评估肾结构改变和结果的制作方法
【专利摘要】本发明提供了涉及评价肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失)以及涉及评价结果的方法和材料。例如，提供了使用尿液CNP(如尿液与血浆CNP比率)水平以确定哺乳动物是否正在发生肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失)的方法和材料，以及使用尿液CNP水平以鉴定发生不良结果可能性升高的患者的方法和材料。
【专利说明】评估肾结构改变和结果
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2011年12月23日提交的美国临时申请系列号61/580, 139的优先权。 在先申请的公开内容被认为是本申请公开的部分（且通过引用纳入本文）。
[0003] 有关联邦资助的研究的声明
[0004] 本发明是在国立卫生研究院（National Institutes of Health)授予的基金号 R01-HL36634和P01-HL7661下由政府资助完成。政府对本发明拥有某些权利。
[0005] 背景 [0006] 1.【技术领域】
[0007] 本发明涉及评价肾结构改变（如肾纤维化）的方法和材料以及评价后果的方法和 材料。例如，本发明涉及使用尿液C型利尿钠肽（CNP)的水平（如尿液与血浆CNP的比率） 或血浆CNP的水平以确定哺乳动物是否正发生肾结构改变（如肾纤维化、肾小球基底增厚、 足细胞肿胀和足突消失）的方法和材料。本发明还涉及使用尿液或血浆CNP(可包括六种 分子CNP形式）水平鉴定心力衰竭患者的方法和材料，所述患者发生不良结果的几率增加 且可能罹患已知与肾脏相关的疾病，所述疾病包括但不限于心力衰竭、高血压、糖尿病、代 谢综合征和慢性肾疾病。
[0008] 2.背景信息
[0009] C型利尿钠肽（CNP)是利尿钠肽家族中的一部分，在肾脏及内皮中生成并可在血 浆和尿液中检测到。首先合成前体103个氨基酸（AA)的蛋白质proCNP(AAl-103)，然后被 细胞内内切蛋白酶弗林蛋白酶切割成CNP-53(AA51-103)和NT-proCNP(AAl-50)。由一未知 酶催化的进一步下游加工对将CNP-53切割成主要的生物活性形式CNP-22 (AA82-103)及其 氨基端 NT-CNP-53 (51-81)。
[0010] 通过激活利尿钠肽受体B (NPR-B，也被称作鸟苷酸环化酶受体B (GC-B))并生成第 二信使3'，5' -环鸟苷一磷酸（cGMP)，CNP拥有强大的抗纤维化和抗增殖特性。CNP含有 有限的排钠利尿和利尿活性。
[0011] 概述
[0012] 本发明提供了涉及评价肾结构改变（如肾纤维化、肾小球基底增厚、足细胞肿胀 和足突消失）的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液CNP (如尿液与血浆CNP的比率） 和/或血浆CNP的水平以确定哺乳动物是否正在或将要发生肾结构改变（如肾纤维化、肾 小球基底增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失）的方法和材料。通过评价尿液或血 浆CNP水平（如尿液与血浆CNP的比率）确定人类患者是否正在或将要发生肾结构改变能 够有助于在症状和疾病出现前鉴定临床前肾结构改变的人，从而启动设计用于防止慢性肾 疾病发展的策略。
[0013] 本发明还提供了评价心力衰竭结果的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液 或血浆CNP和/或其六个可能的分子形式（图8)鉴定发生不良结果几率增加的人的方法 和材料。至少部分基于尿液CNP水平上升和/或血浆CNP水平降低对发生不良结果几率增 加的患者的鉴定能够帮助医生和患者做出适当的治疗决定。
[0014] 总的来说，本发明的一个方面描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包 括，或基本由以下步骤组成：确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高，尿液 CNP与血浆CNP的比率升高表明哺乳动物肾结构改变或有可能发生肾结构改变，且尿液CNP 与血浆CNP的比率未升高表明哺乳动物未发生且不会发生肾结构改变。所述哺乳动物可 以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高 于12, OOOpg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血楽CNP的比率可以高于13, 200pg/天比 18pg/mL〇
[0015] 在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或 基本由以下步骤组成：确定哺乳动物的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率是否升高，尿液 CNP-22与血浆CNP-22的比率升高表明哺乳动物肾结构改变或有可能发生肾结构改变，且 不存在尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率升高表明哺乳动物未发生且不会发生肾结构改 变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP-22与 血浆CNP-22的比率可以高于12, OOOpg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22 的比率可以高于13, 200pg/天比18pg/mL。
[0016] 在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基 本由以下步骤组成：（a)检测哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高，以及（b)至 少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。所述哺乳 动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可 以高于12, OOOpg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
