘相似的区域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336处发生3个碱基突变及在337 338处有2个碱基缺失，在蛋白质的C未端发生移码，在氨基酸序列中fill处与大豆生育期基因El相同，112^147处为错位氨基酸序列，因移码(frameshift)而形成了終止子(见Seq ID No :2)，而且在148位产生了终止密码子，因而本实施方式的大豆生育期el_b3a基因的氨基酸65位从苏氨酸改变为异亮氨酸，改变了大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的B3结构域的完整性，从而使大豆开花提前，说明El基因中类似于B3的结构域的改变，引发了大豆El基因功能的改变。具有该基因的品种烟黄3号表现为早花特性。通过以下试验验证本发明的效果(I)本发明的el_b3a基因是通过如下方法得到的取长至三叶真叶期烟黄3号大豆品种的叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA ；以提取的DNA为模板通过Kl与K2引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS扩增el-b3a基因，PCR反应条件如下94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循环，再72°C延伸7min，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序。 测序结果表明大豆生育期el_b3a基因具有序列表中Seq ID No :1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由522个碱基组成，并编码具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白质。(2)大豆El基因中el_b3a基因鉴定一、取长至三叶真叶期待测品种的叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA ;ニ、以步骤ー提取的基因组DNA为模板，Fl和F2为引物，采用购买自Takara公司的rTaq酶进行扩增，PCR反应条件如下95°C预变性3min ;95°C变性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32个循环，再72°C延伸7min ;三、取经步骤ニ PCR后的8 μ I (其浓度约为300ng/μ I)，稀释I倍后，经BfuI限制性内切酶(购买自Takara公司)，在37° C温度下，消化3h ;四、然后将步骤三酶切后的产物，采用13%非变性PAGE胶电泳进行检测；其中，步骤一所述的待测品种中黄13，合丰55，Jack，烟黄3号，垦丰18和合丰50。电泳检测结果如图I所示，由图I可知，4号烟黄3号品种出现2条条带(如BC所示)，即为el-b3a基因型，而1、2、3、5和6号只有一条条带(如A所示)，即没有并不能被BfuI消化，则为El的其它基因型。(3) el_b3a基因的功能验证一、大豆品种带有el_b3a基因的表型分析为进ー步验证el_b3a基因型的功能，将含有el_b3a基因的烟黄3号与含有大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的Harosoy-El品种，种植在人工培养箱中(人工控制日照长度长日照为16小时光照/8小时黑暗，中等长照为13. 5小时/9. 5小时，短日照条件为12小时光照/12小时黑暗)，光源为荧光灯与白炽灯，其光强为235^270 μ mo I · s^1 ·πΓ2，同时，在自然光照的田间种植，观察含有el_b3a基因烟黄3号品种与含有大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)的Harosoy-El品种从出苗到开花的天数。结果如表I所示，从表I中可以看出，大豆为短日照作物，在短日照(12小时光照/12小时黑暗)条件下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品种与含有el_b3a基因的烟黄3号种开花天数(从播种到开花)相当，大约30天左右；而在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品种的开花天数超过70天，而含有el-b3a基因的烟黄3号品种为43天左右，在中等日照条件下，含有el_b3a基因的烟黄3号品种在45天时已经开花(图2)，而含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品种则处于营养生长状况(图3)。el_b3a基因是在我国自己培育的大豆品种烟黄3号中发现的，说明el_b3a基因代表着一个极其重要的一类变异，对于全面了解El基因的机理起决定作用。表I品种带有el_b3a基因与带有El基因型的比较
权利要求
1.大豆生育期el-b3a基因，其特征在于大豆生育期el-b3a基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如权利要求I所述的大豆生育期el_b3a基因的编码蛋白，其特征在于大豆生育期el-b3a基因编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-b3a基因及其编码蛋白，它涉及大豆生育期e1-b3a基因及其编码蛋白。本发明提供了大豆生育期e1-b3a基因及其编码蛋白。本发明的大豆生育期e1-b3a基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本发明的大豆生育期e1-b3a基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本发明通过品种的相关的遗传及分子功能验证，e1-b3a基因与E1基因相比，具有促进开花的功能。
文档编号C07K14/415GK102690831SQ20121016217
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者刘宝辉, 吕世翔, 吴红艳, 夏正俊, 翟红, 邱丽娟 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所