人源化的轻链小鼠的制作方法

人源化的轻链小鼠的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种非人动物、组织、细胞和遗传物质，其包括对内源性非人源重链免疫球蛋白序列的修饰以及包括在小鼠中具有功能的ADAM6活性，其中所述非人动物表达人源免疫球蛋白重链可变结构域和同源的人源免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
【专利说明】人源化的轻链小鼠 发明领域
[0001] 基因修饰的具有生育能力的非人动物，所述动物表达与人源重链可变序列同源的 人源免疫球蛋白λ轻链可变序列。本申请描述了基因修饰的小鼠、细胞、胚胎和组织，其包 括编码在小鼠 ADAM6基因座中有功能的ADAM6a的核酸序列，其中所述小鼠、细胞、胚胎和组 织包括能够重排形成功能性免疫球蛋白轻链可变结构域的人源免疫球蛋白λ轻链基因区 段。修饰包括人源和/或人源化的免疫球蛋白基因座。本申请描述了包括ADAM6功能的小 鼠，包括含有编码ADAM6蛋白的异位核酸序列的小鼠。本申请描述了包括基因修饰的内源 性小鼠免疫球蛋白V H区基因座并且还包括ADAM6活性的基因修饰的雄性小鼠，包括含有恢 复雄性小鼠生育能力的异位核酸序列的小鼠。
[0002] 基因修饰的具有生育能力的非人动物，所述动物包括内源性ADAM6基因或者其同 源物或直系同源物的缺失或修饰，并且所述动物包括全部或部分恢复ADAM6 (或其同源物 或直系同源物）功能的基因修饰，其中所述非人动物在λ或K轻链恒定序列背景下表达 人源免疫球蛋白λ可变序列。
[0003] 置量
[0004] 抗体在过去二十年的药学应用为大量制备适用于人用疗法的抗体的研究起到了 推波助澜的作用。基于小鼠抗体的早期抗体疗法并不是理想的人用疗法，因为重复给予人 小鼠抗体后会导致免疫原性问题，这个问题可能会干扰长期治疗方案。基于将小鼠抗体人 源化以使抗体更加像人并且更少像小鼠的解决方案被开发出来。表达供抗体使用的人源免 疫球蛋白序列的方法随之产生，这大部分是基于人源免疫球蛋白文库在噬菌体、细菌或酵 母中的体外表达。最后，尝试从体外的人源淋巴细胞中，从植入人源造血细胞的小鼠中以及 从使内源性免疫球蛋白基因座丧失功能的转染色体或转基因小鼠中来制备有用的人源抗 体。在转基因小鼠中，使内源性小鼠免疫球蛋白基因丧失功能是必要的，这使得随机整合的 全人源转基因作为小鼠中所表达的免疫球蛋白序列的来源。这种小鼠能够制备适合在人用 疗法中使用的人源抗体，但是这些小鼠的免疫系统均存在严重的问题。这些问题（1)使得 小鼠无法产生足够多样性的抗体库，（2)需要使用大量再工程化的修复，（3)可能是由于人 与小鼠元件之间的不相容性提供了欠佳的克隆选择过程，以及（4)使得这些小鼠成为所需 的真正用于制备人用疗法的、人源可变序列大量和多样性群体的不可靠来源。
[0005] 含有全人源抗体转基因的转基因小鼠包含随机插入的转基因，所述转基因包含与 人源重链恒定序列连接的、未经重排的人源免疫球蛋白重链可变序列（V、D和J序列）以及 与人源轻链恒定序列连接的、未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变序列（V和J)。因此，所 述小鼠从内源性小鼠基因座以外的基因座产生重排的抗体基因，其中所述重排的抗体基因 是全人源的。尽管已经报道了具有至少一些人源λ序列的小鼠，但是在通常情况下，所述 小鼠含有人源重链序列和人源κ轻链序列。转基因小鼠通常具有损坏的和非功能性的内 源性免疫球蛋白基因座，或者内源性免疫球蛋白基因座敲除，以使得所述小鼠不能在内源 性小鼠免疫球蛋白基因座上重排人源抗体序列。这种转基因小鼠的变化莫测使其不能理想 地在小鼠中产生足够多样性的人源抗体库，这可能至少部分是由于在内源性小鼠选择系统 中连接全人源抗体分子的是欠佳的克隆选择过程。
[0006] 在本领域中仍需要制备改进的基因修饰的非人动物，所述动物用于生产免疫球蛋 白序列（包括人源抗体序列）以及用于生产足够多样性的人源抗体库。还需要一种小鼠， 所述小鼠能够重排免疫球蛋白基因区段以形成有用的经重排的免疫球蛋白基因，包括与人 源λ或人源 K可变结构域同源的人源重链可变结构域，或者所述小鼠能够由改变的免疫 球蛋白基因座来制备蛋白，包括含有足够多样选择性的人源λ和/或人源 Κ轻链可变序 列的基因座。需要一种非人动物，所述动物能够由人源κ和人源λ区段产生抗体可变区， 其中所述人源κ和人源λ区段与人源重链可变结构域同源。还需要增加人源λ序列基 因修饰动物的使用量。
[0007] 发明概沭
[0008] 本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括可降低或消除了 ADAM6基 因或者其同源物或直系同源物活性的修饰，其中所述修饰造成是生育能力的丧失，并且所 述动物还包括编码某种活性的序列，所述活性补足或挽救失去的或降低的ADAM6活性（或 者同源物或直系同源物活性），并且所述非人动物还包括某种修饰，所述修饰能够使其表达 与人源免疫球蛋白λ轻链可变区具有同源性的人源免疫球蛋白重链可变区。在各种方面， 所表达的人源免疫球蛋白λ轻链可变区与λ或 Κ恒定区融合。
[0009] 在各种方面，编码ADAM6活性的序列与人源免疫球蛋白序列相邻。在各种方面，编 码ADAM6活性的序列与非人源免疫球蛋白序列相邻。在各种方面，所述序列与非人动物的 内源性非人源免疫球蛋白重链基因座存在于相同的染色体上。在各种方面，所述序列与非 人动物的免疫球蛋白重链基因座存在于不同的染色体上。
[0010] 本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括可维持ADAM6基因或者其 同源物或直系同源物活性的修饰，其中所述修饰包括在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游 插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段，并且所述非人动物还包括某种修饰，所述 修饰能够使其表达与人源免疫球蛋白重链可变区具有同源性的人源免疫球蛋白λ轻链可 变区。在各种方面，所表达的人源免疫球蛋白λ轻链可变区与λ或 κ恒定区融合。
[0011] 在各种方面，所述插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段是在非人动物 ADAM6基因的3'端或其下游进行。在各种方面，所述插入一个或多个人源免疫球蛋白重链 基因区段是以某种方式进行，使得非人动物的ADAM6基因不被破坏、缺失和/或功能性沉 默，这样非人动物ADAM6的活性与不含这种插入的非人动物在相同或相当的水平。示例性 的破坏、缺失和/或功能性沉默的修饰包括导致由非人动物DAM6基因编码的ADAM6蛋白的 活性降低、消除和/或丧失的任意修饰。
[0012] 在一个方面，本申请提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法， 所述小鼠包括导致产生无功能的内源性小鼠 ADAM6蛋白或ADAM6基因（例如内源性ADAM6 基因的敲除或缺失）的修饰，其中所述小鼠包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白 或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
[0013] 在一个方面，本申请提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法， 所述小鼠包括内源性小鼠免疫球蛋白基因座的修饰，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有 功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方式中，所述内源性小 鼠免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座，并且所述修饰降低或消除雄性小鼠细胞或 组织的ADAM6活性。
[0014] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码小鼠 ADAM6或者其直系 同源物或同源物或功能性片段的异位核苷酸序列；本申请还提供了一种小鼠，所述小鼠包 括编码小鼠 ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的内源性核苷酸序列，以及至 少一个基因修饰的重链免疫球蛋白基因座。
[0015] 在一个方面，本申请提供了制备小鼠的方法，所述小鼠包括修饰的内源性小鼠免 疫球蛋白基因座，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源 物或同源物或片段。
[0016] 在一个方面，本申请提供了制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的重链免疫 球蛋白基因座，其中应用所述方法得到包括经修饰的重链免疫球蛋白基因座（或使其缺 失）的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方式中，所述雄性 小鼠能够生产精子，所述精子可以小鼠的子宫进入小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。
[0017] 在一个方面，本申请提供了一种制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的免疫 球蛋白重链基因座和免疫球蛋白轻链基因座，其中应用所述方法修饰重链基因座使得雄性 小鼠显示出降低的生育能力，并且所述小鼠包括使降低的生育能力全部或部分恢复的基因 修饰。在各种实施方式中，生育能力降低的特征为雄性小鼠的精子不能从小鼠的子宫迁移 至小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。在各种实施方式中，生育能力降低的特征为精子显示 出体内迁移缺陷。在各种实施方式中，使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰是编 码在雄性小鼠中具有功能的小鼠 ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序 列。
[0018] 在一个实施方式中，所述基因修饰包括使用另一物种（例如不是小鼠的物种）的 免疫球蛋白重链可变基因座来取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个实施方式 中，所述基因修饰包括将直系同源的免疫球蛋白重链可变基因座插入内源性免疫球蛋白重 链可变基因座。在一个特定的实施方式中，所述物种是人。在一个实施方式中，所述基因 修饰包括内源性免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分缺失，其中所述缺失导致内源性 ADAM6功能的丧失。在一个特定的实施方式中，内源性ADAM6功能的丧失与雄性小鼠生育能 力的降低相关。
[0019] 在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性非人源免疫球蛋白重链可变基因座 的全部或部分失活，其中所述失活不会导致内源性ADAM6功能的丧失。失活可以包括一个 或多个内源性非人源基因区段的取代或缺失，以使得内源性非人源免疫球蛋白重链基因座 基本上不能重排以编码包括内源性非人源基因区段的抗体重链。失活可以包括使得内源性 免疫球蛋白重链基因座不能重排以编码抗体重链的其他修饰，其中所述修饰不包括内源性 基因区段的取代或缺失。示例性的修饰包括通过分子技术介导的染色体翻转和/或转位， 例如使用位点特异性重排位点的精确放置（例如Cre-lox技术）。其他的示例性修饰包括 使非人源免疫球蛋白可变基因区段与非人源免疫球蛋白恒定区之间不能操作性连接。
[0020] 在一个实施方式中，所述基因修饰包括将DNA片段插入非人动物的基因组，所述 DNA片段包括可操作地与一个或多个恒定区序列（例如IgM和/或IgG基因）连接的另一 物种（例如不是小鼠的物种）的一个或多个人源￥ 11基因区段、一个或多个人源011基因区段 和一个或多个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述DNA片段能够在非人动物的基因 组中重排以形成编码抗体重链可变结构域的序列。在一个实施方式中，所述物种是人。在 一个实施方式中，所述基因修饰包括将一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段插入到非 人动物内源性ADAM6基因的下游或3'端，以使得ADAM6活性（例如编码蛋白的表达和/或 功能）与不包括该插入的非人动物相同或相当。
[0021] 在一个方面，本申请提供了包括修饰的小鼠，所述修饰从内源性ADAM6等位基因 上降低或消除小鼠 ADAM6的表达，以使得由于内源性ADAM6功能的降低或消除，具有该修饰 的雄性小鼠显示出降低的生育能力（例如通过交配产生后代的能力大大降低），或者基本 上是不育的，其中所述小鼠还包括异位ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片 段。在一个方面，所述降低或消除小鼠 ADAM6表达的修饰是在小鼠免疫球蛋白基因座的修 饰（例如插入、缺失、取代等）。
[0022] 在一个实施方式中，ADAM6功能的降低或丧失包括小鼠不能或基本上不能产生可 以从小鼠子宫进入小鼠输卵管使小鼠卵子受精的精子。在一个特定的实施方式中，在小鼠 的一次射精体积中至少约95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的精子细胞在交配后在体内不能 进入输卵管并使小鼠的卵子受精。
[0023] 在一个实施方式中，ADAM6功能的降低或丧失包括在小鼠的精子细胞表面不能形 成或基本上不能形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方式中，ADAM6 功能的丧失包括基本上不能通过与雌性小鼠交配来使小鼠的卵子受精。
[0024] 在一个方面，本申请提供了某种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因，但 是包括使小鼠具有ADAM6功能的蛋白（或者编码蛋白的异位核苷酸序列）。在一个实施方 式中，所述小鼠是雄性小鼠，并且所述功能包括与缺乏功能性内源性ADAM6基因的小鼠相 比具有增强的生育能力。
[0025] 在一个实施方式中，所述蛋白由位于小鼠生殖细胞系免疫球蛋白基因座中的基因 组序列编码。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在另一个 特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源％、至少一个人源0 11和至少一个人 源JH基因区段。在一个实施方式中，所述异位蛋白由小鼠生殖细胞系非免疫球蛋白基因座 中的基因组序列编码。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是具有转录活性的基 因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座是R0SA26基因座。在一个特 定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座与组织特异性表达相关。在一个实施方式中， 所述组织特异性表达存在于生殖组织中。在一个实施方式中，所述蛋白由随机插入小鼠生 殖细胞系中的基因组序列编码。
[0026] 在一个实施方式中，所述小鼠包括人源或嵌合的人源/小鼠或嵌合的人源/大鼠 轻链（例如人源可变、小鼠或大鼠恒定）和嵌合的人源可变/小鼠或大鼠恒定重链。在一个 特定的实施方式中，所述小鼠包括转基因，所述转基因包含与具有转录活性的启动子（例 如R0SA26启动子）可操作连接的嵌合的人源可变/大鼠或小鼠恒定轻链基因。在进一步 特定的实施方式中，在小鼠生殖细胞系中的所述嵌合的人源/小鼠或大鼠轻链转基因包括 重排的人源轻链可变区序列。
[0027] 在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列位于小鼠生殖细胞系的免疫球蛋白基因 座中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方式 中，所述重链基因座包括至少一个人源％、至少一个人源至少一个人源义基因区段。在 一个实施方式中，所述异位核苷酸序列位于小鼠生殖细胞系的非免疫球蛋白基因座中。在 一个实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是具有转录活性的基因座。在一个特定的实施 方式中，所述具有转录活性的基因座是R0SA26基因座。在一个实施方式中，所述异位核苷 酸序列的位置随机插入小鼠的生殖细胞系中。
[0028] 在一个方面，本申请提供了一种缺乏功能性内源性ADAM6基因的小鼠，其中所述 小鼠包括对小鼠 ADAM6功能的缺失进行补偿的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述 异位核苷酸序列使小鼠生育后代的能力与包含功能性内源ADAM6基因的野生型小鼠相当。 在一个实施方式中，所述序列使小鼠具有在小鼠的精子细胞表面形成ADAM2和/或ADAM3 和/或ADAM6复合物的能力。在一个实施方式中，所述序列使小鼠能够从小鼠子宫通过小 鼠输卵管到小鼠的卵子以使小鼠的卵子受精。
[0029] 在一个实施方式中，缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的 小鼠产生在六个月时间段内同龄和同品系的野生型小鼠至少约50 %、60 %、70 %、80 %或 90%的整窝胎仔数。
[0030] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列 的小鼠当在六个月时间段内交配时，与同龄和相同或类似品系但缺乏功能性内源性ADAM6 基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠在基本上相同的时间段和基本上相同的条件下交配 相比，产生至少约1. 5倍、约2倍、约2. 5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10 倍或者更多的后代。
[0031] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列 的小鼠在4个月或6个月的交配期内，与缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷 酸序列且交配时间段相同的小鼠相比，产生的平均窝胎仔数高至少约2倍、3倍或4倍。
[0032] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列 的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生的精子，当在交配后约5-6小时从输卵管中回 收时反映的输卵管迁移，与缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠 相比，为其至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、 至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或者更高。
[0033] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列 的小鼠，当与雌性小鼠交配时产生的精子能够在约6小时内以同野生型小鼠的精子大致相 同的效率通过子宫并且进入和通过输卵管。
[0034] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列 的小鼠，与缺乏功能性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比，在相当的时间段 内产生约1. 5倍、约2倍、约3倍或约4倍或者更多的整窝胎仔。
[0035] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括编码免疫 球蛋白的非小鼠核酸序列，其中所述非小鼠免疫球蛋白序列包括插入小鼠 ADAM6基因或者 其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白序列包 括人源免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述序列包括人源免疫球蛋白重链序列。在 一个实施方式中，所述序列包括人源免疫球蛋白轻链序列。在一个实施方式中，所述序列包 括一个或多个V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段；在一个实施方 式中，所述序列包括一个或多个V基因区段和一个或多个J基因区段。在一个实施方式中， 所述一个或多个V、D和J基因区段或者一个或多个V和J基因区段是未经重排的。在一个 实施方式中，所述一个或多个V、D和J基因区段，或者一个或多个V和J基因区段是经过重 排的。在一个实施方式中，在一个或多个V、D和J基因区段或者一个或多个V和J基因区 段重排后，所述小鼠在其基因组中包括至少一个编码小鼠 ADAM6基因或者其同源物或直系 同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，重排后所述小鼠在其基因组中包括 至少两个编码小鼠 ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一 个实施方式中，重排后所述小鼠在其基因组中包括至少一个编码小鼠 ADAM6基因或者其同 源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在B细胞中包 括ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方式中，所述小鼠在 非B细胞中包括ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。
[0036] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自内源性小鼠免疫球蛋白 重链基因座的人源免疫球蛋白重链可变区或其功能性片段，其中所述小鼠包括在雄性小鼠 中具有功能的ADAM6活性。
[0037] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性ADAM6基因座包括单一未经修饰的内 源性ADAM6等位基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段。
[0038] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠包括编码具有ADAM6功能的蛋白的异位小鼠 ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。
[0039] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在小鼠基因组中的一个位置包括ADAM6序列或 者其同源物或直系同源物或功能性片段，该位置大致在内源性小鼠 ADAM6等位基因的位 置，例如V基因区段序列的3'端和初始D基因区段的5'端。
[0040] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在编码免疫球蛋白可变基因区段的核酸序列的 上游、下游或者上游和下游（相对于ADAM6序列的转录方向）的翼侧包括ADAM6序列或者 其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白可变基 因区段是人源基因区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变基因区段是人源基因区 段，并且在小鼠中具有功能的编码小鼠 ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的序列位 于人源V基因区段之间；在一个实施方式中，所述小鼠包括两个或多个人源V基因区段，并 且所述序列位于最后一个V基因区段和倒数第二个V基因区段之间；在一个实施方式中，所 述序列位于最后一个V基因区段和第一个D基因区段之间。
[0041] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性免疫球蛋白基因座的一个位置包括 ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段，所述位置与在野生型雄性小鼠中相 同或基本上相同。在一个特定的实施方式中，所述内源性基因座不能编码抗体的重链可变 区，其中所述可变区包括或来源于内源性非人源基因区段。在一个特定的实施方式中，所述 内源性基因座位于雄性小鼠基因组中的一个位置上，这使其不能编码抗体的重链可变区。 在各种实施方式中，所述雄性小鼠包括的ADAM6序列与人源免疫球蛋白基因区段位于相同 的染色体上，并且所述ADAM6序列编码功能性ADAM6蛋白。
[0042] 在一个方面，本申请提供了一种雄性小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括无功 能的内源性ADAM6基因或者内源性ADAM6基因的缺失；其中所述小鼠的精子细胞能够进入 雌性小鼠的输卵管并且使卵子受精。
[0043] 在一个方面，本申请提供了一种雄性小鼠，所述小鼠包括功能性内源性ADAM6基 因以及内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰。在一个实施方式中，所述修饰在内源性ADAM6 基因的下游或3'端。在一个实施方式中，所述修饰使用一个或多个人源免疫球蛋白重链基 因区段来取代一个或多个内源性免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方式中，所述修饰 是在内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的上游插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因 区段。
[0044] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括降低内源性小鼠 ADAM6功能 的基因修饰，其中所述小鼠包括至少一些ADAM6的功能，所述功能由具有全部或部分功能 的内源性未经修饰的等位基因（例如杂合子）来提供，或者由编码在雄性小鼠中具有功能 的ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列表达来提供。
[0045] 在一个实施方式中，与缺乏功能性ADAM6的雄性小鼠相比，所述小鼠包括的ADAM6 功能足以使雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方式中，所述ADAM6功能由存在 编码小鼠 ADAM6或者其同源物或直系同源物或功能片段的异位核苷酸序列赋予。在一个实 施方式中，所述ADAM6功能由在内源性免疫球蛋白基因座中存在的内源性ADAM6基因赋予， 其中所述内源性免疫球蛋白基因座不能编码抗体的重链可变区。在雄性小鼠中具有功能的 ADAM6同源物或其直系同源物或片段包括使缺乏足够内源性小鼠 ADAM6活性的雄性小鼠中 观察到的产生后代能力的丧失（例如在ADAM6敲除小鼠中观察到的能力的丧失）完全或部 分恢复的那些ADAM6同源物或其直系同源物或片段。从这个意义上讲，ADAM6敲除小鼠包 括含有内源性基因座或其片段但是其不具有功能的小鼠，即根本不表达ADAM6 (ADAM6a和/ 或ADAM6b)，或者表达ADAM6 (ADAM6a和/或ADAM6b)的水平不足以支持野生型雄性小鼠的 基本的正常产生后代的能力。功能的丧失可能是由于例如对基因座结构基因（即ADAM6a 或ADAM6b编码区）或者基因座调控区（例如在ADAM6a基因的5'端序列，或者ADAM6a或 ADAM6b编码区的3'端，其中所述序列完全或部分控制ADAM6基因的转录、ADAM6RNA的表达 或者ADAM6蛋白的表达）的修饰导致的。在各种实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的其 直系同源物或同源物或片段是能够使雄性小鼠的精子（或者雄性小鼠射精中的大部分精 子细胞）进入小鼠输卵管并且使小鼠卵子受精的那些直系同源物或同源物或片段。
[0046] 在一个实施方式中，表达人源免疫球蛋白可变区或其功能性片段的雄性小鼠包括 足够的ADAM6活性，所述活性赋予了雄性小鼠通过与雌性小鼠交配产生后代的能力，并且 在一个实施方式中，当与雌性小鼠交配时所述雄性小鼠显示出的产生后代的能力为具有一 个或两个内源性未经修饰ADAM6等位基因小鼠的在一个实施方式中至少25%，在一个实施 方式中至少30%，在一个实施方式中至少40%，在一个实施方式中至少50%，在一个实施 方式中至少60%，在一个实施方式中至少70%，在一个实施方式中至少80%，在一个实施 方式中至少90%以及在一个实施方式中大致是相同的。
[0047] 在一个实施方式中，雄性小鼠表达足量的ADAM6(或者其直系同源物或同源物或 功能性片段）使得雄性小鼠的精子细胞能够进入雌性小鼠的输卵管并且使小鼠的卵子受 精。
[0048] 在一个实施方式中，ADAM6的功能由与小鼠染色体序列邻近的（contiguous)核酸 序列（例如核酸随机整合至小鼠染色体；或者位于特定位置，例如通过将核酸靶向至特定 位置例如位点特异性重组酶介导的（例如Cre-介导的）插入或同源重组）所赋予。在一 个实施方式中，ADAM6序列存在于与小鼠染色体不同的核酸上（例如ADAM6序列存在于游 离基因上，即染色体外，例如在表达构建体、载体、YAC、转移染色体等中）。
[0049] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠和细胞，其包括内源性免疫球蛋 白重链基因座的修饰，其中所述小鼠表达至少一部分免疫球蛋白重链序列，例如至少一部 分人源序列，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方式中， 所述修饰降低或消除小鼠的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述小鼠被修饰，以使得编码 ADAM6活性的两个等位基因要么不存在要么表达的ADAM6基本上不具有支持雄性小鼠正常 交配的功能。在一个实施方式中，所述小鼠还包括编码小鼠 ADAM6或者其直系同源物或同 源物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述修饰维持小鼠的ADAM6活性 并且使内源性免疫球蛋白重链基因座不能编码抗体的重链可变区。在一个特定的实施方式 中，包括染色体翻转和或转位的修饰使内源性免疫球蛋白重链可变基因区段不能重排以编 码与重链恒定区可操作连接的抗体的重链可变区。
[0050] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠和细胞，其包括内源性免疫球蛋 白重链基因座的修饰，其中所述修饰降低或消除由基因座ADAM6序列所表达的ADAM6的活 性，并且其中所述小鼠包括ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段。在各种 实施方式中，ADAM6蛋白或其片段由异位ADAM6序列编码。在各种实施方式中，ADAM6蛋白 或其片段由内源性ADAM6等位基因表达。在各种实施方式中，所述小鼠包括含有第一修饰 的第一免疫球蛋白重链等位基因，所述第一修饰降低或消除来自所述第一免疫球蛋白重链 等位基因的功能性ADAM6的表达，以及所述小鼠包括含有第二修饰的第二免疫球蛋白重链 等位基因，所述第二修饰基本上不降低或不消除来自第二免疫球蛋白重链等位基因表达的 功能性ADAM6的表达。
[0051] 在各种实施方式中，所述修饰是在内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的上游或5' 端插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段。在各种实施方式中，所述修饰保持了位 于内源性免疫球蛋白重链基因座的内源性ADAM6基因。
[0052] 在一个实施方式中，所述第二修饰位于最后一个小鼠 V基因区段的3'端（相对于 小鼠 V基因区段的转录方向）和小鼠（或嵌合的人/小鼠）免疫球蛋白重链恒定基因或其 片段（例如编码人和/或小鼠：CH1和/或铰链和/或C H2和/或Ch3的核酸序列）的5'端 (相对于恒定序列的转录方向）。
[0053] 在一个实施方式中，所述修饰是在编码第一 ADAM6等位基因的第一基因座上的第 一免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于在编码功能性ADAM6的第二基 因座上的第二免疫球蛋白重链等位基因上表达的内源性ADAM6,其中所述第二免疫球蛋白 重链等位基因包括至少一个V、D和/或J基因区段的修饰。在一个特定的实施方式中，至 少一个V、D和或J基因区段的修饰是将其缺失，使用人源V、D和/或J基因区段取代，使用 骆驼V、D和/或J基因区段取代，使用人源化或骆驼源化V、D和/或J基因区段取代，使用 轻链序列取代重链序列，及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个修饰是将一个或多个 重链V、D和/或J基因区段缺失并且在重链基因座使用一个或多个轻链V和/或J基因区 段（例如人源轻链V和/或J基因区段）取代。
[0054] 在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和 第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于小鼠生殖细胞 系中非免疫球蛋白基因座中异位ADAM6的表达。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球 蛋白基因座是R0SA26基因座。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座在生殖 组织中具有转录活性。
[0055] 在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和 第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于小鼠生殖细胞 系中的内源性ADAM6基因。在一个特定的实施方式中，所述内源性ADAM6基因与小鼠免疫 球蛋白基因区段是峨邻（juxtapose)的。
[0056] 在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和 第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于在第一免疫球 蛋白重链等位基因上异位ADAM6序列的表达。在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因 座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且 所述ADAM6功能或活性来自于在第二免疫球蛋白重链等位基因上异位ADAM6的表达。
[0057] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括杂合或纯合的ADAM6敲除。在 一个实施方式中，所述小鼠还包括修饰的免疫球蛋白序列，所述序列是人源或人源化的免 疫球蛋白序列，或者骆驼或骆驼源化的人源或小鼠免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所 述经修饰的免疫球蛋白序列存在于内源性重链免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所 述经修饰的免疫球蛋白序列在内源性重链免疫球蛋白基因座上包括人源重链可变基因序 列。在一个实施方式中，所述人源重链可变基因序列在内源性免疫球蛋白重链基因座上取 代内源性重链可变序列。
[0058] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠不能由内源性小鼠 ADAM6基因座 表达功能性内源性小鼠 ADAM6。在一个实施方式中，所述小鼠包括在小鼠中具有功能的异位 核酸序列，所述序列编码ADAM6或其功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述异位核酸 序列编码的蛋白挽救ADAM6敲除纯合子雄性小鼠显示出的产生后代能力的丧失。在一个特 定的实施方式中，所述异位核酸序列编码小鼠 ADAM6蛋白。
[0059] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座， 并且包括使其具有小鼠 ADAM6功能的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列包 括内源性小鼠 ADAM6序列或其功能性片段。在一个实施方式中，所述内源性小鼠 ADAM6序 列包括在野生型小鼠3' -端小鼠免疫球蛋白重链V基因区段（VH)和5' -端小鼠免疫球蛋 白重链D基因区段（DH)之间的ADAM6a-和ADAM6b-编码序列。
[0060] 在一个实施方式中，核酸序列包括编码小鼠 ADAM6a或其功能性片段的序列和/或 编码小鼠 ADAM6b或其功能性片段的序列，其中ADAM6a和/或ADAM6b或其功能性片段与启 动子可操作地连接。在一个实施方式中，所述启动子是人源启动子。在一个实施方式中，所 述启动子是小鼠 ADAM6启动子。在一个特定的实施方式中，所述ADAM6启动子包括位于与 小鼠5' -端DH基因区段最接近的第一 ADAM6基因的第一密码子和5' -端DH基因区段的重 组信号序列之间的序列，其中以5'端是相对于小鼠免疫球蛋白基因的转录方向而言。在一 个实施方式中，所述启动子是病毒启动子。在一个特定的实施方式中，所述病毒启动子是巨 细胞病毒（CMV)启动子。在一个实施方式中，所述启动子是泛素启动子。
[0061] 在一个实施方式中，所述启动子是可诱导的启动子。在一个实施方式中，所述可诱 导的启动子在非生殖组织中调控表达。在一个实施方式中，所述可诱导的启动子在生殖组 织中调控表达。在一个特定的实施方式中，小鼠 ADAM6a和/或ADAM6b序列或其功能性片 段的表达受到可诱导的启动子在生殖组织中的发育调控。
[0062] 在一个实施方式中，所述小鼠 ADAM6a和/或ADAM6b选自SEQ ID NO: 1所示的 ADAM6a和/或SEQ ID勵:2所示的40八11613序列。在一个实施方式中，所述小鼠40416启 动子是SEQ ID N0:3所示的启动子。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 ADAM6启动子包 括ADAM6a的第一密码子直接上游（相对于ADAM6a的转录方向）的SEQ ID N0:3所示的核 酸序列并且延伸至ADAM6编码区上游SEQ ID N0:3的末端。在另一个特定实施方式中，所 述ADAM6启动子是由ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸以内延伸至ADAM6a起 始密码子上游约0. 5kb、lkb、2kb或3kb或者更大的片段。
[0063] 在一个实施方式中，当将包括SEQ ID N0:3或其片段的核酸序列置于由于缺乏 ADAM6而不育或生育能力降低的小鼠中时，小鼠的生育能力改善或生育能力大约恢复至野 生型生育能力。在一个实施方式中，SEQ ID N0:3或其片段使雄性小鼠具有产生能够进入 雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力。
[0064] 在一个实施方式中，所述核酸序列是编码ADAM6基因或其同源物或直系同源物或 功能性片段的任意序列，当将其置于或保持在小鼠中时，产生的生育能力水平与野生型小 鼠相同或相当。示例性的生育能力水平可以由雄性小鼠产生能够进入雌性小鼠的输卵管以 使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力所证实。
[0065] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码ADAM6蛋白的内源性核 苷酸序列的缺失，内源性小鼠 VH基因区段被人源VH基因区段的取代，以及编码在雄性小鼠 中具有功能的小鼠 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
[0066] 在一个实施方式中，所述小鼠包括免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包括含有 内源性ADAM6基因的内源性免疫球蛋白基因座核苷酸序列的缺失，其包括编码一个或多个 人源免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列，并且其中编码小鼠 ADMA6蛋白的异位核苷酸序列 在编码一个或多个人源免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。
[0067] 在一个实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的内源性乂11基因区段被编码 一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列取代，并且编码小鼠 ADMA6蛋白的异位核苷酸序 列在编码一个或多个人源￥11基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。在一个实施方式中，所 述小鼠还包括在内源性D H基因座的一个或多个内源性DH基因区段被一个或多个人源DH基 因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性J H基因座的一个或多个内源性 JH基因区段被一个或多个人源JH基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠包括全部或 基本上全部内源性V H、DH和JH基因区段并且在内源性VH、DH和J H基因座上被人源VH、DH和 JH基因区段取代，其中所述小鼠包括编码小鼠 ADAM6蛋白的异位序列。在一个实施方式中， 所述小鼠包括在内源性免疫球蛋白重链基因座插入人源VH、义基因区段，其中所述小 鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6基因。在一个特定的实施方式中，编码小鼠 ADAM6蛋白 的异位序列位于人源VH基因区段3' -端倒数第二个VH基因区段与人源VH基因区段的3' 端最后一个VH基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部 小鼠％基因区段的缺失，和全部或基本上全部人源￥ 11基因区段的取代，并且编码小鼠 ADAM6 蛋白的异位核苷酸序列位于人源基因区段VHl-2的下游和人源基因区段￥116-1的上游。 [0068] 在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的内源性乂 11基因区段 被编码一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列取代，并且编码小鼠 ADAM6蛋白的异位核 苷酸序列在编码一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。
