专利名称：心脏型脂肪酸结合蛋白b细胞表位肽及其抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检测领域，特别涉及心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，还涉及由该表位肽的制备的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
心血管疾病是严重威胁人类生命和健康的重要疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。全球每年有1750万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3，预计到2020年这个数字将突破2500万，届时心血管疾病将成为人类死亡和致残的首要原因。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是心血管疾病的主要类型,发病突然，急性期死亡率约为30%。在我国，急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势，正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。因此，AMI的早期诊断和治疗监测非常重要。寻找AMI的高特异性、高灵敏度的早期诊断标志物是临床亟待解决的热点问题。对AMI早期正确诊断，以便进行及时有效的治疗，是改善预后、降低AMI急性期病死率提高患者生存率的关键。临床上虽然可以通过患者的临床表现、心电图对典型AMI病例进行有效诊断及预后判断，但是对一些非典型病例仍然需要通过心肌损伤标志物的检测进行早期诊断。目前，用于诊断AMI的指标主要有肌酸激酶同工酶MB (creatine kinase isoenzymeMB, CK-MB)、心肌肌I丐蛋白 T ( cardiac troponin T, cTnT)、心肌肌I丐蛋白 I ( cardiactroponin I, cTn I)和肌红蛋白(Myoglobin,Mb)等,但它们对于早期诊断AMI均不够理想，主要原因是CK-MB、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T缺乏足够的敏感性(胸痛后41小时后浓度才上升)。而肌红蛋白早期敏感性虽高(胸痛后2 3小时浓度上升)，但特异性较差，不能区分骨骼肌损伤和心肌损伤，也不是一个理想的早期诊断指标。心脏型脂肪酸结合蛋白(hearttype fatty acid-binding protein, H-FABP)是存在于心肌细胞胞质内的小分子可溶性蛋白质，分子质量约为15KD，其作用是与细胞内长链脂肪酸结合，促进细胞内长链脂肪酸转运，将其转运至线粒体，进入线粒体后参加P氧化，并最终生成ATP，后者是心肌收缩的主要能量来源。经研究发现H-FABP对于AMI的早期诊断更具有特异性和敏感性，有望成为理想的早期诊断AMI的生化指标。新近发现，H-FABP可弥补CK -MB、cTnl和Mb检测的不足，对于AMI的早期诊断更具有特异性和敏感性，有望成为理想的AMI的早期诊断生化指标。主要是由于H-FABP具备以下特点①心肌特异性高大量地存在于心肌组织中，在心肌中比骨骼肌高10倍，在肾脏、肝脏、小肠中水平很低；②敏感性高由于H-FABP的相对分子质量小，当心肌细胞缺血时，H-FABP可快速从心肌细胞释放，并迅速进入到血液中，在心肌损伤发生20分钟内可被检测到，3 4小时内可检测到其峰值，20-24小时后回到正常值。而且，H-FABP在AMI发生3小时内的敏感度显著高于肌红蛋白(72. 3 % Vs 57. 4 %)。上述特点表明，H-FABP对早期诊断和排除AM I是一个有用的生化标志物，是早期检测心肌损伤的理想指标。目前，对于H-FABP的B细胞表位肽未见相关报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，与载体蛋白交联后能够刺激免疫体统产生免疫反应，制备成杂交瘤细胞株后能产生单克隆抗体。为实现上述发明目的，技术方案为
心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本发明的目的之二在于提供心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，技术方案为
含有权利要求I所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物为N端引入半胱氨酸的心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽与载体蛋白的交联体。优选的，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。本发明的目的之三在于提供由心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物制备的杂交瘤细胞株，技术方案为
所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物制备的杂交瘤细胞株。优选的，所述杂交瘤细胞株的生物保藏号为CCTCC N0:C201269。本发明的目的之四在于提供杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，技术方案为
所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。本发明的目的之五在于提供单克隆抗体的应用，技术方案为