[0017] 在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或 基本由以下步骤组成：(a)检测哺乳动物的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率是否升高，以 及（b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。 所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP-22与血浆 CNP-22的比率可以高于12, OOOpg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比 率可以高于13, 200pg/天比18pg/mL。
[0018] 在另一个方面，本发明描述了一种评价结果的方法的特征。所述方法包括，或基本 由以下步骤组成：确定哺乳动物是否患有一种会使尿液CNP水平升高的疾病，尿液CNP水平 升高表明哺乳动物可能发生不良结果，且尿液CNP水平未升高表明哺乳动物不可能发生不 良结果。所述哺乳动物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或 慢性肾脏疾病。所述不良结果可以是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心 脏功能恶化或透析。所述尿液0即可以是尿液阶-0即-53。升高的水平可以高于36,000? 8 的NT-CNP-53/天。升高的水平可以高于42, OOOpg的NT-CNP-53/天。
[0019] 在另一个方面，本发明描述了一种评价结果的方法的特征。所述方法包括，或基 本由以下步骤组成：（a)检测患病哺乳动物的尿液CNP是否升高，以及（b)至少部分基于 检测结果将哺乳动物鉴定为可能发生不良结果。所述哺乳动物可以是人。所患疾病可以 是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。所述不良结果可以是死亡、住 院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。所述尿液CNP可以是尿 液NT-CNP-53。升高的水平可以高于36, OOOpg的NT-CNP-53/天。升高的水平可以高于 42, OOOpg 的 NT-CNP-53/ 天。
[0020] 在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基 本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中尿液CNP与血浆 CNP的比率升高，以及（b)将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。所述 哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率 可以高于12, OOOpg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血楽CNP的比率可以高于13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
[0021] 在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基 本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中尿液CNP-22与 血浆CNP-22的比率升高，以及（b)将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改 变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP-22与 血浆CNP-22的比率可以高于12, OOOpg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22 的比率可以高于13, 200pg/天比18pg/mL。
[0022] 在另一个方面，本发明描述了一种评价结果的方法的特征。所述方法包括，或基本 由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测患病哺乳动物中尿液CNP水平 是否升高，以及（b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为可能发生不良结果。所述哺 乳动物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。 所述不良结果可以是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化或透 析。所述尿液CNP可以是尿液NT-CNP53。升高的水平可以高于36, OOOpg的NT-CNP53/天。 升高的水平可以高于42, OOOpg的NT-CNP53/天。
[0023] 在另一个方面，本发明描述了一种评价哺乳动物是否存在死亡或心肌梗塞风险升 高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：确定哺乳动物的血浆CNP-22水 平是否升高，血浆水平升高表明该哺乳动物有可能比该水平未升高的同等哺乳动物早发生 死亡或心肌梗塞，且血浆水平未升高表明该哺乳动物有可能比该水平升高的同等哺乳动物 晚发生死亡或心肌梗塞。所述哺乳动物可以是人。升高的水平可以高于14pg/mL。升高的 水平可以高于16pg/mL。
[0024] 在另一个方面，本发明描述了一种评价哺乳动物是否存在死亡或心肌梗塞风险升 高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试 验以检测哺乳动物中血浆CNP-22水平是否升高，以及（b)至少部分基于检测结果将哺乳动 物鉴定为可能发生死亡或心肌梗塞。所述哺乳动物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ mL。升高的水平可以高于16pg/mL。所述方法可包括将哺乳动物鉴定为可能比该水平未升 高的同等哺乳动物早发生死亡或心肌梗塞。
[0025] 在另一个方面，本发明描述了一种治疗肾结构改变风险升高的哺乳动物的方法的 特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的 比率升高，（b)监测哺乳动物是否存在肾结构改变的风险因素，以及（c)指导给予哺乳动 物治疗剂以减轻肾结构改变的症状。所述哺乳动物可以是人。升高的尿液CNP与血浆CNP 的比率可以高于12,000?8/天比16?8/11^。升高的尿液0即与血浆0即的比率可以高于 13, 200pg/天比18pg/mL。所述风险因素可以选自由以下因素组成的组：年龄因素、高血压、 血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。所述治 疗剂可以是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或 设计利尿钠肽。
