专利名称：一种龙虾头中虾青素的提取方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种龙虾头中虾青素的提取方法。
背景技术：
虫下青素(astaxanthin)，学名为3，3，_二羟基-β，β ’ _胡萝卜素_4，4’ - 二酮，属于叶黄族类的酮式类胡萝卜素，广泛存在于生物界中，特别是水产动物的虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中。虾青素除具有一般类胡萝卜素的化学性质外，还具有优良的抗氧化性，其脂溶性自由基猝灭功能的活力是β-胡萝卜素的10倍、维生素E的100倍，在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景。虾青素具有两个手性碳原子，存在三种立体异构体(3R，3’ R)、(3R，3’ S)和(3S，3’ S)，几何构型大部分是反式异构体，也是热力学上最稳定的构型；虾青素在生物体中常与蛋白质结合而呈蓝紫色，蛋白质变性后才呈现橙红色，而氧化后为虾红素(astacene);虾青素为长链不饱和双键结构体系，因此性质不稳定，易于异构化和降解，有机溶剂能使天然虾青素降解褪色，也能使天然虾青素异构化降解，而且在碱性条件下，易发生不可逆变性。专利200510050390. 4公开了一种用虾壳生产甲壳素、虾青素、蛋白质、钙粉和生物肥料的方法，其工艺步骤为将虾壳粉进行酶解，加入有机溶剂萃取，液体分液为水解液和有机液，其中有机液部分浓缩提取得虾青素粗品，再经过超滤得到虾青素，本方法使用有机溶剂提取浓缩，过程中虾青素降解褪色、异构降解，最终产品浓度仅为O. 5^1. 0%，且使用超滤生产成本较高；专利2122565. 6公开了一种用鲜虾壳生产甲壳素、虾青素和蛋白质的方 法，具体方法为先将虾壳加水粉碎，然后用有机溶剂萃取，有机萃取液备用，再将不溶物(虾壳粉残渣)用蛋白酶水解、有机酸脱钙软化、有机液提取，将有机提取液和萃取液混合回收溶剂，即得虾青素，该方法提取率也低于I. 0% ;专利200810236028. X公开了一种利用克氏原螯虾壳提取虾青素的方法，该方法为将虾壳粉碎、盐酸脱钙软化、氯仿提取、浓缩回收，由于采用有机溶剂直接提取，奸青素的提取率仅为130mg/kg-300mg/kg。因此，需要一种新的虾青素的提取方法以解决上述问题。
发明内容
发明目的本发明的目的针对现有技术中虾青素的提取方法生产成本较高以及提取率低的缺陷，提供一种龙虾头中虾青素的提取方法以解决上述问题。技术方案为实现上述发明目的，本发明的龙虾头中虾青素的提取方法可采用如下技术方案一种龙虾头中虾青素的提取方法，包括以下步骤a、分离虾黄将龙虾头中的虾黄挤出，捣烂备用；b、酶解用生物酶对步骤a中得到的虾黄进行酶解，收集析出的油层；C、萃取将步骤b得到的油层用有机溶剂萃取，将萃取液低温离心浓缩；d、冷冻除杂将步骤c中低温离心浓缩后得到的样品冰冻，趁冷抽滤；
e、皂化保护纯化将步骤d得到的样品用碱的醇溶液进行皂化；f、柱层析纯化将步骤e得到的样品低温离心浓缩，用聚酰胺进行纯化，得到虾青素。有益效果与背景技术相比，本发明的龙虾头中虾青素的提取方法生产成本较低并可以达到较闻的提纯率。优选的，步骤b中所述生物酶为木瓜蛋白酶、风味酶或复合酶。其中木瓜蛋白酶酶解效果最闻。优选的，步骤b中所述酶解的条件为固液比(g/ml)为1:广1:3，酶解温度为47 49°C，酶解pH值5. 5 6. 0，水解时间6(T80min，酶与底物比为230(T2800U/g。提纯率相对较高。制得虾青素的含量均高于10%，介于12. 1(Γ15. 84% ;当选用酶解条件为固液比(g/ml)为:1:2，酶解温度为48°C，酶解pH值5. 7，水解时间70min，酶与底物比为2500U / g， 所制得的ife下青素含量最闻，为15. 84%ο优选的，步骤c中所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯或正己烷。其中，二氯甲烷萃取效率最高。优选的，步骤d中将低温离心浓缩后的样品放入-8(T-20°C条件下，趁冷抽滤。冷冻除杂效果最佳。考虑到耗能和设备要求，以-20°C作为冷冻条件更合理。优选的，步骤e中所述碱的醇溶液为KOH乙醇溶液，所述KOH乙醇溶液的浓度为10-50g/L，皂化反应温度为10-25°C，反应时间为10-40min。当碱浓度低于40g/L时，皂化反应不充分；而碱质量浓度高于40g/L时，虾青素的量反而下降，这是由于皂化后生成的游离虾青素在强碱浓度下不稳定而发生了降解的缘故。