[0069] 在一个实施方式中，编码小鼠 ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠基因组中 的转基因上。在一个实施方式中，编码小鼠 ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠中的 染色体外。
[0070] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括内源性免疫球蛋白重链基因 座的修饰，其中所述小鼠表达一种B细胞，所述B细胞包括与重链恒定区基因序列可操作地 连接的经重排的免疫球蛋白序列，并且所述B细胞在其基因组（例如在B细胞的染色体上） 中包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的基因。在一 个实施方式中，与重链恒定区基因序列可操作地连接的经重排的免疫球蛋白序列包括人源 重链V、D和/或J序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人源或小鼠轻链V和/或J序列。在 一个实施方式中，重链恒定区基因序列包括选自C H1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或小鼠 重链序列。
[0071] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括功能沉默的内源性免疫球蛋 白重链可变基因座，其中在小鼠中维持了 ADAM6的功能，并且所述小鼠还包括在一个或多 个小鼠重链恒定区上游或5'端插入一个或多个人源免疫球蛋白基因区段。在一个实施方式 中，所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括一个或多个人源％基因区段、一个或多 个人源D H基因区段和一个或多个人源JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠还 包括功能沉默的内源性轻链基因座，其中所述小鼠包括的ADAM6活性与野生型小鼠相同或 相当，并且所述小鼠还包括在小鼠轻链恒定区上游或5'端插入一个或多个人源λ轻链基 因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括12个人源νλ基因区段和一 个或多个人源JA基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括12个人 源νλ基因区段和4个人源JA基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段 包括28个人源νλ基因区段和一个或多个人源JA基因区段。在一个实施方式中，所述人 源λ轻链基因区段包括28个人源V λ基因区段和4个人源J λ基因区段。在一个实施方 式中，所述人源λ轻链基因区段包括40个人源νλ基因区段和一个或多个人源JA基因 区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括40个人源νλ基因区段和4个 人源JX基因区段。在各种实施方式中，所述4个人源JX基因区段包括JX1、JA2、JA3 和JA 7。在各种实施方式中，所述小鼠轻链恒定区是小鼠 Ck或小鼠以。
[0072] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括功能沉默的 免疫球蛋白轻链基因，并且还包括一个或多个内源性免疫球蛋白轻链可变区基因区段被 一个或多个人源免疫球蛋白重链可变区基因区段取代，其中所述小鼠缺乏功能性内源性 ADAM6基因座，并且其中所述小鼠包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠 ADAM6蛋白或者 其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
[0073] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性小鼠 ADAM6基 因座或序列，并且包括编码小鼠 ADAM6基因座或者小鼠 ADAM6基因座或序列的功能性片段 的异位核苷酸序列，其中所述小鼠能够与相反性别的小鼠交配以产生包括异位ADAM6基因 座或序列的后代。在一个实施方式中，所述小鼠是雄性的。在一个实施方式中，所述小鼠是 雌性的。
[0074] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性小鼠免 疫球蛋白重链可变区基因座上包括人源免疫球蛋白重链可变区基因区段，所述小鼠在内源 性小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座上缺乏内源性功能性ADAM6序列，并且其中所述小鼠 包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的 异位核苷酸序列。
[0075] 在一个实施方式中，表达小鼠 ADAM6蛋白的异位核苷酸序列是染色体外的。在一 个实施方式中，表达小鼠 ADAM6蛋白的异位核苷酸序列整合至小鼠基因组的一个或多个基 因座上。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个基因座包括免疫球蛋白基因座。
[0076] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自经修饰的内源性小鼠免 疫球蛋白重链基因座的免疫球蛋白重链序列，其中所述重链来源于人源V基因区段、D基因 区段和J基因区段，其中所述小鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6活性。
[0077] 在一个实施方式中，所述小鼠包括多个人源V基因区段、多个D基因区段和多个J 基因区段。在一个实施方式中，所述D基因区段是人源D基因区段。在一个实施方式中，所 述J基因区段是人源J基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠还包括人源化的重链恒定 区序列，其中所述人源化包括取代选自C H1、铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在一个特定的 实施方式中，所述重链来源于人源V基因区段、人源D基因区段、人源J基因区段、人源C H1 序列、人源或小鼠铰链序列、小鼠 CH2序列和小鼠 CH3序列。在另一个特定实施方式中，所述 小鼠还包括人源轻链恒定序列。
[0078] 在一个实施方式中，所述小鼠包括ADAM6基因，所述ADAM6基因的5'和3'翼侧是 内源性免疫球蛋白重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链 基因区段不能编码抗体的重链。在一个特定的实施方式中，小鼠的ADAM6基因在与野生型 小鼠相同的位置上，并且小鼠的内源性免疫球蛋白重链可变基因座不能重排以编码抗体的 重链。
[0079] 在一个实施方式中，所述V基因区段的5'翼侧（相对于V基因区段的转录方向） 是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。
[0080] 在一个实施方式中，所述V基因区段的3'翼侧（相对于V基因区段的转录方向） 是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。
[0081] 在一个实施方式中，所述D基因区段的5'翼侧（相对于D基因区段的转录方向） 是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。
[0082] 在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源 性小鼠重链免疫球蛋白基因座的5' -端（5' -most)D基因区段5'端和3' -端（3' -most) V基因区段3'端（相对于V基因区段的转录方向）的核苷酸序列的表达。
[0083] 在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源 性小鼠重链免疫球蛋白基因座中两个人源V基因区段之间的核苷酸序列的表达。在一个实 施方式中，所述两个人源V基因区段是人源V Hl-2基因区段和VH6-1基因区段。
[0084] 在一个实施方式中，所述核苷酸序列包括选自下组的序列：小鼠 ADAM6b序列或其 功能性片段、小鼠 ADAM6a序列或其功能性片段及其组合。
[0085] 在一个实施方式中，在两个人源V基因区段之间的核苷酸序列与人源V基因区段 位于相反的转录方向。在一个特定的实施方式中，核苷酸序列相对于ADAM6基因的转录方 向由5'至3'编码，并且ADAM6a序列之后是ADAM6b序列。
[0086] 在一个实施方式中，所述小鼠包括在人源V基因区段VH1_2和VH6_1之间的人源 ADAM6假基因序列被小鼠 ADAM6序列或其功能性片段取代。
[0087] 在一个实施方式中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列是小鼠 ADAM6序 列或其功能性片段。
[0088] 在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性小鼠 DFL16. 1基因区段（例如在针对经 修饰的内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的小鼠杂合子中）或人源DH1-1基因区段。在一 个实施方式中，由小鼠表达的免疫球蛋白重链的D基因区段来源于内源性小鼠 DFL16. 1基 因区段或人源DH1-1基因区段。
[0089] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在非重排B细胞谱系的携带 DNA的细胞中编码小鼠 ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段）的核酸序列，但 是不包括在包含重排的免疫球蛋白基因座的B细胞中编码小鼠 ADAM6(或者其同源物或直 系同源物或功能性片段）的核酸序列，其中所述编码小鼠 ADAM6 (或者其同源物或直系同源 物或功能性片段）的核酸序列出现在基因组中的位置不同于小鼠 ADAM6基因出现在野生型 小鼠中的位置。在一个实施方式中，所述编码小鼠 ADAM6 (或者其同源物或直系同源物或功 能性片段）的核酸序列全部或基本上全部存在于非重排B细胞谱系中携带DNA的细胞中； 在一个实施方式中，所述核酸序列存在于小鼠的生殖细胞中，但是不在重排B细胞的染色 体中。
[0090] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在全部或基本上全部的携带 DNA的细胞中编码小鼠 ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段）的核酸序列，所 述细胞包括含有重排的免疫球蛋白基因座的B细胞，其中所述编码小鼠 ADAM6 (或者其同源 物或直系同源物或功能性片段）的核酸序列出现在基因组中的位置不同于小鼠 ADAM6基因 出现在野生型小鼠中的位置。在一个实施方式中，所述编码小鼠 ADAM6 (或者其同源物或直 系同源物或功能性片段）的核酸序列在与重排的免疫球蛋白基因座邻近的核酸上。在一个 实施方式中，与重排的免疫球蛋白基因座邻近的核酸是染色体。在一个实施方式中，所述染 色体是在野生型小鼠中发现的染色体，并且所述染色体包括对小鼠免疫球蛋白基因座的修 饰。
[0091] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括B细胞，所述 B细胞在其基因组中包含ADAM6序列或者其直系同源物或同源物。在一个实施方式中，所述 ADAM6序列或者其直系同源物或同源物在免疫球蛋白重链基因座上。在一个实施方式中，所 述ADAM6序列或者其直系同源物或同源物在非免疫球蛋白基因座的基因座上。在一个实施 方式中，所述ADAM6序列是由异源启动子驱动的转基因。在一个特定的实施方式中，所述异 源启动子是非免疫球蛋白启动子。在一个特定的实施方式中，B细胞表达ADAM6蛋白或其 直系同源物或同源物。
[0092] 在一个实施方式中，90%或更多的小鼠 B细胞包括在小鼠中具有功能的编码 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 是雄性小鼠。
[0093] 在一个实施方式中，B细胞基因组包括含有ADAM6序列或其直系同源物或同源物 的第一等位基因和第二等位基因。在一个实施方式中，B细胞基因组包括含有ADAM6序列 或其直系同源物或同源物的第一等位基因但不包括第二等位基因。
[0094] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在一个或多个内源性免疫球 蛋白重链等位基因的修饰，其中所述修饰保留一个或多个内源性ADAM6等位基因，并且所 述小鼠还包括在小鼠轻链恒定区上游插入一个或多个人源νλ基因区段和一个或多个人 源JA基因区段。在各种实施方式中，所述小鼠轻链恒定区是小鼠 Ck或小鼠(：入。
[0095] 在一个实施方式中，所述修饰使小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链 包括来自至少一个重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段，并且保留了位于至少 一个内源性免疫球蛋白重链等位基因中的内源性ADAM6等位基因。
[0096] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来 自至少一个内源性免疫球蛋白重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段，并且所述 小鼠表达来自内源性ADAM6等位基因的ADAM6蛋白。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自两个内源性免疫球蛋白重链等位基因 的、经重排的内源性重链基因区段的功能性重链，并且所述小鼠表达来自一个或多个内源 性ADAM6等位基因的ADAM6蛋白。
[0097] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性重链等位基因的功能性重 链，并且所述小鼠包括位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游（相对于小鼠重链基因座 转录的方向）1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110 或 120 或者更多个Mbp 内 的功能性ADMA6等位基因。在一个特定的实施方式中，所述功能性ADAM6等位基因在内源 性免疫球蛋白重链基因座上（例如在基因间的V-D区、在两个V基因区段之间、在V与D基 因区段之间、在D与J基因区段之间等）。在一个特定的实施方式中，所述功能性ADAM6等 位基因位于最后一个小鼠 V基因区段与第一个小鼠 D基因区段之间90至100kb的基因间 序列中。
[0098] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在一个或多个内源性ADAM6 等位基因的修饰。
[0099] 在一个实施方式中，所述修饰使小鼠不能表达来自一个或多个内源性ADAM6等位 基因中的至少一个功能性ADAM6蛋白。在一个特定的实施方式中，所述小鼠不能表达来自 各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白。
[0100] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性 ADAM6蛋白，并且所述小鼠包括异位ADAM6序列。
[0101] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性 ADAM6蛋白，并且所述小鼠包括位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游（相对于小鼠重 链基因座转录的方向）1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110 或 120 或者更多 个kb内的异位ADMA6序列。在一个特定的实施方式中，所述异位ADAM6序列在内源性重链 基因座上（例如在基因间的V-D区、在两个V基因区段之间、在V与D基因区段之间、在D与 J基因区段之间等）。在一个特定的实施方式中，所述异位ADAM6序列位于最后一个小鼠 V 基因区段与第一个小鼠 D基因区段之间的90至100kb的基因间序列中。在另一个特定实 施方式中，内源性90至100kb基因间V-D序列被除去，并且异位ADAM6序列位于最后一个 V与第一个D基因区段之间。
[0102] 在一个方面，本申请提供了一种不具有生育能力的小鼠，其中所述小鼠包括两个 或更多个内源性ADAM6等位基因的缺失。在一个方面，本申请提供了一种携带雄性不育性 状的雌性小鼠，其中所述雌性小鼠在其生殖细胞系中包括无功能的ADAM6等位基因或内源 性ADAM6等位基因的敲除。
[0103] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括内源性免疫球蛋白重链V、 D和或J基因区段，其不能重排以编码抗体的重链，其中大部分的小鼠 B细胞包括功能性 ADAM6基因。在各种实施方式中，大部分的小鼠 B细胞还包括在小鼠免疫球蛋白轻链恒定 区上游的一个或多个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在一个实施方式 中，所述小鼠的免疫球蛋白轻链恒定区选自小鼠 Ck和小鼠 CA。
[0104] 在一个实施方式中，所述小鼠包括完好的内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区 段，其不能重排以编码抗体的功能性重链。在一个实施方式中，所述小鼠包括至少1个和至 多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段及 其组合；其中所述至少1个和至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至 少1个和至多4个J基因区段不能重排以编码抗体的重链可变区。在一个特定的实施方式 中，所述小鼠包括位于完好的内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段中的功能性ADAM6 基因。在一个实施方式中，所述小鼠包括含有内源性ADAM6基因座的内源性重链基因座，其 中所述内源性重链基因座包括89个V基因区段、13个D基因区段和4个J基因区段，其中 所述内源性重链基因区段不能重排以编码抗体的重链可变区并且ADAM6基因座编码在小 鼠中具有功能的ADAM6蛋白。
[0105] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏内源性免疫球蛋白重链V、D 和J基因区段，其中大部分的小鼠 B细胞包括ADAM6序列或其直系同源物或同源物。在一 个实施方式中，大部分的小鼠 B细胞表达包括人源λ可变结构域和内源性免疫球蛋白轻链 恒定区的免疫球蛋白轻链。
[0106] 在一个实施方式中，所述小鼠缺乏选自下组的内源性免疫球蛋白重链基因区段： 两个或多个V基因区段、两个或多个D基因区段、两个或多个J基因区段及其组合。在一个 实施方式中，所述小鼠缺乏选自下组的免疫球蛋白重链基因区段：至少1个至至多89个V 基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段及其组合。在 一个实施方式中，所述小鼠缺乏来自染色体12的基因组DNA片段，其包含约3百万碱基的 内源性免疫球蛋白重链基因座。在一个特定的实施方式中，所述小鼠缺乏全部功能性的内 源性重链V、D和J基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠缺乏89个V H基因区段、 13个DH基因区段和4个JH基因区段。
[0107] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中所述小鼠在其生殖细胞系中具有包括 免疫球蛋白重链基因座修饰的基因组，其中对免疫球蛋白重链基因座的修饰包括使用一个 或多个非小鼠免疫球蛋白可变区序列来取代一个或多个小鼠免疫球蛋白可变区序列，并且 其中所述小鼠包括编码小鼠 ADAM6蛋白的核酸序列。在一个优选的实施方式中，免疫球蛋 白重链基因座的〇11和义序列以及至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或 至少80个V H序列被非小鼠免疫球蛋白可变区序列取代。在进一步优选的实施方式中，免疫 球蛋白重链基因座的DH、J H和全部VH序列被非小鼠免疫球蛋白可变区序列取代。所述非小 鼠免疫球蛋白可变区序列可以是未经重排的。在一个优选的实施方式中，所述非小鼠免疫 球蛋白可变区序列包括非小鼠物种的全部未经重排的J H区以及至少3个、至少10个、 至少20个、至少40个、至少60个或至少80个未经重排的VH序列。在进一步优选的实施 方式中，所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列包括非小鼠物种的全部的可变区，包括全部VH、 DH和JH区。所述非小鼠物种可以是智人（Homo sapiens)并且所述非小鼠免疫球蛋白可变 区序列可以是人源序列。
[0108] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达包括至少一个人源可变结构 域/非人源恒定结构域免疫球蛋白多肽的抗体，其中所述小鼠表达来自不同于免疫球蛋白 基因座的基因座的小鼠 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物。
[0109] 在一个实施方式中，所述ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物在小鼠的B细胞 中表达，其中所述B细胞包括重排的免疫球蛋白序列，其包含人源可变序列和非人源恒定 序列。
[0110] 在一个实施方式中，所述非人源恒定序列是哨齿动物序列。在一个实施方式中，所 述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
[0111] 在一个方面，本申请提供了一种制备不育雄性小鼠的方法，所述方法包括使供体 ES细胞内源性ADAM6等位基因无功能（或敲除所述等位基因），将供体ES细胞引入宿主胚 胎，将所述宿主胚胎在代孕母体中妊娠，并且使代孕母体生出全部或部分来源于所述供体 ES细胞的后代。在一个实施方式中，所述方法还包括繁殖后代以获得不育的雄性小鼠。
[0112] 在一个方面，本申请提供了一种制备具有目标基因修饰的小鼠的方法，其中所述 小鼠是不育的，所述方法包括下述步骤：(a)在基因组中制备目标基因修饰；(b)修饰所述 基因组以敲除内源性ADAM6等位基因，或者使内源性ADAM6等位基因不具有功能；以及（c) 利用所述基因组以制备小鼠。在各种实施方式中，所述基因组来自ES细胞或在核转移实验 中使用。
[0113] 在一个方面，本申请提供了一种使用本申请描述的靶向载体、核苷酸构建体或细 胞制备的小鼠。
[0114] 在一个方面，本申请提供了一种将如本申请所描述的小鼠与另一种野生型或基因 修饰的小鼠交配的后代。
[0115] 在一个方面，本申请提供了一种用于保持小鼠品系的方法，其中所述小鼠品系包 括使用一个或多个异源性免疫球蛋白重链序列取代小鼠免疫球蛋白重链序列。在一个实施 方式中，所述一个或多个异源性免疫球蛋白重链序列是人源免疫球蛋白重链序列。
[0116] 在一个实施方式中，所述小鼠品系包括一个或多个小鼠 VH、DH和/或JH基因区段 的缺失。在一个实施方式中，所述小鼠还包括一个或多个人源乂 11基因区段、一个或多个人源 DH基因区段和/或一个或多个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括至少3 个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个人源V H区段，至少27个人源 DH基因区段以及至少6个义基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括与恒定区 基因可操作地连接的至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个 人源V H区段，至少27个人源DH基因区段以及至少6个JH基因区段。在一个实施方式中， 所述恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方式中，所述恒定区基因包括选自CJ、铰 链、C H2、CH3和/或CH4或其组合的小鼠恒定区基因序列。
[0117] 在一个实施方式中，所述方法包括针对小鼠免疫球蛋白重链序列取代而产生雄性 小鼠杂合子，并且使用野生型雌性小鼠或针对人源重链序列是纯合子或杂合子的雌性小鼠 来繁殖杂合雄性小鼠。在一个实施方式中，所述方法包括通过使用野生型或者针对人源重 链序列是纯合子或杂合子的雌性与杂合雄性反复繁殖以保持所述品系。
[0118] 在一个实施方式中，所述方法包括从针对人源重链序列是纯合子或杂合子的雄性 或雌性小鼠中获得细胞，并且利用这些细胞作为供体细胞或利用其核作为供体核，并且使 用所述细胞或核以制备使用宿主细胞和/或在代孕母体中将所述细胞和/或核妊娠的基因 修饰的动物。
[0119] 在一个实施方式中，将仅针对在重链基因座的取代是杂合子的雄性小鼠与雌性小 鼠交配。在一个特定的实施方式中，所述雌性小鼠相对于取代的重链基因座是纯合子、杂合 子或野生型。
[0120] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用异源性免疫球蛋白轻链序列取代在内源 性免疫球蛋白轻链基因座的λ和/或 K轻链可变序列。在一个实施方式中，所述异源性 免疫球蛋白轻链序列是人源免疫球蛋白λ和/或Κ轻链可变序列。
[0121] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括在不同于内源性免疫球蛋白基因座的基因座 上的转基因，其中所述转基因包括一种序列，所述序列编码与免疫球蛋白轻链恒定区序列 可操作地连接（针对未经重排的）或融合（针对重排的）的经重排的或未经重排的异源性 λ或κ轻链序列（例如未经重排的\和未经重排的叉或者重排的VJ)。在一个实施方式 中，所述异源性λ或κ轻链序列是人源的。在一个实施方式中，所述恒定区序列选自啮齿 动物、人源和非人灵长类。在一个实施方式中，所述恒定区序列选自小鼠、大鼠和仓鼠。在 一个实施方式中，所述转基因包括驱动轻链序列表达的非免疫球蛋白启动子。在一个特定 的实施方式中，所述启动子是转录活化的启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是 R0SA26启动子。
[0122] 在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括上游同源臂和 下游同源臂，其中所述上游同源臂包括与人源免疫球蛋白重链可变区序列相同或基本上相 同的序列，所述下游同源臂包括与人源或小鼠免疫球蛋白可变区序列相同或基本上相同的 序列，并且在所述上游和下游同源臂之间排列的是包括编码小鼠 ADAM6蛋白的核苷酸序列 的序列。在一个特定的实施方式中，所述编码小鼠 ADAM6基因的序列与小鼠启动子可操作 地连接，在野生型小鼠中通过其与小鼠 ADAM6连接。
[0123] 在一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体包括（a)与人源可变区 基因区段的核苷酸序列相同或基本上相同的核苷酸序列；以及（b)编码在小鼠中具有功能 的小鼠 ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的核苷酸序列。
[0124] 在一个实施方式中，所述靶向载体还包括与编码小鼠 ADAM6的序列可操作地连接 的启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是小鼠 ADAM6启动子。
[0125] 在一个方面，本申请提供了一种用于修饰小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的核苷 酸构建体，其中所述构建体包括至少一个位点特异性重组酶识别位点和编码在小鼠中具有 功能的小鼠 ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的序列。
[0126] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠细胞和小鼠胚胎，包括但不限于ES细胞、多 能干细胞和诱导性多能干细胞，其包括如上文所描述的基因修饰。本申请提供了 XX细胞和 XY细胞。本申请还提供了包括含有如本申请所述修饰的核的细胞，例如通过原核注射引入 细胞的修饰。本申请还提供了包括通过病毒引入的ADAM6基因的细胞、胚胎和小鼠,例如包 括含有在小鼠中具有功能的ADAM6基因的转导构建体的细胞、胚胎和小鼠。
[0127] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠细胞，其中所述细胞缺乏功能性 内源性小鼠 ADAM6基因座，并且所述细胞包括编码小鼠 ADAM6蛋白或其功能性片段的异位 核苷酸序列。在一个实施方式中，所述细胞还包括内源性免疫球蛋白重链可变基因序列的 修饰。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰包括选 自下组的缺失：小鼠 VH基因区段缺失、小鼠 DH基因区段缺失、小鼠 JH基因区段缺失及其组 合。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括使用人源免疫球蛋白序列取代一个或多个小 鼠免疫球蛋白V H、DH和/或JH序列。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列 选自人源V H、人源 '、人源DH、人源JH、人源1及其组合。
[0128] 在一个实施方式中，所述细胞是全能干细胞、多能干细胞或诱导性多能干细胞。在 一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠 ES细胞。
[0129] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠 B细胞，其中所述小鼠 B细胞包括重排的免 疫球蛋白重链基因，其中所述B细胞在B细胞染色体上包括编码在雄性小鼠中具有功能的 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠 B 细胞包括核酸序列的两个等位基因。
[0130] 在一个实施方式中，所述核酸序列在与重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座邻近的 核酸分子（例如B细胞染色体）上。
[0131] 在一个实施方式中，所述核酸序列在与包括重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座的 核酸分子不同的核酸分子（例如B细胞染色体）上。
[0132] 在一个实施方式中，所述小鼠 B细胞包括与小鼠或人源免疫球蛋白恒定区基因可 操作地连接的经重排的非小鼠免疫球蛋白可变基因序列，其中所述B细胞包括编码在雄性 小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
[0133] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠体细胞，所述细胞包括含有经修饰的免疫球 蛋白重链基因座的染色体，以及编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或者其直系同源物和 或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列与经修饰的免疫球蛋白重 链基因座在相同的染色体上。在一个实施方式中，所述核酸序列与经修饰的免疫球蛋白重 链基因座在不同的染色体上。在一个实施方式中，所述体细胞包括单拷贝的核酸序列。在 一个实施方式中，所述体细胞包括至少两个拷贝的核酸序列。在一个特定的实施方式中，所 述体细胞是B细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是生殖细胞。在一个特定的实施 方式中，所述细胞是干细胞。
[0134] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠生殖细胞，所述细胞包括在生殖细胞的染色 体上的编码小鼠 ADAM6 (或者其同源物或直系同源物或功能性片段）的核酸序列，其中编码 小鼠 ADAM6 (或者其同源物或直系同源物或功能性片段）的核酸序列在染色体上的位置与 其在野生型小鼠生殖细胞染色体上的位置不同。在一个实施方式中，所述核酸序列在小鼠 免疫球蛋白基因座上。在一个实施方式中，所述核酸序列与小鼠免疫球蛋白基因座在生殖 细胞相同的染色体上。在一个实施方式中，所述核酸序列与小鼠免疫球蛋白基因座在生殖 细胞不同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白基因座包括使用至少一个 非小鼠免疫球蛋白序列来取代至少一个小鼠免疫球蛋白序列。在一个特定的实施方式中， 所述至少一个非小鼠免疫球蛋白序列是人源免疫球蛋白序列。
[0135] 在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述小鼠的多能、诱导多能或全能干 细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠胚胎干（ES)细胞。
[0136] 在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织。在一个实施 方式中，所述细胞或组织来源于如本申请所述小鼠的脾脏、淋巴结或骨髓。在一个实施方式 中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞。在一个实施方式中， 所述细胞是生殖细胞。
[0137] 在一个实施方式中，所述组织选自结缔、肌肉、神经和上皮组织。在一个特定的实 施方式中，所述组织是生殖组织。
[0138] 在一个实施方式中，分离来源于如本申请所述小鼠的细胞和/或组织以用于一项 或多项间接体内检测。在各种实施方式中，所述一项或多项间接体内检测包括物理、热、电、 机械或光学性质检测，外科手术，不同组织类型相互作用的检测，影像技术显影或其组合。
[0139] 在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织来制备抗 体的用途。在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织来制备 杂交瘤或四价体杂交瘤（quadroma)的用途。
[0140] 在一个方面，非人源细胞包括如本申请所述非人动物的染色体或其片段。在一个 实施方式中，所述非人源细胞包括如本申请所述非人动物的核。在一个实施方式中，所述非 人源细胞包括核转移所得到的染色体或其片段。
[0141] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述小鼠的核。在一个实施方式 中，所述核来自非B细胞的二倍体细胞。
[0142] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的编码免疫球蛋白可变区 的核苷酸序列。
[0143] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的抗体的免疫球蛋白重链 或免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列。
[0144] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的编码抗体可变区的免疫 球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
[0145] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的抗体或其抗原结合片段 (例如 Fab、F(ab)2、scFv)。
[0146] 在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用 一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段来取代小鼠内源性ADAM6基因座上游（相对于免 疫球蛋白重链基因区段的转录方向）的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，并且使用一 个或多个人源免疫球蛋白重链或轻链基因区段来取代小鼠 ADAM6基因座下游（相对于免疫 球蛋白重链基因区段的转录方向）的一个或多个免疫球蛋白基因区段。在一个实施方式 中，将小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的 所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括V基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内 源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述人源免 疫球蛋白基因区段包括V和D基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座 下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋 白基因区段包括J基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个 或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段 包括D和J基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个 内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括V、D 和J基因区段。
[0147] 在一个实施方式中，所述ADAM6基因上游和/或下游的一个或多个免疫球蛋白重 链基因区段在多能、诱导多能或全能干细胞中被取代，以形成基因修饰的祖细胞；经所述基 因修饰的祖细胞被引入宿主；并且将包括所述基因修饰的祖细胞的宿主进行妊娠以形成某 种小鼠，所述小鼠包括来源于基因修饰的祖细胞的基因组。在一个实施方式中，所述宿主是 胚胎。在一个特定的实施方式中，所述宿主选自小鼠的桑葚胚（例如8或4细胞期）、四倍 体胚胎、胚胎细胞聚集物或胚泡。
[0148] 在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用 包括人免疫球蛋白基因区段的序列来取代包括小鼠免疫球蛋白基因区段和小鼠 ADAM6(或 者在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段）核苷酸序列的小鼠核苷酸序 列以形成第一嵌合基因座，然后将包括小鼠 ADAM6编码序列（或者编码其直系同源物或同 源物或功能性片段的序列）的序列插入包括所述人源免疫球蛋白基因区段的序列以形成 第二嵌合基因座。
[0149] 在一个实施方式中，所述第二嵌合基因座包括人源免疫球蛋白重链可变（VH)基因 区段。在一个实施方式中，所述第二嵌合基因座包括人源免疫球蛋白轻链可变（')基因区 段。在一个特定的实施方式中，所述第二嵌合基因座包括与人源D H基因区段和人源JH基 因区段可操作地连接的人源％基因区段或人源'基因区段。在进一步特定的实施方式中， 所述第二嵌合基因座与第三嵌合基因座可操作地连接，所述第三嵌合基因座包括与小鼠 CH2+CH3序列融合的人源CH1序列或者人源CH1和人源铰链序列。
[0150] 在一个方面，本申请提供了使用包括含有小鼠 ADAM6基因座或序列的异位核苷酸 序列的小鼠来制备具有生育能力的雄性小鼠的用途，其中所述用途包括将包括含有小鼠 ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠与缺乏功能性内源性小鼠 ADAM6基因座或序 列的小鼠进行交配，并且获得能产生具有异位ADAM6基因座或序列的后代的雌性后代或包 括异位ADAM6基因座或序列的雄性后代，并且所述雄性显示出的生育能力与野生型雄性小 鼠显示出的生育能力大致相同。
[0151] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备免疫球蛋白可变区核苷 酸序列的用途。
[0152] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备全人源Fab或全人源 F(ab)2的用途。
[0153] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备永生化细胞系的用途。
[0154] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备杂交瘤或四价体杂交瘤 的用途。
[0155] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备包含人源重链可变区和 人源轻链可变区的噬菌体文库的用途。
[0156] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗体的可 变区序列的用途，包括（a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，（b)从（a)中经免 疫的小鼠中来分离淋巴细胞，（c)将所述淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，（d)鉴定能 够与目标抗原结合的淋巴细胞，以及（e)扩增来自所述淋巴细胞的一个或多个可变区核酸 序列以产生可变区序列。
[0157] 在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的脾脏。在一个实施方式中，所述淋 巴细胞来源于小鼠的淋巴结。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的骨髓。
[0158] 在一个实施方式中，所述标记抗体是荧光团偶联的抗体。一个实施方式中，所述一 种或多种荧光团偶联的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
[0159] 在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。
[0160] 在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链可变区序列。在一 个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含轻链可变区序列。在一个特定实施方 式中，所述轻链可变区序列是免疫球蛋白κ轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述一 个或多个可变区核酸序列包含重链和κ轻链可变区序列。