[0026] 在另一个方面，本发明描述了一种治疗不良结果风险升高的哺乳动物的方法的特 征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：（a)确定哺乳动物的尿液CNP水平升高，（b)监 测哺乳动物是否存在不良结果的风险因素，以及（c)指导给予哺乳动物治疗剂以降低不良 结果发生的可能性。所述哺乳动物可以是人。所述尿液CNP可以是尿液NT-CNP-53。升高的 水平可以高于36, OOOpg的NT-CNP-53/天。升高的水平可以高于42, OOOpg的NT-CNP-53/ 天。所述风险因素可以选自由以下因素组成的组：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、 蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。所述治疗剂可以是ACE抑制 齐U、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
[0027] 在另一个方面，本发明描述了一种治疗心肌梗塞风险升高的哺乳动物的方法的特 征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)确定哺乳动物的血浆CNP-22水平升高，（b) 监测哺乳动物是否存在心肌梗塞的风险因素，以及（c)指导给予哺乳动物治疗剂以降低心 肌梗塞的风险。所述哺乳动物可以是人。升高的水平可以高于14pg/mL。升高的水平可以 高于16pg/mL。所述风险因素可以选自由以下因素组成的组：年龄因素、高血压、血清肌酸 酐水平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。所述治疗剂可以 是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿 钠肽。
[0028] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所 述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申 请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书（包括定 义在内）为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
[0029] 从下文的详述和权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1. (A)天狼猩红染色在20x物镜放大下的代表性组织学图像和定量（B)2、ll和 20个月龄费歇尔大鼠的肾皮质纤维化的20x物镜放大下的代表性组织学图像。数值为平均 值土SE。所有年龄组中η = 7。*P〈0. 05相对于2个月，t P<〇.〇5相对于11个月。
[0031] 图2. (A)天狼猩红染色在20x物镜放大下的代表性组织学图像和定量（B)2、ll和 20个月龄费歇尔大鼠的肾髓质纤维化的20x物镜放大下代表性组织学图像。数值为平均值 土SE。所有年龄组中η = 7。*P〈0. 05相对于2个月，t P<().()5相对于11个月。
[0032] 图3.来自2个月（A)、11个月⑶和20个月（C)龄费歇尔大鼠的肾小球在8000x 放大下的代表性电子显微镜图。
[0033] 图4.来自2、11和20个月龄费歇尔大鼠中肾小球基底增厚的定量。数值为平均 值土SE。所有年龄组中η = 5。*P〈0. 05相对于2个月，十P<().()5相对于11个月。
[0034] 图5.来自2、11和20个月龄费歇尔大鼠中肾皮质和髓质CNP的免疫组化定位在 20x物镜放大下的代表性图像。
[0035] 图6. 2、11和20个月龄费歇尔大鼠之间血浆CNP (A)、尿液CNP排泄（B)、尿液与 血浆CNP的比率（C)和蛋白尿（D)的变化。数值为平均值土SE。所有年龄组中η = 10。 *Ρ〈0. 05相对于2个月，t Ρ<().()5相对于11个月。
[0036] 图7.尿液CNP排泄与肾皮质㈧和髓质⑶纤维化、以及尿液与血浆CNP的比率 与肾皮质（C)和髓质（D)纤维化之间的关联。
[0037] 图8为CNP分子形式的示意图。
[0038] 图9为CNP分子形式的氨基酸序列表。
[0039] 图10.来自年轻人类供体（A-C)和年长人类供体（D-F)的肾组织内CNP免疫组化 定位在20χ物镜放大下的图像。阴性对照（G)。
[0040] 图11.肾小球基底膜（GBM)厚度与尿液CNP排泄之间㈧以及GBM厚度与尿液与 血浆CNP的比率之间（Β)的关联。
[0041] 图12. ADHF患者（HHF)对比对照组中尿液ΚΜ-1排泄。带有24小时ΚΜ-1排泄 数值的中位数和四分位差（IQR;盒）以及1.5*IQR(误差线）的异常值盒状图。
[0042] 图13A-C。NT-CNP-53排泄和临床结果之间的关联：㈧死亡率，⑶首次非选择 性（所有原因）再入院治疗的时间/死亡，（C)首次非选择性心血管再入院治疗的时间/死 亡。带有24小时NT-CNP-53排泄数值的中位数和四分位差（IQR ;盒）以及1. 5*IQR(误差 线）的异常值盒状图（转化成自然对数数据）。
[0043] 图14A-C。ADHF中主要结果（死亡率）形成的CNP分子的尿液排泄。显示ADHF 中24小时尿液的（A)CNP22、（B)CNP53和（C)NT-CNP53排泄数值的中位数和四分位差（IQR ; 盒）以及1.5*IQR(误差线）相对于死亡率的异常值盒状图。
[0044] 图15A-B。普通人群中根据血浆CNP-22水平四分位数的死亡（A)和心肌梗塞（MI ; B)的卡普兰-迈耶曲线。CNP-22Q1 为 2. 0 至 10. lpg/mL ;CNP-22Q2 为 10. 2 至 13. lpg/mL ; CNP-22Q3 为 13. 2 至 16. 7pg/mL ;且 CNP-22Q4 为 16. 8 至 265. Opg/mL。
[0045] 发明详述