所述的单克隆抗体在制备检测心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试剂中的应用。本发明的有益效果在于心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，该表位肽的抗原性好，能够刺激免疫系统产生免疫反应，免疫后血清效价达到1:3200，因此该表位肽可用于制备杂交瘤细胞株并分泌相应的单克隆抗体，单克隆抗体的纯度大于96%，纯化后的抗体用间接ELISA法检测效价达I :256000用间接ELISA法检测效价达I :256000，且特异性好，可大批量制备，通过本发明制备的单克隆抗体和多克隆抗体可用于病人血液心脏型脂肪结合蛋白的检测，能够用于急性心肌梗死的早期诊断，为临床治疗急性心肌梗死提供指导。培养物保藏
本发明中杂交瘤细胞株3-Fabp送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO: C201269，地址位于中国武汉武汉大学，保存日期为2012年6月6日，保藏的培养物名称为杂交瘤细胞株3-Fabp。
图I为纯化后的H-FABP重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图。图2为H-FABP单克隆抗体的纯化色谱图。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非、限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。实施例I、H-FABP重组蛋白的制备
通过逆转录PCR扩增H-FABP基因编码区核苷酸序列，克隆入原核表达载体pET28a，经测序鉴定后诱导蛋白表达，经性质鉴定后，纯化制备的H-FABP重组蛋白，该重组蛋白可用于制备多克隆抗体的免疫原及筛选原，同时可以作为后续建立H-FABP检测时的校准品，具体的 根据报道的可参考心脏型脂肪酸结合蛋白(heart type fatty acid-bindingprotein, H-FABP)的基因序列(Genbank :NM_004102)，其编码区的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。翻译为氨基酸后相应的多肽序列如SEQ ID NO. 2所示，编码133个氨基酸，具体为
MVDAFLGTffK LVDSKNFDDY MKSLGVGFAT RQVASMTKPT TIIEKNGDIL TLKTHSTFKNTEISFKLGVE FDETTADDRK VKSIVTLDGG KLVHLQKffDG QETTLVRELI DGKLILTLTHGTAVCTRTYE KEA上述氨基酸的中英文对照如下
谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G;丝氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;苏氨酸thr T ;缬氨酸val V ;异亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸tyr Y ;苯丙氨酸phe F ;组氨酸his H ;脯氨酸pro P ;天冬酰胺asn N ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸trp W ;赖氨酸IysK ;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R ;天冬氨酸Asp D
用Trizol Reagent法提取心脏总RNA，然后用ToYoBo FSK-100试剂盒逆转录制备心脏cDNA。H-FABP基因的核苷酸序列设计扩增编码区的上、下游引物，上游引物为 5’ -catgccatggtggacgctttcctgg-3J (SEQ ID NO. 3),下划线处为 NcoI酶切位点，下游引物为 5’ -ccgctcgagttatcatgcctctttctcataagtgc-3’ (SEQ ID NO. 4),下划线处为Xho I酶切位点，引物序列由Invitrogen公司合成。以制备的cDNA为模板,SEQID NO: 3和SEQ ID NO. 4的序列为引物，扩增H-FABP基因编码区序列，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(普通离心柱型)回收PCR产物。测序结果与报道的H-FABP基因编码区序列一致。对H-FABP基因的糖基化位点进行预测分析，发现该蛋白序列上无糖基化位点。因此，结合原核体系大肠杆菌特点，选择大肠杆菌表达体系，使用菌株Escherich coli BL21,具有成本低、遗传背景清楚、周期短等优点。选用的基因表达载体PET28a具有基因表达载体应有的优点，且携带Kan+基因，易于筛选。利用Nco I和Xho I双酶切pET28a载体后与经同样酶切的H-FABP基因连接，得pET28a-H-FABP载体，连接反应为4°C过夜，然后将pET28a_H_FABP载体转化DH5 a感受态细胞，并将其涂于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37°C培养过夜。次日挑取单个白色菌落扩大化培养，将扩大培养的菌体用于提取质粒，取10 UL质粒用Nco I和Xho I双酶切后用质量分数为I %琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示pET28a-H-FABP重组质粒经过双酶切切下了约400bp大小的片段，证实pET28a-H-FABP重组载体构建成功。将pET28a-H_FABP重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，过夜培养后挑取单个菌落37°C扩大化培养。取100 ii L菌液接种于5mL含50 y g/L卡那霉素LB培养液，37°C摇菌至0D600达到0. 6 0. 8时，加入IPTG(至终浓度lmmol/L)诱导表达6小时。分析表达情况培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH7. 