专利名称：一种幽门螺杆菌抗原hla限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用。
背景技术：
1982年，澳大利亚学者Warren和Marshall发现一种定植在人胃和十二指肠的微需氧、革兰氏阴性、螺旋弯曲菌一幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)。幽门螺杆菌是上消化道的主要致病菌，与胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和胃癌等疾病的发生密切相关。近几年的研究显示，幽门螺杆菌感染还与缺血性心脏病、动脉粥样硬化、缺铁性贫血等胃外疾病相关。1994年，世界卫生组织已将其列为人群第一类致癌因子。全球50%以上人群存在幽门螺杆菌感染，特别是某些发展中国家的感染率甚至高达80%。因此，有效的治疗幽门螺杆菌感染对人类的健康是非常重要的。目前，临床上主要是通过“三联”或“四联”疗法来对幽门螺杆菌感染的患者进行根除治疗，但因药物的副作用大，患者的依从性差，耐药菌株的逐渐增加，使其应用受到了较大的限制。且根除治疗并不能预防幽门螺杆菌的感染与根除后再感染。幽门螺杆菌疫苗能诱发机体的特异性免疫应答清除感染，又可激发机体的免疫记忆来预防再次感染，且副作用少。面对幽门螺杆菌高感染率和严重的致病性，国内外已广泛开展幽门螺杆菌疫苗研究。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于幽门螺杆菌感染的高发病率及其与慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等消化系统疾病的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种能有效地调动机体的免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染的细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对耐药细菌仍然有效，因此研究幽门螺杆菌疫苗具有重要的意义。动物实验研究表明，疫苗接种能显著的降低幽门螺杆菌的定植量，并减轻胃黏膜的炎症反应，并且能产生抗原特异性CD4+T细胞的应答以及IgG和sIgA抗体的产生，起到预防和治疗幽门螺杆菌感染的作用。现有疫苗主要有以下几种形式全菌灭活疫苗、重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与幽门螺杆菌感染的免疫应答相似。幽门螺杆菌感染使机体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至是终身感染，说明机体已经对幽门螺杆菌的存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除幽门螺杆菌就必须在抗原选择以及在表位水平对抗原进行改造，激发更有效和更高效的免疫应答。随着对抗原分子识别理论的发展和深入认识，抗原刺激机体所产生的特异性免疫应答的本质就是表位特异性应答的集合。然而，机体的免疫应答不是针对整个外源物质(抗原)，而仅仅只是抗原的一小段区域，即抗原表位。表位疫苗，就是使用抗原表位制备而成的疫苗。表位疫苗具有易于生产、特异性高、免疫原性强、安全性较好等特点。表位疫苗，是近年来疫苗设计的新思路，在感染性疾病，恶性肿瘤以及、自身免疫性疾病等疫苗设计的新方向，具较好的应用前景。表位的筛选和鉴定，是研制表位疫苗的第一步。研究显示，幽门螺杆菌的免疫保护机制趋向于依赖CD4+T细胞，而并非CD8+T细胞的免疫反应。因此，在幽门螺杆菌表位疫苗的设计中加入CD4+T细胞表位(及辅助T细胞表位)尤为重要。此外，使用全长蛋白作为疫苗研究的抗原，存在抗原表位组成成分复杂、特异性不高、免疫应答不强等局限性。只有免疫显性表位才能激发机体较强的免疫应答,亚显性表位引起的免疫应答远远弱于显性表位，因此，免疫显性CD4+T细胞表位才是幽门螺杆菌表位疫苗所需要的。目前，已报道的幽门螺杆菌抗原⑶4+T细胞表位均为小鼠H-2限制性Th表位，由于小鼠和人MHC分子之间存在着明显的差别，H-2限制性表位可能不适用于人类疫苗设计，因此需要筛选鉴定HLA限制性表位。此外，现有报道的幽门螺杆菌表位多采用生物信息学软件预测而来，准确率不高，虽能通过实验加以验证，但是仍不能避免表位漏筛现象。此外，软件预测方法筛选表位难以解决表位的免疫显性问题，而免疫显性表位才是幽门螺杆菌表位疫苗最佳的候选表位。本发明利用抗原特异性T细胞及步移重叠合成肽，筛选鉴定得到了两个幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性辅助T细胞(Th细胞)表位SEQ ID NO:63和74。
发明内容