[0046] 本发明提供了涉及评价肾结构改变（如肾纤维化）的方法和材料。例如，本发明 提供了使用尿液CNP水平（例如尿液与血浆CNP的比率）和/或血浆CNP水平以确定哺乳 动物是否肾结构改变或有可能发生肾结构改变的方法和材料。如本文所述，存在尿液CNP 水平升高、血浆CNP水平降低和/或尿液与血浆CNP的比率升高表明哺乳动物肾结构改变 或有可能发生肾结构改变。肾结构改变的示例包括但不限于肾纤维化、肾小球基底膜增厚、 系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失。本文所提供的方法和材料可用于评价任何适当哺 乳动物中的肾结构改变，所述哺乳动物包括但不限于人类、猴、马、奶牛、绵羊、山羊、小鼠和 大鼠。
[0047] 人类CNP的六种分子形式的氨基酸序列列于图8和9。
[0048] 本文中相对于血浆或尿液CNP水平（或CNP的一种特定分子形式，如CNP-53)所 用术语"升高的水平"表示高于没有肾疾病的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体（如含有 10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群体）中血浆或尿液水平中位 数的任意水平。在一些情况下，血浆CNP(如血浆CNP-22)升高的水平可以是高于16pg/mL 的任意水平。在一些情况下，尿液CNP(如尿液CNP-22)升高的水平可以是高于12, OOOpg/ 天的任意水平。
[0049] 本文中相对于尿液CNP与血浆CNP的比率所用术语"升高"表示高于没有肾疾病 的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体（如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动 物的年龄匹配随机群体）中尿液CNP与血浆CNP的比率平均值的任意比率水平。在一些情 况下，升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以是高于12, OOOpg/天的尿液CNP比16pg/mL 血浆CNP的一个比率。在一些情况下，可使用血浆CNP与尿液CNP的比率替代尿液CNP与 血浆CNP的比率。
[0050] 在一些情况下，血浆CNP水平降低可表明哺乳动物肾结构改变或有会发生肾结构 改变或可能发生不良结果。本文中相对于血浆CNP水平所用术语"降低的水平"表示低于 没有肾疾病的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体（如含有1〇、20、30、40、50、100或500个 健康哺乳动物的年龄匹配随机群体）中血浆CNP水平中位数的任意水平。在一些情况下， 降低的血浆CNP水平可以是低于10pg/mL的任意水平。
[0051] 在一些情况下，存在血浆CNP水平降低、尿液CNP水平升高和血浆NT-proBNP水平 升高可表明哺乳动物肾结构改变或可能发生肾结构改变或可能发生不良结果。本文中相对 于血浆NT-proBNP水平所用术语"升高的水平"表示高于没有肾疾病的健康哺乳动物的年 龄匹配随机群体（如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群 体）中血浆水平中位数的任意水平。在一些情况下，血浆NT-proBNP升高的水平可以是高 于450pg/mL的任意水平。
[0052] 可使用任意适当方法以确定尿液CNP水平、血浆CNP水平、尿液CNP与血浆CNP的 比率、血浆NT-proBNP水平或血浆CNP与尿液CNP的比率。例如，可使用多肽检测法（如免 疫试验（如ELISA或放射免疫试验））和质谱确定血浆或尿液样品中的CNP水平。在一些 情况下，可使用放射免疫试验确定尿液CNP与血浆CNP的比率。
[0053] 本发明还提供了涉及评价结果的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液CNP 或其六种可能的分子形式（如CNP-53或NT-CNP-53)的水平以确定哺乳动物是否可能发生 不良结果的方法和材料。如本文所述，存在尿液CNP水平升高表明哺乳动物可能发生不良 结果。不良结果的示例包括但不限于死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功 能恶化和透析。本文所提供的方法和材料可用于评价任何适当哺乳动物中的结果，所述哺 乳动物包括但不限于人类、猴、马、奶牛、绵羊和山羊。
[0054] 在一些情况下，本文中相对于尿液NT-CNP-53水平所用术语"升高的水平"表示高 于健康哺乳动物的年龄匹配随机群体（如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动 物的年龄匹配随机群体）中尿液NT-CNP-53水平中位数的任意水平，所述健康哺乳动物没 有其他共病病史，如心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。在一些情况 下，升高的尿液NT-CNP-53水平可以是高于36, OOOpg/天的任意水平。
[0055] 本发明还提供了帮助医疗或研究专家确定哺乳动物是否肾结构改变或有可能发 生肾结构改变的方法和材料以及帮助医疗或研究专业人员确定哺乳动物是否可能发生不 良结果的方法和材料。医疗专业人员可以是例如医生、护士、医疗实验室技术人员和药剂 师。研究专业人员可以是例如研究负责人、研究技术员、博士后研究员或研究生。可以通过 (1)确定尿液CNP水平、血浆CNP水平、尿液CNP与血浆CNP的比率或血浆CNP与尿液CNP 的比率，以及（2)将上述水平和比率的信息与专业人员交流的方式帮助专业人员确定哺乳 动物是否肾结构改变或有可能发生肾结构改变。可以通过（1)确定尿液CNP水平，以及（2) 将上述水平的信息与专业人员交流的方式帮助专业人员确定哺乳动物是否可能发生不良 结果。
[0056] 可使用任何方法与其他人员（如专业人员）交流信息。例如，可以将信息直接或间 接地提供给专业人员。此外，可使用任何形式的交流方式以交流信息。例如，可使用邮件、 电子邮件、电话和面对面交谈。也可以通过将这些信息电子化的方式将信息传递给专业人 员来与专业人员交流信息。例如可以通过将信息置于计算机数据库中以使专业人员能够获 得该信息，从而实现与专业人员交流信息。此外，信息可以传递给医院、诊所、或者作为所述 专业人员媒介的研究机构。
