一种高产率制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法
【专利摘要】本发明提供一种高产率制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，属于生物化学【技术领域】。本发明利用产生特异性葡萄糖醛酸酶的菌株为催化剂，以甘草酸为底物，在不断搅拌通气转化反应过程中，以某种大孔树脂为分离介质，移走产物单葡萄糖醛酸甘草次酸，释放树脂中吸附的底物甘草酸，与发酵液中未反应的甘草酸一起流出树脂柱，流回发酵罐继续发酵。实现发酵、补料和产物分离三个过程同时耦合。通过维持发酵过程中适当的底物浓度和较低的产物浓度，从而解除产物负反馈抑制及因产物和底物发酵液粘度过高不利于发酵的难题，显著提高了底物的利用效率和单葡萄糖醛酸甘草次酸发酵产率，同时自动化程度高。
【专利说明】一种高产率制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产率制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，更具体涉及一种发酵与树脂分离耦合制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，属于生物化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甘草酸是中国传统药材甘草中的主要药理活性成分。国内外对该中药单体的研究始于19世纪，其具有抗炎症、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏等作用。而且它是一种甜味剂，甜度约是蔗糖的170倍。随着研究的深入，上世纪80年代学者们发现不同生物中的β-葡萄糖醛酸苷酶作为催化剂在甘草酸的转化中具有以下4种催化特性:(I)甘草酸一甘草次酸；(2)甘草酸一单葡萄糖醛酸甘草次酸一甘草次酸；(3)甘草酸一单葡萄糖醛酸甘草次酸:(4)单葡萄糖醛酸甘草次酸一甘草次酸。
[0003]其中单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)是利用葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸分子结构中的末端糖苷键裂解，水解去一个葡萄糖醛酸分子而得到的。单葡萄糖醛酸甘草次酸极性介于甘草酸和甘草次酸之间，因此作为药物其具有更好的跨膜运输能力，其在抗炎和抗过敏活性上等同或超甘草酸，还具有显著的抗癌作用，并可以合成比甘草酸更具药用价值的甘草次酸类衍生物。同时单葡萄糖醛酸甘草次酸的甜度是甘草酸的5倍多(蔗糖的1000多倍)，目前市场上作为高端甜味剂开发。综上所述单葡萄糖醛酸甘草次酸具有比甘草酸更优的生理和药理活性。开发出高产的单葡萄糖醛酸甘草次酸生产工艺具有良好的经济效益和社会意义。
[0004]利用强酸强碱化学水解甘草酸制备单葡萄糖醛酸甘草次酸，收率低，酸碱溶剂消耗量大，产生的废液、废渣严重污染环境，运行成本高，未见工业化应用的报道。已经发现能够转化甘草酸为单葡萄糖醛酸甘草次酸的葡萄糖醛酸苷酶存在于肠道细菌、真菌和动物组织等。国内有鱼红闪、冯世江等人先后报道利用筛选得到的霉菌转化获得单葡萄糖醛酸甘草次酸，宋占科等克隆了产紫青霉(P.purpurogenum Li_3) β -葡萄糖醒酸苷酶,并在大肠杆菌中表达进行转化单葡萄糖醒酸甘草次酸；国外报道有采用微生物Sreptococcus LJ-22和Cryptococcus magnus MG-27进行转化单葡萄糖醒酸甘草次酸。也有利用纯化获得的葡萄糖醛酸苷酶来转化单葡萄糖醛酸甘草次酸的报道，但步骤繁琐，周期长。
[0005]目前使用微生物细胞进行甘草酸的生物转化存在的主要问题是:
[0006]1、生物催化剂主要为微生物细胞，过高的底物浓度，增加了培养基的渗透压，不利于微生物的生长和葡萄糖醛酸苷酶的积累 。
[0007]2、转化产物单葡萄糖醛酸甘草次酸在发酵液不断积累，对葡萄糖醛酸苷酶的反馈抑制作用增强，发酵液粘度增加，不利于转化反应的充分进行。
[0008]因此需要创造适宜的发酵环境，既能解除产物的抑制又能增加底物的利用，同时保持酶转化需要的生物量。李春等在专利号为201110344409.1名为《一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸的方法》的发明专利中，使用分批补料添加底物甘草酸的间歇操作，虽然改善了底物的抑制，但底物利用率低、能耗高，而且没有解决产物反馈抑制的问题，导致发酵产量难以进一步提高，生产效率较低。