3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4°C IOOOOrpm离心15分钟，上清以0. 45 y m微孔滤膜过滤。分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性。将诱导表达的菌液超声破菌后收集沉淀，沉淀用20mmol/L Tris HCl (pH8. 0)充分重悬，悬液缓慢滴加入约IOOmL包涵体溶解液中，磁力搅拌溶解数小时(视溶解情况而定)，6000rpm离心20分钟，取上清，0. 45 u m滤膜过滤。将溶解的包涵体与复性液按I :1比例混合后，于4°C放置2h后，装入透析袋，用0.02mol/L Tris HCI溶液pH8. 0，4°C透析过夜，期间需更换液3 4次。采用高效的QSepharose F. F.阴离子层析柱等方法纯化重组蛋白，采用BCA法(按碧云天BCA蛋白测定试剂盒说明书操作)测定H-FABP重组蛋白浓度。采用HPLC测定纯化后H-FABP重组蛋白的纯度。结果诱导表达后的菌液进行SDS-PAGE电泳，结果如图I所示，发现预期分子量(14 15kD)附近出现了诱导表达的目的条带。经过IPTG诱导筛选出的高表达菌株进行扩大化培养及大量诱导表达，经鉴定表达物破菌后几乎都存在沉淀中，为包涵体表达。凝胶自动扫描分析显示，目的蛋白的表达量超过了菌体蛋白的30%。将包涵体溶解并复性处理，复性后的蛋白溶液用0.45iim滤膜过滤，然后使用Q Sepharose F. F.阴离子层析柱(Amersham XK 16/20)纯化重组H-FABP多肽。纯化后的重组蛋白SDS-PAGE电泳分析可见在约15kD处出现清晰可见的粗大条带。纯化后用BCA法测得H-FABP重组蛋白浓度为0. 48mg/mL，检测其纯度为95%。Lowry法测定H-FABP重组蛋白含量(Lowry法测定的试剂盒购于上海美季生物技术有限公司)
试剂A 1) 10克Na2CO3, 2克NaOH和0. 25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6 4H20)。溶解于500毫升蒸馏水中；2) 0. 5克硫酸铜(CuSO4 *5H20)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份(A)与I份(B)混合，即为试剂甲。试剂B :在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4 2H20)，25克钥酸钠(Na2MoO4 *2H20)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li2SO4), 50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至I升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水I倍，使最终的酸浓度为IN左右。标准蛋白质溶液精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。详见表I :
表I、Lowry法测定H-FABP重组蛋白含量权利要求
1.心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，其特征在于所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2.含有权利要求I所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，其特征在于所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物为N端引入半胱氨酸的心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽与载体蛋白的交联体。
3.根据权利要求2所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，其特征在于所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。
4.权利要求2所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物制备的杂交瘤细胞株。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的生物保藏号为 CCTCC NO C201269o
6.权利要求5所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
7.权利要求6所述的单克隆抗体在制备检测心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明属于医学中的免疫学领域，特别涉及心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽及其单克隆抗体的应用，所述表位肽段如SEQIDNO.5所示，其可用于制备杂交瘤细胞株并分泌相应的单克隆抗体；该单克隆抗体可用于制备检测心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试剂；本单克隆抗体纯度高大于96%，纯化的抗体用间接ELISA法检测效价达1256000，且特异性好、可大批量制备等优点；通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人血液心脏型脂肪酸结合蛋白的检测，为急性心肌梗死的早期诊断奠定了基础。
文档编号C07K19/00GK102746382SQ201210263140
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者姚静, 张宪, 石延宾, 胡伟, 魏勇, 黄洪涛 申请人:重庆业为基生物科技有限公司