[0161] 在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人 源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括（a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述 的小鼠，（b)从（a)中经免疫的小鼠中来分离脾脏，（c)将来自于脾脏的B淋巴细胞与一种 或多种标记抗体接触，（d)鉴定（c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及（e)从B淋 巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区 序列。
[0162] 在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人 源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括（a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述 的小鼠，（b)从（a)中经免疫的小鼠中来分离一个或多个淋巴结，（c)将来自于一个或多个 淋巴结的B淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，（d)鉴定（c)中能够与目标抗原结合的 B淋巴细胞，以及（e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列 以产生重链和κ轻链可变区序列。
[0163] 在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人 源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括（a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述 的小鼠，（b)从（a)中经免疫的小鼠中来分离骨髓，（c)将来自于骨髓的B淋巴细胞与一种 或多种标记的抗体接触，（d)鉴定（c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及（e)从B 淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变 区序列。在各种实施方式中，所述一种或多种标记抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
[0164] 在各种实施方式中，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗 体的重链和κ轻链可变区序列的用途，所述用途还包括将经扩增的重链和轻链可变区序 列与人源重链和轻链恒定区序列融合，在细胞中表达融合的重链和轻链序列，并且回收所 表达的重链和轻链序列以产生人源抗体。
[0165] 在各种实施方式中，所述人源重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在各种 特定实施方式中，所述IgG选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在各种实施方式中，所述人源重 链恒定区包含C H1、铰链、CH2、CH3、CH4或其组合。在各种实施方式中，所述重链恒定区是免 疫球蛋白κ恒定区。在各种实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细 胞、MCF-7 细胞、MDA-MB-438 细胞、PC3 细胞、T47D 细胞、THP-1 细胞、U87 细胞、SHSY5Y (人 神经母细胞瘤）细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CH0细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细 胞（例如PER. C6?细胞）和MC3T3细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是CH0细胞。
[0166] 在一个方面，本申请提供了 一种产生特异性针对目标抗原的反向嵌合啮齿动 物-人源抗体的方法，所述方法包括步骤：使用所述抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，从 产生特异性针对所述抗原的反向嵌合小鼠-人源抗体的小鼠中分离至少一种细胞，培养产 生所述特异性针对所述抗原的反向嵌合小鼠-人源抗体的至少一种细胞，并且获得所述抗 体。
[0167] 在一个实施方式中，所述反向-嵌合小鼠-人源抗体包含与小鼠或大鼠重链恒定 基因融合的人源重链可变结构域，以及与小鼠或大鼠或人源轻链恒定基因融合的人源轻链 可变结构域。
[0168] 在一个实施方式中，培养至少一种产生特异性针对抗原的反向嵌合啮齿动物-人 源抗体的细胞是在从小鼠分离的至少一种细胞产生的至少一种杂交瘤细胞上进行。
[0169] 在一个方面，本申请提供了一种用于产生特异性针对目标抗原的全人源抗体的方 法，所述方法包括步骤：使用所述抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，从产生特异性针对所 述抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠中分离至少一种细胞，产生至少一种生产来 源于特异性针对所述抗原的反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的全人源抗体的细胞，并且培 养至少一种生产所述全人源抗体的细胞，并且获得所述全人源抗体。
[0170] 在各种实施方式中，从产生特异性针对所述抗原的反向-嵌合啮齿动物-人源抗 体的小鼠分离的至少一种细胞是脾细胞或B细胞。
[0171] 在各种实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
[0172] 在各种实施方式中，使用蛋白、DNA、DNA和蛋白的组合或者表达所述抗原的细胞来 实施目标抗原的免疫。
[0173] 在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来制备编码免疫球蛋白可 变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人源抗体或 其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自下组的抗原结合蛋白：抗体、 多特异性抗体（例如双特异性抗体）、scFv、双特异性scFv、二体、三体、四体、V-NAR、Vhh、'、 F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变结构域抗原结合蛋白）、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白） 或者双特异性T细胞募召剂（Bispecific T cell Engager) (BiTE)。
[0174] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠将异位ADAM6序列引入到缺乏 功能性内源性小鼠 ADAM6序列的小鼠中的用途，其中所述用途包括将如本申请所述小鼠与 缺乏功能性内源性小鼠 ADAM6序列的小鼠交配。
[0175] 在一个方面，本申请提供了使用来自如本申请所述小鼠的遗传物质来制备具有异 位ADAM6序列的小鼠的用途。在一个实施方式中，所述用途包括使用如本申请所述小鼠的 细胞核进行核转移。在一个实施方式中，所述用途包括将如本申请所述小鼠的细胞克隆以 产生来源于所述细胞的动物。在一个实施方式中，所述用途包括在制备包括异位ADMA6序 列的小鼠的过程中利用如本申请所述小鼠的精子或卵子。
[0176] 在一个方面，本申请提供了一种制备包括经修饰的免疫球蛋白重链基因座的、具 有生育能力的雄性小鼠的方法，所述方法包括使用包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基 因或者其直系同源物或同源物或片段的第二小鼠生殖细胞将包括经修饰的内源性免疫球 蛋白重链基因座的第一小鼠生殖细胞受精；形成已受精的细胞；使已受精的细胞发育成胚 胎；并且将所述胚胎在代孕母体中妊娠以获得小鼠。
[0177] 在一个实施方式中，通过将雄性小鼠与雌性小鼠交配来完成受精。在一个实施方 式中，所述雌性小鼠包括ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方式 中，所述雄性小鼠包括ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段。
[0178] 在一个方面，本申请提供了使用编码小鼠 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物 或相应ADAM6蛋白功能性片段的核酸序列的用途，所述用途是恢复或增强具有包括免疫球 蛋白重链基因座修饰的基因组的小鼠的生育能力，其中所述修饰降低或消除内源性ADAM6 的功能。
[0179] 在一个实施方式中，所述核酸序列在异位整合至小鼠基因组。在一个实施方式中， 所述核酸序列在内源性免疫球蛋白基因座处整合至小鼠基因组。在一个特定的实施方式 中，所述内源性免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方式中，所述核酸序列在不同 于内源性免疫球蛋白基因座的位置整合至小鼠基因组。
[0180] 在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所描述的小鼠用于生产药物（例如 抗原结合蛋白），或者用于生产编码药物（例如抗原结合蛋白）可变序列的序列的用途，所 述药物用于治疗人类疾病或病症。
[0181] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠细胞，所述细胞不能表达包括经 重排的内源性免疫球蛋白重链基因区段的重链，并且所述细胞包括编码小鼠 ADAM6蛋白或 其功能性片段的功能性ADAM6基因。在一个实施方式中，所述细胞还包括人源免疫球蛋白 基因区段的插入。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白基因区段是与小鼠重链 恒定区可操作地连接的重链基因区段，以使得重排后其编码包括人源可变区的抗体的功能 性重链。
[0182] 本申请提供了基因修饰的非人动物、胚胎、细胞、组织和用于修饰非人动物的核酸 构建体，以及用于制备和使用其的方法和组合物。本申请提供了在κ轻链背景下产生λ可 变区（人源或非人源的）的动物和细胞，其中所述动物和细胞包括可消除或降低ADAM6蛋 白或者其同源物或直系同源物活性的重链免疫球蛋白基因座的修饰，其中所述动物还包括 全部或部分恢复ADAM6活性（或者其同源物或直系同源物的活性）的基因修饰。本申请提 供了具有生育能力并且表达与人源重链可变结构域具有同源性的人源λ可变结构域的小 鼠，其中在小鼠中表达的人源λ可变结构域与λ或 κ恒定区邻近，并且在各种实施方式 中，所述λ或κ可变区是内源性（例如小鼠或大鼠）恒定区。本申请还提供了在κ或λ 轻链（例如来自内源性小鼠轻链基因座）的背景下产生人源λ可变区的小鼠和细胞。本 申请还提供了用于制备包括λ可变区的抗体的方法。本申请还提供了用于选择表达与λ 可变区同源的重链的方法。
[0183] 本申请提供了嵌合的和人源抗原结合蛋白（例如抗体）以及编码其的核酸，其包 括体细胞突变的可变区，包括具有轻链的抗体，所述轻链包含来源于与小鼠轻链恒定结构 域融合的人源Vλ和人源Jλ基因区段的可变结构域。
[0184] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在包括小鼠恒定区的轻链上表达 人源λ可变区序列。在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在包括 Κ恒定区的轻 链上表达人源λ可变区序列。在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠由包括人源 λ可变区序列的内源性小鼠轻链基因座来表达。在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述 小鼠包括经重排的轻链基因，所述轻链基因包含与小鼠恒定区序列连接的人源λ可变序 列；在一个实施方式中，所述小鼠恒定区序列是λ恒定序列；在一个实施方式中，所述小鼠 恒定区序列是Κ恒定序列。
[0185] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括未经重排的 人源λ轻链可变基因区段（hvA)和人源λ连接基因区段α^λ)。在一个实施方式中，所 述未经重排的hV λ和hj λ在小鼠轻链基因座。在一个实施方式中，所述未经重排的hV λ 和未经重排的hJA在转基因上并且与人源或小鼠恒定区序列可操作地连接。在一个实施 方式中，所述未经重排的hV λ和未经重排的hj λ在游离基因上。在一个实施方式中，所述 小鼠能够制备免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括来源于未经重排的hVA序列和hJA序列 的轻链以及小鼠轻链恒定区（CJ核酸序列。本申请还提供了用于制备和使用基因修饰的 小鼠的方法和组合物。本申请提供了一种抗体，所述抗体包括（a)与小鼠重链恒定区融合 的人源重链可变结构域（hV H)，以及（b)与小鼠 Q结构域融合的人源VL;包括其中一个或多 个可变结构域是例如在本发明小鼠的抗体或免疫细胞的选择中的体细胞突变。在一个实施 方式中，所述未经重排的hV λ和未经重排的hj λ与人源或小鼠 K恒定区（Ck)可操作地 连接。在一个实施方式中，所述未经重排的hV λ和未经重排的hj λ与人源或小鼠 λ恒定 区（C λ)可操作地连接。
[0186] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系的内源性小鼠轻 链基因座中包括人源λ轻链可变区序列，其中所述人源λ可变区序列在包括小鼠免疫球 蛋白恒定区基因序列的轻链中表达。
[0187] 在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是λ基因座。在一个实施方式 中，所述内源性小鼠轻链基因座是κ基因座。
[0188] 在一个实施方式中，所述小鼠在内源性小鼠轻链基因座中缺乏内源性轻链可变序 列。
[0189] 在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠轻链可变区基因区段被一个 或多个人源λ可变区基因区段取代。
[0190] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括人源J λ序列。在一个实施 方式中，所述人源J λ序列选自下组：J λ 1、J λ 2、J λ 3、J λ 7及其组合。
[0191] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括人源轻链基因座簇Α的片 段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇A的片段由hVA3-27延伸至 hVA 3-1〇
[0192] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括人源轻链基因座簇B的片 段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇Β的片段由hVA5-52延伸至 hVA 1-40。
[0193] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括簇A的基因组片段和簇B的 基因组片段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括簇A的至少一个基因区 段和簇B的至少一个基因区段。
[0194] 在一个实施方式中，10%以上的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5_45 和9-49的至少两个hVA基因区段。在一个实施方式中，20%以上的小鼠轻链天然库来源 于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少三个1^入基因区段。在一个实施方式中，30% 以上的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少四个hVA基因区 段。
[0195] 在一个方面，本申请提供了一种表达免疫球蛋白轻链的小鼠，所述免疫球蛋白轻 链包括与小鼠恒定区融合的人源λ可变序列，其中所述小鼠显示出的 K与λ的比例为约 1:1。
[0196] 在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链由内源性小鼠轻链基因座表达。
[0197] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括与小鼠 κ轻链恒定区序列邻 近的λ轻链可变区序列（V λ)和至少一个J序列（J)。
[0198] 在一个实施方式中，所述小鼠缺乏功能性小鼠 Vk和/或小鼠 JK基因区段。
[0199] 在一个实施方式中，所述νλ是人源νλ (hVX )和所述J是人源JX (hJX )。在一 个实施方式中，所述hVA和hJA是未经重排的基因区段。
[0200] 在一个实施方式中，所述小鼠包括多个未经重排的hVA基因区段和至少一个 hJA基因区段。在一个特定的实施方式中，所述多个未经重排的hVA基因区段是至少12 个基因区段、至少28个基因区段或至少40个基因区段。
[0201] 在一个实施方式中，所述至少一个hJX基因区段选自下组：JXl、JX2、JA3、 JA 7及其组合。
[0202] 在一个实施方式中，内源性小鼠 λ轻链基因座全部或部分缺失。
[0203] 在一个实施方式中，所述小鼠 κ轻链恒定区序列是内源性小鼠 Κ轻链基因座。
[0204] 在一个实施方式中，约10%至约45%的小鼠 Β细胞表达包括轻链的抗体，所述轻 链包括人源λ轻链可变（V λ)结构域和小鼠 Κ轻链恒定（Ck)结构域。
[0205] 在一个实施方式中，所述人源λ可变结构域来源于经重排的hV λ/hj λ序列， 所述序列选自下组：3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、 2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、 1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7 和 1-51/1。
[0206] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括来自人源κ轻链基因座的人源Vk -JK基因 间区，其中所述人源Vk-JK基因间区与V λ序列和J序列邻近。在一个特定的实施方式 中，所述人源Vk-JK基因间区位于νλ序列和J序列之间。
[0207] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括（a)在内源性小鼠轻链基因 座上的至少12个至至少40个未经重排的人源λ轻链可变区基因区段和至少1个人源J λ 基因区段；(b)位于至少12个到至少40个人源轻链可变区基因区段和至少1个人源J λ序 列之间的人源Vk-JK基因间序列；其中所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包含人 源VA结构域和小鼠 Ck结构域。
[0208] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包 含λ可变序列和 K恒定序列。
[0209] 在一个实施方式中，所述小鼠显示出κ与λ的比例为约1:1。
[0210] 在一个实施方式中，来自小鼠骨髓的未成熟Β细胞群显示出的κ与λ的比例为 约 1:1。
[0211] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括与包含小鼠 Q基因的小鼠轻链基因座可操作地连接的、未经重排的免疫球蛋白νλ和JA基因区段。
[0212] 在一个实施方式中，所述νλ和/或JA基因区段是人源基因区段。在一个实施 方式中，所述νλ和/或JA基因区段是小鼠基因区段，并且所述Q是小鼠 Ck。
[0213] 在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是κ轻链基因座。在一个实施方 式中，所述内源性小鼠轻链基因座是λ轻链基因座。
[0214] 在一个实施方式中，所述未经重排的νλ和JA基因区段在内源性小鼠轻链基因 座。
[0215] 在一个实施方式中，所述未经重排的免疫球蛋白νλ和JA基因区段在转基因上。
[0216] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性小鼠重链免疫球蛋白基因座上使用 一个或多个人源V、D和/或J基因区段取代一个或多个重链V、D和/或J基因区段。
[0217] 在一个实施方式中，所述小鼠在含有小鼠 Ck基因的内源性小鼠Κ轻链基因座上 包括未经重排的免疫球蛋白νλ和JA基因区段。
[0218] 在一个实施方式中，所述小鼠在含有小鼠 CA基因的内源性小鼠 λ轻链基因座上 包括未经重排的人源免疫球蛋白λ轻链可变基因区段（νλ)和λ连接基因区段（ja)。
[0219] 在一个实施方式中，所述轻链可变基因座（"'基因座"）包括至少一个人源 νλ Οτνλ)基因区段。在一个实施方式中，所述八基因座包括至少一个人源jx 〇αλ)基 因区段。在另一个实施方式中，'基因座包括至多四个hJA基因区段。在一个实施方式 中，所述'基因座包括邻近序列，所述邻近序列包含人源λ和人源 κ基因组序列。
[0220] 在一个实施方式中，所述κ轻链可变基因座（" Κ基因座"）包括至少一个人源 νλ 〇τνλ)基因区段。在一个实施方式中，所述κ基因座包括至少一个人源jx 〇αλ)基 因区段。在一个实施方式中，所述Κ基因座包括至多四个hJA基因区段。在一个实施方式 中，所述K基因座包括至少一个hV λ和至少一个hj λ，并且缺乏或基本上缺乏功能性VK 区基因区段和缺乏或基本上缺乏功能性Jk区基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包 括无功能的Vk区基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的J K区基因区段。
[0221] 在一个实施方式中，所述λ轻链可变基因座（" λ基因座"）包括至少一个Μλ 基因区段。在一个实施方式中，所述λ基因座包括至少一个人源ja α^λ)基因区段。在 另一个实施方式中，所述λ基因座包括至多四个hJA基因区段。
[0222] 在一个实施方式中，所述'基因座包括多个hVA。在一个实施方式中，选择多 个hVA以使得表达λ轻链可变区库，反映了在人中观察到的约10%、约20%、约30%、约 40%、约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%或者更多的V λ使用。在一个实施方式 中，所述\基因座包括基因区段hVA 1-40、1-44、2-8、2-14、3-21及其组合。
[0223] 在一个实施方式中，所述hVA包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2_11和3-12。在一个 特定的实施方式中，所述八基因座包括跨距为νλ 3-12至νλ 3-1的人源λ轻链基因座的 邻近序列。在一个实施方式中，所述'基因座包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个 hVA。在一个特定的实施方式中，所述hVA包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在 一个特定的实施方式中，所述'基因座包括跨距为νλ 3-12至νλ 3-1的人源λ基因座的 邻近序列。在一个实施方式中，所述'基因座在内源性κ基因座。在一个特定的实施方式 中，所述'基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性λ轻链基因座部分或全部缺失。 在一个实施方式中，所述'基因座在内源性λ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述 '基因座在内源性λ基因座上，并且所述内源性 κ基因座部分或全部缺失。
[0224] 在一个实施方式中，所述'基因座包括13至28个或更多的hVX。在一个特定的 实施方式中，所述 hVA 包括 2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25 和 3-27。在一个 特定的实施方式中，所述κ基因座包括跨距为νλ 3-27至νλ 3-1的人源λ基因座的邻近 序列。在一个实施方式中，所述'基因座在内源性κ基因座上。在一个特定的实施方式 中，所述\基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性λ轻链基因座部分或全部缺失。 在另一个实施方式中，所述'基因座在内源性λ基因座上。在一个特定的实施方式中，所 述'基因座在内源性λ基因座上，并且所述内源性 κ基因座部分或全部缺失。
[0225] 在一个实施方式中，所述'基因座包括29至40个hV λ。在一个特定的实施方式 中，所述κ基因座包括跨距为νλ 3-29至νλ 3-1的人源λ基因座的邻近序列，以及跨距 为νλ 5-52至νλ 1-40的人源λ基因座的邻近序列。在一个特定的实施方式中，在基因修 饰小鼠中hV λ 1-40和hV λ 3-29之间的全部或基本上全部的序列基本上由hV λ 1-40基因 区段下游（在3'非翻译部分下游）天然存在的（例如在人群中）约959bp人源λ序列、 限制性酶位点（例如Pl-Scel)、后接的天然存在的hV λ 3-29基因区段上游约3, 431bp的人 源λ序列组成。在一个实施方式中，所述'基因座在内源性小鼠 κ基因座上。在一个特 定的实施方式中，所述\基因座在内源性小鼠 κ基因座上，并且所述内源性小鼠 λ轻链 基因座部分或全部缺失。在另一个实施方式中，所述'基因座在内源性小鼠 λ基因座上。 在一个特定的实施方式中，所述'基因座在内源性小鼠 λ基因座上，并且所述内源性小鼠 κ基因座的部分或全部缺失。
[0226] 在一个实施方式中，所述'基因座包括至少一个hj λ。在一个实施方式中，所述 '基因座包括多个hJA。在一个实施方式中，所述'基因座包括至少2、3、4、5、6或7个 hj λ。在一个特定的实施方式中，所述'基因座包括四个hj λ。在一个特定的实施方式中， 所述四个1^入是}^入1、}^入2、1^入3和1^入7。在一个实施方式中，所述'基因座是1^ 基因座。在一个特定的实施方式中，所述'基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性 入轻链基因座部分或全部缺失。在一个实施方式中，所述'基因座包括一个hj λ。在一个 特定的实施方式中，所述一个hJA是hJAl。在一个实施方式中，所述'基因座在内源性 κ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述'基因座在内源性κ基因座上，并且所述内 源性λ轻链基因座部分或全部缺失。在另一个实施方式中，所述'基因座在内源性λ基 因座上。在一个特定的实施方式中，所述'基因座在内源性λ基因座上，并且所述内源性 κ基因座部分或全部缺失。
[0227] 在一个实施方式中，所述'基因座包括至少一个hVA、至少一个hJA和小鼠 Ck 基因。在一个实施方式中，所述八基因座包括至少一个hVA、至少一个hJA和小鼠 CX基 因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因是CA 2。在一个特定的实施方式中，所 述小鼠 CA基因与小鼠 CA 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、 96%、97%、98%或至少 99% -致性。
[0228] 在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个hVA基因区段取代内源性小 鼠 Vk基因区段的内源性小鼠 K基因座，其中所述hVA基因区段与内源性小鼠 Ck区基 因可操作地连接，以使得小鼠重排人源νλ基因区段并且表达包括人源νλ结构域和小鼠 Ck的反向嵌合免疫球蛋白轻链。在一个实施方式中，90-100%的未经重排的小鼠 Vk基因 区段被至少一个未经重排的hVA基因区段取代。在一个特定的实施方式中，全部或基本上 全部的内源性小鼠 Vk基因区段被至少一个未经重排的hVA基因区段取代。在一个实施方 式中，所述取代是被至少12个、至少28个或至少40个未经重排的hVA基因区段取代。在 一个实施方式中，所述取代是被至少7个功能性未经重排的hV λ基因区段、至少16个功能 性未经重排的hV λ基因区段或者至少27个功能性未经重排的hV λ基因区段取代。在一个 实施方式中，所述小鼠包括用至少一个未经重排的hJA基因区段来取代全部小鼠 JK基因 区段。在一个实施方式中，所述至少一个未经重排的hJA基因区段选自JA1、JA2、JA3、 了入4、1入5、1入6、1入7及其组合。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个1^入基因区 段选自 3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、 3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、5-48、9-49、1-50、1-51、5-52hV λ 基因区段及其组 合。在一个特定的实施方式中，所述至少一个未经重排的hJA基因区段选自JA1、JA 2、 JA3、JA7及其组合。
[0229] 在一个实施方式中，所述小鼠包括使用在内源性小鼠 λ基因座的一个或多个人 源νλ基因区段来取代在内源性小鼠 λ基因座的内源性小鼠 νλ基因区段，其中所述hVA 基因区段与小鼠 CA区基因可操作地连接，以使得所述小鼠重排hVA基因区段并且表达包 括hVA结构域和小鼠 CA的反向嵌合免疫球蛋白轻链。在一个特定的实施方式中，所述小 鼠 CA基因是以2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因与小鼠以2具有至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。在一个实施方式 中，90-100%的未经重排的小鼠 νλ基因区段被至少一个未经重排的hVA基因区段取代。 在一个特定的实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠 νλ基因区段被至少一个未经 重排的hVA基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少12个、至少28个或至 少40个未经重排的hVA基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少7个功能 性未经重排的hV λ基因区段、至少16个功能性未经重排的hV λ基因区段或至少27个功 能性未经重排的hVA基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠包括用至少一个未经重 排的hJA基因区段来取代全部小鼠 JA基因区段。在一个实施方式中，所述至少一个未经 重排的hJA基因区段选自JA 1、JA2、JA3、JA4、】入5、】入6、】入7及其组合。在一个特 定的实施方式中，所述一个或多个hVA基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、 2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、卜47、 5-48、9-49、l-50、l-51、5-52hVA基因区段及其组合。在一个特定的实施方式中，所述至少 一个未经重排的hJX基因区段选自1、】入2、】入3、】入7及其组合。
[0230] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括位于内源性小鼠 κ轻链基因座的人源Vk-Jk基因间区序列。
[0231] 在一个实施方式中，所述人源Vk-Jk基因间区序列在包括hVA和hJA基因区 段的小鼠内源性κ轻链基因座上，并且所述人源Vk-J K基因间区序列位于hVA和hJA 基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述hVA和hJA基因区段能够在小鼠中重组 形成功能性人源λ轻链可变结构域。
[0232] 在一个实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括多个hVA和一个或多 个hj λ，并且所述人源V K-J K基因间区序列，相对于转录方向，位于hV λ序列的近端下游 或3'端（3' most)和第一 hj λ序列的上游或5'端。
[0233] 在一个实施方式中，所述人源V κ -J Κ基因间区是位于人源V Κ 4-1基因区段下游 约130bp或3'端、人源V κ 4-1基因区段3'端非翻译区下游约130bp的区域，并且跨距至 人源Jk 1基因区段上游约600bp或5'端。在一个特定的实施方式中，所述人源Vk-Jk 基因间区的大小约22.8kb。在一个实施方式中，所述Vk-Jk基因间区与人源Vk-Jk基 因间区具有约90%或以上、91 %或以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上或者约95% 或以上的一致性，所述人源Vk-JK基因间区由人源Vk 4-1基因区段的3'非翻译区末端 延伸至人源JkI基因区段上游约600bp。在一个实施方式中，所述Vk-JK基因间区包括 SEQ ID NO: 158。在一个特定的实施方式中，所述Vk-Jk基因间区包括SEQ ID NO: 158的 功能性区段。在一个特定的实施方式中，所述Vk-Jk基因间区是SEQ ID N0:158。
[0234] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物、非人细胞（例如ES细胞或多能干细 胞）、非人胚胎或非人组织，其包括所述人源Vk-J K基因间区序列，其中所述基因间区序 列是异位的。在一个特定的实施方式中，所述异位序列位于人源化的内源性非人源免疫球 蛋白基因座。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、牛、绵羊和非人 灵长类。
[0235] 在一个方面，本申请提供了一种分离的核酸构建体，所述核酸构建体包括所述人 源VK-J K基因间区序列。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括将人源VK-JK基因 间区序列靶向至小鼠轻链基因座的靶向臂。在一个特定的实施方式中，所述小鼠轻链基因 座是κ基因座。在一个特定的实施方式中，所述靶向臂将人源Vk-Jk基因间区靶向至经 修饰的内源性小鼠 κ基因座，其中所述靶向是靶向至hVA序列和hJA序列之间的位置。
[0236] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括不超过两个 轻链等位基因，其中所述轻链等位基因包括（a)在包括小鼠 Q基因的内源性小鼠轻链基因 座上的未经重排的免疫球蛋白人源νλ和JA基因区段；以及（b)在包括小鼠 Q基因的内 源性小鼠轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白 '和1基因区段。
[0237] 在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是κ基因座。在另一个实施方式 中，所述内源性小鼠轻链基因座是λ基因座。
[0238] 在一个实施方式中，所述不超过两个轻链等位基因选自κ等位基因和λ等位基 因、两个κ等位基因和两个λ等位基因。在一个特定的实施方式中，所述两个轻链等位基 因之一是包括C λ 2基因的λ等位基因。
[0239] 在一个实施方式中，所述小鼠包括一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个无功 能的轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在含有小鼠 Ck基因的内源性小鼠Κ轻链基 因座上包括未经重排的免疫球蛋白人源νλ和JA基因区段。
[0240] 在一个实施方式中，所述小鼠包括一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个无功 能的轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在含有小鼠 CA基因的内源性小鼠 λ轻链基 因座上包括未经重排的免疫球蛋白人源νλ和JA基因区段。在一个实施方式中，所述(：入 基因是CA 2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因与小鼠 CA 2具有至少60%、至 少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。
[0241] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括至少一个免疫球蛋白重链等位基因。在一个 实施方式中，所述至少一个免疫球蛋白重链等位基因在内源性小鼠重链基因座上包括人源 VH基因区段、人源011基因区段和人源义基因区段，所述内源性小鼠重链基因座包括表达人 源/小鼠重链的人源重链基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括两个免疫球蛋白 重链等位基因，并且所述小鼠表达人源/小鼠重链。
[0242] 在一个实施方式中，所述小鼠在包括内源性Ck基因的内源性小鼠K基因座上包 括第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因包括未经重排的hVK和未经重排的hjK，； 并且在包括内源性Ck基因的内源性小鼠 K基因座上包括第二轻链等位基因，所述第二轻 链等位基因包括未经重排的hVA和未经重排的hJA。在一个特定的实施方式中，所述第 一和第二轻链等位基因仅是基因修饰小鼠的功能性轻链等位基因。在一个特定的实施方式 中，所述小鼠包括无功能的λ基因座。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠不表达包 括λ恒定区的轻链。
[0243] 在一个实施方式中，所述小鼠在包括内源性Ck基因的内源性小鼠Κ基因座上包 括第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因包括未经重排的hVK和未经重排的hjK ;并 且在包括内源性CA基因的内源性小鼠 λ基因座上包括第二轻链等位基因，所述第二轻链 等位基因包括未经重排的hV λ和未经重排的hj λ。在一个特定的实施方式中，所述第一和 第二轻链等位基因仅是基因修饰小鼠的功能性轻链等位基因。在一个实施方式中，所述内 源性CA基因是CA2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因与小鼠 CA2具有至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。
[0244] 在一个实施方式中，所述小鼠包括六个免疫球蛋白等位基因，其中所述第一等位 基因在包括小鼠 Ck基因的内源性小鼠 Κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白νλ 和JA基因区段，所述第二等位基因在包括小鼠 Ck基因的内源性小鼠Κ轻链基因座上包 括未经重排的免疫球蛋白Vk和JK基因区段，所述第三等位基因在包括小鼠 CA基因的 内源性小鼠 λ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白νλ和JA基因区段，所述第四和 第五等位基因在包括小鼠重链基因的内源性小鼠重链基因座上各自独立地包括未经重排 的％和0 11和义基因区段，并且所述第六等位基因包括（&)在包括小鼠(^基因的内源性 小鼠 λ轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白Υλ和JA基因区段，（b)无功能的λ基 因座，或（c) λ基因座全部或部分缺失。
[0245] 在一个实施方式中，所述第一等位基因包括未经重排的hV λ和hj λ。在一个实施 方式中，所述第二等位基因包括未经重排的hVK和hjK。在一个实施方式中，所述第三等 位基因包括未经重排的hVA和hJA。在一个实施方式中，所述第四和第五各自独立地包 括未经重排的hVj^PhDj^Phi。在一个实施方式中，所述第六等位基因包括内源性小鼠 λ 基因座的全部或部分缺失。
[0246] 在一个实施方式中，所述小鼠包括六个免疫球蛋白等位基因，其中所述第一等位 基因在包括小鼠 CA基因的内源性小鼠 λ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白νλ 和JA基因区段，所述第二等位基因在包括小鼠 CA基因的内源性小鼠 λ轻链基因座上包 括未经重排的免疫球蛋白νλ和JA基因区段，所述第三等位基因在包括小鼠 Ck基因的 内源性小鼠 κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vk和JK基因区段，所述第四和 第五等位基因在包括小鼠重链基因的内源性小鼠重链基因座上各自独立地包括的未经重 排的义基因区段，并且所述第六等位基因包括（a)在包括小鼠 Ck基因的内源性 小鼠 κ轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白Vk和JK基因区段，（b)无功能的κ基 因座，或（C) K基因座的一个或多个元件缺失。
[0247] 在一个实施方式中，所述第一等位基因包括未经重排的hVA和hJA基因区段。在 一个实施方式中，所述第二等位基因包括未经重排的hVA和hJA基因区段。在一个实施 方式中，所述第三等位基因包括未经重排的hVK和hjK基因区段。在一个实施方式中，所 述第四和第五各自独立地包括未经重排的hV H和hDH和hJH基因区段。在一个实施方式中， 所述第六等位基因包括功能沉默的内源性小鼠 κ基因座。
[0248] 在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠包括含有重排的抗体基因 B细胞，所述 重排的抗体基因包括与小鼠 Q结构域可操作地连接的重排的hVA结构域。在一个实施方 式中，所述小鼠 Q结构域选自小鼠 Ck和小鼠 CA结构域。在一个特定的实施方式中，所 述小鼠 CA结构域来源于CA 2基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA结构域来源 于与小鼠 C λ 2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 % -致 性的C λ结构域。
[0249] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在Q上表达νλ区，所 述Q是Ck。在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在Q上表达hVA 区，所述Q选自人源Ck、人源CA或小鼠 Ck。在一个方面，本申请提供了一种基因修饰 的小鼠，所述小鼠在小鼠 Ck上表达hV λ区。