[0009]本发明提供的制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，是采用产生特异性葡萄糖醛酸酶的菌株为催化剂，运用发酵与树脂分离耦合技术，获得高产量的物单葡萄糖醛酸甘草次酸，具有效率高、成本低的优点，同时重复性好，适合产业化生产，目前未见相关专利和文献报道。
【发明内容】
[0010]本发明为了解决上述问题，提供一种高产率制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。本发明的技术方法包括如下步骤:
[0011](I)制备单葡萄糖醛酸甘草次酸发酵的种子培养液；
[0012](2)制备发酵培养基,在发酵罐中灭菌,冷却后,接入步骤(1)中的种子培养液；
[0013](3)控制发酵罐中的发酵参数，发酵至对数生长中后期；
[0014](4)将树脂柱预先吸附一定量的甘草酸底物；
[0015](5)将发酵液在一定的流速下经过过滤分离器过滤除菌，滤液流经步骤(4)中的树脂柱，再经过无菌过滤重新流回发酵罐，继续发酵，形成循环通路；
[0016](6)发酵结束后，将吸附了单葡萄糖醛酸甘草次酸的树脂柱经过洗脱，收集，浓缩，干燥，得单葡萄糖醛酸甘草次酸。
[0017]所述步骤(1)种子培养基制备由如下步骤组成:
[0018]①种子培养基为`pH5.0~7.0的含有碳源、氮源、无机盐的常规液体培养基；斜面培养时添加1.8~2.5%的琼脂，其中无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐和氨水中的一种或者多种，有机氮源为蛋白胨，酵母膏，玉米浆或者牛肉膏中的一种或多种，无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、锰盐中的一种或者多种；
[0019]②斜面培养:将产单葡萄糖醛酸甘草次酸的菌株在斜面培养基中进行划线后，在温度25~37°C培养24~360h，用于种子培养基接种或者菌株保存；
[0020]③发酵种子培养:每100ml种子培养基接种3~5环，温度25~37°C培养24~120h ；
[0021]上述培养基均经过115°C，20min灭菌冷却。
[0022]所述步骤(2)中，发酵培养基为pH5.0~7.0的含有底物甘草酸盐、氮源、无机盐的常规液体培养基，其中甘草酸盐为钠盐，钾盐，镁盐，铵盐中的一种或者几种，浓度为
0.1g~80g/L ;氮源优选无机氮源，包括各种铵盐、硝酸盐和氨水中的一种或者多种；发酵培养基经升温，灭菌，然后将培养基冷却，接入种子培养液的接种量占发酵培养基体积的2~10%，优选5~8%。
[0023]所述步骤(3)中，发酵参数优选温度25~37°C ;发酵罐通气量每分钟0.1~1.5倍发酵液体积；搅拌转速为150~300rpm。
[0024]所述步骤(4)中，使用树脂为大孔吸附树脂，类别包括AB-8，NK_2，DM130中的一种；该树脂对单葡萄糖醛酸甘草次酸的吸附力强于底物甘草酸，预先吸附一定量的底物甘草酸。待发酵液流入树脂时，发酵液中产物单葡萄糖醛酸甘草次酸吸附上去，同时将甘草酸竞争脱附流出，与未反应底物一起流回发酵罐，继续用于发酵转化。树脂用量并非量越大越好，在实际操作中，随转化持续时间的延长，杂菌污染几率增大，发酵液中的固悬物增多，需要适时终止发酵，优选树脂与发酵液的体积比为0.9: I。本发明使用的某种大孔吸附树月旨，是经过大量的筛选，选择出在多组分发酵液和一定PH条件下，能竞争性吸附产物，取代低吸附性的甘草酸的一种大孔吸附树脂。并非是常规的发酵后富集纯化，而是在发酵过程中吸附发酵产物单葡萄糖醛酸甘草次酸的同时，释放树脂柱上吸附的甘草酸底物，作为补料底物，与发酵液中未反应的甘草酸一起流出树脂柱，流回发酵罐继续发酵。实现发酵、补料和产物分离三个过程同时耦合，维持发酵过程中适当的底物浓度和较低的产物浓度，从而解除产物负反馈抑制和因产物和底物发酵液粘度过高不利于发酵的难题，使得转化持续彻底的进行，延长发酵时间，显著提高了底物的利用效率和单葡萄糖醛酸甘草次酸发酵产率，同时自动化程度高。
[0025]所述步骤(5)中，发酵液经过过滤分离器过滤的流速为每小时0.01~0.2倍发酵液体积；使用的过滤分离器可以选用的过滤介质包括无机分离膜(材质是莫来石、氧化铝等)，烧结的多孔合金，不锈钢滤网。在实际操作中，随转化持续时间的延长，发酵液中的固悬物增多，可以同时启动高速反冲洗泵，冲洗去除滤网表面截留的菌体，防止阻塞。循环通路可以采用间歇方式或者连续方式:采用间歇方式时，每隔8~20小时进行一次操作，每次持续8~24小时，循环3~10次；采用连续方式时，持续进行120~240h至发酵结束。