因此在实施该方法时，选择40g/L的KOH乙醇溶液为最佳。优选的，步骤f中所述聚酰胺经过预处理，所述预处理步骤为I)、称取聚酰胺粉，加入无水乙醇，固液比(g/ml)为1:3 1:5，搅拌均匀，在50 600C的温度下保温3飞h，过滤，取滤渣，将所述滤渣按照上述步骤重复处理一次；2)、将经二次乙醇处理的聚酰胺粉加正己烷，固液比(g/ml)为1:3 1:5，搅拌均匀，在50 60°C的温度下保温l 3h，过滤，取滤渣，得到经过预处理的聚酰胺粉。经过预处理的聚酰胺粉，按此条件实施该发明，制得虾青素的含量均高于10%，介于11. 2(Γ15. 32%。优选的，步骤f中，所述柱层析纯化的步骤如下I)、称取一定量经过预处理的聚酰胺粉于烧杯中，加入正己烷，得到聚酰胺-正己烷溶液，所述聚酰胺-正己烷溶液的固液比(g/ml)为I: I，超声波脱气；2)、在空柱管中加入正己烷，再加入步骤I得到的聚酰胺-正己烷溶液，加入完毕，用洗耳球将所述聚酰胺-正己烷溶液压紧；3)、取皂化后得到的样品，然后用同体积的正己烷配成溶液，将溶液加入到步骤2的空柱管中，然后依次加入正己烷、正己烷-二氯甲烷溶液、二氯甲烷进行梯度洗脱，其中正己烷-二氯甲烷溶液中正己烷与二氯甲烷的体积比为6:1，每种溶剂洗脱2飞个柱体积，洗脱液用紫外分光光度计在474nm波长下检测，选择有吸收的部分，即得虾青素。经过柱层析的虾青素暗紫色，深棕色，虾青素的含量达到15. 32。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例I酶解对虾青素提取的影响。根据分离虾黄一酶解一萃取一冷冻除杂一皂化纯化一柱层析纯化的步骤制备虾青素产品。a、分离虾黄步骤为将龙虾头中的虾黄挤出，捣烂备用；b、酶解步骤为选用生物酶对虾黄进行酶解，酶解条件为固液比(g/ml)为1:2，酶解温度为48°C，酶解pH值5. 7，水解时间70min，酶与底物比为2500U / g ；C、萃取步骤为将酶解液上层油层取出，选用二氯甲烷萃取，油层与二氯甲烷体积比为1: 3，分液漏斗振荡萃取25min，重复3次，将萃取液合并后低温离心浓缩； d、冷冻除杂步骤为将低温离心浓缩后的样品放入_20°C条件下保存12h，趁冷抽滤，将抽滤后的溶液继续冷冻保存12h再趁冷抽滤，如是共重复操作三次；e、皂化纯化步骤为选用浓度为40g/L的KOH乙醇溶液，皂化反应温度为20°C，反应时间为20min ；f、柱层析步骤为对聚酰胺填料的预处理如下(I)称取聚酰胺粉放置于适合大小的三口烧瓶瓶中，加入无水乙醇，固液比(g/ml)为1: 4，磁力搅拌，于60°C保温3h，过滤，取滤渣，重复处理一次；(2)经二次乙醇处理的聚酰胺粉加正己烷，固液比(g/ml)为1:4，磁力搅拌，于60°C保温lh，过滤，聚酰胺粉装入广口瓶中，备用；柱层析步骤如下(I)称取一定量经过聚酰胺粉于烧杯中，加入正己烷，固液比(g/ml) 1:1，超声波脱气；(2)在空柱中加入IOml正己烷，再加入经脱气的聚酰胺-正己烷，用洗耳球将聚酰胺压紧；(3)取皂化后的样品(经过离心浓缩，已成为粘稠液体)，然后用同体积正己烷配成溶液，以一定的流速进样，然后依次加入正己烷、正己烷二氯甲烷=6:1、二氯甲烷梯度洗脱，每种溶剂洗脱3个柱体积，洗脱液用紫外分光光度计在474nm波长下检测，选择有吸收的部分，即得虾青素产品。其中第二步酶解步骤，分别选用木瓜蛋白酶、风味酶、复合酶对虾黄进行酶解，制得虾青素含量如下表I所示。表I不同蛋白酶对提取的影响
" 木瓜蛋白酶风味酶复合酶~
含量 15.84%6. 34% 9.23%根据表I可知，木瓜蛋白酶的酶解效果最佳，所以实施该发明时，选用木瓜蛋白酶更合适。
进一步实验得到的酶解条件为固液比(g/ml)为I: I 1:3，酶解温度为47 49°C，酶解pH值5. 5 6. 0，水解时间6(T80min，酶与底物比为230(T2800U / g，按此条件实施该发明，制得虾青素的含量均高于10%，介于12. 1(Γ15. 84% ;当选用酶解条件为固液比(g/ml)为:1:2，酶解温度为48°C，酶解pH值5. 7，水解时间70min，酶与底物比为2500U / g，所制得的虾青素含量最高，为15. 84%。实施例2萃取对虾青素产品含量的影响。根据分离虾黄一酶解一萃取一冷冻除杂一皂化纯化一柱层析纯化的步骤制备虾青素产品，具体实验步骤及参数同实施例I。其中，第二步酶解步骤中选用的生物酶为木瓜蛋白酶。第三步萃取步骤中，取出酶解后的酶解液上层析出的油层，用不同溶剂进行萃取，所选溶剂及产品结果见下表2。表2不同溶剂对虾青素萃取的影响