本发明的目的是提供一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:63、74、95和、105所示。所述表位肽具有HLA-DR亚型限制性，所述SEQID NO: 63和95所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DRBI* 1404，SEQ ID NO: 74和105所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DRB1*0803。本发明进一步提供了所述表位肽的制备方法，包含以下步骤I)从蛋白数据库中获取幽门螺杆菌来源的UreB蛋白质序列；2)从步骤I)获取的UreB蛋白质序列的第I号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，以步移重叠的18个氨基酸为一个多肽段，形成第一多肽库，和/或在获得的第一多肽中每次步移2个氨基酸，以步移重叠的至少13个氨基酸为一个多肽段，形成第二多肽库；和/或通过分别在核心序列FFGVKPWI和匪IIKGGFI的基础上进行逐个氨基酸的增加而合成多肽，形成第三多肽库；3)利用抗原特异性⑶4+T细胞从步骤2)所述的第一多肽库和/或第二多肽库和/或第三多肽库中筛选免疫显性表位肽；4)利用HLA- II类分子抗体阻断实验初步确定步骤3)筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性；5)利用不同HLA- II类分子亚型的B淋巴母细胞系对表位的递呈实验确定步骤3)筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性的具体亚型；6)通过抗原递呈实验验证所筛选的免疫显性表位肽。本发明还提供了所述表位肽用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。由于本发明所提供的免疫显性表位肽具有高免疫原性，可引发强烈的免疫反应。另外所述免疫显性表位肽不含有不必要甚至有害的部分，从而降低由其所制备的疫苗的使用风险。本免疫显性表位肽可以与其他疫苗成分进行优势组合，从而扩大免疫应答的宽度。由本免疫显性多肽制备的疫苗对幽门螺杆菌感染不仅有预防作用，还可以作为治疗性疫苗使用。、
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图IA表示(样本编号为4529)经ICS方法检测到的幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞中抗原特异性⑶4+T细胞频率，可见DMSO对照组和肽库刺激组之间有显著差别；图IB表示(样本编号4493)经ICS方法检测到的幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞中抗原特异性⑶4+T细胞频率，可见DMSO对照组和肽库刺激组之间有显著差别；图2A表示(样本编号为4529)利用抗原特异性⑶4+T细胞和步移重叠合成肽对18氨基酸(18-mer)免疫显性表位进行筛选，其中第63条肽段(P63，U373-390)为免疫显性肽段，第68 (P68, U403-420)和第93 (P93, U553-569)条肽段免疫亚显性肽段；图2B表示(样本编号4493)利用抗原特异性⑶4+T细胞和步移重叠合成肽对18氨基酸(18-mer)免疫显性表位进行筛选，其中第74条肽段(P74，U439-456)为免疫显性肽段，第44 (P44, U259-276)和第81 (P81, U481-498)条肽段免疫亚显性肽段；图3A表示(样本编号为4529)利用抗原特异性⑶4+T细胞和步移重叠合成肽对13-mer免疫显性表位进行筛选，其中63-2 (U373-385)为免疫显性肽段；图3B1表示(样本编号4493)利用抗原特异性⑶4+T细胞和步移重叠合成肽对13-mer免疫显性表位进行筛选,结果发现合成的13_mer肽太短；图3B2表示(样本编号4493)利用DD30抗原特异性⑶4+T细胞和合成相关氨基酸短肽对其免疫显性表位进行筛选，其中74-3 (U438-452)为免疫显性肽段；图4A表示(样本编号为4529)利用HLA- II类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性肽 P63-2(U373-385)是 HLA-DR 限制性的；图4B表示(样本编号为4493)利用HLA- II类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性肽 P74-3 (U438-452)是 HLA-DR 限制性的；图5A1表示(样本编号为4529)利用B淋巴细胞系(BLCL)递呈实验确定免疫显性肽 P63-2 (U373-385)的 HLA 限制性是 HLA_DRB1*1404 ；图5A2表示(样本编号为4529) HLA-DRBI* 1454与HLA_DRB1*1404的基因序列比对图；图5B表示(样本编号为4493)利用B淋巴细胞系递呈实验确定免疫显性肽P74-3(U438-452)的 HLA 限制性是 HLA_DRB1*0803 ；图6表示(样本编号为4529)利用自然递呈实验确定所筛选到的18_mer短肽P63，能够被自然递呈，为真正的免疫显性表位。
具体实施例方式为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。材料与方法、