[0250] 在一个实施方式中，约10-50%的小鼠脾细胞是Β细胞（即⑶19-阳性），或者其 约9-28%表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的hVA结 构域。
[0251] 在一个特定的实施方式中，约23-34%的小鼠脾细胞是B细胞（即⑶19-阳性）， 或者其约9-11%表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的 hVA结构域。
[0252] 在一个特定的实施方式中，约19-31 %的小鼠脾细胞是B细胞（即⑶19-阳性）， 或者其约9-17%表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的 hVA结构域。
[0253] 在一个特定的实施方式中，约21-38%的小鼠脾细胞是B细胞（即⑶19-阳性）， 或者其约24-27%表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合 的hV λ结构域。
[0254] 在一个特定的实施方式中，约10-14%的小鼠脾细胞是Β细胞（即⑶19-阳性）， 或者其约9-13%表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的 hVA结构域。
[0255] 在一个特定的实施方式中，约31-48%的小鼠脾细胞是B细胞（即⑶19-阳性），或 者其约15-21%表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的 hVA结构域。在一个特定的实施方式中，约30-38%的小鼠脾细胞是B细胞（即⑶19-阳 性），或者其约33-48 %表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 C κ结构域 融合的hV λ结构域。
[0256] 在一个实施方式中，约52-70%的小鼠骨髓是Β细胞（即⑶19-阳性），或者其约 31-47%的未成熟Β细胞（即⑶-阳性/Β220-中间阳性/IgM-阳性）表达免疫球蛋白轻链， 所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的hVA结构域。
[0257] 在一个实施方式中，约60 %的小鼠骨髓是B细胞（即⑶19-阳性），或者其约 38. 3%的未成熟B细胞（即⑶-阳性/B220-中间阳性/IgM-阳性）表达免疫球蛋白轻链， 所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠 Ck结构域融合的hVA结构域。
[0258] 在一个实施方式中，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包括来源于人源V 和人源J基因区段的可变结构域，以及来源于小鼠恒定区基因的恒定结构域。在一个实施 方式中，所述小鼠恒定区基因是Ck基因。在另一个实施方式中，所述小鼠恒定区基因是 C λ基因。在一个特定的实施方式中，所述C λ区是C λ 2。在一个特定的实施方式中，所述 小鼠 CA基因是来源于与小鼠 CA 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少 95%或至少98% -致性的CA基因。在一个特定的实施方式中，所述抗体还包括重链，所述 重链包含来源于人源V、人源D和人源J基因区段的可变结构域，以及来源于小鼠重链恒定 区基因的重链恒定结构域。在一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括重链恒定结 构域的铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括重链恒定 结构域的CH1-铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括 重链恒定结构域的CH1-CH2-CH3-CH4序列。在另一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基 因包括重链恒定结构域的CH2-CH3-CH4序列。
[0259] 在一个实施方式中，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包含重排的人源 νλ-JX序列和小鼠 CK序列。在一个实施方式中，所述重排的人源VX-JX序列来源于 hVA基因区段的重排，所述hVA基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-14、3-19、2-23、 3- 25、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、9-49 和 1-51 基因区段。在一个实施方式中，所 述重排的人源νλ-JA序列来源于hJA基因区段的重排，所述hJA基因区段选自JA1、 JX2、JX3和JX7基因区段。
[0260] 在一个实施方式中，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包括含有人源V λ / JA序列的经重排的免疫球蛋白λ轻链可变区，所述人源νλ/JA序列选自3-1/1、3_1/7、 4- 3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、 1-40/1、1-40/2、卜40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、 7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7 和 1-51/1。在一个特定的实施方式中，所 述Β细胞表达抗体，所述抗体包括与小鼠重链恒定结构域融合的人源免疫球蛋白重链可变 结构域，以及与小鼠 κ轻链恒定结构域融合的人源免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
[0261] 在一个方面，本申请提供了一种表达抗体的小鼠，所述抗体包括（a)重链，所述重 链包含来源于未经重排的人源重链可变区基因区段的重链可变结构域，其中所述重链可变 结构域与小鼠重链恒定（C H)区融合；以及（b)轻链，所述轻链包含来源于未经重排的hV λ 和hj λ的轻链可变结构域，其中所述轻链可变结构域与小鼠 Q区融合。
[0262] 在一个实施方式中，所述小鼠包括（i)重链基因座，所述重链基因座包含全部或 基本上全部功能性内源性小鼠 V、D和J基因区段被全部或基本上全部功能性人源V、D和 J基因区段取代，和小鼠(^基因，（ii)第一 κ轻链基因座，所述第一 κ轻链基因座包含全 部或基本上全部功能性内源性小鼠 Vk和Jk基因区段被全部、基本上全部或多个功能性 Μλ和hJA基因区段取代，和小鼠 Ck基因，（iii)第二K轻链基因座，所述第二K轻链 基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠 Vk和Jk基因区段被全部、基本上全部 或多个功能性hVA和hJA基因区段取代，和小鼠 Ck基因。在一个实施方式中，所述小鼠 不表达包括CA区的抗体。在一个实施方式中，所述小鼠包括CA基因和/或νλ和/或 JA基因区段的缺失。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的λ轻链基因座。在一个 特定的实施方式中，所述λ轻链基因座全部或部分缺失。
[0263] 在一个实施方式中，所述小鼠包括（i)重链基因座，所述重链基因座包含全部或 基本上全部功能性内源性小鼠 V、D和J基因区段被全部或基本上全部功能性人源V、D和 J基因区段取代，和小鼠(^基因，（ii)第一 λ轻链基因座，所述第一 λ轻链基因座包含全 部或基本上全部功能性内源性小鼠 νλ和JA基因区段被全部、基本上全部或多个功能性 Μλ和hJA基因区段取代，和小鼠 CA基因，（iii)第二λ轻链基因座，所述第二λ轻 链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠 νλ和JA基因区段被全部、基本上全 部或多个功能性hV λ和hj λ基因区段取代，和小鼠 C λ基因。在一个特定的实施方式中， 所述小鼠 CA基因是CA2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因是来源于与小鼠 (：入2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98% -致性的(：入 基因。
[0264] 在一个实施方式中，所述小鼠包括Ck基因和/或Vk和/*JK基因区段的缺 失。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的κ轻链基因座。
[0265] 在一个方面，本申请提供了一种表达抗体的基因修饰的小鼠，其中由所述小鼠生 产的总IgG抗体的超过10%、超过15%、超过20%、超过25%、超过30%、超过35%、超过 40%、超过60%、超过70%、超过80%或超过90%包括λ来源可变结构域，并且其中所述 小鼠表达包括与小鼠 Ck区融合的κ来源可变结构域的抗体。在特定的实施方式中，由所 述小鼠生产的总抗体的约15-40%、20-40%、25-40%、30-40%或35-40%包括λ来源可变 结构域。
[0266] 在一个实施方式中，所述λ来源的可变结构域来源于hV λ和hj λ。在一个实施 方式中，所述λ来源的可变结构域在包括小鼠 Ck区的轻链中。在一个特定的实施方式中， 所述λ来源的可变结构域在包括小鼠 CA区的轻链中。在另一个特定的实施方式中，所述 (：入区是CA2区。在一个实施方式中，所述κ来源的可变结构域来源于hVK和hjK，并 且在特定实施方式中，其在包括小鼠 Ck区的轻链中。
[0267] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括上游同源臂 和下游同源臂，其中所述上游和下游同源臂将所述构建体靶向至小鼠 κ基因座，并且所述 构建体包括功能性未经重排的hV λ区段和功能性未经重排的hj λ区段以及选择或标记序 列。
[0268] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向小鼠 νλ 2上游的小鼠 λ序列的靶向臂、在重组酶识别位点5' 和3'翼侧的选择性表达盒（cassette)以及用于靶向小鼠 JA 2的3'端的小鼠 λ序列的 革巴向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的（Frt'ed)Hyg-TK表达盒。在一 个实施方式中，所述3'靶向臂包括小鼠 C λ 2、J λ 4、C λ 4和小鼠增强子2. 4。
[0269] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于νλ?为5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、在重组酶识 别位点5'和3'翼侧的选择性表达盒以及用于靶向相对于小鼠 CA 1为3'端的小鼠 λ序 列的3'端祀向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是loxed新霉素表达盒。在一个 实施方式中，所述3'靶向臂包括小鼠 λ 3'增强子和小鼠 λ 3'增强子3. 1。
[0270] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于νλ 2为5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、在重组酶识 别位点5'和3'翼侧的选择性表达盒以及用于靶向相对于小鼠 JA 2为3'端和相对于小鼠 CA 2为5'端的小鼠 λ序列的3'靶向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化 的潮霉素-TK表达盒。在一个实施方式中，所述3'靶向臂包括小鼠 C λ 2-J λ 4-C λ 4基因 区段和小鼠 λ增强子2. 4。
[0271] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于νλ 2为5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、在重组酶识 别位点5'和3'翼侧的选择性表达盒、包括从hV λ 3-12下游至hj λ 1末端的人源λ轻链 基因座邻近区域的人源基因组片段以及用于靶向相对于小鼠 JA 2为3'端的小鼠 λ序列 的3'祀向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的新霉素表达盒。在一个实 施方式中，所述3'靶向臂包括小鼠 C λ 2-J λ 4-C λ 4基因区段和小鼠 λ增强子2. 4。
[0272] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括由hV λ 3-12 下游至hj λ 1末端的人源λ轻链基因座的连续区域。
[0273] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于νλ 2为5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、在重组酶识 别位点5'和3'翼侧的选择性表达盒以及包括从hV λ 3-27下游至hV λ 2-8末端的人源λ 轻链基因座邻近区域的人源基因组片段。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化 的潮霉素表达盒。在一个实施方式中，所述人源基因组片段包括3'靶向臂。在一个特定的 实施方式中，所述3'靶向臂包括从hV λ 3-12下游至hV λ 2-8末端的约53kb的人源λ轻 链基因座。
[0274] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括由hV λ 3-27 下游至h νλ 3-12末端的人源λ轻链基因座的邻近区域。
[0275] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于νλ2为5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、在重组酶识别 位点5'和3'翼侧的选择性表达盒、包括从hVA 5-52下游至hVA 1-40末端的人源λ轻链基 因座邻近区域的第一人源基因组片段、限制性酶位点以及包括从hV λ 3-29下游至hV λ 82Κ 末端的人源λ轻链基因座邻近区域的第二人源基因组片段。在一个实施方式中，所述选择 性表达盒是Frt化的新霉素表达盒。在一个实施方式中，所述限制性酶位点是归巢核酸内 切酶的位点。在一个特定的实施方式中，所述归巢核酸内切酶是Pl-Scel。在一个实施方式 中，所述第二人源基因组片段是3'靶向臂。在一个特定的实施方式中，所述3'靶向臂包括 从hV λ 3-29下游至hV λ 82K末端的约27kb的人源λ轻链基因座。
[0276] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括由hV λ 5-52 下游至hV λ 1-40末端的人源λ轻链基因座的邻近区域。
[0277] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于内源性Vk基因区段为5'端的小鼠 κ基因座的靶向 臂、两个并列的重组酶识别位点、在并列重组酶识别位点的3'的选择性表达盒以及用于靶 向相对于κ轻链可变基因区段为5'端的小鼠 κ序列的3'靶向臂。在一个实施方式中， 所述并列的重组酶识别位点彼此之间的方向相反。在一个特定的实施方式中，所述重组酶 识别位点是不同的。在另一个特定实施方式中，所述重组酶识别位点是ΙοχΡ位点和1 〇Χ511 位点。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是新霉素表达盒。
[0278] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，用于靶向相对于小鼠 Jk基因区段为5'端的小鼠 κ基因座的靶向臂、 选择性表达盒、在选择性表达盒3'端的重组酶识别位点以及用于靶向相对于小鼠 Jk基因 区段为3'端和小鼠 κ内部增强子（intronic enhancer)为5'端的小鼠 κ序列的3'靶 向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是潮霉素-TK表达盒。在一个实施方式中，所 述重组酶识别位点与选择性表达盒具有相同的转录方法。在一个特定的实施方式中，所述 重组酶识别位点是ΙοχΡ位点。
[0279] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方 向从5'至3'包括，含有内源性小鼠 Vk基因区段5'端序列的第一小鼠基因组片段、第一 重组酶识别位点、第二重组酶识别位点以及含有内源性小鼠 Jk基因区段3'端和小鼠 κ 内部增强子5'端序列的第二小鼠基因组片段。
[0280] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述基因修饰包括具有如 上文或本申请中所描述的一个或多个DNA构建体的修饰。
[0281] 在一个方面，本申请提供了一种使用分离的DNA构建体来制备如本申请所述小鼠 的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的分离的DNA构建体在用于制备 抗原结合蛋白的方法中的用途。
[0282] 在一个方面，本申请提供了一种非人源干细胞，所述干细胞包括含有如上文和本 文中所描述的DNA构建体的靶向载体。在一个方面，本申请提供了一种非人源干细胞，其中 所述非人源干细胞来源于本申请所描述的小鼠。
[0283] 在一个实施方式中，所述非人源干细胞是胚胎干（ES)细胞。在一个特定的实施方 式中，所述ES细胞是小鼠 ES细胞。
[0284] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述非人源干细胞来制备如本申请所述 小鼠的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述非人源干细胞来制备抗原结合 蛋白的用途。
[0285] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠胚胎，其中所述小鼠胚胎包括如本申请所提 供的基因修饰。在一个实施方式中，本申请提供了一种包含供体ES细胞的宿主小鼠胚胎， 其中所述供体ES细胞包括如本申请所描述的基因修饰。在一个实施方式中，所述小鼠胚胎 是前桑葚胚（pre-morula)阶段胚胎。在一个特定的实施方式中，所述前桑葚胚阶段胚胎是 4_细胞阶段胚胎或8-细胞阶段胚胎。在另一个特定实施方式中，所述小鼠胚胎是囊胚。
[0286] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠胚胎来制备如本申请所述小鼠 的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠胚胎来制备抗原结合蛋白的用 途。
[0287] 在一个方面，本申请提供了一种非人源细胞，其中所述非人源细胞包括从如本申 请所述经基因修饰的小鼠来源的重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方式中，所 述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是杂交瘤。在一个实施方式中，所述细胞编 码体细胞突变的免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。
[0288] 在一个方面，本申请提供了一种非人源细胞，其中所述非人源细胞包括从如本申 请所述基因修饰的小鼠来源的经重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方式中，所 述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是杂交瘤。在一个实施方式中，所述细胞编 码体细胞突变的免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。
[0289] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人源细胞来制备如本申请所 描述的非人动物的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人源细胞来 制备抗原结合蛋白的用途。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、 山羊、牛和非人灵长类。
[0290] 在一个方面，本申请提供了一种表达免疫球蛋白轻链的小鼠 B细胞，所述免疫球 蛋白轻链包括（a)来源于hVA基因区段和hJA基因区段的可变区；以及（b)小鼠 Q基因。 在一个实施方式中，所述小鼠 Q基因选自Ck和CA基因。在一个特定的实施方式中，所述 (：入基因是CA2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠的CA基因来源于与小鼠 CA2具有 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98% -致性的CA基因。在 一个实施方式中，所述小鼠 Β细胞还表达同源的重链，所述重链包括（c)来源于 可变区和（d)hJH区段。在一个实施方式中，所述B细胞不包括重排的λ基因。在另一个 实施方式中，所述Β细胞不包括重排的κ基因。
[0291] 在一个方面，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备抗体的方法，所述 方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述动物具有在内源性轻链基因 座上包括至少一个hVA和至少一个hJA的基因组，其中所述内源性轻链基因座包括非人 源Q基因；(b)使所述基因修饰的动物针对所述抗原出现免疫应答；以及（c)从来自（b)的 动物分离特异性识别所述抗原的抗体，或者从来自（b)的动物分离的包括特异性识别所述 抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中所述抗体包括来源于hVA、hJA和动物Q基因的轻 链。在一个特定的实施方式中，所述非人源Q基因是小鼠 Ck基因。在一个实施方式中， 所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、牛和非人灵长类。
[0292] 在一个实施方式中，本申请提供了一种用于在基因修饰的非人动物中制备抗体的 方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的动物暴露于抗原，其中所述动物具有包括在内源性 κ基因座上的至少一个hV λ和在K基因座上的至少一个hj λ的基因组，其中所述K基 因座包括非人源Ck基因；(b)使所述基因修饰的动物针对所述抗原出现免疫应答；以及 (c)从来自（b)的动物分离特异性识别所述抗原的抗体，或者从来自（b)的小鼠分离包括特 异性识别所述抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中所述抗体包括来源于hVA、hJA和非 人源Ck基因的轻链。
[0293] 在一个实施方式中，所述κ轻链恒定基因选自人源Ck基因和小鼠 Ck基因。
[0294] 在一个实施方式中，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备抗体的方 法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述动物具有包括在λ轻 链基因座上的至少一个hV λ和在λ轻链基因座上的至少一个J λ的基因组，其中所述λ 轻链基因座包括非人源C λ基因；(b)使所述基因修饰的动物针对所述抗原出现免疫应答； 以及（c)从来自（b)的动物分离特异性识别所述抗原的抗体，或者从来自（b)的动物分离 的包括特异性识别所述抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，或者鉴定动物B中编码与所述抗 原结合的重链和/或轻链可变结构域的核酸序列，其中所述抗体包括来源于hV λ、hj λ和 非人源CA基因的轻链。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山 羊、牛和非人灵长类。
[0295] 在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因选自人源C λ基因和非人源C λ基因。 在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因是人源CA基因。在一个特定的实施方式中，所 述人源(：入基因选自（：入1、(：入2、(：入3和(：入7。在一个实施方式中，所述入轻链恒定基因 是小鼠或大鼠 CA基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因选自CA1、CA2和 CA 3。在一个更特定的实施方式中，所述小鼠 CA基因是CA 2。在另一个特定的实施方式 中，所述小鼠 C λ基因来源于与小鼠 C λ 2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、 至少95%或至少98% -致性的CA基因。
[0296] 在一个方面，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备重排的抗体基因的 方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述基因修饰包括在内 源性轻链基因座上的hV λ和hj λ，其中所述内源性轻链基因座包括非人源Q基因或其功 能性片段；以及（b)鉴定在所述非人动物中的重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免 疫球蛋白基因包括λ轻链可变区基因区段和Q基因或其功能性片段。
[0297] 在一个实施方式中，所述方法还包括克隆编码来自所述动物的重链和/或轻链可 变区的核酸序列，其中所述重链和/或轻链可变区来自包括人源V λ和小鼠 Q的抗体。
[0298] 在一个实施方式中，所述小鼠 Q基因或其功能性片段选自人源Q基因和小鼠(^基 因或其功能性片段。
[0299] 在一个实施方式中，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备重排的抗体 基因的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述基因修饰包 括在κ轻链基因座上的hV λ和hj λ，其中所述κ轻链基因座包括非人源Ck基因或其功 能性片段；以及（b)鉴定在所述动物中的重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球 蛋白基因包括λ轻链可变区基因区段和Ck基因或其功能性片段。
[0300] 在一个实施方式中，所述κ轻链恒定基因或其功能性片段选自人源Ck基因和非 人源（例如小鼠或大鼠）Ck基因，或者其功能性片段。
[0301] 在一个实施方式中，所述方法还包括克隆编码来自所述动物的重链和/或轻链可 变区的核酸序列，其中所述重链和/或轻链可变区来自包括人源νλ和非人源（例如小鼠 或大鼠）CK的抗体。
[0302] 在一个实施方式中，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备重排的抗体 基因的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述基因修饰包 括在非人动物λ轻链基因座上的hVA和hJA，其中所述λ轻链基因座包括非人源CA基 因或其功能性片段；以及（b)鉴定在所述动物中的重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排 的免疫球蛋白基因包括λ轻链可变区基因区段和Cλ基因或其功能性片段。
[0303] 在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因或其功能性片段选自人源C λ基因和小 鼠或大鼠 CA基因，或者其功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述λ轻链恒定基因 是小鼠或大鼠 CA基因，或者其功能性片段。
[0304] 在一个实施方式中，所述方法还包括克隆来自所述动物的重链和/或轻链可变区 的核酸序列，其中所述重链和/或轻链可变区来自包括人源νλ和非人源（例如小鼠或大 鼠 ）C λ的抗体。
[0305] 在一个方面，本申请提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括将如本申请所描 述的非人动物暴露于抗原，使所述动物激发包括制备特异性结合所述抗原的抗体的免疫应 答，鉴定在所述动物中编码重链的、重排的核酸序列和在所述动物中编码抗体的同源轻链 可变结构域序列的、重排的核酸序列，其中所述抗体与所述抗原特异性结合，以及使用与人 源恒定结构域融合的所述重链和轻链可变结构域的核酸序列以制备所需的抗体，其中所述 所需的抗体包括含有与Q结构域融合的V λ结构域的轻链。在一个实施方式中，所述V λ 结构域是人源的并且所述Q结构域是人源或小鼠或大鼠 CA结构域。在一个实施方式中， 所述νλ结构域是小鼠或大鼠的并且所述Q结构域是人源或小鼠 Ck结构域。
[0306] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括将如本申 请所描述的非人动物暴露于抗原，使所述动物激发包括制备特异性结合所述抗原的抗体的 免疫应答，鉴定在所述小鼠中编码重链的、重排的核酸序列和在所述动物中编码抗体的同 源轻链可变结构域序列的、重排的核酸序列，其中所述抗体与所述抗原特异性结合，以及使 用与人源恒定结构域核酸序列融合的所述重链和轻链可变结构域的核酸序列以制备所需 的抗体，其中所述所需的抗体包括含有与Ck结构域融合的V λ结构域的轻链。
[0307] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括将如本申 请所描述的非人动物暴露于抗原，使所述动物激发包括制备特异性结合所述抗原的抗体的 免疫应答，鉴定在所述动物中编码重链可变结构域的、重排的核酸序列和在所述动物中编 码抗体的同源轻链可变结构域序列的、重排的核酸序列，其中所述抗体与所述抗原特异性 结合，以及使用与编码人源重链恒定结构域和人源轻链恒定结构域融合的核酸序列融合的 所述核酸序列以制备来源于人源序列的抗体，其中所述抗体与包括轻链的所述抗原特异性 结合，所述轻链含有与非人源（例如小鼠或大鼠）CA区融合的人源νλ结构域。
[0308] 在一个实施方式中，所述CA区是小鼠的，并且在一个实施方式中选自C λ 1、C λ 2 和CA 3。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA区是CA 2。
[0309] 在一个方面，本申请提供了一种制备重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，所 述方法包括（a)将如本申请所描述的非人动物暴露于抗原；(b)使所述动物激发免疫应答； (c)鉴定在动物中包括编码与非人源Q结构域融合的重排的人源λ结构域序列的核酸序 列的细胞，其中所述细胞还编码包括人源V H结构域和非人源CH结构域的同源重链，并且其 中所述细胞表达与所述抗原结合的抗体；（d)从所述细胞中克隆编码人源V λ结构域的核 酸序列和编码同源的人源VH结构域的核酸序列；以及（e)使用所述编码人源V λ结构域的 克隆的核酸序列和所述编码同源的人源％结构域的克隆的核酸序列以制备全人源抗体。在 一个实施方式中，所述非人动物和非人动物结构域选自小鼠和大鼠。
[0310] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备重排的抗体轻链可变区基因序列的方 法，所述方法包括（a)将如本公开中所描述的非人动物暴露于抗原；(b)使所述动物激发免 疫应答；（c)鉴定在动物中包括编码重排人源V λ结构域序列的核酸序列的细胞，所述核酸 序列与编码非人动物Ck结构域的核酸序列在相同核酸分子上相邻，其中所述细胞还编码 包括人源V H结构域和非人动物CH结构域的同源重链，并且其中所述细胞表达与所述抗原结 合的抗体；（d)从所述细胞中克隆编码所述人源V λ结构域的核酸序列和编码所述同源人 源％结构域的核酸序列；以及（e)使用所述编码人源V λ结构域的克隆的核酸序列和所述 编码同源的人源％结构域的克隆的核酸序列以制备全人源抗体。
[0311] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备重排的抗体轻链可变区基因序列的方 法，所述方法包括（a)将如本申请中所描述的非人动物暴露于抗原；(b)使所述动物激发针 对所述抗原的免疫应答；（C)鉴定在动物中包括一种DNA的细胞，所述DNA编码与所述动物 的非人源C λ结构域融合的重排的人源V λ结构域序列，其中所述细胞还编码包括所述动 物的人源VH结构域和非人源CH结构域的同源重链，并且其中所述细胞表达与所述抗原结合 的抗体；（d)从所述细胞中克隆编码重排的人源V λ结构域的核酸序列和编码同源的人源 VH结构域的核酸序列；以及（e)使用所述编码人源V λ结构域的克隆的核酸序列和所述编 码同源的人源VH结构域的克隆的核酸序列以制备全人源抗体。在一个实施方式中，所述非 人动物是小鼠且所述CA结构域是小鼠 CA2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA结 构域来源于与小鼠 CA 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少 98% -致性的C λ基因。
[0312] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物表达与内源性轻 链恒定区（CJ融合的人源λ来源的轻链，其中所述动物使用抗原免疫后制备抗体，所述抗 体包括与所述动物的非人源Q结构域融合的人源νλ结构域。在一个实施方式中，所述非 人源Q结构域选自CK结构域和CA结构域。在一个实施方式中，所述Q结构域是CK结 构域。在一个实施方式中，所述动物是小鼠。在一个实施方式中，所述小鼠 Q结构域是C λ 结构域。在一个特定的实施方式中，所述CA结构域是CA 2。在一个特定的实施方式中，所 述小鼠 CA结构域来源于与小鼠 CA 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至 少95%或至少98% -致性的CA基因。
[0313] 在一个方面，本申请提供了一种包括如本申请所描述的经修饰的内源性κ或λ 轻链基因座的基因修饰的非人动物，所述动物表达与多个免疫球蛋白重链结合的多个免疫 球蛋白λ轻链。在一个实施方式中，所述重链包括人源序列。在各种实施方式中，所述人 源序列选自可变序列、C H1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述多个免疫球蛋 白λ轻链包括人源序列。在各种实施方式中，所述人源序列选自可变序列、恒定序列及其 组合。在一个实施方式中，所述动物包括失能的内源性免疫球蛋白基因座，并且表达来自转 基因或染色体外游离基因的重链和/或λ轻链。在一个实施方式中，所述动物包括使用一 个或多个人源免疫球蛋白序列来取代内源性（非人源）基因座的一些或全部内源性非人源 重链基因区段（即V、D、J)、和/或一些或全部内源性非人源重链恒定序列（例如C H1、铰链、 CH2、CH3或其组合）和/或一些或全部非人源轻链序列（例如V、J、恒定或其组合）。在一 个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0314] 在一个方面，本申请提供了一种适于制备具有人源λ来源轻链的抗体的非人动 物，其中在非人动物中制备的全部或基本上全部的抗体表达人源λ来源的轻链。在一个实 施方式中，所述人源λ来源的轻链由内源性轻链基因座表达。在一个实施方式中，所述内 源性轻链基因座是κ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述动物是小鼠，并且所述 Κ轻链基因座是小鼠 Κ轻链基因座。
[0315] 在一个方面，本申请提供了一种制备用于人源抗体的λ来源轻链的方法，所述方 法包括从本申请所描述的非人动物中获得轻链序列和重链序列，并且使用所述轻链序列和 所述重链序列以制备人源抗体。
[0316] 在一个方面，本申请提供了 一种用于制备抗原结合蛋白的方法，所述方法包括将 如本申请所描述的非人动物暴露于抗原；使所述非人动物激发免疫应答；以及从所述非人 动物中获得与所述抗原结合的抗原结合蛋白，或者从所述非人动物中获得在制备与所述抗 原结合的抗原结合蛋白中使用的序列。
[0317] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物（例如小鼠或 大鼠）的细胞。在一个实施方式中，所述细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、诱导性多能干 细胞、B细胞和杂交瘤。
[0318] 在一个方面，本申请提供了包括如本申请所描述的基因修饰的细胞。在一个实施 方式中，所述细胞是小鼠细胞。在一个实施方式中，所述细胞选自杂交瘤和四价体杂交瘤。 在一个实施方式中，所述细胞表达包括与小鼠恒定序列融合的人源λ可变序列的免疫球 蛋白轻链。在一个特定的实施方式中，所述小鼠恒定序列是小鼠 κ恒定序列。
[0319] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的组织。
[0320] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物或细胞来制备抗原结 合蛋白的用途。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源蛋白。在一个实施方式中，所 述人源蛋白是人源抗体。
[0321] 在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所描述的非人动物、细胞、组织或方 法制备的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源蛋白。在一个实施 方式中，所述人源蛋白是人源抗体。
[0322] 除非另有明示或从上下文看是明显的，否则本申请所描述的任意实施方式和方面 均能够彼此结合使用。通过后文的描述，对本领域技术人员而言其他的实施方式将是显而 易见的。
[0323] 附图的简要说明
[0324] 图1Α显示了直接基因组取代的一般说明（未按照比例），所述直接基因组取代是 使用约1百万碱基（Mb)人源免疫球蛋白重链可变基因座（空心符号）来取代约3百万碱 基（Mb)小鼠免疫球蛋白重链可变基因座（实心符号）。
[0325] 图1B显示了直接基因组取代的一般说明（未按照比例），所述直接基因组取代使 用约0.5百万碱基（Mb)的两个几乎相同的人源免疫球蛋白κ轻链可变基因座中的第一个 或近端（空心符号）来取代约3百万碱基（Mb)小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座（实心 符号）。
[0326] 图2A显示了三个初始步骤（A-C)的详细说明（未按照比例），所述三个初始步骤 (A-C)是针对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的直接基因组取代（所述取代使得小鼠 Vh、Dh 和JH基因区段全部缺失）以及使用三个人源VH、全部人源011和义基因区段的取代。图中 显示了用于人源免疫球蛋白重链基因区段第一插入的靶向载体（3hV H BACvec)，具有67kb 5'小鼠同源臂、选择性表达盒（空心矩形）、位点特异性重组位点（空心三角形）、145kb人 源基因组片段和8kb 3'小鼠同源臂。图中显示了由随后的靶向载体插入的人源（空心符 号）和小鼠（实心符号）免疫球蛋白基因区段、其他选择性表达盒（空心矩形）和位点特 异性重组位点（空心三角形）。
[0327] 图2B显示了 6个附加步骤（D-Ι)的详细说明（未按照比例），所述6个附加步骤 (D-Ι)是针对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的直接基因组取代，所述取代使得插入77个 附加的人源V H基因区段和除去最后的选择性表达盒。图中显示了用于将附加人源VH基因 区段（18hV H BACvec)插入人源重链基因区段初始插入（3hVH-CRE杂交等位基因）的靶向载 体，所述载体具有20kb 5'小鼠同源臂、选择性表达盒（空心矩形）、196kb人源基因组片段 和62kb人源同源臂，附加人源VH基因区段与人源重链基因区段初始插入的5'端重叠，如 图所示其具有位于人源基因区段5'的位点特异性重组位点（空心三角形）。图中显示了由 随后靶向载体插入的人源（空心符号）和小鼠（实心符号）免疫球蛋白基因区段和附加的 选择性表达盒（空心矩形）。
[0328] 图2C显示了三个初始步骤（A-C)的详细说明（未按照比例），所述三个初始步骤 (A-C)是针对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座的直接基因组取代，所述取代使得所有小 鼠 VK和JK基因区段（IgK-CRE杂交等位基因）缺失。图中显示了由靶向载体插入的选 择性表达盒（空心矩形）和位点特异性重组位点（空心三角形）。
[0329] 图2D显示了五个附加步骤（D-Η)的详细说明（未按照比例），所述五个附加步骤 (D-Η)是针对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座的直接基因组取代，所述取代使得在近端 重复中插入所有人源Vk和】!^基因区段并且缺失最后的选择性表达盒（40hVKdHyg杂交 等位基因）。图中显示了由随后靶向载体插入的人源（空心符号）和小鼠（实心符号）免 疫球蛋白基因区段和附加的选择性表达盒（空心矩形）。
[0330] 图3A显示了筛选策略的一般说明（未按照比例），所述筛选策略包括定量 PCR(qPCR)引物/探针的位置以检测在经靶向的胚胎干（ES)细胞中人重链基因序列的插 入和小鼠重链基因序列的缺失。图中显示了在ES细胞和小鼠中针对第一人源重链基因插 入的筛选策略，所述筛选策略具有针对在未经修饰的小鼠染色体（上图）和正确靶向的染 色体（下图）上的缺失区（"丢失"探针C和D)、插入区（"hlgH"探针G和H)和翼侧区 ("保留"探针A、B、E和F)的qPCR引物/探针组。
[0331] 图3B的代表性计算结果显示了在母体和经修饰的ES细胞中针对人源免疫球蛋白 重链基因区段第一插入的所观察到的探针拷贝数。探针A至F所观察到的探针拷贝数以 2/2 Δ Δ Ct计算。Δ Δ Ct根据ave [ Δ Ct (样品）-med Δ Ct (对照）]计算，其中Δ Ct是待 测和参照探针（参照探针为4-6个，视检测而定）Ct之间的差值。术语med Λ Ct (对照）是 多个（>60)来自母体ES细胞的非靶向DNA样品的中位数ACt。对各经修饰ES细胞克隆的 检测均重复六次。为计算母体ES细胞中IgH探针G和Η的拷贝数，我们假设即使未观察到 扩增，在经修饰的ES细胞中具有的拷贝数为1并且使用35作为最大Ct。
[0332] 图3C的代表性计算结果显示了仅使用探针D和Η计算的各基因型的四只小鼠的 拷贝数。野生型小鼠：WT小鼠；针对人源免疫球蛋白基因区段第一插入的小鼠杂合子：ΗΕΤ 小鼠；针对人源免疫球蛋白基因区段第一插入的小鼠纯合子：Homo小鼠。