[0057] 本发明还提供了治疗肾结构改变或有可能发生肾结构改变的哺乳动物的方法和 材料。例如，可以评价哺乳动物以确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高。 如本文所述，尿液CNP与血浆CNP的比率升高的哺乳动物可能肾结构改变或有可能发生肾 结构改变。一旦哺乳动物被鉴定为尿液CNP与血浆CNP的比率升高，可监测该哺乳动物以 确定是否存在肾结构改变的一项或多项风险因素。例如，可监测或评价该哺乳动物以确定 是否存在年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性别、体重指数升高、胆固 醇水平升高、吸烟习惯和/或糖尿病。一旦鉴定存在尿液CNP与血浆CNP的比率升高和一 项或多项风险因素的哺乳动物，可使用一种或多种治疗剂治疗该哺乳动物，所述治疗剂被 设计用于缓解或抵消肾结构改变的症状。例如，可使用ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂 (ARB)、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽治疗尿液CNP与血浆CNP的比 率升高和高血压的哺乳动物以缓解肾结构改变的症状。在一些情况下，可指导尿液CNP与 血浆CNP的比率升高且带有一项或多项风险因素的哺乳动物使用一种或多种治疗剂进行 自我治疗，所述治疗剂被设计用于缓解或抵消肾结构改变的症状。
[0058] 本发明还提供了治疗可能发生不良结果（如死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、肾 功能恶化、心脏功能恶化和透析）的哺乳动物的方法和材料。例如，可对哺乳动物进行评价 以确定哺乳动物的尿液CNP或其六种可能分子形式（如CNP-53或NT-CNP-53)的水平是否 升高。如本文所述，尿液CNP或其六种可能分子形式（如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升 高的哺乳动物可能发生不良结果。一旦哺乳动物被鉴定为尿液CNP或其六种可能分子形式 (如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高，则可监测该哺乳动物以确定是否存在不良结果的 一项或多项风险因素。例如，可监测或评价该哺乳动物以确定是否存在年龄因素、高血压、 血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性别、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和/或 糖尿病。一旦鉴定存在尿液CNP或其六种可能分子形式（如CNP-53或NT-CNP-53)的水平 升高和一种或多种风险因素的哺乳动物，可使用一种或多种治疗剂治疗该哺乳动物，所述 治疗剂被设计用来降低不良结果发生的可能性。例如，可使用ACE抑制剂、ARB、醛固酮拮 抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽治疗存在尿液CNP或其六种可能分子形式（如 CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高和高血压的哺乳动物以降低不良结果发生的可能性。在 一些情况下，可指导尿液CNP或其六种可能分子形式（如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升 高且有一项或多项风险因素的哺乳动物使用一种或多种治疗剂进行自我治疗，所述治疗剂 被设计用来降低不良结果发生的可能性。
[0059] 本发明还提供了治疗哺乳动物的方法和材料。例如，可以评价哺乳动物以确定哺 乳动物的血浆CNP-22水平是否升高。如本文所述，血浆CNP-22水平升高的哺乳动物遭受 死亡或心肌梗塞的风险上升。一旦哺乳动物被鉴定为血浆CNP-22水平升高，可监测该哺乳 动物以确定是否存在死亡或心肌梗塞的一项或多项风险因素。例如，可监测或评价该哺乳 动物以确定是否存在年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性别、体重指数 升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和/或糖尿病。一旦鉴定到血浆CNP-22水平升高且有一 项或多项风险因素的哺乳动物，可使用一种或多种治疗剂治疗该哺乳动物，所述治疗剂被 设计用来降低哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险。例如，可使用ACE抑制剂、ARB、醛固酮 拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽治疗血浆CNP-22水平升高且胆固醇水平升 高的哺乳动物以降低该哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险。在一些情况下，可指导血浆 CNP-22水平升高且有一项或多项风险因素的哺乳动物使用一种或多种治疗剂进行自我治 疗，所述治疗剂被设计用来降低哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险。
[0060] 以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明 的范围。 实施例
[0061] 实施例1 - #用尿液CNP棑泄作为衰老期间肾纤维化的牛物标记
[0062] 动物
[0063] 研究在2、11和20个月龄雄性费歇尔大鼠中进行（哈伦实验室公司（Harlan Laboratories, Inc.)，威斯康星州麦迪逊，每个年龄组η = 8-10,另有说明者除外）。 实验性研究按照动物福利法和梅约临床机构动物管理和使用委员会（Mayo Cl inic Institutional Animal Care and Use Committee)的批准进行。
[0064] 人类肾活检组织
[0065] 人类肾组织获得自捐献肾脏时健康生活的肾供体的细针抽吸活检样本，如他处所 述（Rule等，Ann. Intern. Med. ,152:561-567(2010))。本研究中检测了总共六份石蜡包埋 肾活检样本。年轻组由三名平均年龄为19岁（年龄范围18至20岁）的女性供体组成，年 老组由三名71岁的女性供体组成。
[0066] 24小时尿液收集
[0067] 大鼠置于代谢笼中，能够自由进食和饮水并用24小时时间使之适应环境。适应期 后，随即用24小时收集尿液用于蛋白尿和CNP评价。使用邻苯三酚红染色结合试验测量24 小时尿液样品中的尿蛋白排泄。
[0068] 急性血压研究、肾小球过滤速率和血浆收集