权利要求
1.一种龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤 a、分离虾黄将龙虾头中的虾黄挤出，捣烂备用； b、酶解用生物酶对步骤a中得到的虾黄进行酶解，收集析出的油层； C、萃取将步骤b得到的油层用有机溶剂萃取，将萃取液低温离心浓缩； d、冷冻除杂将步骤c中低温离心浓缩后得到的样品冰冻，趁冷抽滤； e、皂化保护纯化将步骤d得到的样品用碱的醇溶液进行皂化； f、柱层析纯化将步骤e得到的样品低温离心浓缩，用聚酰胺进行纯化，得到虾青素。
2.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤b中所述生物酶为木瓜蛋白酶、风味酶或复合酶。
3.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤b中所述酶解的条件为固液比(g/ml)为I: I 1: 3，酶解温度为47^490C，酶解pH值5. 5 6. O,水解时间60 80 min，酶与底物比为2300 2800 U/g。
4.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤c中所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯或正己烷。
5.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤c中所述萃取的有机溶剂为二氯甲烷，其中，油层与二氯甲烷体积比为I:广1:3，利用分液漏斗振荡萃取15 25min，重复萃取2 3次，将得到萃取液合并后低温离心浓缩。
6.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤d中将低温离心浓缩后的样品放入-8(T-20°C条件下，趁冷抽滤。
7.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤e中所述碱的醇溶液为KOH乙醇溶液，所述KOH乙醇溶液的浓度为10-50g/L，皂化反应温度为10_25°C，反应时间为10-40min。
8.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤f中所述聚酰胺经过预处理，所述预处理步骤为 1)、称取聚酰胺粉，加入无水乙醇，固液比(g/ml)为1:3 1:5，搅拌均匀，在50 60°C的温度下保温3 5 h，过滤，取滤渣，将所述滤渣按照上述步骤重复处理一次； 2)、将经二次乙醇处理的聚酰胺粉加正己烷，固液比(g/ml)为1:3 1:5，搅拌均匀，在50 60°C的温度下保温f 3 h，过滤，取滤渣，得到经过预处理的聚酰胺粉。
9.如权利要求I所述的龙虾头中虾青素的提取方法，其特征在于，步骤f中，所述柱层析纯化的步骤如下 1)、称取一定量经过预处理的聚酰胺粉于烧杯中，加入正己烷，得到聚酰胺-正己烷溶液，所述聚酰胺-正己烷溶液的固液比(g/ml)为1:1，超声波脱气； 2)、在空柱管中加入正己烷，再加入步骤I得到的聚酰胺-正己烷溶液，加入完毕，用洗耳球将所述聚酰胺-正己烷溶液压紧； 3)、取皂化后得到的样品，然后用同体积的正己烷配成溶液，将溶液加入到步骤2的空柱管中，然后依次加入正己烷、正己烷-二氯甲烷溶液、二氯甲烷进行梯度洗脱，其中正己烷-二氯甲烷溶液中正己烷与二氯甲烷的体积比为6:1，每种溶剂洗脱2飞个柱体积，洗脱液用紫外分光光度计在474nm波长下检测，选择有吸收的部分，即得虾青素。
全文摘要
本发明公开了一种龙虾头中虾青素的提取方法，包括以下步骤a、分离虾黄将龙虾头中的虾黄挤出，捣烂备用；b、酶解用生物酶对步骤a中得到的虾黄进行酶解，收集析出的油层；c、萃取将步骤b得到的油层用有机溶剂萃取，将萃取液低温离心浓缩；d、冷冻除杂将步骤c中低温离心浓缩后得到的样品冰冻，趁冷抽滤；e、皂化保护纯化将步骤d得到的样品用碱的醇溶液进行皂化；f、柱层析纯化将步骤e得到的样品低温离心浓缩，用聚酰胺进行纯化，得到虾青素。本发明的龙虾头中虾青素的提取方法生产成本较低并可以达到较高的提纯率。
文档编号C07C403/24GK102746206SQ201210269269
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者史劲松, 张超, 戚善龙, 施存葆, 李恒, 许正宏, 钱建瑛 申请人:扬州日兴生物科技股份有限公司, 江南大学