[0333] 图4A显示了用于通过细菌同源重组（BHR)构建3hVH BACvec的三个步骤地详细图 示（未按照比例）。图中显示了从靶向载体插入的人源（空心符号）和小鼠（实心符号） 免疫球蛋白基因区段、选择性表达盒（空心矩形）和位点特异性重组位点（空心三角形）。
[0334] 图4B显示了在Notl消化后三个BAC克隆（Bl、B2和B3)的脉冲场凝胶电泳 (PFGE)。标记物Ml、M2和M3分别为低范围、中范围和λ梯度PFG标记物（马萨诸塞州伊 普斯威奇（Ipswich)的 ΝΕΒ 公司（New England BioLabs))。
[0335] 图5A显示了使用增加量的人源免疫球蛋白重链基因区段来按序修饰小鼠免疫球 蛋白重链基因座的示意性说明（未按照比例）。从各自三个不同阶段的重链免疫来制备纯 合小鼠。空心符号表不人源序列；实心符号表不小鼠序列。
[0336] 图5B显示了使用增加量的人源免疫球蛋白κ轻链基因区段来按序修饰小鼠免疫 球蛋白κ轻链基因座的示意性说明（未按照比例）。从各自三个不同阶段的κ轻链免疫 来制备纯合小鼠。空心符号表不人源序列；实心符号表不小鼠序列。
[0337] 图6显示了在野生型和V E LOCI Μ M U Ν Ε?人源化小鼠中Β细胞群的FACS 点图。对来自野生型（wt)、VELOC丨MMUNE? 丨（VI)、VELOCIMMUNE? 2(V2)或 VELOC丨MMUNE? 3(V3)小鼠的脾脏（最上面行，由上数第三行和最下面一行）或腹股沟 淋巴结（由上数第二行）的细胞进行染色，所述染色是针对表面IgM表达的B细胞（最上 面一行和由上面数第二行）、含有κ或λ轻链的表面免疫球蛋白（由上面数第三行）或特 定单体型（haplotype)的表面IgM (最下面一行），并使用FACS分群。
[0338] 图7A显示了连接周围的随机选择的VELOCIMMUNE?抗体的 代表性重链⑶R3序列，显示了连接的多样性和核苷酸的加入。根据所使用的011基因区段对 重链⑶R3序列进行分组，上述各组的生殖细胞系以黑体表示。各重链⑶R3序列的VH基因 区段在各序列5'末端的括号中列出（例如3-72是人源V H3-72)。各重链⑶R3的JH基因 区段在各序列3'末端的括号中列出（例如3是人源J H3)。所显示的各序列的SEQ ID N0 从上至下如下所示：SEQ ID N0:21;SEQ ID N0:22;SEQ ID N0:23;SEQ ID N0:24;SEQ ID NO:25 ；SEQ ID NO:26 ；SEQ ID NO:27 ；SEQ ID NO:28 ；SEQ ID NO:29 ；SEQ ID NO:30 ；SEQ ID NO:31 ；SEQ ID NO:32 ；SEQ ID NO:33 ；SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 ；SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37 ；SEQ ID NO:38 ；SEQ ID N0:39〇
[0339] 图7B显示了在Vk-Jk (⑶R3)连接周围的随机选择的V E LOCI Μ M U N E?抗体的 代表性轻链⑶R3序列，显示了连接的多样性和核苷酸的加入。各轻链⑶R3序列的Vk基 因区段在各序列5'末端的括号中列出（例如1-6是人源Vk 1-6)。各轻链CDR3的Jk基 因区段在各序列3'末端的括号中列出（例如1是人源JkI)。所显示的各序列的SEQ ID NO从上至下如下所示：SEQ ID N0:40 ;SEQ ID N0:41 ;SEQ ID N0:42 ;SEQ ID N0:43 ;SEQ ID N0:44 ；SEQ ID N0:45 ；SEQ ID N0:46 ；SEQ ID N0:47 ；SEQ ID N0:48 ；SEQ ID N0:49 ；SEQ ID NO:50 ；SEQ ID NO:51 ；SEQ ID NO:52 ；SEQ ID NO:53 ；SEQ ID NO:54 ；SEQ ID NO:55 ；SEQ ID NO:56 ；SEQ ID NO:57 ；SEQ ID N0:58〇
[0340] 图8显示了 VELOCIMMUNE?抗体重链和轻链的体细胞高频突变频率，所述高 频突变频率是以在38 (未经免疫的IgM)、28 (未经免疫的IgG)、32 (未经免疫的来自IgG的 IgO、36(经免疫的IgG)或36(经免疫的来自IgG的IgK)序列的集合中各核苷酸（NT ; 左栏）或氨基酸（AA;右栏）位置上所改变的序列的百分率来进行评分。用阴影表示的柱 子表不⑶R的位置。
[0341] 图9A显示了在野生型（空心柱子）或VELOCIMMUNE?小鼠（实心柱子）IgM 和IgG同种型的血清免疫球蛋白水平。
[0342] 图9B显示了在野生型（空心柱子）或VELOCIMMUNE?小鼠（实心柱子）IgA 同种型的血清免疫球蛋白水平。
[0343] 图9C显示了在野生型（空心柱子）或VELOCIMMUNE?小鼠（实心柱子）IgE 同种型的血清免疫球蛋白水平。
[0344] 图10A显示了在使用白介素-6受体（IL-6R)胞外域免疫接种2 (第1次取血）或 3 (第2次取血）轮后，7只VELOCIMMUNE3i (VI)和5只野生型（WT)小鼠血清中针对白 介素-6受体（IL-6R)的抗原特异性IgG的效价（titer)。
[0345] 图10B显示了 7只VELOC丨ΜMUNE? (VI)和5只野生型（WT)小鼠的IL-6R-特 异性IgG同种型特异性效价。
[0346] 图11A显示了在VELOCIMMUNE?小鼠中产生的抗-白介素-6受体单克隆抗体 的亲和性分布。
[0347] 图11B显示了在VELOCIMMUNE? (VI)和野生型（WT)小鼠中产生的抗-白介 素-6受体单克隆抗体的抗原特异性阻断。
[0348] 图12显示了在小鼠免疫球蛋白重链基因座中的小鼠 ADAM6a和ADAM6b基因的示 意性说明（未按照比例）。图中显示了用于将小鼠 ADAM6a和ADAM6b插入人源化内源性重 链基因座的靶向载体（mADAM6靶向载体），所述载体具有选择性表达盒（HYG :潮霉素），其 翼侧为在5'和3'末端包括工程改造的限制性位点的位点特异性重组位点（Frt)。
[0349] 图13显示了位于人源重链可变基因区段1-2(VH1_2)和6-l(V H6_l)之间的人 源ADAM6假基因（hADAM6W)的示意性说明（未按照比例）。图中显示了用于将细菌同源 重组以缺失人源性ADAM6假基因并将独特的限制性位点插入人源重链基因座的靶向载体 0ιΑ?ΑΜ6Ψ靶向载体），所述载体具有选择性表达盒（ΝΕ0 :新霉素），其翼侧为在5'和3'末 端包括工程改造的限制性位点的位点特异性重组位点（loxP)。图中显示了（未按照比例） 所得的靶向人源化重链基因座，该基因座包括编码小鼠 ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片 断，并且ADAM6b基因包括翼侧为位点特异性重组位点的选择性表达盒。
[0350] 图14A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有包括小鼠 ADAM6基因的小鼠基因组片段插入的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子+/+)的骨髓中，对IgM和B220表面表达的以单个门控的淋 巴细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了未成熟（B220 intIgM+)和成熟（B220*IgM+) B细胞的百分率。
[0351] 图14B显示了在从针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子 (H+/+K +/+)以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ 轻链可变基因座的小鼠纯合子（H+/+A6MSK+/+)的股骨中分离的骨髓中，未成熟（B220 intIgM+) 和成熟（B220sIgM+)B细胞的总数。
[0352] 图15A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子+/+)的骨髓中，对c-kit和⑶43表面表达的以⑶19+-门 控的B细胞FACS等值线图。在各等值线图中的右上和左下象限分别显示了原-B (pro-B) (CD19+CD43+ckit+)和前-B(pre-B) (CD19+CD43-cki〇 细胞的百分率。
[0353] 图15B显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有包含小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子（H+/+A6MSK +/+)的股骨中分离的骨髓中，原-B细胞（⑶19+⑶43+ckit+) 和前-B细胞（CD19+CD43-cki〇的总数。
[0354] 图16A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链 可变基因座的小鼠纯合子（H+/+A6MSK +/+)的骨髓中，对⑶19和⑶43表面表达的以单 个门控的淋巴细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了未成熟的B(⑶19+⑶43_)、 前-B(CD19+CD43int)和原-B(CD19+CD43+)细胞的百分率。
[0355] 图16B显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子 (Η+/+κ +/+)以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源 κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（H+/+A6MSK+/+)的骨髓中，未成熟的B(⑶19+CD43_)和 前-B(CD19+CD43 int)细胞的直方图。
[0356] 图17A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子κ +/+)的脾细胞中，对⑶19和⑶3表面表达的以单个门控的 淋巴细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了 B(⑶19+CD3_)和T(⑶19TD3+)细胞的百 分率。
[0357] 图17B显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子κ +/+)的脾脏中，对Ig λ和Ig κ轻链表面表达的以⑶19+-门 控的B细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了 IgA+(左上象限）和IgK+(右下象 限）B细胞的百分率。
[0358] 图17C显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子0^6^^+)的脾脏中，CD19+B细胞的总数。
[0359] 图18A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（Η+/+κ +/+) 以及针对人源重链和具有编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变 基因座的小鼠纯合子κ +/+)的脾脏中，对IgD和IgM表面表达的⑶19+-门控的B 细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了成熟的B细胞（⑶19+IgDsIgMint)的百分率。 在右侧等值线图中的箭头表示与IgM和IgD表面表达相关的B细胞成熟过程。
[0360] 图18B显示了在由CD19+IgM高IgDint向CD19+IgMintIgD高成熟的过程中，在针对 人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子（H +/+K+/+)以及针对人源重链和具有 编码小鼠 ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子 (H+/+A6MSK +/+)的脾脏中，B细胞的总数。
[0361] 图19显示了包括νλ基因区段（A、B和C)的簇以及JX和CX区对（J-C对）的 人源λ轻链基因座的详细说明（未按照比例）。
[0362] 图20显示了用于将内源性小鼠 λ轻链基因座失活的靶向策略的一般说明（未按 照比例）。
[0363] 图21显示了用于将内源性小鼠 κ轻链基因座失活的靶向策略的一般说明（未按 照比例）。
[0364] 图22Α显示了使用包括12个hV λ基因区段和hj λ 1基因区段的人源λ轻链序 列革巴向内源性小鼠 λ轻链基因座的初始祀向载体（12/1-λ祀向载体）的一般说明（未按 照比例）。
[0365] 图22Β显示了用于使用人源λ轻链序列靶向内源性小鼠Κ轻链基因座的四个 初始靶向载体的一般说明（未按照比例），所述人源λ轻链序列包括12个hVA基因序列 和hJAl基因序列（12/1-κ靶向载体），12个hVX基因区段与hJAl、2、3和7基因区段 (12/4-κ靶向载体），12个hVA基因区段、人源Vk-Jk基因组序列和hJAl基因区段 (12(κ)1-κ靶向载体）以及12个hVX基因区段、人源Vk-Jk基因组片段与hJXl、2、3 和7基因区段（12( Κ )4_ κ靶向载体）。
[0366] 图23A显示了用于将40个hV λ基因区段和单一 hj λ基因区段进行性 (progressive)插入小鼠 λ轻链基因座的祀向策略的一般说明（未按照比例）。
[0367] 图23Β显示了用于将40个hVA基因区段和单一 hJA基因区段进行性插入小鼠 κ基因座的靶向策略的一般说明（未按照比例）。
[0368] 图24显示了用于制备独特的人源λ-K杂交靶向载体所使用的靶向和分子工 程步骤的一般说明（未按照比例），所述靶向载体用于构建含有人源κ基因间序列、多个 hj λ基因区段或两者的杂交轻链基因座。
[0369] 图25Α显示了基因座结构的一般说明（未按照比例），所述基因座结构是针对含有 40个hVA基因区段和与内源性CA2基因可操作地连接的单一 hJA基因区段的经修饰的 小鼠 λ轻链基因座。
[0370] 图25Β显示了用于四个独立的经修饰的小鼠 κ轻链基因座的基因座结构的一般 说明（未按照比例），所述小鼠 κ轻链基因座含有40个hVA基因区段以及一个或四个 hJA基因区段，具有或不具有与内源性Ck基因可操作地连接的连续的人源VK-JK基因 组序列。
[0371] 图26A显示了来自野生型小鼠（WT)、针对包括人源Vk-JK基因组序列的12个 hVA和4个hJA基因区段的小鼠纯合子（12hVA-VK JK-4hJA)以及针对40个hVX和 1个hJX基因区段的小鼠纯合子（40hVA-lhJA)的⑶19+门控的IgA +和IgK+脾细胞等 值线图。
[0372] 图26B显示了在来自野生型小鼠（WT)、针对包括人源Vk-JK基因组序列的12个 hVA和4个hJA基因区段的小鼠纯合子（12hVA-VKjK-4hJA)以及针对40个hVX和 1个hJX基因区段的小鼠纯合子（40hVA-lhJA)所收集的脾脏中，⑶19+B细胞的总数。
[0373] 图27A，上图显示了来自野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-Jk基因组序列 的40个hV λ和4个J λ基因区段的小鼠纯合子（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )，单一门控和针 对Β和Τ细胞（分别为CD19+和CD3+)染色的脾细胞等值线图。下图显示了来自野生型小 鼠（WT)以及包括人源Vk-Jk基因组序列的40个hVX和4个JX基因区段的小鼠纯合 子（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )中，以CD19+门控和针对Ig λ +和Ig κ +表达染色的脾细胞等值 线图。
[0374] 图27Β显示了从野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序列的40个 hVA和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVA-VK JK-4hJA)所收集的脾脏中，CD19+、 CD19+Ig κ + 和 CD19+Ig λ +B 细胞的总数。
[0375] 图27C显示了来自野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序列的 40个hVX和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVA-VK JK-4hJX)，以CD19+门控 以及针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾细胞等值线图。在各个等 值线图中显示了成熟的（WT为72,40hVX-VK JK-4hJX为51)和过渡态的（WT为13， 40hV λ -V κ J κ -4hJ λ 为 22) B 细胞。
[0376] 图27D显示了从野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序列的40个 hVA和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVA-VK JK-4hJA)所收集的脾脏中，CD19+B 细胞、过渡态的B细胞（⑶lg+Igi^IgD'和成熟的B细胞（⑶lg+IgMhgD1^)的总数。
[0377] 图28A，上图显示了来自野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序 列的40个hV λ和4个J λ基因区段的小鼠纯合子（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )，对B和T细 胞染色（分别为CD19+和CD3+)的骨髓等值线图。下图显示了来自野生型小鼠（WT)以 及针对包括人源Vk-J K基因组序列的40个hVA和4个JA基因区段的小鼠纯合子 (40hVA-VK Jk -4hJX)，以CD19+门控并对ckit+和CD43+染色的骨髓等值线图。在下图 的等值线图中显示了原B细胞和前B细胞。
[0378] 图28B显示了从野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序列的40个 hVA和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVX-VKjK-4hJA)的股骨收集的骨髓中，原 (CD19 +CD43+ckit+)和前（CD19+CD43-ckitjB 细胞的数量。
[0379] 图28C显示了来自野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-Jk基因组序列的40 个hVX和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVA-VK JK-4hJX)，以单一门控以及针对 免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓等值线图。各等值线图中分别显示了未成熟的、成 熟的和原/前B细胞。
[0380] 图28D显示了从野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序列的40个 hVA和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVX-VKjK-4hJA)的股骨分离的骨髓中，未 成熟的（B220 intIgM+)和成熟的（B220hiIgM+)B细胞的总数。
[0381] 图28E显示了从野生型小鼠（WT)以及针对包括人源Vk-JK基因组序列的40个 hVA和4个JX基因区段的小鼠纯合子（40hVX-VKjK-4hJA)的股骨分离的，以未成熟 的（B220 intIgM+)和成熟的（B220hiIgM+)B细胞门控的针对IgA和IgK表达染色的骨髓等 值线图。
[0382] 图29显示了 18个独立RT-PCT克隆的V λ -J λ -C κ连接的核苷酸序列比对结果， 所述独立RT-PCT克隆由在内源性小鼠 κ轻链基因座上携带人源λ轻链基因序列的小鼠 脾细胞 RNA 中扩增。Α6 = SEQ ID Ν0:115 ;B6 = SEQ ID Ν0:116 ;F6 = SEQ ID Ν0:117 ;Β7 =SEQ ID NO: 118 ；E7 = SEQ ID NO: 119 ；F7 = SEQ ID NO: 120 ；C8 = SEQ ID NO: 121 ；E12 = SEQ ID NO: 122 ； 1-4 = SEQ ID NO: 123 ； 1-20 = SEQ ID NO: 124 ；3B43 = SEQ ID NO: 125； 5-8 = SEQ ID N0:126 ；5-19 = SEQ ID NO: 127 ；1010 = SEQ ID NO: 128 ；11A1 = SEQ ID NO: 129 ;7A8 = SEQ ID NO: 130 ;3A3 = SEQ ID NO: 131 ;2-7 = SEQ ID NO: 132。小写字母 碱基表示由在重组过程中的突变和/或N加入所产生的非生殖细胞系碱基。在框架4区 (FWR4)中由hj λ 1和小鼠 Ck的核苷酸序列编码的共有氨基酸序列示于序列比对的底部。
[0383] 图30显示了 12个独立RT-PCT克隆的V λ -J λ -C κ连接的核苷酸序列比对结果， 所述独立RT-PCT克隆是由在内源性小鼠 κ轻链基因座上携带包括连续的人源Vk-Jk基 因组序列的人源λ轻链基因序列的小鼠脾细胞RNA中扩增。5-2 = SEQ ID N0:145 ;2-5 = SEQ ID NO: 146 ；l-3 = SEQ ID NO: 147 ；4B-1 = SEQ ID NO: 148 ；3B-5 = SEQ ID NO: 149 ； 7A-1 = SEQ ID NO: 150 ；5-l = SEQ ID NO: 151 ；4A-1 = SEQ ID NO: 152 ；11A-1 = SEQ ID NO: 153 ;5-7 = SEQ ID NO: 154 ;5-4 = SEQ ID NO: 155 ;2-3 = SEQ ID NO: 156。小写字母 碱基表示由在重组过程中的突变和/或N加入所产生的非生殖细胞系碱基。在框架4区 (FWR4)中由各个人源J λ和小鼠 Ck的核苷酸序列编码的共有氨基酸序列示于序列比对的 底部。
[0384] 图31显示了3个独立1^(：1'克隆的￥入-^-(^连接的核苷酸序列比对结果，所 述独立RT-PCT克隆由在内源性小鼠 λ轻链基因座上携带人源λ轻链基因序列的小鼠脾 细胞 RNA 中扩增。2D1 = SEQ ID Ν0:159 ;2D9 = SEQ ID Ν0:160 ;3E15 = SEQ ID Ν0:161。 小写字母碱基表示由在重组过程中的突变和/或N加入所产生的非生殖细胞系碱基。在框 架4区（FWR4)中由hj λ 1和小鼠 C λ 2的核苷酸序列编码的共有氨基酸序列示于序列比对 的底部。
[0385] 详沭
[0386] 本发明不限于所描述的特定方法以及实验条件，因为这些方法和条件可以改变。 还应理解本申请所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且其并不旨在限定，因 为本发明的范围是由权利要求所定义的。
[0387] 除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域 中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见 的。尽管在实施或检验本发明中可以使用与本申请所描述的那些相似或等效的任意方法和 材料，但是在本申请中仅描述了特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通过引用并入 本申请。
[0388] 当使用短语"基本上的"或"基本上地"指基因区段的数量（例如"基本上全部 的"V基因区段）包括功能性和非功能性基因区段，并且包括，在各种实施方式中，例如全部 基因区段的80%或以上、85%或以上、90%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、 98%或以上或者99%或以上；在各种实施方式中，"基本上全部的"基因区段包括例如至少 95%、96%、97%、98%或99%的功能性（即非假基因）基因区段。
[0389] 术语"取代"包括其中将DNA序列置于细胞的基因组中，使得在所述基因组序列的 基因座上使用异源性序列（例如在小鼠中的人源序列）来取代基因组中的序列。这样放置 的DNA序列可以包括一个或多个调控序列，所述调控序列作为用于获得这样放置的所述序 列的来源DNA的一部分（例如启动子、增强子、5' -或3' -非翻译区、适宜的重组信号序列 等）。例如，在各种实施方式中，所述取代是异源性序列对内源性序列的取代，以使得产生这 样放置的DNA序列（包含异源性序列）的基因产物，但是不表达内源性序列；所述取代是用 DNA序列来取代内源性基因组序列，所述DNA序列编码与内源性基因组序列编码的蛋白（例 如内源性基因组序列编码免疫球蛋白基因或结构域，以及DNA片段编码一个或多个人源免 疫球蛋白基因或结构域）具有相似功能的蛋白。在各种实施方式中，使用相应的人源基因 或其片段取代内源性基因或其片段。相应的人源基因或其片段是被取代的内源性基因或其 片段的直系同源物、同源物或与其在结构和/或功能上基本相等或相同的人源基因或其片 段。
[0390] 术语"邻近的（contiguous) "指出现在相同的核酸分子上，例如如果两条核酸出 现在相同核酸分子上但是被另一条核酸序列所中断，则两条核酸序列是"邻近的"。例如，重 排的V (D) J序列与恒定区基因序列是"邻近的"，尽管V (D) J序列的最后一个密码子之后并 不是紧随着恒定区序列的第一个密码子。在另一个例子中，如果两个V基因区段序列出现 在相同的基因组片段上，那么所述两个V基因区段序列是"邻近的"，尽管其可能被不编码 V区密码子的序列所分隔，例如其可能被调控序列所分隔，所述调控序列例如启动子或其他 非编码序列。在一个实施方式中，邻近的序列包括含有以如在野生型基因组中所见的方式 排布的基因组序列的基因组片段。
[0391] 当用"来源于"所引用的基因或基因区段的可变区时，短语"来源于"包括能够将 所述序列追溯至经重排以形成表达可变结构域的基因的（考虑如适用的剪接差异和体细 胞突变）、特定的未经重排的一段或多段基因区段。
[0392] 短语"功能性"当用在可变区基因区段或连接基因区段时是指在表达抗体库中的 用途；例如在人源νλ基因区段3-1、4-3、2-8等中是功能性的，而在νλ基因区段3-2、3-4、 2_5等中是无功能的。
[0393] "重链基因座"包括在染色体（例如小鼠染色体）上的某个位置，其可见于野生型 小鼠重链可变（V H)、重链多样性（DH)、重链连接（JH)和重链恒定（CH)区DNA序列中。
[0394] " κ基因座"包括在染色体（例如小鼠染色体）上的某个位置，其可见于野生型小 鼠 κ可变（V κ )、κ连接（J κ )和κ恒定（C κ )区DNA序列中。
[0395] " λ基因座"包括在染色体（例如小鼠染色体）上的某个位置，其可见于野生型小 鼠入可变（νλ)、λ连接（JA)和λ恒定（CA)区DNA序列中。
[0396] 当与表达某序列相关时，术语"细胞"包括适于表达重组核酸序列的任意细胞。细 胞包括那些原核生物和真核生物（单细胞或多细胞）、细菌细胞（例如大肠杆菌（E. coli)、 芽孢杆菌属（Bacillus)、链霉菌属（Streptomyces)等的菌株）、分枝杆菌细胞、真菌细 胞、酵母细胞（例如酿酒酵母（S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（S. pombe)、巴斯德毕赤酵 母（P. pastoris)、甲醇毕赤酵母（P. methanolica)等）、植物细胞、昆虫细胞（例如SF-9、 SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)等）、非人动物细胞、人细 胞、B细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、 猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞： CH0 (例如 CH0 Kl、DXB-11CH0、Veggie-CHO)、C0S (例如 C0S-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾 (例如 HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、Η印G2、WI38、MRC 5、C〇1〇205、HB 8065、HL-60、（例如 BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮）、CV-1、U937、3T3、L 细胞、C127 细 胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli 细胞、BRL 3A 细胞、HT1080 细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤 细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包括一种或多种病毒基因， 例如表达病毒基因的视网膜细胞（例如PER. C6?细胞）。
[0397] 短语"互补性决定区"或术语"⑶R"包括由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编 码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常（即在野生型动物中）出现在免疫球蛋白分子 (例如抗体或T细胞受体）的轻链或重链可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如生 殖细胞系序列或者重排的或未经重排的序列，以及例如由天然存在的或者成熟的B细胞或 T细胞来编码。在一些情况下（例如针对CDR3)，CDR可由两条或更多条序列（例如生殖细 胞系序列）编码，所述序列（例如在未经重排的核酸序列中）不是邻近的，但是在B细胞 核酸序列中是邻近的，例如作为所述序列剪接或连接的结果（例如V-D-J重组以形成重链 CDR3)。
[0398] 短语"基因区段"或"区段"包括指V(轻链或重链）或D或J(轻链或重链）免疫 球蛋白基因区段，这包括在免疫球蛋白基因座（在例如人和小鼠中）中未经重排的序列，其 能够参与重排（由例如内源性重组酶所介导）以形成重排的V/J或V/D/J序列。除非另有 明示，否则所述V、D和J区段包括重组信号序列（RSS)，所述重组信号序列允许根据12/23 规则来进行V/J重组或V/D/J重组。除非另有明示，否则所述区段还包括与其在性质上相 关的序列或其功能性等效物的序列（例如V区段的一个或多个启动子和一个或多个先导序 列）。
[0399] 术语"未经重排的"包括免疫球蛋白基因座的状态，其中V基因区段和J基因区段 (对于重链，还有D基因区段）均保持独立但是其能够结合在一起形成包括V (D) J库的单一 V、（D)、J的重排的V〇))J基因。
[0400] 短语"微摩范围"旨在表示1-999微摩；短语"纳摩范围"旨在表示1-999纳摩；短 语"皮摩范围"旨在表示1-999皮摩。
[0401] 术语"非人动物"旨在包括任意非人动物例如圆口类、硬骨鱼类、软骨鱼类如鲨鱼 和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。适宜的非人动物包括哺乳动物。适宜的哺 乳动物包括非人灵长类、山羊、绵羊、猪、犬、牛和啮齿类。适宜的非人哺乳动物选自啮齿动 物家族（包括大鼠和小鼠）。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0402] 小鼠作为一种遗传模型通过转基因和敲除技术已经被极大地增强，小鼠已能够用 于研究定向的过表达或缺失特定基因的作用。尽管所有的均为其优势，但是所述小鼠仍存 在遗传障碍，这使小鼠是用于人类疾病的不完善模型并且是检测人用疗法或制备所述疗法 的不完善的平台。首先，尽管约99%的人类基因与小鼠具有同源性（Water St〇n，R.H.等， (2002) Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome (小鼠基 因组的起始测序和比较研究），Nature 420, 520-562)，但是潜在的疗法常常不能与拟采用 的人靶点的小鼠直系同源物发生交叉反应或者交叉反应不充分。为了避免这个问题，可以 将所选择的靶基因人源化，也就是说，可以将小鼠基因消除并使用相应的人源直系同源基 因序列来取代（例如US 6, 586, 251、US 6, 596, 541和US 7, 105, 348,其通过引用并入本申 请）。最初，努力通过"敲除加转基因人源化"的策略将小鼠基因人源化，使得携带内源性 基因缺失（即敲除）的小鼠与携带随机整合的人源转基因的小鼠杂交（参见例如Bril，W. S.等，(2006)Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593)to Cys substitution(在表达载有Arg(593)到 Cys取代的人源因子VIII cDNA的转基因小鼠中对因子VIII的耐受性），Thromb Haemost 95, 341-347 ；Homanics, G. E.等，（2006)Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease (经典型和中间型枫 糖尿症的鼠模型的生成和定性），BMC Med Genet 7,33 ;Jamsai,D·等，（2006) A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia (针对 HbE/β -地 中海贫血的人源化BAC转基因/敲出小鼠模型），Genomics88(3) :309-15 ;Pan，Q.等， (2006)Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma_and CD3gammadelta_deficient mice (前 T细胞受体（preTCR)功能中小鼠和人⑶3 δ/ε异二聚体的不同作用：人CD3 δ/ε异 二聚体在⑶3 γ -和⑶3 γ δ -缺陷小鼠中恢复有缺陷的preTCR的功能），Mol Immunol 43, 1741-1750)。但是那些努力受到尺寸限制的阻碍；常规的敲除技术不足以直接使用其较 大的人源基因组对应基因（counterpart)来取代较大的小鼠基因。因为存在技术困难，很 少尝试直接同源取代的简单方法，即直接使用人源对应基因在小鼠基因相同的精确基因位 置（即在内源性小鼠基因座）上取代内源性小鼠基因。直到现在，直接取代的努力涉及复 杂和繁琐的程序，因此限制了能够被处理的遗传物质的长度以及其能够被操作的精确度。 [0403] 在小鼠的前体B细胞中外源性的引入了人源免疫球蛋白转基因重排（Alt, F. ff. , Blackwell, T. Κ.和 Yancopoulos, G.D. (1985) · Immunoglobulin genes in transgenic mice(转基因小鼠中的免疫球蛋白基因 ），Trends Genet 1,231-236)。这一发现是通 过使用敲除加转基因方法将小鼠工程改造以表达人源抗体（Green，L.L.等，（1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs(来自使用人源Ig重链和轻链YAC工程改造的小鼠的抗原特 异性人源单克隆抗体），Nat Genet 7, 13-21 ;Lonberg，N. (2005) .Human antibodies from transgenic animals(来自转基因动物的人源抗体），Nat Biotechnol 23, 1117-1125 ; Lonberg, N.等，（1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications (来自包含四个不同的基因修饰的小鼠的抗原特异性人 源抗体），Nature 368, 856-859 ;Jakobovits，A.等，（2007)From XenoMouse technology to panitumumab，the first fully human antibody product from transgenic mice (从 XenoMouse技术到帕尼单抗，来自转基因小鼠的第一个全人源抗体产物），Nat Biotechnol 25, 1134-1143)。在这些小鼠中通过将各内源性基因座小而关键的部分靶向缺失来使内 源性小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活，随后通过如上文所描述的随机整合大 的转基因或者微染色体来引入人源免疫球蛋白基因座（Tomizuka，K.等，（2000)Double trans-chromosomic mice:maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies(双 转染色体小鼠：包含Ig重链和κ基因座的两个个人染色体片段的维持和全人源抗体的 表达），Proc Natl Acad Sci U S A 97,722-727)。这种小鼠代表了基因工程的一个重 要进展；从其中分离的全人源单克隆抗体对于治疗多种人类疾病具有有希望的治疗潜力 (Gibson，Τ· B.等，（2006) Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer(转移性结直肠癌中，全人源抗表皮生长因子受体单克隆抗体帕尼 单抗的随机的 III 期试验结果），Clin Colorectal Cancer 6, 29-31 ;Jakobovits 等， 2007 ;Kim，Y.H.等，（2007)Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax_CD4):two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma(zanolimumab 的临床效果： 难治性皮肤T细胞淋巴瘤的两个II期研究），Blood 109(11) :4655-62 ;Lonberg，2005 ; Maker, A. V.等，（2005)Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4blockade and interleukin 2:a phase I/II study (用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4阻断和白介素2治疗的患者中的肿瘤 抑制和自身免疫），Ann Surg Oncol 12, 1005-1016 ;McClung，M.R.，Lewiecki，E.M.等， (2006)Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density(具有 低骨密度的绝经后妇女中的地诺单抗），N Engl J Med 354,821-831)。但是，如上文所 讨论的，当与野生型小鼠相比时，这些小鼠显示出受损的B细胞发育和免疫缺陷。这样 的问题可能限制了小鼠支持较强体液免疫应答的能力，因此产生针对某些抗原的全人源 抗体。所述缺陷可能是由于：（1)由于随机引入人源免疫球蛋白转基因所导致的低效的 功能性，以及由于缺乏上游和下游控制元件所导致的不正确的表达（Garrett，F.E.等， (2005)Chromatin architecture near a potential 3' end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites(在igh基因座的潜在3'末端附近的染色质结构包括 B细胞发育过程中的组蛋白修饰的模块调节和CTCF位点的体内占有），Mol Cell Biol 25, 1511-1525 ；Manis, J. P.等，(2003)Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region (3' IgH 调节区的下游边界的说明），Mol Immunol 39, 753-760 ; Pawlitzky, I.等，(2006) Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse Igh locus defined by pr〇-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.l，Pax5, and E2A(由原 B 细胞特异 性过敏症相关的PU. 1、Pax5和E2A结合所定义的小鼠 Igh基因座的5'侧翼区中的候选调 控元件的鉴定），J Immunol 176,6839-6851) ;(2)人源恒定结构域与小鼠细胞表面B细 胞受体信号转导复合物元件之间低效率的种间相互作用，这可能使B细胞的正常的成熟、 增殖和存活所需的信号转导过程受损（Hombach，J.等，（1990)Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class (IgM 类的 B 细胞抗原受体复 合物的分子组成），Nature 343,760-762);以及（3)可溶性人源免疫球蛋白与小鼠 Fc受 体之间低效率的种间相互作用可能会降低亲和性选择（Rao，S. P.等，（2002)Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells:implications for selection of high-affinity B cells(生发中心细胞上抑 制性IgG Fc受体Fc γ RIIB的差异表达：对高亲和性B细胞选择性的影响），J Immunol 169,1859-1868)以及免疫球蛋白的血清浓度（Brambell，F.W.等，（1964)A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism( γ 球蛋白分解代谢的理论模型），Nature 203, 1352-1354 ;Junghans，R.P.和 Anderson, C.L. (1996) .The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor (IgG分解代谢的保护受体是包含β 2微球蛋白的新生儿肠道转运 受体），Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516 ;Rao 等，2002 ;Hjelm，F.等，（2006) Antibody-mediated regulation of the immune response (免疫应答的抗体介导的调 控），Scand J Immunol 64, 177-184 ;Nimmerjahn，F.和 Ravetch, J. V. (2007)Fc-receptors as regulators of immunity (Fc 受体作为免疫调节剂），Adv Immunol 96, 179-204)。能够 通过仅仅针对在内源性重链和轻链基因座上其天然位置中的小鼠免疫球蛋白基因座的可 变区的原位人源化来纠正这些缺陷。这将有效地产生制备"反向嵌合"（即人源V:小鼠 C) 抗体的小鼠，所述抗体将能够基于保留小鼠恒定区在小鼠环境中产生正常的相互作用和选 择性。此外这种反向嵌合抗体可以容易地重新形成用于治疗目的的全人源抗体。