[0069] 麻醉大鼠（氧气中1. 5%异氟烷），将PE-50管置于颈动脉以使用CardioSOFT Pro 软件（Sonometrics公司，安大略省伦敦）采集血压（BP)并取血样。将插管插入膀胱进行尿 液收集。将PE-50管插入颈静脉并持续注入含2%菊粉的生理盐水（西格玛公司（Sigma)， 密苏里州圣路易斯）。60分钟平衡后，进行廓清研究。廓清研究持续60分钟，在廓清研究 结束时同血样一起收集尿液以计算菊粉廓清中的GFR并用于测量血浆CNP。从颈动脉中收 集血液并置于冰上的 EDTA 管中（Stingo 等，Am.J.Phys.，263:H1318-1321 (1992))。立即 将血液在4°C下2, 500rpm离心10分钟，血浆储存于聚苯乙烯管，在-80〇C保存以备后续使 用。使用用于GFR分析的蒽酮法测量菊粉浓度，如他处所述（Davidson和Sackner，J. Lab. Clin. Med. ,62:351-356(1963))。
[0070] 大鼠肾组织
[0071] 急性研究后，完整移除大鼠肾脏，随后将其分成几部分。将肾组织的横截面保存于 10%福尔马林中用于纤维化和CNP的组织学分析，较小的方形部分保存于2. 5%戊二醛中 用于电子显微镜（EM)分析。
[0072] 纤维化的组织学分析
[0073] 将固定后的大鼠肾组织（η = 7)脱水并包埋于石蜡中，切成厚度为4μπι的切片。 使用天狼猩红对纤维化的胶原蛋白和延伸进行染色。使用Axioplan II KS400显微镜（卡 尔蔡司公司（Carl Zeiss，Inc)，德国）在每张切片中捕捉至少4张随机选择的图像，使用 20x物镜并使用KS400软件确定纤维化区域占组织总面积的百分比。
[0074] 电子显微镜分析
[0075] 将2. 5%戊二醛中固定的大鼠肾组织脱水并包埋于树脂模具中。根据EM核心设备 程序切割超薄切片。使用JEM-1400透射电子显微镜在5000x和8000x放大下对肾小球进 行成像。
[0076] 肾小球基底膜厚度测量
[0077] 在每个年龄组（η = 5)的大鼠中使用5000x放大捕捉肾小球EM图像。使用应用 数字显微照片（Digital Micrograph) (Gatan公司，加利福尼亚州普莱森顿）测量GBM的厚 度。对于每只大鼠，由一名有经验的EM技术员测量20次并使用Excel形态测量宏处理数 据，给出以纳米（nm)为单位的平均厚度。
[0078] 血浆和尿液CNP
[0079] 使用来自于菲尼克斯制药有限公司（Phoenix Pharmaceutical)(加利福尼亚州 芒廷维尤）的市售非平衡放射免疫试验试剂盒和与大鼠 CNP-22具有完全交叉反应性的 抗-人CNP-22抗体确定血楽和尿液CNP-22的方法如他处所述（Stingo等，Am. J. Phys., 263:H1318-1321 (1992))。使用C-18Bond Elut固相萃取筒提取一毫升血浆。使用4mL100% 甲醇和4mL水清洗筒后，加入血浆并清洗筒。在Savant快速真空浓缩器中浓缩洗脱液，并 用300 μ L试验缓冲液重悬沉淀。将100 μ L标准品和样品与100 μ L抗-人CNP抗体在4°C 下孵育。18小时后，加入100 μ L (10, 000计数）1125标记的CNP并在4°C下孵育18小时。随 后，在所有样品中加入二抗以使游离和结合的部分分离，并对样品进行离心。吸出游离的部 分并在Y计数器上对结合的部分进行计数。生成并使用标准曲线以计算未知样品的浓度， 其报告单位为pg/mL。标准曲线的范围为0. 5至128pg，检测的下限为0. 5pg。试验间和试 验内差异分别为11%和5.2%。回收率为72±6(%。与4即、8即、内皮素和肾上腺髓质素的 交叉反应性〈1%，与CNP-53的交叉反应性为97%。
[0080] CNP免疫组化
[0081] 评价是否存在肾脏CNP免疫组化的方法如他处所述（Stingo等，Am. J. Phys., 263:H1318-1321 (1992))。简单地说，将石蜡包埋的肾组织切片在60°C加热炉中孵育2小 时，随后使用已有的实验室方法进行脱石蜡。脱石蜡后，用甲醇中0.6%过氧化氢室温下孵 育切片20分钟以限制内源性过氧化氢酶活性，随后在加入一抗前使用5%正常山羊血清 封闭非特异性蛋白结合位点。将切片置于保湿室，以1:500的稀释比例加入一抗（兔抗人 CNP-22,菲尼克斯制药有限公司（Phoenix Pharmaceutical)，加利福尼亚州芒廷维尤），室 温反应18-24小时。使用正常兔血清处理对照切片。将切片与共价连接了辣根过氧化物 酶的山羊抗兔IgG以及过氧化物酶的底物3-氨基-9-乙基-咔唑孵育，并使用苏木精反染 以强化核的细节。随后由一名不知道年龄分组的肾脏病理学家观察并解释染色的切片。 [0082] 统计学分析
[0083] 结果表示为平均值土SE。使用AN0VA及随后的Newman-Keuls多重比较检验进行 组内比较。进行皮尔森相关以计算尿液CNP排泄和肾纤维化以及GFR之间和尿液与血浆 CNP的比率和肾纤维化之间的关联。上述计算使用GraphPad Prism软件（图形软件有限公 司（GraphPad Software)，加利福尼亚州拉由拉市）。统计的显著性接受为Ρ〈0· 05。
[0084] 结果
[0085] 与年龄相关的人体测量、肾脏特征和血液动力学确定了体重（BW)、肾脏总重量 (TKW)、血浆肌酸酐、GFR以及平均动脉压（MAP)水平（表1)。相比于2个月的组，11个月 时BW和TKW有显著增加，在20个月时持续。当使用BW对TKW进行标准化时，TKW:BW比率 在11和20个月时出现显著下降。此外，相比于2个月，11和20个月时血浆肌酸酐水平显 著上升，11个月时GFR存在下降的趋势，在20个月时持续。MAP仅在20个月时出现显著上 升。
[0086] 表1.老化费歇尔大鼠中体重、肾脏特征和血压汇总。
[0087]
【权利要求】
1. 一种评估肾结构的方法，所述方法包括确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率 是否升高，升高的尿液CNP与血浆CNP的比率表明所述哺乳动物肾结构改变或有可能发生 肾结构改变，所述尿液CNP与血浆CNP的比率未升高表明所述哺乳动物未发生且不会发生 肾结构改变。
2. 如权利要求1所述的方法，所述哺乳动物是人。
3. 如权利要求1所述的方法，所述肾结构改变包括肾纤维化。
4. 如权利要求1所述的方法，所述升高的尿液CNP与血浆CNP的比率高于12, OOOpg/ ?：匕 16pg/mL。
5. 如权利要求1所述的方法，所述升高的尿液CNP与血浆CNP的比率高于13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
6. -种评估肾结构的方法，所述方法包括确定哺乳动物的尿液CNP-22与血浆CNP-22 的比率是否升高，升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率表明所述哺乳动物肾结构改变 或有可能发生肾结构改变，所述尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率未升高表明所述哺乳动 物未发生且不会发生肾结构改变。