(一)蛋白和肽段重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)蛋白为本单位重组构建(吴超幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用中华检验医学杂志2001年5期)；多肽肽段通过化学方法合成(由上海吉尔生化公司合成)，用二甲亚砜(DMSO)溶解至IOmM的浓度，在_70°C保存，临用时用RPMI-1640完全培养基稀释到ImM的浓度。(二)主要溶液及试剂配制I. RPMI-1640不完全培养基分别称取10. 4g RPMI-1640粉末，2. 4g Ifepes和2g NaHCO3，加入去离子水至IOOmL,搅匀过滤除菌，分装冻存。
2. RPMI-1640 完全培养基分别量取950mL RPMI-1640不完全培养基和50mL人AB血清，加入20万单位/mL的青霉素和链霉素双抗各0. 5mL (终浓度为100U/mL)。3.冻存液将胎牛血清与DMSO按照9 I的比例混合，然后分装冻存。(三)所使用的主要试剂及其来源
权利要求
1.一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:63、74,95和105所示。
2.如权利要求I所述的幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽，其特征在于，所述表位肽具有HLA-DR亚型限制性。
3.如权利要求2所述的幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽，其特征在于，所述SEQ ID NO:63 和 95 所示的表位肽的 HLA-DR 亚型为 HLA-DRB1*1404，SEQ ID NO: 74 105所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DR B1*0803。
4.权利要求1-3任一项所述的幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽在制备用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制剂为疫苗。
6.一种制备权利要求I所述的幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法，其特征在于，包含步骤 1)从蛋白数据库中获取幽门螺杆菌来源的UreB蛋白质序列； 2)从步骤I)获取的UreB蛋白质序列的第I号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，以步移重叠的18个氨基酸为一个多肽段，形成第一多肽库，和/或在获得的第一多肽中每次步移2个氨基酸，以步移重叠的至少13个氨基酸为一个多肽段，形成第二多肽库；和/或通过分别在核心序列FFGVKPWI和WIIKGGFI的基础上进行逐个氨基酸的增加而合成多肽，形成第三多肽库； 3)利用抗原特异性CD4+T细胞从步骤2)所述的第一多肽库和/或第二多肽库和/或第三多肽库中筛选免疫显性表位肽； 4)利用HLA-II类分子抗体阻断实验初步确定步骤3)筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性； 5)利用不同HLA-II类分子亚型的B淋巴母细胞系对表位的递呈实验确定步骤3)筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性的具体亚型； 6)通过抗原递呈实验验证所筛选的免疫显性表位肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的第一多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-93所示；第二多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:94_103所示；第三多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 104-115所示。
全文摘要
本发明涉及一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用，所述显性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:63、74、95和105所示。本发明还提供了所述表位肽的制备方法，并进一步提供了所述表位肽用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。
文档编号C07K7/08GK102746381SQ20121026156
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者吴超, 李海波, 李滨, 杨武晨, 毛旭虎, 章金勇, 童文德, 赵 卓, 邹全明, 郭刚, 郭红, 陈立, 鲁东水 申请人:中国人民解放军第三军医大学