[0404] 基因修饰的动物包括在内源性免疫球蛋白重链基因座上使用异源性（例如来自 其他物种的）免疫球蛋白序列的取代，所述基因修饰的动物能够从与内源性免疫球蛋白轻 链基因座的取代相结合来制备或者与免疫球蛋白轻链转基因相结合来制备（例如嵌合的 免疫球蛋白轻链转基因或者全人源全小鼠等）。作为异源性免疫球蛋白重链序列来源的物 种可以与在免疫球蛋白轻链序列取代或免疫球蛋白轻链转基因中使用的免疫球蛋白轻链 序列存在较大差异。
[0405] 免疫球蛋白可变区核酸序列例如V、D和/或J区段在各种实施方式中来自人源或 非人动物。适于提供V、D和/或J区段的非人动物包括例如硬骨鱼类、软骨鱼类如鲨鱼和 鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、鸟类（例如鸡）。非人动物包括例如哺乳动物。哺乳 动物包括例如非人灵长类、山羊、绵羊、猪、犬、牛（例如奶牛、公牛、水牛）、鹿、骆驼、雪貂和 啮齿动物以及非人灵长类（例如黑猩猩、猩猩、大猩猩、狨猴、猕猴、狒狒）。适宜的非人动物 选自啮齿动物家族，包括大鼠、小鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。如 从上下文中可知，各种非人动物可以作为可变结构域或可变基因区段的来源（例如鲨鱼、 鳐鱼、哺乳动物（例如骆驼、啮齿动物如小鼠和大鼠）。
[0406] 根据上下文，非人动物还作为用于与可变序列或区段连接的恒定区序列的来源， 例如啮齿动物的恒定序列可以作为与人源或非人源可变序列可操作地连接的转基因（例 如人源或非人源灵长类可变序列与例如啮齿动物如小鼠或大鼠或仓鼠的恒定序列可操作 地连接）。这样，在各种实施方式中，人源V、D和/或J区段与啮齿动物（例如小鼠或大鼠 或仓鼠）的恒定区基因序列可操作地连接。在一些实施方式中，所述人源V、D和/或J区 段（或者一个或多个重排的VDJ或VJ基因）与在例如转基因整合至基因座中的小鼠、大鼠 或仓鼠恒定区基因序列可操作地连接或融合，所述基因座不是内源性免疫球蛋白基因座。
[0407] 在一个特定的实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在内源性免疫球蛋 白重链基因座上包括用一个或多个人源V H、DH和JH区段来取代VH、DH和J H基因区段被，其 中所述一个或多个人源％、JH区段与内源性免疫球蛋白重链恒定基因可操作地连接； 其中所述小鼠包括在与内源性免疫球蛋白基因座不同的基因座上的转基因，其中所述转基 因包括与小鼠或大鼠或人源恒定区可操作地连接的未经重排的或重排的人源\和人源叉 区段。
[0408] 在一个特定的实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在内源性免疫 球蛋白重链基因座上插入一个或多个人源V H、011和1基因区段。在一个实施方式中，所述 插入在内源性免疫球蛋白重链恒定基因的上游；在一个实施方式中，所述插入在内源性可 变（V)基因区段的下游；在一个实施方式中，所述插入在内源性多样性（D)基因区段的下 游；在一个实施方式中，所述插入在内源性连接（J)基因区段的下游。在各种实施方式中， 所述插入是所述一个或多个人源V H、DH和JH基因区段位于与一个或多个内源性重链恒定基 因的可操作连接处。
[0409] 本申请描述了一种方法，所述方法用于使用人源生殖细胞系免疫球蛋白可变基因 座大量原位基因取代小鼠生殖细胞系免疫球蛋白可变基因座，但同时保持小鼠产生后代的 能力。特别地，本申请描述了使用其人源对应基因精确取代6百万碱基的小鼠重链和κ轻 链免疫球蛋白可变基因座，但同时完好保留小鼠的恒定区。其结果是，建立了一种小鼠，其 整个生殖细胞系免疫球蛋白可变库被等效的人源生殖细胞系免疫球蛋白可变序列精确取 代，但同时保留小鼠的恒定区。人源可变区与小鼠恒定区连接以形成嵌合人源-小鼠免疫 球蛋白基因座，所述基因座在生理上适宜的水平重排和表达。所表达的抗体是"反向嵌合 的"，即抗体包括人源可变区序列和小鼠恒定区序列。这些小鼠具有表达具有人源可变区 和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区，，将所述小鼠称为VELCOIMMUNE?小 鼠。
[0410] VELOCIMMUNE?人源化小鼠显示出与野生型小鼠本质上不同的全功能体液免 疫系统。所述小鼠显示出在B细胞发育所有阶段的正常的细胞群。所述小鼠显示出正常的 淋巴器官形态。VELOCIMMUNES·小鼠的抗体序列显示出正常的V(D)J重排和正常的体 细胞高频突变频率。在这些小鼠中的抗体群反映出由正常的类型转换（例如正常同种型顺 式（cis)转换）产生的同种型分布。免疫VELOCIMMUNE?小鼠产生强的体液免疫应答， 所述体液免疫应答产生具有适于作为治疗候选物的人源免疫球蛋白可变结构域的大量的、 多样性的抗体库。该平台提供了用于制备药学上可接受的抗体和其他抗原结合蛋白的天然 亲和性成熟的人源免疫球蛋白可变区序列的充足来源。
[0411] 使用人源免疫球蛋白可变序列精确取代小鼠免疫球蛋白可变序列能够制备 VELOCIMMUNE?小鼠。尽管通过按序重组非常大跨距的人源免疫球蛋白序列来使用等 效的人源免疫球蛋白序列在重链和轻链基因座上精确取代内源性小鼠免疫球蛋白序列，但 是由于小鼠和人之间免疫球蛋白基因座的趋异进化使得可能存在某些挑战。例如，在免疫 球蛋白基因座中散布的基因间序列在小鼠和人之间不是相同的，并且在一些情况下，可能 功能上并不等效。小鼠和人在其免疫球蛋白基因座之间的差异仍会导致人源化小鼠的异 常，特别是当人源化或操作内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分时。在小鼠免疫 球蛋白重链基因座上的一些修饰是有害的。有害的修饰可能包括例如经修饰的小鼠交配和 产生后代能力的丧失。在各种实施方式中，在小鼠基因组中工程改造人源免疫球蛋白序列 包括，当其在经修饰的小鼠品系中缺失是有害的时维持内源性序列的方法。示例性的有害 作用可以包括不能繁殖经修饰的品系、必需基因功能的丧失、不能表达多肽等。这种有害作 用可能直接或间接地与工程改造进入小鼠基因组的修饰相关。
[0412] 精确地、大规模地使用相应1. 4百万个人源基因组序列在原位取代6百万个小鼠 重链和轻链免疫球蛋白基因座的可变区（VH-DH-J!^P VK -JK)，同时在杂交基因座中使小 鼠翼侧序列保留完好并具有功能，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区（图1A 和图1B)。特别地，使用VELOCIGENE?基因工程技术通过将13个携带人源生殖细胞系 可变基因座的重叠片段的嵌合BAC靶向载体逐步插入小鼠 ES细胞中，从而引入人源Vh、Dh、 Jh、Vk和Jk基因序列（参见例如US专利号6, 586, 251和Valenzuela, D.M.等，（2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis (与高分辨率表达分析的偶联的小鼠基因组的高通量工程改造 ）.Nat Biotechnol 21，652-659)。
[0413] 小鼠免疫球蛋白基因的人源化是迄今为止对小鼠基因组的最大的基因修饰。尽管 此前使用随机整合的人源免疫球蛋白转基因已经取得了一些成功（上述已讨论），但是使 用人源对应基因直接取代小鼠免疫球蛋白基因显著增加了能够在其他正常小鼠中有效产 生全人源抗体的效率。而且，与携带失能的内源性基因座和全人源抗体转基因的小鼠相比， 这种小鼠在使用几乎任何抗原免疫后均能够获得的全人源抗体的多样性显著增加。经过多 种方式取代后，人源化的基因座显示出完全正常水平的成熟和未成熟的B细胞，而与之相 反的是随机整合了人源转基因的小鼠在不同的分化阶段显示出显著减少的B细胞群。尽管 通过在人源转基因小鼠中努力增加人源基因区段的数量已减少了这种缺陷，但是扩大的免 疫球蛋白库还不能完全纠正与野生型小鼠相比B细胞群的减少。
[0414] 尽管在具有经取代的免疫球蛋白基因座的小鼠（即VELOCIMMUNE?小鼠）中 观察到了接近野生型的体液免疫功能，但是当使用在用随机整合的转基因的一些方法中未 遇到过的免疫球蛋白的直接取代时，还会遇到其他挑战。小鼠和人之间免疫球蛋白基因座 基因组成的差异导致发现了对具有经取代的免疫球蛋白基因区段的小鼠繁殖有益的序列。 特别地，由于其在生育能力方面的作用，在具有经取代的免疫球蛋白基因座的小鼠中，最好 存在位于内源性免疫球蛋白基因座中的小鼠 ADAM基因。
[0415] 小鼠 ADAM6在基因组中的位置和功能
[0416] 缺乏表达任何功能性ADAM6蛋白能力的雄性小鼠惊人地显示出所述小鼠缺乏交 配和产生后代的能力。由于全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白可变区基因区段被人源可变区 基因区段取代，所述小鼠缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。产生ADAM6功能丧失的结果 是由于ADAM6基因座位于内源性小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座区域内，邻近位于0 11基 因区段上游的VH基因区段基因座的3'末端。为了繁殖针对全部或基本上全部内源性小鼠 重链可变基因区段被人源重链可变基因区段取代的纯合子小鼠，通常比较麻烦的方法是建 立针对所述取代各自为纯合子的雄性和雌性并等待产生交配。窝仔成功的频率和大小均比 较低。取而代之的是，使用针对所述取代是杂合子的雄性与针对所述取代是纯合子的雌性 交配，以产生针对所述取代是杂合子的后代，然后从其上繁殖纯合子小鼠。本发明人已确定 导致雄性小鼠生育能力的丧失的可能的原因是在纯合雄性小鼠中缺乏功能性ADAM6蛋白。
[0417] 在各种方面，包括受损的（即无功能或具有轻微功能）ADAM6基因的雄性小鼠显示 出生育能力的降低或消失。由于在小鼠（和其他啮齿动物）中ADAM6基因位于免疫球蛋白 重链基因座，因此本发明人已确定为了繁殖小鼠或建立和维持包括经取代的免疫球蛋白重 链基因座的小鼠品系，应使用涉及交配和繁殖方案的多种修饰。在针对内源性免疫球蛋白 重链可变基因座的取代是纯合子的低生育或无生育能力的雄性小鼠使得在小鼠品系中的 维持这种修饰是困难的。在各种实施方式中，维持所述品系包括避免针对所述取代是纯合 子的雄性小鼠所显示出不具有生育能力的问题。
[0418] 在一个方面，本申请提供了一种维持如本申请所描述的小鼠品系的方法。所述小 鼠品系不需要包括异位ADAM6序列，并且在各种实施方式中所述小鼠品系是针对ADAM6局支 除（例如功能性敲除）的纯合子或杂合子。
[0419] 所述小鼠品系包括在内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，所述修饰使得在雄性 小鼠中生育能力降低或丧失。在一个实施方式中，所述修饰包括ADAM6基因调控区和/或 编码区的缺失。在一个特定的实施方式中，所述修饰包括内源性ADAM6基因（调控和/或 编码区）的修饰，所述修饰使得包括所述修饰的雄性小鼠的生育能力降低或消除；在一个 特定的实施方式中，所述修饰使得针对所述修饰是纯合子的雄性小鼠的生育能力降低或消 除。
[0420] 在一个实施方式中，所述小鼠品系是针对ADAM6基因的敲除（例如功能性敲除） 或缺失的纯合子或杂合子。
[0421] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子 的小鼠中分离细胞，和在宿主胚胎中使用供体细胞，并将所述宿主胚胎以及供体细胞在代 孕母体中妊娠，并且由所述代孕母体中获得包括所述基因修饰的后代。在一个实施方式中， 所述供体细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述供体细胞是多能细胞，例如诱导性多能 细胞。
[0422] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子 的小鼠中分离包括所述修饰的核酸序列，和将所述核酸序列引入宿主细胞核，并将包括所 述核酸序列和所述宿主细胞核的细胞在适宜的动物中妊娠。在一个实施方式中，将所述核 酸序列引入宿主卵母细胞胚胎。
[0423] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子 的小鼠中分离细胞核，和将所述细胞核引入宿主细胞，并且将所述细胞核以及宿主细胞在 适宜的动物中妊娠以获得针对所述修饰是纯合子或杂合子的后代。
[0424] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过使用包括所述基因修饰的雄性小鼠 的精子对雌性小鼠（野生型，针对所述修饰是纯合子，或者针对所述修饰是杂合子）进行体 外受精（IVF)。在一个实施方式中，所述雄性小鼠针对所述基因修饰是杂合子。在一个实施 方式中，所述雄性小鼠针对所述基因修饰是纯合子。
[0425] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过将针对所述基因修饰是杂合子的雄 性小鼠与雌性小鼠繁殖以获得包括所述基因修饰的后代，鉴定包括所述基因修饰的雄性和 雌性后代，并且使用针对所述基因修饰是杂合子的雄性与野生型、针对所述基因修饰是纯 合子或杂合子的雌性繁殖以获得包括所述基因修饰的后代。在一个实施方式中，将针对所 述基因修饰是杂合子的雄性与野生型雌性、针对所述修饰是杂合子的雌性或针对所述修饰 是纯合子的雌性繁殖的步骤重复，以维持在小鼠品系中的所述基因修饰。
[0426] 在一个方面，本申请提供了一种保持小鼠品系的方法，所述小鼠品系包括使用一 个或多个人源免疫球蛋白重链序列取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括 将所述小鼠品系繁殖以产生杂合子雄性小鼠，其中将所述杂合子雄性小鼠繁殖以维持在该 品系中的所述基因修饰。在一个特定的实施方式中，所述品系不通过将纯合子雄性与野生 型雌性、或者针对所述基因修饰是纯合子或杂合子的雌性的任意交配来维持。
[0427] ADAM6蛋白是ADAM蛋白家族成员，其中ADAM是A Disintegrin And Metalloprotease (去整合蛋白和金属蛋白酶）的首字母缩略词。ADAM家族的蛋白较大而 且多样，具有包括细胞粘附在内的多样性功能。ADAM家族的一些成员参与精子发生和受精。 例如，ADAM2编码受精素的亚基，受精素参与精子和卵子的相互作用。ADAM3或cyritestin 似乎是精子与透明带结合所必需的。ADAM2或ADAM3的缺乏造成不具有生育能力。已假设 ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠精子细胞表面上形成复合物。
[0428] 人源ADAM6基因，正常存在于人源VH基因区段VH1_2和V H6_1之间，似乎是假基因 (图12)。在小鼠中，有两个ADAM6基因--ADAM6a和ADAM6b，是两个ADAM6基因存在于 小鼠 VH和DH基因区段之间的基因间区，并且在小鼠中ADAM6a和ADAM6b基因的方向与周围 的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反（图12)。在小鼠中，功能性的ADAM6基因座显然 是正常生育所需的。然后，功能性ADAM6基因座或序列是指一种ADAM6基因座或序列，所述 ADAM6基因座或序列能够补足或挽救在具有丧失功能或无功能的内源性ADAM6基因座的雄 性小鼠中显示出的大幅下降的生育能力。
[0429] 在编码ADAM6a和ADAM6b的小鼠中的基因间序列的位置使得当修饰内源性小鼠 重链时所述基因间序列易于修饰。当V H基因区段缺失或被取代时，或者iDH基因区段缺 失或被取代时，所得到的小鼠在生育能力方面显示出严重缺陷的概率较高。为了补偿该缺 陷，对所述小鼠进行修饰以使其包括编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白将与由于内源性小 鼠 ADAM6基因座的修饰而导致的ADAM6活性的丧失补足。在各种实施方式中，所述补足核 苷酸序列是编码挽救生育能力缺陷的小鼠 ADAM6a、小鼠 ADAM6b或者其同源物或直系同源 物或功能性片段的核苷酸序列。或者，可以使用保留内源性ADAM6基因座的适宜方法，同时 使小鼠 ADAM6基因座翼侧的内源性免疫球蛋白重链序列不能重排以编码功能性内源性重 链可变区。示例性的替代方法包括以操纵位于内源性免疫球蛋白重链可变区基因座的大部 分小鼠染色体，以使其不能重排以编码与内源性重链恒定基因可操作地连接的功能性重链 可变区。在各种实施方式中，所述方法包括将含有内源性免疫球蛋白重链基因区段的小鼠 染色体片段倒置和/或转位。
[0430] 可以将挽救生育能力的核苷酸序列置于任意适宜的位置。可以将其置于基因间 区，或者基因组中任意适宜的位置（即异位的）。在一个实施方式中，可以将所述核苷酸 序列引入到随机整合至小鼠基因组中的转基因上。在一个实施方式中，所述序列可以维持 在游离基因上，也就是说在小鼠染色体以外的独立核酸上。适宜的位置包括允许转录或具 有转录活性的位置，例如 R0SA26 基因座（Zambrowicz 等，1997, PNAS USA 94:3789-3794)、 BT-5 基因座（Michael 等，1999, Mech. Dev. 85:35-47)或 0ct4 基因座（Wallace 等， 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464)。对将核苷酸序列靶向至具有转录活性的基因座 的描述例如参见US 7, 473, 557,其通过引用并入本申请。
[0431] 或者，可以将挽救生育能力的核苷酸序列与诱导性启动子偶联，以促进在适宜的 细胞和/或组织例如生殖组织中最佳表达。示例性的诱导性启动子包括以物理（例如热休 克启动子）和/或化学方法（例如IPTG或四环素）活化的启动子。
[0432] 而且，所述核苷酸的表达能够与其他基因相关联，以实现在发育特定阶段或在特 定组织中的表达。这种表达能够通过将所述核苷酸序列与在发育特定阶段表达的基因启动 子可操作地连接来实现。例如，工程改造至宿主物种基因组中的来自一个物种的免疫球蛋 白序列，位于与宿主物种CD19基因（B细胞特异性基因）的启动子序列可操作地连接的位 置上。实现了在精确发育阶段的B细胞特异性表达时，免疫球蛋白表达。
[0433] 实现插入的核苷酸序列强表达的另一种方法是使用组成性启动子。示例性的组成 性启动子包括SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK和CAGG。按照类似的方式，将所需的核苷酸序列置 于与选定的组成性启动子可操作地连接的位置上，所述启动子提供了核苷酸序列编码的一 种或多种蛋白的高水平表达。
[0434] 术语"异位"旨在包括移位，或者在自然界中正常情况下不存在的位置上安置（例 如核酸序列所在的位置在不同于野生型小鼠中所发现的该核酸序列的位置上安置）。该术 语在各种实施方式中用于对象不在正常的或正确的位置的情况下。例如，短语"编码……的 异位核苷酸序列"指核苷酸序列出现在小鼠中的正常情况下不出现的位置上。例如，在编码 小鼠 ADAM6蛋白（或对雄性小鼠的生育能力提供相同或相近的益处的其直系同源物或同源 物或片段）的异位核苷酸序列的情况下，所述序列可以位于小鼠基因组中与在野生型小鼠 中在正常情况下所发现的不同位置上。在这种情况下，通过将所述序列置于小鼠基因组中 与野生型小鼠不同的位置上，从而形成新的小鼠序列的序列连接。小鼠 ADAM6的功能性同 源物或直系同源物是能挽救在ADAM6+小鼠中观察到的生育能力丧失（例如雄性小鼠通过 交配产生后代的能力丧失）的序列。功能性同源物或直系同源物包括与ADAM6a的氨基酸 序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89 % -致性或者更高（例如达99 %-致性） 的蛋白，并且所述蛋白能够补足或挽救具有包括ADAM6a和/或ADAM6b缺失或敲除基因型 的小鼠成功交配的能力。
[0435] 异位位置可以在任意位置（例如作为含有小鼠ADAM6序列的转基因的随机插入）， 或者可以例如在与其在野生型小鼠中的位置接近（但不是精确地相同）的位置（例如在 经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白基因座，但是在其天然位置的上游或下游，例如在经修饰 的免疫球蛋白基因座内但是在不同的基因区段之间，或者在小鼠 V-D基因间序列的不同位 置）。异位安置的一个例子是将在野生型小鼠中正常发现的位置维持在内源性免疫球蛋白 重链基因座中，但是使得周围的内源性重链基因区段不能重排以编码含有内源性重链恒定 区的功能性重链。在这个例子中，这可以通过使含有所述内源性免疫球蛋白重链可变基因 座的染色体片段翻转来实现，例如使用在所述可变区基因座翼侧位置上的工程改造的位点 特异性重组位点。这样，重组后，内源性重链可变区基因座置于远离内源性重链恒定区基因 的位置上，以阻止重排以编码含有内源性重链恒定区的功能性重链。本领域技术人员在阅 读了本公开和/或与本领域公知的方法结合后，对获得内源性免疫球蛋白重链可变基因座 功能性沉默并维持功能性ADAM6基因座的其他示例性方法将是显而易见的。内源性重链基 因座具有这种安置时，维持了所述内源性ADAM6基因，并且所述内源性免疫球蛋白重链基 因座被功能性沉默。
[0436] 异位安置的另一个例子是在人源化免疫球蛋白重链基因座中安置。例如，包括一 个或多个内源性％基因区段被人源％基因区段取代的小鼠（其中所述取代除去内源性 ADAM6序列）能够被工程改造为在位于含有人源VH基因区段的序列中具有小鼠 ADAM6序 列。所得到的修饰将在人源基因序列中产生（异位）小鼠 ADAM6序列，并且在人源基因序 列中（异位）安置小鼠 ADAM6序列可以接近人源ADAM6假基因的位置（即在两个V区段之 间）或者可以接近小鼠 ADAM6序列的位置（即在V-D基因间区中）。通过将在小鼠生殖细 胞系中的人源基因序列（例如免疫球蛋白基因序列）中或与之邻近的（异位）小鼠 ADAM6 序列连接以形成所得到的序列连接，与在野生型小鼠基因组中的相同或相近位置相比所述 所得到的序列连接是新的。
[0437] 在各种实施方式中，本申请提供了一种非人动物，所述动物缺乏ADAM6或者其直 系同源物或同源物，其中所述缺乏使非人动物不具有生育能力，或者实质性降低所述非人 动物的生育能力。在各种实施方式中，ADAM6或者其直系同源物或同源物的缺乏是由于内 源性免疫球蛋白重链基因座的修饰导致。实质性降低生育能力是指例如生育能力（例如繁 殖频率、窝胎仔数、年窝数等）降低约50%、60%、70%、80%、90%或95%或者更多。在各 种实施方式中，所述非人动物补充了在雄性非人动物中具有功能的小鼠 ADAM6基因或者其 直系同源物或同源物或功能性片段，其中所补充的ADAM6基因或者其直系同源物或同源物 或功能性片段全部或大部分挽救了生育能力的降低。大部分挽救了生育能力是指例如使生 育能力恢复，以使得所述非人动物显示出的生育能力与未经修饰的（即不具有ADAM6基因 或者其直系同源物或同源物修饰的动物）重链基因座相比为至少70%、80%或90%或者更 商。
[0438] 赋予所述经基因修饰的动物（即由于例如免疫球蛋白重链基因座的修饰而缺乏 功能性ADAM6或者其直系同源物或同源物的动物）的序列，在各种实施方式中，选自ADAM6 基因或者其直系同源物或同源物。例如，在一个实施方式中，在小鼠中，ADAM6功能的丧失 通过加入小鼠 ADAM6基因来挽救。在一个实施方式中，在小鼠中ADAM6功能的丧失通过加 入与小鼠密切相关物种的直系同源物或同源物来挽救，所述物种例如啮齿动物，例如不同 品系或物种的小鼠，任意物种的大鼠，啮齿动物；其中加入小鼠的直系同源物或同源物挽救 了由于ADAM6功能的丧失或者ADAM6基因的缺失而导致的生育能力的丧失。来自其他物种 的直系同源物和同源物，在各种实施方式中，选自在系统发育上有关的物种以及，在各种实 施方式中，显示出与所述内源性ADAM6(或者直系同源物）的一致性百分率为约80%或更 高、85 %或更高、90 %或更高、95 %或更高、96 %或更高或者97 %或更高；并且挽救ADAM6有 关的或者（在非小鼠中）ADAM6的直系同源物有关的生育能力丧失。例如，在缺乏ADAM6功 能的经基因修饰的雄性大鼠中（例如内源性免疫球蛋白重链可变区被人源免疫球蛋白重 链可变区取代的大鼠，或者在大鼠的免疫球蛋白重链区中敲除的大鼠），在大鼠中挽救生育 能力丧失是通过加入大鼠 ADAM6，或者在一些实施方式中，是通过加入大鼠 ADAM6的直系同 源物（例如来自其他大鼠品系或物种，或者在一个实施方式中来自小鼠的ADAM6直系同源 物）。
[0439] 因此，在各种实施方式中，经基因修饰的动物显示出由于编码ADAM6蛋白（或者其 直系同源物或同源物）的核酸序列的修饰或者与所述核酸序列可操作地连接的调控区的 修饰而导致无生育能力或生育能力降低，所述经基因修饰的动物包括补足或恢复生育能力 丧失的核酸序列，其中补足或恢复生育能力丧失的所述核酸序列来自相同物种的不同品系 或者来自系统发育上有关的物种。在各种实施方式中，补足的核酸序列是ADAM6直系同源 物或其同源物或功能性片段。在各种实施方式中，所述补足的ADAM6直系同源物或其同源 物或功能性片段来自与具有生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物密切相关的非人动物。 例如，当所述经基因修饰的动物是特定品系的小鼠时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能 性片段可以来自于另一个品系的小鼠，或者相关物种的小鼠。在一个实施方式中，当包括生 育能力缺陷的所述经基因修饰的动物是啮齿目时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能性 片段来自于啮齿目中的另一种动物。在一个实施方式中，包括生育能力缺陷的所述经基因 修饰的动物是鼠型亚目（Myomoropha)(例如跳鼠、跳鼠、小鼠样仓鼠、仓鼠、新世界大鼠和 小鼠、田鼠、真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄诞鼠、攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和 小鼠、多刺睡鼠、鼹鼠、竹鼠、鼢鼠）并且ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段选自啮 齿目（Rodentia)或鼠型亚目的动物。
[0440] 在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自跳鼠科（Dipodoidea)总科，并且 所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自鼠科（Muroidea)总科。在一个实施 方式中，所述经基因修饰的动物来自鼠科总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或 功能性片段来自跳鼠科总科。
[0441] 在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述 啮齿动物选自鼠科总科，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科总科的不同物种。 在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科（Calomyscidae) (例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠科 (Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄诞鼠）、马岛鼠科（Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白 尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺山鼠科（Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠）和廳形 鼠科（Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠）；以及所述ADAM6直系同源物或同源物选自同 一科的不同物种。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大 鼠（鼠科），并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自下述的物种：沙鼠、多刺小鼠或 黄冠鼠。在一个实施方式中，所述经基因修饰的小鼠来自鼠科成员，并且所述ADAM6直系同 源物或同源物来自鼠科的不同物种。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动 物是鼠科中的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科中的大鼠、沙鼠、多刺小 鼠或黄冠鼠。
[0442] 在各种实施方式中，使用科中啮齿动物的一种或多种啮齿动物ADAM6直系同源物 或其同源物或功能性片段，从而使相同科的缺乏ADAM6直系同源物或同源物的、经基因修 饰的啮齿动物的生育能力恢复（例如仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）；鼠科 (例如真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄诞鼠））。
[0443] 在各种实施方式中，通过确定所述直系同源物、同源物或片段使缺乏ADAM6活性 的经基因修饰的非人动物（例如包括ADAM6或其直系同源物敲除的啮齿动物，例如小鼠或 大鼠）是否恢复生育能力来评估ADAM6直系同源物、其同源物及片段的功能性。在各种实 施方式中，将功能性定义为缺乏内源性ADAM6或其直系同源物或同源物的经基因修饰的动 物的精子迁移至输卵管并且使经基因修饰的相同物种动物的卵子受精的能力。
[0444] 在各种方面，可以制备包括内源性重链可变区基因座或其部分的缺失或取代的小 鼠，所述小鼠含有异位核苷酸序列，所述异位核苷酸序列编码赋予与小鼠 ADAM6 (例如在雄 性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段）具有相似生育能力益处的蛋白。所 述异位核苷酸序列可以包括编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白是不同小鼠品系或不同物种 (例如不同的啮齿动物物种）的ADAM6同源物或直系同源物（或其片段），并且在生育能力 方面具有益处，例如在特定时间段内增加窝数，和/或增加每窝胎仔数，和/或使雄性小鼠 的精子细胞能够穿过小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。
[0445] 在一个实施方式中，ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白具有至少89 %至99 %-致性的同 源物或直系同源物（例如与小鼠40416&或小鼠40八1613具有至少89%至99%-致性）。在 一个实施方式中，所述异位核苷酸序列编码一种或多种蛋白，所述蛋白独立地选自与小鼠 ADAM6a具有至少89 % -致性的蛋白、与小鼠ADAM6b具有至少89 % -致性的蛋白，及其组 合。在一个实施方式中，所述同源物或直系同源物是大鼠、仓鼠、小鼠或豚鼠蛋白，所述蛋白 为或被修饰为与小鼠40416&和/或小鼠40八1613具有约89%或者更高的一致性。在一个实 施方式中，所述同源物或直系同源物为或与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b具有至少90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%-致性。
[0446] 在一个方面，本申请提供了 一种非人动物，其中所述非人动物包括（a)在非人源 免疫球蛋白轻链恒定区上游插入一个或多个人源νλ和JA基因区段，（b)在非人源免疫 球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源％、一个或多个人源D H以及一个或多个人源JH 基因区段，和（c)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述 非人源重链和/或轻链恒定区是啮齿动物恒定区（例如选自小鼠、大鼠或仓鼠恒定区）。在 一个实施方式中，所述非人源轻链恒定区是啮齿动物恒定区。在一个特定的实施方式中，所 述轻链恒定区是小鼠 Ck或大鼠 Ck区。在一个特定的实施方式中，所述轻链恒定区是小 鼠 CA或大鼠 Ck区。适宜的非人动物包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施 方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
[0447] 在一个实施方式中，所述非人动物包括至少12个到至少40个人源νλ基因区段 和至少1个人源J λ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括12个人源V λ 基因区段和至少1个人源JA基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括28 个人源νλ基因区段和至少1个人源JA基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包 括40个人源νλ基因区段和至少1个人源JA基因区段。在各种实施方式中，所述至少1 个人源JA基因区段选自JA 1、JA2、JA3和JA7。在一个特定的实施方式中，所述非人 动物包括至少4个人源JA基因区段。在一个实施方式中，所述至少4个人源JA基因区 段包括至少JX 1、JX2、JX3和JA7。
[0448] 在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在非人动物中 是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段（其在非人动物中具有功 能）的核苷酸序列存在于与野生型非人ADAM6基因座相同的位置。在一个实施方式中，所述 非人动物是小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠的ADAM6蛋白或其功能性片段且存在于非 人动物基因组的异位位置。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述核苷酸序列 编码小鼠 ADAM6蛋白或其功能性片段且存在于免疫球蛋白基因区段中。在一个特定的实施 方式中，所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个实施方式中，所述重链基因区段 是人源的。在一个实施方式中，所述重链基因区段是非人动物的内源性重链基因区段。在 一个实施方式中，所述小鼠包括含有一个或多个内源性未经重排的重链基因区段的异位邻 近的序列，并且ADAM6序列在所述异位邻近的序列中。
[0449] 在一个实施方式中，所述非人动物在内源性免疫球蛋白轻链基因座上缺乏内源性 免疫球蛋白\和/或1基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包括在非人动物中不 能重排形成免疫球蛋白' 结构域的内源性免疫球蛋白 '和/或叉基因区段。在一个实施 方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白Vk和Jk基因区段被一个或多个人源νλ 和JA基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白νλ和 基因区段被一个或多个人源νλ和JA基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上 全部内源性免疫球蛋白'和1基因区段在非人动物中是完好的，并且所述非人动物包括插 入内源性免疫球蛋白'和/或1基因区段和内源性免疫球蛋白轻链恒定区之间的一个或 多个人源νλ基因区段和一个或多个人源JA基因区段。在一个特定的实施方式中，所述 完好的内源性免疫球蛋白\和1基因区段在非人动物中不能重排形成抗体的'结构域。 在各种实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链 基因座。在各种实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白 入轻链基因座。在各种实施方式中，所述内源性免疫球蛋白'和叉基因区段是Vk和Jk 基因区段。在各种实施方式中，所述内源性免疫球蛋白'和叉基因区段是νλ和JA基因 区段。
[0450] 在一个实施方式中，所述非人动物还包括来自人源κ轻链基因座的人源Vk-Jk 基因间区，其中所述人源Vk-JK基因间区与一个或多个人源Υλ和JA基因区段邻近。在 一个特定的实施方式中，所述人源Vk-J K基因间区位于人源Υλ基因区段和人源JA基 因区段之间。
[0451] 在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所描述的非人动物的细胞和/或组 织，其中所述细胞和/或组织包括（a)在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游插入一个或多 个人源νλ和JA基因区段，（b)在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人 源％、一个或多个人源D H以及一个或多个人源义基因区段，和（c)编码ADAM6蛋白或其功 能性片段的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是小鼠恒 定区。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是大鼠恒定区。在一个实施 方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是仓鼠恒定区。
[0452] 在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在所述细胞和 /或组织中是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列存 在于与野生型非人源ADAM6基因座相同的位置。在一个实施方式中，所述非人源细胞和/ 或组织来源于小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠 ADAM6蛋白或其功能性片段并存在于异 位位置。在一个实施方式中，所述非人源细胞和/或组织来源于小鼠，并且所述核苷酸序列 编码小鼠 ADAM6蛋白或其功能性片段并存在于免疫球蛋白基因区段中。在一个特定的实施 方式中，所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个实施方式中，内源性重链基因区 段的连续序列在非人动物中位于异位，其中位于内源性重链基因区段异位的邻近序列包括 在小鼠中（例如在雄性小鼠中）具有功能的ADAM6基因。
[0453] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物来制备抗原结合蛋白 的用途，其中所述非人动物表达（a)抗体，所述抗体包括（i)含有人源V λ结构域和非人源 轻链恒定区的免疫球蛋白轻链，以及（ii)含有人源乂11结构域和非人源恒定区的免疫球蛋 白重链；以及（b)ADAM6蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人 源的。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，并且所述非人源恒定区是啮齿动物恒 定区。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是小鼠。
[0454] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的非人源细胞 或组织。在一个实施方式中，所述非人源细胞或组织包括与非人源免疫球蛋白轻链恒定区 基因邻近的一个或多个人源免疫球蛋白Vλ基因区段和至少一个人源免疫球蛋白Jλ基因 区段，以及与非人源免疫球蛋白重链恒定区基因邻近的一个或多个人源V H、一个或多个人 源011和一个或多个人源义基因区段，其中所述细胞或组织表达ADAM6蛋白或其功能性片 段。在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定区基因是小鼠 Ck或小鼠 CA。
[0455] 在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列是异位的。在 一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列的位置与野生型非人源细 胞的位置相同。在各种实施方式中，所述非人源细胞是小鼠 B细胞。在各种实施方式中，所 述非人源细胞是胚胎干细胞。
[0456] 在一个实施方式中，所述组织来源于非人动物的脾脏、骨髓或淋巴结。
[0457] 在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织 来制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。
[0458] 在一个方面，本申请提供了包括如本申请所述经修饰的基因组的非人细胞，其中 所述非人细胞是来自如本申请所描述的非人动物的卵母细胞、宿主胚胎或者来自如本申请 所描述的非人动物的细胞与来自不同非人动物的细胞的融合。
[0459] 在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织 来制备全人源抗体的用途。在一个实施方式中，所述全人源抗体包括分离自如本申请所描 述的非人动物的人源VH结构域和人源V λ结构域。
[0460] 在一个方面，本申请提供了一种用于制备与目标抗原结合的抗体的方法，其中所 述方法包括（a)将如本申请所描述的非人动物暴露于目标抗原，（b)从非人动物分离一种 或多种B淋巴细胞，其中所述一种或多种B淋巴细胞表达与目标抗原结合的抗体，以及（c) 鉴定编码与目标抗原结合的抗体的免疫球蛋白轻链的核酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链 包括人源V λ结构域和非人源轻链恒定结构域，以及（d)使用（c)的核酸序列和人源免疫 球蛋白轻链恒定区核酸序列来制备与目标抗原结合的人源抗体。
[0461] 在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定结构域是小鼠 Ck。在一个实施方式中， 所述非人源轻链恒定结构域是小鼠 CA。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0462] 在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的雄性小鼠，所述小鼠包括在免疫 球蛋白重链基因座的修饰，其中所述具有生育能力的小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的异 位ADAM6序列。
[0463] 在人源化重链小鼠中的异位ADAM6
[0464] 在基因靶向方面的发展，例如在细菌人工染色体（BAC)方面的发展，使得目前能 够对相对较大的基因组片段进行重组。BAC工程化使得能够制备较大的缺失以及将较大的 插入引入小鼠 ES细胞。
[0465] 制备人源抗体的小鼠在过去一段时间内已经能够得到。尽管这代表了在人源治疗 性抗体发展中的一个重要的进步，但是这些小鼠显示出多种显著异常，这些异常限制了小 鼠的应用性。例如，小鼠显示出B细胞发育受损。所述发育受损可能是由于转基因小鼠与 野生型小鼠之间存在的多种差异所致。