7. 如权利要求6所述的方法，所述哺乳动物是人。
8. 如权利要求6所述的方法，所述肾结构改变包括肾纤维化。
9. 如权利要求6所述的方法，所述升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率高于 12, OOOpg/ 天比 16pg/mL。
10. 如权利要求6所述的方法，所述升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率高于 13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
11. 一种评估肾结构的方法，所述方法包括： (a) 检测哺乳动物中尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高，以及 (b) 至少部分基于所述检测结果将所述哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾 结构改变。
12. 如权利要求6所述的方法，所述哺乳动物是人。
13. 如权利要求6所述的方法，所述肾结构改变是肾纤维化。
14. 如权利要求6所述的方法，所述升高的尿液CNP与血浆CNP的比率高于12, OOOpg/ ?：匕 16pg/mL。
15. 如权利要求6所述的方法，所述升高的尿液CNP与血浆CNP的比率高于13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
16. -种评估肾结构的方法，所述方法包括： (a) 检测哺乳动物中尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率是否升高，以及 (b) 至少部分基于所述检测结果将所述哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾 结构改变。
17. 如权利要求15所述的方法，所述哺乳动物是人。
18. 如权利要求15所述的方法，所述肾结构改变是肾纤维化。
19. 如权利要求15所述的方法，所述升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率高于 12, OOOpg/ 天比 16pg/mL。
20. 如权利要求15所述的方法，所述升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率高于 13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
21. -种评估结果的方法，所述方法包括确定患病哺乳动物的尿液CNP水平是否升高， 升高的尿液CNP水平表明所述哺乳动物可能发生不良结果，所述尿液CNP水平未升高表明 所述哺乳动物不会发生不良结果。
22. 如权利要求21所述的方法，所述哺乳动物是人。
23. 如权利要求21所述的方法，所患疾病是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或 慢性肾脏疾病。
24. 如权利要求21所述的方法，所述不良结果是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、 肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。
25. 如权利要求21所述的方法，所述尿液CNP是尿液NT-CNP-53。
26. 如权利要求25所述的方法，所述升高的水平高于36,000pg NT-CNP-53/天。
27. 如权利要求25所述的方法，所述升高的水平高于42,000pg NT-CNP-53/天。
28. -种评估结果的方法，所述方法包括： (a) 检测患病哺乳动物的尿液CNP水平是否升高，以及 (b) 至少部分基于所述检测结果将所述哺乳动物鉴定为可能发生不良结果。
29. 如权利要求28所述的方法，所述哺乳动物是人。
30. 如权利要求28所述的方法，所患疾病是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或 慢性肾脏疾病。
31. 如权利要求28所述的方法，所述不良结果是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、 肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。
32. 如权利要求28所述的方法，所述尿液CNP是尿液NT-CNP-53。
33. 如权利要求32所述的方法，所述水平升高至高于36, OOOpg NT-CNP-53/天。
34. 如权利要求32所述的方法，所述水平升高至高于42, OOOpg NT-CNP-53/天。
35. -种评估肾结构的方法，所述方法包括： (a) 用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中尿液CNP与血浆CNP的比率升高， 以及 (b) 将所述哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。
36. 如权利要求35所述的方法，所述哺乳动物是人。
37. 如权利要求35所述的方法，所述肾结构改变包括肾纤维化。
38. 如权利要求35所述的方法，所述尿液CNP与血浆CNP的比率升高至高于12, OOOpg/ ?：匕 16pg/mL。
39. 如权利要求35所述的方法，所述尿液CNP与血浆CNP的比率升高至高于13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
40. -种评估肾结构的方法，所述方法包括： (a) 用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率 是否升高，以及 (b) 将所述哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。
41. 如权利要求40所述的方法，所述哺乳动物是人。
42. 如权利要求40所述的方法，所述肾结构改变包括肾纤维化。
43. 如权利要求40所述的方法，所述尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率升高至高于 12, OOOpg/ 天比 16pg/mL。
44. 如权利要求40所述的方法，所述尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率升高至高于 13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