[0026]所述步骤(6)树脂洗脱剂为一定浓度的乙醇、甲醇、丙酮的水溶液，优选为80%~95%浓度的乙醇。
[0027]本发明提供的葡萄糖醛酸甘草次酸的技术方案，是采用产生特异性葡萄糖醛酸酶的菌株为催化剂，以甘草酸为 底物，在不断搅拌通气转化反应过程中，以某种大孔树脂为分离介质，移走产物单葡萄糖醛酸甘草次酸，释放树脂中预先吸附的底物甘草酸，维持发酵体系相对高的底物浓度和较低的底物浓度，处理后获得高产量的物单葡萄糖醛酸甘草次酸。具有效率高、成本低的优点，同时重复性好，适合产业化生产。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例中所用的甘草酸盐类由江苏天晟药业有限公司研发中心提供，含量为73.4%。下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护绝不局限于此。
[0029]实施例1
[0030](I)配制种子培养基:葡萄糖10g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4 0.25g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然。斜面培养基在此配方中加入20g/L的琼脂。以上培养基均在115°C灭菌20min。从冰箱保存的菌种斜面挑满环菌苔，接种于新鲜斜面培养基，于30°C培养48h后，得到活化的种子斜面。将活化的斜面挑2环接种装有40ml种子培养基的250ml三角瓶，于30°C、200rpm震荡培养24h，获得发酵种子液。
[0031](2)配制发酵培养基:甘草酸浓度 55g/L，KH2PO4 lg/L，尿素 10g/L，MgSO40.8g/L，溶剂为水；用酸碱控制PH6。在115°C灭菌20min。取60ml发酵种子液接种到装有3L转化培养基的5L发酵罐中
[0032](3)控制发酵罐温度30°C,搅拌转速250rpm,通气2vvm。
[0033](4)树脂柱装1600g DM130树脂，用95 %乙醇洗3个柱体积，水洗至无醇味，上样吸附55g甘草酸单铵盐。
[0034](5)待发酵72h后，启动过滤分离器和发酵液输送泵(控制流速3ml/min)，分离菌体和滤液；将滤液流入树脂柱，流出液经过无菌过滤重新流回发酵罐，形成循环通路。发酵和分离循环持续进行20h，完成一次半连续操作。间隔20h再操作一次。
[0035](6)完成5次发酵和分离循环后，用80% (v/v)的乙醇洗脱单葡萄糖醛酸甘草次酸，收集，浓缩，干燥，一共得到含量90.5%的单葡萄糖醛酸甘草次酸120.lg，摩尔转化率达到86.2%。发酵产率达到36.4g/L。
[0036]实施例2
[0037](I)配制种子培养基:葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 lg/L, MgSO4 0.8g/L，溶剂为水，pH自然。斜面培养基在此配方中加入20g/L的琼脂。以上培养基均在115°C灭菌20min。先从冰箱保存的菌种斜面挑满环菌苔，接种于新鲜斜面培养基，于28°C培养240h后，得到活化的种子斜面。将活化的斜面挑2环接种装有40ml种子培养基的250ml三角瓶，于30°C、200rpm震荡培养72h，获得一级种子。用无菌吸管吸取5ml —级种子液接种到装有80ml种子液的500ml摇瓶，于30°C、250rpm震荡培养48h，获得二级种子液。
[0038](2)配制发酵培养基:甘草酸浓度27g/L，KH2PO4 lg/L,氯化铵30g/L，MgSO40.8g/L，溶剂为水；用酸碱控制pH5.5。在115°C灭菌20min。取80ml发酵种子液接种到装有3L转化培养基的5L发酵罐中
[0039](3)控制发酵罐温度28°C,搅拌转速250rpm,通气3vvm。
[0040](4)树脂柱装1200g NK-2树脂，用95 %乙醇洗3个柱体积，水洗至无醇味，上样吸附55g甘草酸单铵盐。
[0041](5)待发酵48h后，启动过滤分离器和发酵液输送泵(控制流速2.5ml/min)，分离菌体和滤液；将滤液流入树脂柱，流出液经过无菌过滤重新流回发酵罐，形成循环通路。连续发酵和分离耦合操作持续进行120h。