[0466] 人源抗体可能无法与小鼠前B细胞或小鼠细胞表面的B细胞受体发生最佳的相互 作用，所述B细胞受体是在克隆选择过程中针对成熟、增殖或存活的信号。全人源抗体可能 无法与小鼠 Fc受体系统发生最佳的相互作用；小鼠表达的Fc受体与相应的人源Fc受体并 不是一一对应的。最后，多种制备全人源抗体的小鼠不包括所有真正的小鼠序列，例如下游 增强子元件和其他基因座控制元件，这些可能是野生型B细胞发育所需的。
[0467] 制备全人源抗体的小鼠通常包括在某种程度上失能的内源性免疫球蛋白基因座， 以及将包括可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人源转基因引入小鼠基因组中的随机位置。 只要内源性基因座充分失能使得无法重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，那么在 这种小鼠中制备全人源抗体的目标就能够实现--尽管B细胞的发育受损。
[0468] 尽管不得不从人源转基因的基因座制备全人源抗体，但是在小鼠中产生人源抗体 显然是一个困难的过程。在一些小鼠中，该过程非常困难，使得无法通过反式转换的机制来 形成嵌合的人源可变/小鼠恒定重链（而非轻链）。通过这种机制，编码全人源抗体的转录 经历由人源同种型向小鼠同种型的反式形式同种型转换。该过程是反式的，因为全人源转 基因的位置远离保留了未受损的小鼠重链恒定区基因拷贝的内源性基因座。尽管在这种小 鼠中反式转换是显而易见的，但是这个现象仍不足以挽救B细胞的发育，B细胞的发育仍然 明显受损。在任何情况下，因为反式转换现象显然不针对轻链发生，所以在这种小鼠中制备 的反式转换抗体均保留全人源轻链；假定反式转换依靠在正常同种型顺式转换中使用的内 源性基因座中（尽管不同）的转换序列。因此，即使当经过工程改造以制备全人源抗体的 小鼠选择反式转换机制来制备具有小鼠恒定区的抗体时，该策略仍不足以挽救正常的B细 胞发育。
[0469] 在发展基于抗体的人用疗法时，首要关注的是制备具有足够大量多样性的人源免 疫球蛋白可变区序列以鉴定有用的可变结构域，所述可变结构域特异性识别特定表位并以 所需的亲和性（通常但并不总是较高的亲和性）与其结合。在开发VELOCIMMUNE?小 鼠（本申请所述）以前，没有迹象表明表达人源可变区和小鼠恒定区的小鼠将与制备来自 转基因的人源抗体的小鼠显示出任何显著的差异。然而，这种假设是不正确的。
[0470] VELOCIΜMUNE?小鼠在内源性小鼠基因座上含有人源免疫球蛋白可变 区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确取代，所述VELOCIMMUNE?小鼠在Β细胞发育 方面显示出与野生型小鼠的令人吃惊的和显著的相似性。在一项令人吃惊和惊叹的 研发中，V E L Ο Cl Μ M U Ν Ε ?小鼠针对免疫接种显示出基本正常的野生型应答，所述 VELOCIMMUNE?小鼠与野生型小鼠仅有的一个显著差异是其响应免疫接种产生的可 变区是全人源的。
[0471] VELΟC丨Μ M U N E?小鼠在内源性基因座上含有使用相应的人源免疫球蛋白可 变区来精确地、大规模地取代生殖细胞系中小鼠免疫球蛋白重链（IgH)和免疫球蛋白轻链 (例如κ轻链，I gK)的可变区。总的来说，小鼠基因座的约6百万个碱基被人源基因组 序列的约1. 5百万个碱基取代。这种精确的取代使得在小鼠中具有杂交的免疫球蛋白基因 座，所述基因座产生具有人源可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠 VH-DH-JH和V κ -J κ 区段的精确取代保留了在杂交免疫球蛋白基因座翼侧小鼠序列的完好性和功能性。所述小 鼠体液免疫系统的功能与野生型小鼠类似。Β细胞发育在全部重要方面都没有受到阻碍，并 且在受到抗原攻击后，在所述小鼠中产生丰度多样的人源可变区。
[0472] VELOCIMMUNE?小鼠是可能的，因为在人和小鼠中重链和κ轻链免疫球蛋白 基因区段的重排是类似的，但这并不是说它们的基因座是相同的或者甚至是接近的，因为 显然不是这样的。然而，所述基因座是足够相似的，能够通过使用基本上覆盖人源免疫球蛋 白基因座等价序列的约1百万个碱基的连续的人源基因组序列来取代含有全部V H、DH和JH 基因区段的约3百万个碱基对的连续的小鼠序列，从而实现重链可变基因座的人源化。
[0473] 在一些实施方式中，进一步使用人源基因序列取代某些小鼠的恒定区基因序列 (例如使用人源CJ序列取代小鼠 CH1序列，和使用人源Q序列取代小鼠 Q序列）使得产 生具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠，所述基因座制备具有人源可变区和部分人源恒定区 的抗体，所述抗体适于例如制备全人源抗体片段例如全人源Fab。具有杂交免疫球蛋白基因 座的小鼠显示出正常的可变基因区段重排，正常的体细胞高频突变和正常的类别转换。这 些小鼠显示出与野生型小鼠无法区分的体液免疫系统，并且显示出在所有B细胞发育阶段 都正常的细胞群和正常的淋巴器官结构--即使是缺乏全人源可变区基因区段库的小鼠 也是如此。对这些小鼠进行免疫产生强的体液应答，所述体液应答显示出可变基因区段用 途的广泛的多样性。
[0474] 小鼠生殖细胞系可变区基因区段的精确取代使得可以制备出具有部分人源免疫 球蛋白基因座的小鼠。由于所述部分人源免疫球蛋白基因座正常地重排、高频突变和类别 转换，因而所述部分人源免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包括人源可变区的抗体。可以对 编码所述可变区的核苷酸序列进行鉴定和克隆，然后与所选择的任意序列（例如适于特定 用途的任意免疫球蛋白同种型）融合（例如在体外系统中），以产生全部来源于人源序列的 抗体或抗原结合蛋白。
[0475] 通过使用重组工程方法来大规模人源化修饰小鼠胚胎干（ES)细胞，以使用含有 一些或基本上全部人源￥ 11、011和JH基因区段的达1百万个碱基的人源基因组序列的等价基 因区段来精确取代包括基本上全部小鼠 VH、DH和JH基因区段的达3百万个碱基的小鼠重链 免疫球蛋白基因座。使用包含编码基本上全部人源Vk和】!^基因区段的两个重复之一的 达0.5百万个碱基的人源基因组区段来取代包含基本上全部小鼠 Vk和】!^基因区段的3 百万个碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的区段。
[0476] 具有这种取代的免疫球蛋白基因座的小鼠可以包括内源性小鼠 ADAM6基因座的 破坏或缺失，所述基因座正常出现在小鼠免疫球蛋白重链基因座的3' -端VH基因区段和 5' -端DH基因区段之间。该区域的破坏能够导致内源性小鼠 ADAM6基因座功能的降低或 消除。如果在该取代中使用人源重链库的3' -端VH基因区段，则在这些VH基因区段之间 即人源VHl-2和V Hl-6之间存在含有似乎是人源ADAM6假基因的假基因的基因间区。然而， 包括这种人源基因间序列的雄性小鼠显示出生育能力的降低。
[0477] 本申请描述了一种包括如上文所述经取代的基因座的小鼠，并且所述小鼠还包括 编码小鼠 ADAM6的异位核酸序列，其中所述小鼠显示出基本正常的生育能力。在一个实施 方式中，所述异位核酸序列包括在经修饰的内源性重链基因座人源V Hl-2基因区段和人源 VH6-1基因区段之间的小鼠 ADAM6a和/或小鼠 ADAM6b序列或其功能性片段。在一个实施 方式中，所述异位核酸序列是位于经修饰的内源性重链基因座的人源VHl-2和V Hl-6之间的 SEQ ID N0:3。SEQ ID N0:3所示的ADAM6基因的转录方向与其周围人源￥11基因区段的转 录方向相反。尽管本申请中的实施例显示了通过取代所示的人源％基因区段之间的异位序 列来挽救生育能力，但是本领域技术人员将理解在小鼠基因组中（或者甚至染色体外）任 意适宜的可转录的基因座的异位序列的取代均预期在雄性小鼠中可相似地挽救生育能力。
[0478] 使用包括小鼠 ADAM6a基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列 来补足缺乏功能性ADAM6基因座的小鼠，这一现象是适用于挽救具有无功能或仅有极低功 能的内源性ADAM6基因座的任意小鼠的通常方法。因此，能够使用本发明的组合物和方法 来挽救包括免疫球蛋白重链基因座的破坏ADAM6的修饰的大量小鼠。因此，本发明包括具 有损坏内源性ADAM6功能的多种免疫球蛋白重链基因座修饰的小鼠。在本说明书中提供了 一些（非限制性的）例子。除了所描述的VELOCIMMUNE?小鼠以外，与ADAM6有关的所 述组合物和方法可以用于很多种应用，例如以多种方式修饰重链基因座。
[0479] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白（或 者其直系同源物或同源物或功能性片段）的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源V H基因 区段取代全部或基本上全部小鼠 VH基因区段，使用人源DH和人源JH基因区段取代全部或 基本上全部小鼠 DH基因区段和JH基因区段；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。在一个 实施方式中，所述小鼠制备的单一可变结构域结合蛋白是选自下述的免疫球蛋白链的二聚 体：(a)人源V H -小鼠 CH1 -小鼠 CH2 -小鼠 CH3 ; (b)人源VH -小鼠铰链-小鼠 CH2 -小 鼠 Ch3 ;和（c)人源VH -小鼠 Ch2 -小鼠 Ch3。
[0480] 在一个方面，挽救生育能力的核苷酸序列位于小鼠中的人源免疫球蛋白重链可变 区序列中（例如在人源VHl-2和VHl-6基因区段之间），所述小鼠具有一个或多个小鼠免疫 球蛋白重链可变基因区段（mVpmDj^P/或mJH)被一个或多个人源免疫球蛋白重链可变基 因区段（hVphDj^P/或hJ H)取代，并且所述小鼠还包括一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻 链可变基因区段（mVK和/或mJ K)被一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段 (hV κ和/或hj κ )取代。在一个实施方式中，所述核苷酸序列位于VELOCIMMUNE?小 鼠中的人源％1-2基因区段和人源￥111-6基因区段之间邮6,596,541和旧7，105,348，其 通过引用并入本申请）。在一个实施方式中，这样修饰的VELOCIMMUNE·?、小鼠包括使用 全部或基本上全部人源免疫球蛋白重链可变基因区段（全部hV H、hD!^PhJH)和全部或基本 上全部人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段（hVK和hjK)的取代。
[0481] 在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包括约3 百万个碱基的小鼠免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫 球蛋白重链可变基因区段包括小鼠免疫球蛋白重链基因座的至少89个乂 11基因区段、至少 13个DH基因区段、至少4个JH基因区段或其组合。在一个实施方式中，所述一个或多个人 源免疫球蛋白重链可变基因区段包括1百万个碱基的人源免疫球蛋白重链基因座。在一个 实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白重链可变基因区段包括人源免疫球蛋白重链 基因座的至少80个V H基因区段、至少27个DH基因区段、至少6个JH基因区段或其组合。
[0482] 在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括 约3百万个碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方式中，所述一个或多个小 鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的至少137个Vk 基因区段、至少5个Jk基因区段或其组合。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫 球蛋白K轻链可变基因区段包括约0.5百万个碱基的人源免疫球蛋白κ轻链基因座。在 一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括人源 免疫球蛋白κ轻链基因座的近端重复（相对于免疫球蛋白κ恒定区）。在一个实施方式 中，所述一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括人源免疫球蛋白κ轻链基 因座的至少40个Vk基因区段、至少5个Jk基因区段或其组合。
[0483] 在一个实施方式中，所述核苷酸序列位于两个人源免疫球蛋白基因区段之间。在 一个特定的实施方式中，所述两个人源免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。
[0484] 在一个方面，功能性小鼠 ADAM6基因座（或者其直系同源物或同源物或功能性片 段）存在于内源性小鼠重链可变区基因座的小鼠基因区段中间，所述基因座不能重排以编 码包含内源性重链恒定区的功能性重链。在一个实施方式中，所述内源性小鼠重链基因座 包括至少1个到至多89个％基因区段、至少1个到至多13个0 11基因区段、至少1个到至 多4个义基因区段及其组合。在各种实施方式中，功能性小鼠 ADAM6基因座（或者其直系 同源物或同源物或功能性片段）编码在小鼠中具有功能的一个或多个ADAM6蛋白，其中所 述一个或多个ADAM6蛋白包括SEQ ID N0:1、SEQ ID Ν0:2和/或其组合。
[0485] 在一个方面，功能性小鼠 ADAM6基因座（或者其直系同源物或同源物或功能性片 段）存在于人源VH基因区段中间，所述人源V H基因区段取代了内源性小鼠￥11基因区段。在 一个实施方式中，至少89个小鼠 VH基因区段被除去并且使用一个或多个人源VH基因区段 取代，并且所述小鼠 ADAM6基因座位于与人源VH基因区段的3'端紧邻，或者在两个人源VH 基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 ADAM6基因座存在于插入的人源VH基 因区段3'末端的约20千碱基（kb)至约40千碱基（kb)中的两fVH基因区段之间。在一 个特定的实施方式中，所述小鼠 ADAM6基因座存在于插入的人源VH基因区段3'末端的约 29kb至约31kb中的两fVH基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 ADAM6基 因座存在于插入的人源％基因区段3'末端约30kb中。在一个特定的实施方式中，所述小 鼠 ADAM6基因座存在于插入的人源￥11基因区段3'末端约30, 184bp中。在一个特定的实施 方式中，所述取代包括人源VH基因区段VHl-2和V H6-1，并且所述小鼠 ADAM6基因座存在于 VH1_2基因区段的下游和VH6-1基因区段的上游。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 ADAM6 基因座存在于人源VHl-2基因区段和人源VH6-1基因区段之间，其中所述小鼠 ADAM6基因座 的5'末端距人源VHl-2基因区段3'末端约13, 848bp，并且所述ADAM6基因座的3'末端距 人源VH6-1基因区段5'末端约29, 737bp。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 ADAM6基因 座包括在小鼠细胞中赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:3或其片段。在一个特定的实施方式中， 然后重排的人源％基因区段如下（相对于人源VH基因区段的转录方向从上游至下游）：人 小鼠 ADAM6基因座-人源VH6-1。在一个特定的实施方式中，在人源￥111-2和人 源V H6-1之间的ADAM6假基因被小鼠 ADAM6基因座取代。在一个实施方式中，与人源VH基 因区段的方向相比，小鼠 ADAM6基因座的一个或多个小鼠 ADAM6a和小鼠 ADAM6b的转录方 向是相反的。或者，所述小鼠 ADAM6基因座存在于3' -端人源VH基因区段和5' -端011基 因区段之间的基因间区。无论所述5'-端DH区段是小鼠的还是人源的，都可以是这样的情 况。
[0486] 类似地，可以修饰一种小鼠，所述小鼠具有用一个或多个人源'基因区段（例如 VK 区段）来取代全部或基本上全部内源性小鼠％基因区段的修饰，以使得例如通 过使用具有包括小鼠 ADAM6基因座或其功能性片段的下游同源臂的靶向载体来维持如上 文所描述的内源性小鼠 ADAM6基因座，或者使用位于两个人源 '基因区段之间或者人源' 基因区段和〇11基因区段（人源或小鼠，例如VA+m/hD H)或J基因区段（人源或小鼠，例如 Vk+Jh)之间的异位序列来取代受损的小鼠 ADAM6基因座。在一个实施方式中，所述取代 包括两个或多个人源\基因区段，并且所述小鼠 ADAM6基因座或其功能性片段存在于两个 3'-端'基因区段之间。在一个特定的实施方式中，人源'基因区段的重排如下（相对于 人源基因区段的转录方向从上游至下游）：人源'3'-1-小鼠 ADAM6基因座-人源'3'。 在一个实施方式中，与人源' 基因区段的方向相比，小鼠 ADAM6基因座的一个或多个小鼠 ADAM6a和小鼠 ADAM6b的转录方向是相反的。或者，所述小鼠 ADAM6基因座存在于3' -端 人源\基因区段和5' _端011基因区段之间的基因间区。无论所述5' _端011区段是小鼠 的还是人源的，都可以是这样的情况。
[0487] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠具有一个或多个内源性小鼠￥11基 因区段的取代，并且所述小鼠包括至少一个内源性小鼠因区段。在这样的小鼠中，内源 性小鼠 VH基因区段的修饰可以包括一个或多个3'-端VH基因区段而不是5'-端DH基因区 段的修饰，在此处已经多加谨慎以使得一个或多个3'-端￥ 11基因区段的修饰不会破坏内源 性小鼠 ADAM6基因座或使得内源性小鼠 ADAM6基因座不具有功能。例如，在一个实施方式 中，所述小鼠包括使用一个或多个人源％基因区段来取代全部或基本上全部的内源性小鼠 VH基因区段，并且所述小鼠包括一个或多个内源性DH基因区段和功能性内源性小鼠 ADAM6 基因座。
[0488] 在另一个实施方式中，所述小鼠包括内源性小鼠3' -端￥11基因区段的修饰，以及 一个或多个内源性小鼠 DH基因区段的修饰，并且实施所述修饰以维持内源性小鼠 ADAM6基 因座的完整性，使得达到使所述内源性ADAM6基因座维持功能性的程度。在一个例子中，这 种修饰是分两步进行的：（1)使用一个或多个人源V H基因区段取代3'-端内源性小鼠￥11基 因区段，所述人源VH基因区段使用具有上游同源臂和下游同源臂的靶向载体，其中所述下 游同源臂包括全部或部分功能性的小鼠 ADAM6基因座；(2)然后使用具有上游同源臂的靶 向载体来取代内源性小鼠〇11基因区段，所述上游同源臂包括小鼠 ADAM6基因座的全部或功 能性部分。
[0489] 在各种方面，使用含有编码小鼠 ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性 同源物的异位序列的小鼠是有用的，该修饰破坏内源性小鼠 ADAM6的功能。当对小鼠免疫 球蛋白基因座进行修饰时，特别是当对小鼠免疫球蛋白重链可变区及其周围序列进行修饰 时，破坏内源性小鼠 ADAM6功能的概率较高。因此，当制备具有免疫球蛋白重链基因座全部 或部分缺失，全部或部分人源化，或者全部或部分被取代（例如使用Vk或νλ序列）的小 鼠时，这种小鼠提供了特别的益处。制备用于对下文所描述的小鼠进行所述基因修饰的方 法是本领域技术人员所公知的。
[0490] 含有编码小鼠 ADAM6蛋白或者与赋予生育能力益处的小鼠 ADAM6蛋白基本相同或 相似的蛋白的小鼠，在破坏或缺失内源性小鼠 ADAM6序列的小鼠免疫球蛋白重链可变基因 座的修饰方面特别有用。尽管主要描述了表达具有人源可变区和小鼠恒定区的抗体的小 鼠，但是这种小鼠在破坏内源性小鼠 ADAM6基因的任何基因修饰中均是有用的。本领域技 术人员将理解这包含了多种多样的基因修饰小鼠，所述小鼠含有小鼠免疫球蛋白重链可变 基因座的修饰。这些包括例如不管其他修饰，具有全部或部分小鼠免疫球蛋白重链基因区 段缺失或取代的小鼠。非限制性的例子如下文所述。
[0491] 在一些方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括在小鼠中具有功 能的异位的小鼠、啮齿动物或其他ADAM6基因（或者其直系同源物或同源物或片段），以及 一个或多个人源免疫球蛋白可变和/或恒定区基因区段。在各种实施方式中，在小鼠中具 有功能的其他ADAM6基因直系同源物或同源物或片段可以包括来自牛、犬、灵长类、家兔或 其他非人源序列的序列。
[0492] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白的异 位ADAM6序列，使用一个或多个人源V H基因区段取代全部或基本上全部的小鼠 VH基因区 段；使用一个或多个人源DH基因区段取代全部或基本上全部的小鼠 DH基因区段；以及使用 一个或多个人源JH基因区段取代全部或基本上全部的小鼠 JH基因区段。
[0493] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源CH1核苷酸序列取代小鼠 CH1核苷酸 序列。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源铰链核苷酸序列取代小鼠铰链核苷酸 序列。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源免疫球蛋白轻链可变基因座取代免疫 球蛋白轻链可变基因座（\和1)。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源免疫球蛋 白轻链恒定区核苷酸序列取代小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列。在一个特定的实施 方式中，所述和Q是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 包括与人源铰链和人源C H1序列融合的小鼠 CH2和小鼠 CH3免疫球蛋白恒定区序列，这样所 述小鼠的免疫球蛋白基因座重排以形成编码结合蛋白的基因，所述结合蛋白包括（a)具有 人源可变区、人源CH1区、人源铰链区以及小鼠 CH2和小鼠 CH3区的重链；和（b)编码包括人 源可变结构域和人源恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。
[0494] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白的异 位ADAM6序列，使用一个或多个人源 '基因区段取代全部或基本上全部的小鼠 VH基因区 段，以及任选地使用一个或多个人源DH基因区段和/或人源JH基因区段取代全部或基本上 全部的D H基因区段和/或JH基因区段，或者任选地使用一个或多个人源1基因区段取代 全部或基本上全部的D H基因区段和JH基因区段。
[0495] 在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个\、一个或多个DH和一个或多 个J基因区段（例如Jk或JA)取代全部或基本上全部的小鼠 Vh、Dj^P义基因区段，其中 所述基因区段与内源性小鼠铰链区任选地连接，其中所述小鼠形成重排的免疫球蛋白链基 因，所述基因从5'至3'的转录方向含有：人源人源或小鼠 DH-人源或小鼠 J-小鼠 铰链-小鼠 CH2-小鼠 CH3。在一个实施方式中，所述J区是人源Jk区。在一个实施方 式中，所述J区是人源JH区。在一个实施方式中，所述J区是人源JA区。在一个实施方 式中，所述人源\区选自人源νλ区和人源Vk区。
[0496] 在特定实施方式中，所述小鼠表达具有小鼠或人源恒定区和可变区的单一可变结 构域抗体，所述可变区来源于人源Vk、人源D H和人源Jk ;人源Vk、人源DH和人源JH;人 源V λ、人源DH和人源J λ ;人源V λ、人源DH和人源JH ;人源V κ、人源DH和人源J λ ;人源 VA、人源DH和人源Jk。在特定实施方式中，对重组识别序列进行修饰，以使得能够在所述 的V、D和J基因区段之间或者在所述的V和J基因区段之间产生多产的重排。
[0497] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白（或者 其直系同源物或同源物或功能性片段）的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源\基因区 段取代全部或基本上全部小鼠乂 11基因区段，使用人源1基因区段取代全部或基本上全部小 鼠 DH基因区段和JH基因区段；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。
[0498] 在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码CH1结构域的序列。在一个实施方式中，所 述小鼠缺乏编码铰链区的序列。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码C H1结构域和铰链 区的序列。
[0499] 在一个特定的实施方式中，所述小鼠表达包括人源免疫球蛋白轻链可变结构域 (入或κ)的结合蛋白，所述轻链可变结构域与同小鼠 Ch3结构域连接的小鼠 CH2结构域融 合。
[0500] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白（或者 其直系同源物或同源物或功能性片段）的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源\基因区 段取代全部或基本上全部小鼠乂 11基因区段，使用人源1基因区段取代全部或基本上全部小 鼠〇11和JH基因区段。
[0501] 在一个实施方式中，所述小鼠包括编码CH1区、铰链区、CH1和铰链区、或者C H1区和 铰链区和CH2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的缺失。
[0502] 在一个实施方式中，所述小鼠制备单一可变结构域结合蛋白，所述结合蛋白包括 选自下述的同源二聚体：（a)人源八-小鼠 CH1 -小鼠 CH2 -小鼠 CH3 ; (b)人源 ' -小鼠 铰链-小鼠 Ch2 -小鼠 Ch3 ; (c)人源八-小鼠 Ch2 -小鼠 Ch3。
[0503] 在一个方面，本申请提供了一种具有失能的内源性重链免疫球蛋白基因座的小 鼠，所述小鼠包括失能的或缺失的内源性小鼠 ADAM6基因座，其中所述小鼠包括表达人源 或小鼠或人源/小鼠或其他嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列存在 于随机整合至小鼠的基因组的经整合的转基因上。在一个实施方式中，所述核酸序列在野 生型小鼠中不存在的游离基因（例如染色体）上。
[0504] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括失能的内源性免疫球蛋白轻链基因座。在一 个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白轻链基因座选自κ和λ轻链基因座。在一 个特定的实施方式中，所述小鼠包括失能的内源性κ轻链基因座和失能的λ轻链基因座， 其中所述小鼠表达包括人源免疫球蛋白重链可变结构域和人源免疫球蛋白轻链结构域的 抗体。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链结构域选自人源κ轻链结构域和人源 λ轻链结构域。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括失能的内源性κ轻链基因座，其 中所述小鼠表达抗体，所述抗体包括人源/小鼠（即人源可变/小鼠恒定）免疫球蛋白重 链和含有人源νλ结构域的人源/小鼠免疫球蛋白轻链。在一个实施方式中，所述人源/ 小鼠免疫球蛋白轻链包括小鼠 Ck。在一个实施方式中，所述人源/小鼠免疫球蛋白轻链包 括小鼠 CA。在一个特定的实施方式中，所述小鼠 CA是CA 2。
[0505] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的动物，所述动物表达嵌合抗体并且表 达在基因修饰的动物中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物。
[0506] 在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所 述基因修饰的动物是小鼠，并且所述ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物来源于与基因 修饰的动物不同品系的小鼠品系。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是仓鼠科啮齿 动物（例如仓鼠、新世界大鼠或小鼠、田鼠），并且所述ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自 鼠科啮齿动物（例如真小鼠或大鼠、沙鼠、多刺小鼠、黄冠鼠）。在一个实施方式中，所述基 因修饰的动物是鼠科啮齿动物，并且所述ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自仓鼠科啮齿 动物。
[0507] 在一个实施方式中，嵌合抗体包括人源可变结构域和啮齿动物的恒定区序列。在 一个实施方式中，所述啮齿动物选自仓鼠科啮齿动物和鼠科啮齿动物。在一个特定的实施 方式中，所述仓鼠科和所述鼠科啮齿动物是小鼠。在一个特定的实施方式中，所述仓鼠科和 所述鼠科啮齿动物是大鼠。在一个实施方式中，嵌合抗体包括人源可变结构域以及来自选 自小鼠或大鼠的动物的恒定结构域；在一个特定的实施方式中，所述小鼠或大鼠选自仓鼠 科和鼠科。在一个实施方式中，嵌合抗体包括人源重链可变结构域、人源轻链可变结构域以 及来源于选自小鼠和大鼠的啮齿动物的恒定区序列，其中所述人源重链可变结构域和人源 轻链是同源的。在一个特定的实施方式中，同源包括来自单一 B细胞的人源重链和人源轻 链可变结构域，所述B细胞同时表达人源轻链可变结构域和人源重链可变结构域并且所述 可变结构域均存在于单个B细胞的表面上。
[0508] 在一个实施方式中，嵌合抗体由免疫球蛋白基因座表达。在一个实施方式中，嵌合 抗体的重链可变结构域由重排的内源性免疫球蛋白重链基因座表达。在一个实施方式中， 嵌合抗体的轻链可变结构域由重排的内源性免疫球蛋白轻链基因座表达。在一个实施方式 中，嵌合抗体的重链可变结构域和/或嵌合抗体的轻链可变结构域由重排的转基因（例如 来源于未经重排的核酸序列的重排的核酸序列，所述未经重排的核酸序列在不同于内源性 免疫球蛋白基因座的基因座上整合至动物基因组）表达。在一个实施方式中，嵌合抗体的 轻链可变结构域由重排的转基因（例如来源于未经重排的核酸序列的重排的核酸序列，所 述未经重排的核酸序列在不同于内源性免疫球蛋白基因座的基因座上整合至动物基因组） 表达。
[0509] 在一个特定的实施方式中，所述转基因由转录活化的基因座表达，所述基因座例 如R0SA26基因座，例如鼠源性（如小鼠）R0SA26基因座。
[0510] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述非人动物包括人源化的免疫球蛋 白重链基因座，其中所述人源化的免疫球蛋白重链基因座包括非人源的ADAM6序列或者其 直系同源物或同源物。
[0511] 在一个实施方式中，所述非人动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物。
[0512] 在一个实施方式中，所述非人动物ADAM6直系同源物或同源物是与小鼠ADAM6序 列直系同源和/或同源的序列，其中所述直系同源物或同源物在非人动物中具有功能。
[0513] 在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠，并且所述ADAM6直系同 源物或同源物来自选自小鼠、大鼠和仓鼠的非人动物。在一个特定的实施方式中，所述非人 动物是小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同小鼠物种、大鼠和仓鼠的 动物。在特定的实施方式中，所述非人动物是大鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来 自选自不同大鼠物种、小鼠和仓鼠的啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述非人动物是 仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同仓鼠物种、小鼠和大鼠的啮齿动 物。
[0514] 在一个特定的实施方式中，所述非人动物来自鼠形亚目（Myomorpha)，并且所述 ADAM6序列来自选自跳鼠总科（Dipodoidea)的啮齿动物和鼠总科（Muroidea)的啮齿动物 的动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科中的小鼠，并且所述ADAM6直系 同源物或同源物来自鼠总科中的小鼠或大鼠或仓鼠。
[0515] 在一个实施方式中，所述人源化重链基因座包括一个或多个人源乂11基因区段、一 个或多个人源D H基因区段和一个或多个人源JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述 一个或多个人源％基因区段、一个或多个人源D H基因区段和一个或多个人源JH基因区段与 一个或多个人源、嵌合和/或啮齿动物（例如小鼠或大鼠）恒定区基因任选地连接。在一 个实施方式中，所述恒定区基因是小鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因是大鼠的。 在一个实施方式中，所述恒定区基因是仓鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因包括选 自铰链、Ch2、C h3及其组合的序列。在特定实施方式中，所述恒定区基因包括铰链、Ch2和Ch3 序列。
[0516] 在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列与人源免疫球蛋白重链序列邻近。在 一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列位于人源免疫球蛋白重链序列中。在一个特定的 实施方式中，所述人源免疫球蛋白重链序列包括V、D和/或J基因区段。
[0517] 在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列与V基因区段是毗邻的。在一个实施 方式中，所述非人源ADAM6序列位于两个V基因区段之间。在一个实施方式中，所述非人源 ADAM6序列在V和D基因区段之间是毗邻的。在一个实施方式中，所述小鼠 ADAM6序列位 于V和J基因区段之间。在一个实施方式中，所述小鼠 ADAM6序列在D和J基因区段之间 是毗邻的。
[0518] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括表达与来自 免疫球蛋白基因座的人源 '结构域同源的人源VH结构域的B细胞，其中所述非人动物表达 来自免疫球蛋白基因座的非免疫球蛋白非人源蛋白。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋 白非人源蛋白是ADAM蛋白。在一个特定的实施方式中，所述ADAM蛋白是ADAM6蛋白或者 其直系同源物或同源物或功能性片段。
[0519] 在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物（例如小鼠或大鼠）。在一个实施方 式中，所述啮齿动物是鼠科的。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科的。在一个特定 的实施方式中，所述鼠总科的啮齿动物选自小鼠和大鼠。
[0520] 在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白非人源蛋白是啮齿动物蛋白。在一个实施 方式中，所述啮齿动物是鼠科的。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科的。在一个特 定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
[0521] 在一个实施方式中，所述人源VH和 '结构域直接或通过接头与免疫球蛋白恒定结 构域序列连接。在一个特定的实施方式中，所述恒定结构域序列包括选自铰链、CH2、C H3及 其组合的序列。在一个特定的实施方式中，所述人源'结构域选自Vk或νλ结构域。
[0522] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物在其生殖细胞系 中包括人源免疫球蛋白序列，其中所述雄性非人动物的精子的特征是体内迁移缺陷。在一 个实施方式中，所述在体内迁移缺陷包括雄性非人动物的精子不能由子宫迁移至相同物种 雌性非人动物的输卵管。在一个实施方式中，所述非人动物缺乏编码ADAM6蛋白或其功能 性片段的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段包括 ADAM6a和/或ADAM6b蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动 物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
[0523] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述动物包括与编码ADAM6蛋白或者 其直系同源物或同源物或功能性片段的非人序列邻近的人源免疫球蛋白序列。在一个实施 方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大 鼠和仓鼠。
[0524] 在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是免疫球蛋白重链序列。在一个实 施方式中，所述免疫球蛋白序列包括一个或多个％基因区段。在一个实施方式中，所述人 源免疫球蛋白序列包括一个或多个〇 11基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白 序列包括一个或多个JH基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括一个 或多个V H基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段。
[0525] 在一个实施方式中，所述免疫球蛋白序列包括在天然人源库中具有较高频率的一 个或多个V H基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括不超 过两个VH基因区段、不超过3个V H基因区段、不超过4个VH基因区段、不超过5个VH基因 区段、不超过6个V H基因区段、不超过7个VH基因区段、不超过8个VH基因区段、不超过9 个％基因区段、不超过10 fVH基因区段、不超过11 fVH基因区段、不超过12 fVH基因区 段、不超过13个VH基因区段、不超过14个VH基因区段、不超过15个V H基因区段、不超过 16个VH基因区段、不超过17个VH基因区段、不超过18个V H基因区段、不超过19个VH基 因区段、不超过20个VH基因区段、不超过21个V H基因区段、不超过22个VH基因区段或不 超过23 fVH基因区段。
[0526] 在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括5个￥11基因区段。在 一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括10个VH基因区段。在一个特定 的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括15个VH基因区段。在一个特定的实施方 式中，所述一个或多个V H基因区段包括20个VH基因区段。
[0527] 在各种实施方式中，所述VH基因区段选自Vh6-1、V h1-2、Vh1-3、Vh2-5、Vh3-7、V h1_8、 Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、V h3-16、Vh1-18、Vh3-20、Vh3-21、V h3-23、Vh1-24、Vh2-26、 Vh4-28、Vh3-30、Vh4-31、Vh3-33、V h4-34、Vh3-35、Vh3-38、Vh4-39、V h3-43、Vh1-45、Vh1-46、 Vh3-48、Vh3-49、Vh5-51、Vh3-53、V h1-58、Vh4-59、Vh4-61、Vh3-64、V h3-66、Vh1-69、Vh2-70、 Vh3-72、Vh3-73和Vh3-74。在各种实施方式中，所述V h基因区段选自Vh1-2、Vh1-8、Vh1-18、 Vh1-46,Vh1-69,Vh3-7,Vh3-9,V h3-1UVh3-13,Vh3-15,Vh3-2UV h3-23,Vh3-30,Vh3-33,Vh3-43, Vh3-48、Vh4-31、Vh4-34、Vh4-39、V h4-59、Vh5-51 和 Vh6-1。在各种实施方式中，所述 VH 基因 区段选自 Vh1_18、Vh1_46、Vh1-69、Vh3-7、V h3-11、Vh3-15、Vh3-21、Vh3-23、V h3-30、Vh3-33、 Vh3-48、Vh4-34、Vh4-39、Vh4-59和V h5-5 1。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1 -18、 VHl-69、VH3-7、VH3-11、VH3-15、V H3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-43、V H3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5_51。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-18、V H3-11、VH3-21、VH3-23、VH3-30、 Vh4-39和Vh4-59。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自V h1-18、Vh3-2 1、Vh3-23、Vh3-30 和Vh4-39。在各种实施方式中，所述V H基因区段选自％1-18、￥113-23和￥114-39。在各种实 施方式中，所述V H基因区段选自VH3-21、￥113-23和VH3-30。在各种实施方式中，所述￥ 11基 因区段选自 Vh3_23、Vh3-30 和 Vh4-39。
[0528] 在一个特定的实施方式中，人源免疫球蛋白序列包括至少18fVH基因区段、27个 DH基因区段和6个JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括 至少39个V H基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。在一个特定的实施方式中， 所述人源免疫球蛋白序列包括至少80个V H基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区 段。