45. -种评估结果的方法，所述方法包括： (a) 用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测患病哺乳动物的尿液CNP水平是否升高，以及 (b) 至少部分基于所述检测结果将所述哺乳动物鉴定为可能发生不良结果。
46. 如权利要求45所述的方法，所述哺乳动物是人。
47. 如权利要求45所述的方法，所患疾病是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或 慢性肾脏疾病。
48. 如权利要求45所述的方法，所述不良结果是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、 肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。
49. 如权利要求45所述的方法，所述尿液CNP是尿液NT-CNP53。
50. 如权利要求49所述的方法，所述水平升高至高于36, OOOpg NT-CNP53/天。
51. 如权利要求49所述的方法，所述水平升高至高于42, OOOpg NT-CNP53/天。
52. -种评估哺乳动物的死亡或心肌梗塞风险是否升高的方法，所述方法包括确定所 述哺乳动物的血浆CNP-22水平是否升高，该水平升高表明所述哺乳动物可能比该水平不 升高的同等的哺乳动物早发生死亡或心肌梗塞，所述水平未升高表明所述哺乳动物可能比 该水平升高的同等的哺乳动物晚发生死亡或心肌梗塞。
53. 如权利要求52所述的方法，所述哺乳动物是人。
54. 如权利要求52所述的方法，所述水平升高至高于14pg/mL。
55. 如权利要求52所述的方法，所述水平升高至高于16pg/mL。
56. -种评估哺乳动物的死亡或心肌梗塞风险是否升高的方法，所述方法包括： (a) 用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中血浆CNP-22水平是否升高，以及 (b) 至少部分基于所述检测结果将所述哺乳动物鉴定为可能发生死亡或心肌梗塞。
57. 如权利要求56所述的方法，所述哺乳动物是人。
58. 如权利要求56所述的方法，所述水平升高至高于14pg/mL。
59. 如权利要求56所述的方法，所述水平升高至高于16pg/mL。
60. 如权利要求56所述的方法，所述方法包括将所述哺乳动物鉴定为可能比所述水平 未升高的同等哺乳动物早发生死亡或心肌梗塞。
61. -种对待肾结构改变高风险哺乳动物的方法，所述方法包括： (a) 确定所述哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高， (b) 监测所述哺乳动物是否存在肾结构改变的风险因素，以及 (c) 指示所述哺乳动物使用治疗剂以减轻肾结构改变的症状。
62. 如权利要求61所述的方法，所述哺乳动物是人。
63. 如权利要求61所述的方法，所述尿液CNP与血浆CNP的比率升高至高于12, OOOpg/ ?：匕 16pg/mL。
64. 如权利要求61所述的方法，所述尿液CNP与血浆CNP的比率升高至高于13, 200pg/ 天比 18pg/mL。
65. 如权利要求61所述的方法，所述风险因素选自：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水 平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。
66. 如权利要求61所述的方法，所述治疗剂是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛 固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
67. -种对待不良结果高风险哺乳动物的方法，所述方法包括： (a) 确定所述哺乳动物的尿液CNP水平是否升高， (b) 监测所述哺乳动物中是否存在不良结果的风险因素，以及 (c) 指示所述哺乳动物使用治疗剂以降低不良结果发生的可能性。
68. 如权利要求67所述的方法，所述哺乳动物是人。
69. 如权利要求67所述的方法，所述尿液CNP是尿液NT-CNP-53。
70. 如权利要求67所述的方法，所述水平升高至高于36,000pg NT-CNP-53/天。
71. 如权利要求67所述的方法，所述水平升高至高于42,000pg NT-CNP-53/天。
72. 如权利要求67所述的方法，所述风险因素选自：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水 平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。
73. 如权利要求67所述的方法，所述治疗剂是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛 固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
74. -种对待心肌梗塞高风险哺乳动物的方法，所述方法包括： (a) 确定所述哺乳动物的血浆CNP-22水平是否升高， (b) 监测所述哺乳动物中是否存在心肌梗塞的风险因素，以及 (c) 指示所述哺乳动物使用治疗剂以降低心肌梗塞的风险。
75. 如权利要求74所述的方法，所述哺乳动物是人。
76. 如权利要求74所述的方法，所述水平升高至高于14pg/mL。
77. 如权利要求74所述的方法，所述水平升高至高于16pg/mL。
78. 如权利要求74所述的方法，所述风险因素选自：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水 平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。
79. 如权利要求74所述的方法，所述治疗剂是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛 固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
【文档编号】C07K14/575GK104144943SQ201280070265
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2012年10月11日 优先权日:2011年12月23日
【发明者】S·J·桑格拉林汉姆, J·C·小伯内特, A·卡塔里奥蒂, D·M·休柏林 申请人:梅约医学教育与研究基金会