[0042](6)发酵结束，用85% (v/v)的乙醇洗脱单葡萄糖醛酸甘草次酸，收集，浓缩，干燥，一共得到含量93.2 %的单葡萄糖醛酸甘草次酸77.1g,摩尔转化率达到91.6%。发酵产率达到24.lg/L。
[0043]实施例3
[0044](I)配制种子培养基:葡萄糖10g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 lg/L, MgSO40.25g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然。斜面培养基在此配方中加入20g/L的琼脂。以上培养基均在1151:灭菌201^11。先从冰箱保存的菌种斜面挑满环菌苔，接种于新鲜斜面培养基，于28°C培养240h后，得到活化的种子斜面。将活化的斜面挑2环接种装有40ml种子培养基的250ml三角瓶，于28°C、200rpm震荡培养72h，获得一级种子。用无菌吸管吸取5ml —级种子液接种到装有80ml种子液的500ml摇瓶，于28°C、250rpm震荡培养48h，获得二级种子液。
[0045](2)配制发酵培养基:甘草酸浓度55g/L，葡萄糖20/L，KH2PO4 lg/L,尿素20g/L，MgSO40.8g/L，溶剂为水；用酸碱控制pH5.5。在115°C灭菌20min。取80ml发酵种子液接种到装有3.5L转化培养基的5L发酵罐中
[0046](3)控制发酵罐温度28°C,搅拌转速250rpm,通气3vvm。
[0047](4)树脂柱装3100g NK-2树脂，用95%乙醇洗3个柱体积，水洗至无醇味，上样吸附220g甘草酸单铵盐。
[0048](5)待发酵48h后，启动过滤分离器和发酵液输送泵(控制流速3.5ml/min)，分离菌体和滤液；将滤液流入树脂柱，流出液经过无菌过滤重新流回发酵罐，形成循环通路。连续发酵和分离耦合操作持续进行120h。
[0049](6)发酵结束，用85% (v/v)的乙醇洗脱单葡萄糖醛酸甘草次酸，收集，浓缩，干燥，一共得到含量88.2%单葡萄糖醛酸甘草次酸267.5g，底物的摩尔转化率达到86.2&。发酵产率达到6 7g/L。
【权利要求】
1.一种高产率制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)制备单葡萄糖醛酸甘草次酸发酵的种子培养液； (2)制备发酵培养基,在发酵罐中灭菌,冷却后,接入步骤(1)中的种子培养液； (3)控制发酵罐中的发酵参数，发酵至对数生长中后期； (4)将树脂柱预先吸附一定量的甘草酸底物； (5)将发酵液在一定的流速下经过过滤分离器过滤除菌，滤液流经步骤(4)中的树脂柱，再经过无菌过滤重新流回发酵罐，继续发酵，形成循环通路； (6)发酵结束后，将吸附了单葡萄糖醛酸甘草次酸的树脂柱经过洗脱，收集，浓缩，干燥，得单葡萄糖醛酸甘草次酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中发酵培养基的pH范围为5.0~7.0 ;所用的甘草酸盐为甘草酸钠盐、钾盐、铵盐中的一种或者几种，浓度为0.1g~80g/L ;接入种子培养液的接种量占发酵培养基体积的2~10%，优选5~8%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中的发酵参数为:温度25~370C ;发酵罐通气量每分钟0.1~1.5倍发酵液体积；搅拌转速为150~300rpm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中吸附材料为大孔吸附树脂，类别包括AB-8，NK-2, DM130中的一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中发酵液经过过滤分离器过滤的流速为每小时0.01~0.2`倍发酵液体积；循环通路可以采用间歇方式或者连续方式:采用间歇方式时，每隔8~20小时进行一次操作，每次持续8~24小时，循环3~10次；采用连续方式时，持续进行120~240h至发酵结束。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(6)中采用的树脂洗脱剂为一定浓度的乙醇、甲醇、丙酮的水溶液，优选为80%~95%浓度的乙醇。
【文档编号】C07H1/08GK103509843SQ201210218997
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】魏元刚, 杨永安, 易铭, 钟慧, 金显友, 袁继文, 黄全书, 季浩 申请人:江苏天晟药业有限公司