[0529] 在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述小鼠包括使用一个或多个人 源VH基因区段取代内源性小鼠 VH基因区段，其中所述人源VH基因区段与小鼠 CH区基因可 操作地连接，以使得所述小鼠重排所述人源VH基因区段并且表达包括人源V H结构域和小鼠 CH的反向嵌合免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，90-100%的未经重排的小鼠 VH基因区 段被至少一个未经重排的人源％基因区段取代。在一个特定的实施方式中，全部或基本上 全部的内源性小鼠 VH基因区段被至少一个未经重排的人源￥11基因区段取代。在一个实施方 式中，所述取代是使用至少19个、至少39个、或者至少80或81个未经重排的人源V H基因 区段。在一个实施方式中，所述取代是使用至少12个功能性未经重排的人源VH基因区段、 至少25个功能性未经重排的人源V H基因区段或者至少43个功能性未经重排的人源VH基 因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括使用至少一个未经重排的人源D H区段和至少一 个未经重排的人源JH区段取代全部小鼠 JH区段。在一个实施方式中，所述至少一个未 经重排的人源 DH 区段选自 1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、 6-13、7-27及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个未经重排的人源义区段选自1、2、 3、4、5、6及其组合。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源￥ 11基因区段选自1-2、 1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、 4-39、4-59、5-51、6-1人源V H基因区段及其组合。
[0530] 在各种实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是在与非人动物（例如啮齿动物， 例如小鼠、大鼠或仓鼠）生殖细胞系的恒定区的可操作连接中。在一个实施方式中，所述恒 定区是人源、嵌合人源/小鼠或嵌合人源/大鼠或嵌合人源/仓鼠、小鼠、大鼠或仓鼠恒定 区。在一个实施方式中，所述恒定区是啮齿动物（例如小鼠或大鼠或仓鼠）恒定区。在一 个特定的实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。在各种实施方式中，所述恒定区包括至 少G2结构域和C H3结构域。
[0531] 在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白重链序列位于非人动物（例如啮齿动 物，例如小鼠或大鼠或仓鼠）生殖细胞系中的免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中， 所述人源免疫球蛋白重链序列位于非人动物生殖细胞系中的非免疫球蛋白重链基因座，其 中所述非重链基因座是转录活化的基因座。在一个特定的实施方式中，所述非重链基因座 是R0SA26基因座。
[0532] 在各种方面，所述非人动物还包括在非人动物生殖细胞系中的人源免疫球蛋白轻 链序列（例如一个或多个未经重排的轻链V和J序列，或者一个或多个重排的VJ序列）。 在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白轻链序列是免疫球蛋白λ轻链序列。在一个实 施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括一个或多个νλ基因区段。在一个实施方式 中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括一个或多个JA基因区段。在一个实施方式中，所述 人源免疫球蛋白轻链序列包括一个或多个Vλ基因区段和一个或多个Jλ基因区段。
[0533] 在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少12个νλ基因 区段和1个JA基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括 至少12个νλ基因区段和4个JX基因区段。
[0534] 在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少28个νλ基因 区段和1个JA基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括 至少28个νλ基因区段和4个JA基因区段。
[0535] 在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少40个νλ基因 区段和1个JA基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括 至少40个νλ基因区段和4个JA基因区段。
[0536] 在各种实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列是在与非人动物（例如啮齿动 物，例如小鼠、大鼠或仓鼠）生殖细胞系的恒定区的可操作连接中。在一个实施方式中，所 述恒定区是人源、嵌合人源/啮齿动物、小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。在一个特定的实施方式 中，所述恒定区是小鼠或大鼠恒定区。在一个特定的实施方式中，所述恒定区是小鼠 κ恒 定（mCK)区或大鼠 κ恒定（rCK)区。在一个特定的实施方式中，所述恒定区是小鼠 λ 恒定（mCl)区或大鼠 λ恒定（rCA)区。在一个实施方式中，所述小鼠 CX区是小鼠以2 区。
[0537] 在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列位于非人动物生殖细胞系中的 免疫球蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，在非人动物生殖细胞系中的所述免疫 球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，在非人动物生 殖细胞系中的所述免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个实施方式 中，所述人源免疫球蛋白轻链序列是转录活化的、位于非人动物生殖细胞系中的非免疫球 蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是R0SA26基因座。
[0538] 在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗体的方法，其中所述人源抗体包括来 源于在如本申请所描述的非人动物细胞中由一个或多个可变区核酸序列编码的可变结构 域。
[0539] 在一个方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括含有抗体或抗 体片段的多肽，所述抗体或抗体片段来源于分离自如本申请所描述的非人动物的一个或多 个可变区核酸序列。在一个实施方式中，所述多肽是抗体。在一个实施方式中，所述多肽是 仅具有重链的抗体。在一个实施方式中，所述多肽是单链可变片段（例如scFv)。
[0540] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物制备抗体的用途。在 各种实施方式中，所述抗体包括一个或多个可变结构域，所述可变结构域来源于分离自所 述非人动物的一个或多个可变区核酸序列。在一个特定的实施方式中，所述可变区核酸序 列包括免疫球蛋白重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述可变区核酸序列包括免 疫球蛋白轻链基因区段。
[0541] 表达人源λ可变结构域的小鼠
[0542] 包括由于ADAM蛋白活性（例如ADAM6依赖性）丧失导致生育能力降低的修饰的 经基因修饰的非人动物（例如小鼠、大鼠等）可以与如本申请所描述的在内源性非人源或 (例如转基因）人源恒定轻链基因上包括人源λ可变序列的非人动物交配。例如，将包括 ADAM6基因受损（或ADAM6基因缺失）的非人动物如小鼠或大鼠（例如具有人源化免疫球 蛋白重链基因座的动物），与包括轻链基因座（内源性或转基因）的小鼠结合，所述轻链基 因座包括与人源或非人源（例如内源性小鼠或大鼠）轻链恒定区基因连接的人源λ区段 和几区段，其中所述非人动物包括恢复ADAM依赖的生育能力的活性。恢复ADAM依赖的生 育能力的基因修饰可以在非人动物（例如具有人源化重链的小鼠）中，或者在具有人源化 λ可变区段的小鼠中。后代包括形成人源化重链（即造成表达人源重链可变结构域）和 人源化轻链基因座（即造成表达与人源或非人源λ或 κ区融合的人源λ轻链可变结构 域）的基因，其中所述动物显示出与缺乏ADAM6活性或者缺乏ADAM6直系同源物或同源物 的活性的小鼠相比增加的生育能力。
[0543] VELOC丨Μ M UΝ Ε?基因工程改造的小鼠包括在内源性小鼠基因座上使用人源 V (D) J基因区段取代未经重排的V (D) J基因区段。VELOCΙΜMUΝΕ?小鼠表达具有人源 可变结构域和小鼠恒定结构域的嵌合抗体（参见例如美国专利号7, 605, 237)。大多数其他 报告涉及表达来自小鼠中全人源转基因的全人源抗体的小鼠，所述小鼠具有已失能的内源 性免疫球蛋白基因座。
[0544] 抗体轻链由下面两个独立的基因座之一编码：Κ和λ。小鼠抗体轻链主要为κ 型。制备小鼠抗体的小鼠和制备全人源或嵌合型人源-小鼠抗体的经修饰的小鼠均显示出 对轻链使用的偏好。在人类中也表现出轻链偏好，但是不如在小鼠中明显；在小鼠中κ轻 链与λ轻链之比为约95:5,而在人类中该比率为约60:40。在小鼠中更加显著的偏好并不 会严重影响抗体的多样性，因为在第一个例子中在小鼠中λ可变基因座并不是非常多样 的。而在人类中不是这样的。人源λ轻链基因座是非常多样的。
[0545] 人源λ轻链基因座延续超过1，OOOkb并且含有超过80个基因，所述基因编码可 变（V)或连接（J)区段（图19)。在人源λ轻链基因座中，在所有已观察到的νλ结构域 中半数以上是由基因区段1-40、1_44、2-8、2-14和3-21编码。总之，据信约30个左右的人 源νλ基因区段是功能性的。共有7个JA基因区段，认为其中仅有4个是通常具有功能 性的JA基因区段-JA1、JA2、JA3和JA7。
[0546] 在人类中的λ轻链基因座在结构上与小鼠和人源的λ基因座类似，因为在人源 λ轻链基因座中具有若干能够重组以形成功能性轻链蛋白的可变区基因区段。人源λ轻 链基因座含有约70个V基因区段和7个JA-CA基因区段对。在这些JA-CA基因区段对 中仅有4个似乎是功能性的。在一些等位基因中，据报道第五个JA-CA基因区段对是假 基因 （CA 6)。所述70个νλ基因区段似乎含有38个功能性基因区段。所述70个νλ序 列排布在3个簇中，簇全都含有独特的V基因家族群的不同成员（簇Α、Β和C，图19)。这 是用于在非人动物中产生具有人源V区抗体的相对未开发的多样性的潜在丰富来源。
[0547] 与之形成鲜明对比的是，小鼠 λ轻链基因座仅含有2或3个（取决于品系）小鼠 νλ区基因区段（图20)。至少因为这个原因，并不认为在小鼠中严重的κ偏好会对总的 抗体多样性产生特别的不利影响。
[0548] 根据小鼠 λ轻链基因座的已公开的谱图，所述基因座基本上由在约200kb跨距中 的两个基因区段簇组成（图20)。这两个簇含有能够独立重排的两个V、J和C基因集合： λ 2_J λ 2_C λ 2_J λ 4_C λ 4 和 V λ 1_J λ 3_C λ 3_J λ 1_C λ 1 〇 尽管已发现 VA2 与所有 JA 基因区段重组，但是V λ 1似乎仅与c λ 1重组。据信c λ 4是具有剪接位点缺陷的假基因。
[0549] 小鼠 κ轻链基因座是截然不同的。参与重组事件以便由小鼠Κ基因座产生功能 性轻链蛋白的基因区段的结构和数量是更加复杂的（图21)。因此，在典型的小鼠中，小鼠 λ轻链对抗体群多样性的贡献并不太大。
[0550] 利用小鼠中人源λ轻链基因座丰富的多样性将可能产生除其他方面以外更加完 整的人源轻链V结构域库的来源。此前挖掘这种多样性的尝试是使用随机整合至小鼠基因 组的含有人源λ轻链基因座块的人源转基因（参见例如US 6, 998, 514和US7, 435, 871)。 已报道含有这些随机整合的转基因的小鼠表达全人源λ轻链，然而，在一些例子中，一个 或两个内源性轻链基因座仍是完好的。这种情况是不理想的，因为在所表达的小鼠抗体库 中人源λ轻链序列与小鼠轻链（ κ或λ)相竞争。
[0551] 而相反的是，本发明人描述了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠能够直接从小鼠轻 链基因座（包括通过在内源性小鼠轻链基因座的取代）表达一种或多种λ轻链核酸序列。 能够从内源性基因座表达人源λ轻链序列的基因修饰的小鼠可以进一步与包括人源重链 基因座的小鼠繁殖，以用于表达包括全人源的V区（重链和轻链）的抗体。在各种实施方 式中，V区表达小鼠恒定区。在各种实施方式中，不存在内源性小鼠免疫球蛋白基因区段， 并且V区表达人源恒定区。这些抗体在诊断和治疗方面的很多应用中将被证明是有用的。
[0552] 针对在小鼠中表达来源于人源νλ和JA基因区段的结合蛋白的各种实施方式能 够实现多种优势。能够通过在内源性轻链基因座（例如小鼠 κ或λ基因座）上使用人源 λ序列取代来实现优势。使用这种小鼠制备的抗体可以具有轻链，所述轻链包括与小鼠 Q 区特别是小鼠 Ck或CA区融合的人源νλ结构域。所述小鼠还将表达人源νλ结构域， 所述νλ结构域适于使用人源Q区特别是Ck和/或CA区的鉴别和克隆。由于在这种 小鼠中Β细胞发育是正常的，所以可能在CA或Ck区背景下产生相容的νλ结构域（包 括体细胞突变的V λ结构域）。
[0553] 本申请描述了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括在免疫球蛋白κ或λ轻链基 因座上的未经重排的νλ基因区段。本申请描述了一种表达抗体的小鼠，所述抗体包括具 有与CK和/或CA区融合的人源νλ结构域的轻链。
[0554] 在一个方面，本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括（1)在非人 动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座上的一个或多个未经重排的人源νλ基因区段和一 个或多个未经重排的人源JA基因区段，（2)在非人动物的内源性免疫球蛋白重链基因座 上的一个或多个人源V H基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因 区段，其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段，其中所述ADAM6蛋白在雄性 非人动物中具有功能。在一个方面，本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物表达 含有包括人源V H结构域和非人源重链恒定区的重链以及包括人源V λ结构域和非人源轻 链恒定区的轻链的抗体，其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段。在各种 实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
[0555] 在一个实施方式中，所述非人动物轻链恒定结构域是Ck或C λ结构域。在一个实 施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段是由小鼠生殖细胞系中的异位序列所编码。在 一个实施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段是由非人动物的内源性序列所编码。
[0556] 在一个实施方式中，所述非人动物的内源性轻链基因座是免疫球蛋白λ轻链基 因座。在一个实施方式中，所述非人动物的内源性轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因 座。
[0557] 在一个实施方式中，所述非人动物在内源性轻链基因座上缺乏内源性 '和/或叉 基因区段。在一个特定的实施方式中，所述'和/或叉基因区段是Vk和/*JK基因区 段。在一个特定的实施方式中，所述VL和/或几基因区段是νλ和/或JA基因区段。
[0558] 在一个实施方式中，所述非人动物的'和1基因区段被一个或多个人源νλ和一 个或多个人源JA基因区段取代。在一个特定的实施方式中，所述非人动物的'和1基因 区段是 Κ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物的'和1基因区段是λ基 因区段。
[0559] 在一个实施方式中，所述一个或多个人源νλ基因区段来自人源免疫球蛋白λ轻 链基因座簇Α的片段。在一个特定的实施方式中，所述簇Α的片段由人源νλ 3-27延伸至人 源νλ 3-1。在一个特定的实施方式中，所述簇Α的片段由人源νλ 3-12延伸至人源JA1。在 一个实施方式中，所述一个或多个人源νλ基因区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座簇 Β的片段。在一个特定的实施方式中，所述簇Β的片段由人源V λ 5-52延伸至人源V λ 1-40。 在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源νλ基因区段来自如本申请所描述的人源 免疫球蛋白λ轻链基因座的簇Α的片段和簇Β的片段。
[0560] 在一个实施方式中，所述非人动物包括至少12个人源νλ基因区段。在一个实施 方式中，所述非人动物包括至少28个人源νλ基因区段。在一个实施方式中，所述非人动 物包括至少40个人源V λ基因区段。
[0561] 在一个实施方式中，所述至少一个人源J λ基因区段选自下组：J λ 1、J λ 2、J λ 3、 JA 7及其组合。
[0562] 在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的非人雄性动物，其中所述具有生 育能力的非人动物表达（1)包括人源νλ结构域或人源VK结构域的免疫球蛋白轻链，和 (2)包括人源V H结构域的免疫球蛋白重链，其中所述雄性非人动物包括经修饰的重链可变 区基因座和在雄性非人动物中具有功能的异位ADAM6基因。在一个实施方式中，所述非人 动物是小鼠。
[0563] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物制备抗原结合蛋白的 用途。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源的。在一个实施方式中，所述抗原结合 蛋白是抗体。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白包括来源于如本申请所描述的非人动 物的人源V H结构域和/或人源V λ结构域。
[0564] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组 织。在一个实施方式中，所述组织来源于脾脏、骨髓或淋巴结。在一个实施方式中，所述细 胞是Β细胞。在一个实施方式中，所述细胞是胚胎干（ES)细胞。在一个实施方式中，所述 细胞是生殖细胞。
[0565] 在一个方面，本申请提供了一种卵母细胞，所述细胞包括如本申请所描述的基因 修饰的非人动物的二倍体基因组。
[0566] 免疫球蛋白κ轻链基因座的不育的（sterile)转录本
[0567] 在能够进行这种表达的基因修饰小鼠的各种实施方式反映了在小鼠中表达人源 免疫球蛋白λ序列方面的变化。因此，在一些实施方式中，所述基因修饰的小鼠包括某些 来自于人源基因座的非编码序列。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠包括在内源性 κ轻链基因座上的人源νλ和JA基因区段，并且还包括人源Κ轻链基因组片段。在一 个特定的实施方式中，所述人源κ轻链基因组片段是天然存在于人源Vk基因区段和人源 JK基因区段之间的非编码序列。
[0568] 所述人源和小鼠 κ轻链基因座包括编码缺乏起始密码子或开放阅读框架的不育 的转录本的序列，并且认为所述序列是调控κ轻链基因座转录的元件。这些不育的转录本 由基因间序列产生，所述基因间序列位于最近端Vk基因区段的下游或3'端和κ轻链内 含子增强子（Εκ i)的上游或5'端，所述增强子位于κ轻链恒定区基因（Ck)的上游。所 述不育的转录本由所述基因间序列重排产生，以形成同Ck融合的Vk JK 1区段。
[0569] Ck基因上游的K轻链基因座的取代将除去编码不育的转录本的基因间区。因 此，在各种实施方式中，使用人源λ轻链基因区段取代小鼠 Ck基因上游的小鼠Κ轻链序 列将产生人源化的小鼠 κ轻链基因座，所述小鼠 Κ轻链基因座含有人源νλ和JA基因 区段但不含编码不育的转录本的κ轻链基因间区。
[0570] 如本申请所描述的，使用人源λ轻链基因区段将内源性小鼠Κ轻链基因座人源 化（其中所述人源化除去基因间区），使得κ轻链基因座的使用显著降低，并伴有λ轻链 的使用显著增加。因此，尽管缺乏所述基因间区的人源化小鼠是有用的，因为所述小鼠能够 制备具有人源轻链可变结构域（例如人源λ或κ结构域）的抗体，但是所述基因座的使 用减少。
[0571] 本申请还描述了使用与人源κ基因间区的插入偶联的人源Υλ和JA基因区段 将内源性小鼠 κ轻链基因座人源化以形成νλ基因座，所述νλ基因座相对于转录方向， 在最后一个人源νλ基因区段和第一个人源JA基因区段之间含有 Κ基因间区；这显示出 与缺乏κ基因间区的基因座相比，具有更高表达的Β细胞群。这一观察结果与这一假设一 致，即基因间区一通过不育的转录本直接地，或间接地--抑制内源性λ轻链基因座的 使用。基于这样的假设，包括基因间区将会降低内源性λ轻链基因座的使用，使得小鼠的 选择受限只好使用经修饰的（将λ引入κ)基因座以产生抗体。
[0572] 在各种实施方式中，使用人源λ轻链序列取代小鼠 Ck基因上游的小鼠Κ轻链 序列还包括人源κ轻链基因间区，所述人源κ轻链基因间区在相对于转录方向上，位于3' 端νλ基因区段的3'非翻译区和第一个人源JA基因区段的5'端之间。或者，可以通过 在内源性λ轻链基因座中进行删除将这种基因间区从取代的内源性 Κ轻链基因座（小鼠 Ck基因的上游）上除去。同样地，在这种实施方式中，所述小鼠从含有人源λ轻链序列的 内源性κ轻链基因座产生抗体。
[0573] 将小鼠工程改造以表达人源νλ结构域的方法
[0574] 本申请描述了制备基因修饰的小鼠的多种方法，所述小鼠制备含有具有与内源性 CJ例如Ck或CA)区融合的人源νλ结构域的轻链的抗体。将基因修饰描述为，在各种 实施方式中，包括一个或两个内源性轻链基因座的缺失。例如，为了从内源性抗体库中去除 小鼠 λ轻链，可以制备第一 VA-JX-CX基因簇的缺失并且通过使用人源νλ-JX基因区 段全部或部分取代第二基因簇的νλ-JA基因区段。本申请还提供了用于制备小鼠、小鼠 胚胎和细胞的经基因修饰的小鼠胚胎、细胞和靶向构建体。
[0575] 将一个内源性VA-JX-CX基因簇缺失并且使用νλ-JX基因区段取代另一个 内源性V λ -J λ -C λ基因簇，对动物中天然抗体恒定区的结合和功能中造成相对最小的破 坏，在各种实施方式中，由于内源性CA基因保持完好，因此保留了正常的功能和与内源性 重链的恒定区结合的能力。因此，在这种实施方式中，对于组装含有两条重链和两条轻链 的功能性抗体分子而言，所述修饰不会根据功能性轻链恒定区来影响其他内源性重链恒定 区依赖。而且，在各种实施方式中，所述修饰不会影响组装功能性膜结合抗体分子，所述抗 体分子含有内源性重链和轻链，例如与小鼠 CA区连接的hVA结构域。由于在内源性基 因座上保留了至少一个功能性CA基因，所以包含使用人源νλ-JA基因区段取代内源性 V λ-J λ-C λ基因簇的V λ-J λ基因区段的动物，应该能够制备正常的λ轻链，所述λ轻 链在免疫应答的过程中能够通过在动物的表达抗体库中存在的人源V λ-J λ基因区段来 结合抗原。
[0576] 图20中提供了缺失内源性小鼠 VX-JX-CX基因簇的示意性说明（未按照比 例）。如图所示，小鼠 λ轻链基因座被分成两个基因簇，两个基因簇均含有能够重组形成 功能性小鼠 λ轻链的功能性基因区段。利用在重组位点翼侧具有新霉素表达盒的靶向构 建体（靶向载体1)将内源性小鼠 νλ 1-JA3-CA3-JA 1-以1基因簇缺失。利用在重组 位点翼侧具有潮霉素-胸苷激酶表达盒的靶向构建体（靶向载体2)将其他内源性基因簇 (VA2-VA3-JA2-CA2-JA4-CA4)部分缺失。在这第二个靶向事件中，CA2-JA4-CA4 内源性基因区段被保留。使用与第一个靶向构建体（靶向载体1)中的那些重组位点不同的 重组位点来构建第二个靶向构建体（靶向载体2)，以便在成功实现靶向后将选择性表达盒 选择性地缺失。因为不能产生内源性λ轻链，所以所得到的双靶向基因座被功能性沉默。 这种经修饰的基因座可以用于插入人源νλ和JA基因区段以形成包括人源νλ和JA基 因区段的内源性小鼠 λ基因座，从而基于经修饰的基因座的重组，所述动物产生包括与内 源性小鼠 CA基因区段连接的经重排的人源νλ和JA基因区段的λ轻链。
[0577] 基因修饰小鼠使得内源性λ基因区段不具有功能，在各种实施方式中，这造成小 鼠显示出在其抗体库中仅具有κ轻链，使得所述小鼠对于评估在免疫应答中λ轻链的作 用是有用的，并且对于用于制备包括Vk结构域但不包括νλ结构域的抗体库是有用的。
[0578] 可以采用本领域公知的任意方法制备基因修饰的小鼠，所述小鼠表达与已在内源 性小鼠 λ轻链基因座上重组的小鼠 CA基因连接的hVA。图22Α中提供了使用人源νλ 和JX基因区段取代内源性小鼠 VA2-VX3-JA2基因区段的示意性说明（未按照比例）。 如图所示，通过包括在重组位点翼侧具有新霉素表达盒的靶向构建体（12/1-λ靶向载体） 取代已无功能的内源性小鼠 λ轻链基因座。使用含有包括12个hVA基因区段和单一hJA 基因区段的人源λ序列的基因组片段取代V λ 2-V λ 3-J λ 2基因区段。
[0579] 因此，所述第一种方法将一个或多个hV λ基因区段置于内源性λ轻链基因座中 与单一 hj λ基因区段邻近的位置（图22Α)。
[0580] 可以使用类似技术对经修饰的内源性λ轻链基因座进行进一步的修饰以插入更 多hV λ基因区段。例如，图23Α中提供了用于累进性插入附加人源hV λ基因区段的两个 附加靶向构建体（+16-λ和+12-λ靶向载体）的示意性说明。如图所示，在使用由前述插 入的人源λ轻链序列提供同源性的连续步骤中，将含有特定人源hVA基因区段的附加基 因组片段插入经修饰的内源性λ轻链基因座。如图所示基于各靶向构建体重组，以顺序形 式，将28个附加 hVA基因区段插入经修饰的内源性λ轻链基因座。这形成了嵌合基因座， 所述嵌合基因座产生包括与小鼠 CA基因连接的人源νλ-JA基因区段的λ轻链蛋白。
[0581] 上述方法在小鼠 λ基因座上插入人源λ轻链基因区段，保留了位于 Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段下游的增强子（称为Enh2.4、Enh和Enh3.1，图22A和图23A)。 这种方法在内源性小鼠 λ轻链基因座上产生单一修饰的等位基因（图25Α)。
[0582] 本申请提供了制备小鼠的组合物和方法，所述小鼠表达包括与小鼠 CA基因区段 可操作地连接的hVA和JA基因区段的轻链，所述组合物和方法包括用于制备由内源性小 鼠 λ轻链基因座表达这种基因的小鼠的组合物和方法。所述方法包括选择性地使得一个 内源性小鼠 VA-JA-CA基因簇不具有功能（例如通过靶向缺失），并且在内源性小鼠 λ 轻链基因座上使用hVA和JA基因区段以在小鼠中表达hVA结构域。
[0583] 或者，在第二种方法中，可以将人源λ轻链基因区段置于内源性K轻链基因座。 所述基因修饰，在各种实施方式中，包括将内源性κ轻链基因座缺失。例如，为了从内源性 抗体库中去除小鼠 κ轻链，可以制备小鼠 VK和】!^基因区段的缺失。本申请还提供了用 于制备小鼠、小鼠胚胎和细胞的经基因修饰的小鼠胚胎、细胞和靶向构建体。
[0584] 基于上述原因，小鼠 V κ和J κ基因区段缺失米用了相对最小的破坏。图21中提 供了缺失小鼠 Vk和JK基因区段的示意性说明（未按照比例）。通过重组酶介导的小鼠 序列缺失来使内源性小鼠 VK和】!^基因区段缺失，所述小鼠序列位于各自使用位点特异 性重组位点来精确定位的靶向载体之间。在第一个靶向事件中使用第一靶向载体（JK靶 向载体）以缺失小鼠 JK基因区段。在第二个顺序的靶向事件中使用第二靶向载体（VK 靶向载体）以缺失位于最远端小鼠 VK基因区段的5'端的序列。因此两个靶向载体都含 有位点特异性重组位点，使得能够选择性地缺失两个选择性表达盒并且在成功靶向后全部 干扰小鼠 κ轻链序列。因为不能产生内源性K轻链，所以所得到的缺失基因座被功能性 沉默。该修饰的基因座能够用于插入hVA和JA基因区段以形成包括hVA和JA基因 区段的内源性小鼠 κ基因座，从而基于经修饰的基因座重组，动物产生包括与内源性小鼠 Ck基因区段可操作地连接的经重排的hVA和JA基因区段的λ轻链。可以将包括人源 λ轻链序列的多种靶向载体用于连接该已缺失的小鼠 K基因座，从而形成包含与小鼠 CK 区可操作地连接的人源λ基因区段的杂交轻链基因座。
[0585] 因此，第二种方法将一个或多个人源νλ基因区段置于小鼠Κ轻链基因座中与单 一人源J λ基因区段邻近的位置（12/1-κ靶向载体，图22Β)。
[0586] 在各种实施方式中，对该方法进行改进以使得能够加入基因区段和/或调控序 列，从而优化来自小鼠抗体库的小鼠 κ基因座的人源λ轻链序列的使用。
[0587] 在第三种方法中，将一个或多个hVA基因区段置于小鼠Κ轻链基因座中与四个 hj λ基因序列邻近的位置（12/4-κ靶向载体，图22Β)。
[0588] 在第三种方法中，将一个或多个hVA基因区段置于小鼠Κ轻链基因座中与人源 κ基因间序列和单一 hj λ基因序列邻近的位直（12 ( κ ) 1-κ祀向载体，图22Β)。
[0589] 在第四种方法中，将一个或多个hVA基因区段置于小鼠Κ轻链基因座中与人源 κ基因间序列四个hJX基因序列邻近的位置（12(κ)4-κ靶向载体，图22Β)。
[0590] 所有上述方法在小鼠 κ基因座上插入人源λ轻链基因区段，同时保持Ck基因 上游的κ内含子增强子元件（称为EKi，图22Β和图23Β)和Ck基因下游的3' κ增强 子（称为Εκ 3'，图22B和图23B)。所述方法在内源性小鼠 κ轻链基因座上产生四个独立 的经修饰的等位基因（图25Β)。
[0591] 在各种实施方式中，基因修饰的小鼠包括敲除内源性小鼠 λ轻链基因座。在一个 实施方式中，通过缺失跨距V λ 2至J λ 2区域和跨距V λ 1至C λ 1区域的策略将λ轻链基 因座敲除（图20)。使内源性λ轻链基因座表达内源性λ结构域的能力降低或消除的任 何策略均适用于本公开中的实施方式。
[0592] 来源于基因修饰小鼠的λ结构域抗体
[0593] 在小鼠 κ或λ轻链基因座上包括人源λ序列的小鼠将表达包括与小鼠 CJCk 或C λ)区融合的hV λ区的轻链。这些对与下述小鼠繁殖均是有利的：(a)包括功能性沉默 的轻链基因座（例如敲除内源性小鼠 κ或λ轻链基因座）；(b)包括内源性小鼠 λ轻链 基因座，所述基因座包括与内源性小鼠 C λ基因可操作地连接的hV和hj基因区段；（c)包 括内源性小鼠 κ轻链基因座，所述基因座包括与内源性小鼠 Ck基因可操作地连接的hVK 和hj κ基因区段；以及（d)小鼠的一个κ等位基因包括hV κ和hj κ ;另一个κ等位基 因包括hV λ和hj λ ;-个λ等位基因包括hV λ和hj λ并且一个λ等位基因被沉默或 敲除，或者两个λ等位基因均包括hVA和hJA ;以及两个重链等位基因均包括hVH、hDj^P hJH。
[0594] 将包括在Ck或CA背景下表达hVA结构域的抗体用于制备全人源抗体，所述制 备是通过将编码hV λ结构域的核酸克隆至携带编码人源C λ基因的表达构建体中。将所得 到的表达构建体转染至适宜的宿主细胞中，所述细胞用于表达展示与hCA融合的全hVA 结构域的抗体。 实施例
[0595] 本发明提供下述实施例以描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而不是旨 在限定发明人所认为的发明的范围。除非另有明示，温度以摄氏度表示，并且压力为处于或 接近大气压。
[0596] 实施例1 :小鼠免疫球蛋白基因的人源化
[0597] 使用人源和小鼠细菌人工染色体（BAC)以工程改造13个用于将小鼠免疫球蛋白 重链和κ轻链基因座人源化的不同的BAC靶向载体（BACvec)。表1和表2分别详细描述 了用于构建将小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座人源化的所有BACvec的步骤。
[0598] 人源和小鼠 BAC的鉴定。通过使用BAC文库的滤膜影印杂交或对小鼠 BAC文库 DNA混合物进行PCR筛选来鉴定跨距为免疫球蛋白重链和κ轻链基因座5'和3'末端的 小鼠 BAC。在标准条件下使用对应于目标区域的探针对滤膜进行杂交。使用位于目标靶向 区翼侧的独特引物对通过PCR对文库混合物进行筛选。使用相同的引物进行附加的PCR以 便将给定的孔进行解卷积并分离相应的目标BAC。BAC滤膜和文库混合物均由129SvJ小鼠 ES细胞（因塞特公司（Incyte Genomics)/英杰公司（Invitrogen))产生。对覆盖整个免 疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人源BAC进行鉴定，所述鉴定是通过使用基于PCR的方法 对人源BAC文库混合物（英杰公司的Caltech文库）进行筛选以对BAC文库（研究遗传学 / 英杰公司（Research Genetics/Invitrogen)的 Caltech B、C 或 D 文库和 RPCI-11 文库） 进行滤膜影印杂交或者使用BAC末端序列数据库（Tigr的Caltech D文库）来完成。
[0599] 通过细菌同源重组和连接来构建BACvec。如此前所描述的进行细菌同源重 组（BHR) (Valenzuela 等，2003 ;Zhang，Y.，Buchholz，F.，Muyrers，J. P.和 Stewart, A. F. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli (大肠杆菌中使用重组对DNA工程改造的新的逻辑）.Nat Genet 20, 123-128)。在大多 数情况下，通过将来源于PCR的同源盒与克隆的表达盒连接、再通过凝胶分离连接产物并 将其电穿孔至携带靶向BAC的BHR感受态细菌中，从而产生线形片段。在经过适宜的抗生 素培养皿选择后，通过对两个新的连接交叉进行PCR检测，随后在脉冲场凝胶上进行限制 性分析（Schwartz, D.C.和 Cantor, C.R. (I984)· Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis (通过脉冲场梯度凝胶电泳对酵母 染色体大小的DNA进行分离）Cell 37,67-75)并且通过使用分布于人源序列的引物的PCR 进行抽查来对正确重组的BAC进行鉴定。
[0600] 使用三个顺序BHR步骤构建用于免疫球蛋白重链基因座人源化初始步骤的 3hVHBACvec (图4A和表1)。在第一个步骤（步骤1)中，将表达盒引入人源VHl-3基因区段 上游的人源母体BAC中，所述表达盒含有与小鼠免疫球蛋白重链基因座（HB1)同源的区域， 在细菌中具有卡那霉素抗性和在动物细胞中具有G418抗性（kanR)以及具有位点特异性重 组位点（例如loxP)的基因。在第二个步骤（步骤2)中，将第二表达盒引入紧邻最后一个 JH区段的下游，所述第二表达盒含有与小鼠免疫球蛋白重链基因座（HB2)同源的第二区域 以及在细菌中具有大观霉素抗性的基因（specR)。所述第二步骤包括使J H6和BAC载体氯 霉素抗性基因（cmR)下游的人源免疫球蛋白重链基因座序列缺失。在第三个步骤（步骤3) 中，然后使用I-CeuI位点将双重修饰的人源BAC(Bl)线形化，所述位点已在前两个步骤中 加入并且利用通过两个同源区（HB1和HB2)的BHR整合至小鼠 BAC(B2)中。将针对第一个 (cm/kan)、第二个（spec/kan)和第三（cm/kan)个步骤的药物选择设计为对所需的产品具 有特异性。通过使用限制性酶消化后的脉冲场凝胶电泳（PFGE)对经修饰的BAC克隆进行 分析以确定适宜的构建（图4B)。
[0601] 以类似的方式，工程改造用于将重链和κ轻链基因座人源化的12个附加的 BACvec。在一些例子中，进行BAC连接代替BHR以便将两个较大的BAC连接在一起，所述连 接是通过利用BHR和仔细放置选择性标记物向两个母体BACvec引入罕见的限制性位点来 实现。这使得经过特定药物标记物组合的选择后保留下来所需的连接产物。在通过BHR获 得的那些类似的方式（如上文所述）中，对在使用罕见的限制性酶消化后通过连接获得的 重组BAC进行鉴定和筛选。
[0602] 表 1
[0603]
【权利要求】
1. 一种非人动物，所述动物包括： (a) 在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游的一个或多个人源νλ和JA基因区段的插 入， (b) 在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游的一个或多个人源VH、一个或多个人源DH和 一个或多个人源J H基因区段的插入，以及 (c) 编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列，其中所述ADAM6蛋白由异位ADAM6 核酸序列表达。
2. 根据权利要求1所述的非人动物，其中所述非人源重链和/或轻链恒定区选自小鼠、 大鼠或仓鼠恒定区。
3. 根据权利要求1所述的非人动物，其中所述非人源轻链恒定区是啮齿动物恒定区。
4. 根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是小鼠 Ck区。
5. 根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是大鼠 Ck区。
6. 根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是小鼠CA区。
7. 根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是大鼠CA区。
8. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少12个到 至少40个人源V λ基因区段和至少一个人源J λ基因区段。
9. 根据权利要求8所述的非人动物，其中所述非人动物包括12个人源V λ基因区段和 至少一个人源Jλ基因区段。
10. 根据权利要求8所述的非人动物，其中所述非人动物包括28个人源V λ基因区段 和至少一个人源Jλ基因区段。
11. 根据权利要求8所述的非人动物，其中所述非人动物包括40个人源νλ基因区段 和至少一个人源Jλ基因区段。
12. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述至少一个人源Jλ基因区 段选自JX 1、0 2、0 3、0 7及其组合。
13. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少四个人 源JA基因区段。
14. 根据权利要求13所述的非人动物，其中所述至少四个人源JA基因区段包括至少 JA 1、JA 2、JA 3 和 JA 7。
15. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能 性片段的核苷酸序列在非人动物中是异位的。
16. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能 性片段的核苷酸序列存在于与野生型非人源ADAM6基因座相同的位置。
17. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能 性片段的核苷酸序列在非人动物的基因组中存在于异位位置。
18. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能 性片段的核苷酸序列存在于免疫球蛋白基因区段中。
19. 根据权利要求18所述的非人动物，其中所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区 段。
20. 根据权利要求19所述的非人动物，其中所述重链基因区段是人源的。
21. 根据权利要求19所述的非人动物，其中所述重链基因区段是所述非人动物的内源 性重链基因区段。
22. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物在内源性免疫球 蛋白轻链基因座缺乏内源性免疫球蛋白 '和/或叉基因区段。
23. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物包括在所述非人 动物中不能重排形成免疫球蛋白' 结构域的内源性免疫球蛋白 '和/或1基因区段。
24. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中全部或基本上全部的内源性免 疫球蛋白Vk和】!^基因区段被一个或多个人源νλ和JA基因区段取代。
25. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中全部或基本上全部的内源性免 疫球蛋白νλ和JA基因区段被一个或多个人源νλ和JA基因区段取代。
26. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中全部或基本上全部的内源性免 疫球蛋白'和1基因区段在所述非人动物中是完好的，并且所述非人动物包括插入在内源 性免疫球蛋白 '和/或1基因区段与内源性免疫球蛋白轻链恒定区之间的一个或多个人 源νλ基因区段和一个或多个人源JA基因区段。
27. 根据权利要求26所述的非人动物，其中所述完好的内源性免疫球蛋白'和叉基 因区段在非人动物中不能重排形成抗体的 '结构域。
28. 根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物还包括来自人源 κ轻链基因座的人源Vk-JK基因间区，其中所述人源V K-JK基因间区与一个或多个人 源νλ和JA基因区段邻近。
29. 根据权利要求28所述的非人动物，其中所述人源Vk-JK基因间区位于人源V λ 基因区段和人源JA基因区段之间。
30. -种来源于前述任意一项权利要求所述的非人动物的细胞或组织。
31. 根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备抗原结合蛋白的用途。
32. 根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。
33. 根据权利要求31或32所述的用途，其中所述细胞是Β细胞。
33. 根据权利要求31或32所述的用途，其中所述组织来源于非人动物的脾脏、骨髓或 淋巴结。
34. 根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备全人源抗体的用途。
35. 根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备人源V λ结构域和/或人源VH结构 域的用途。
36. 根据权利要求31-35任意一项所述的用途，其中所述细胞或组织来源于小鼠。
37. -种制备与目标抗原结合的抗体的方法，其中所述方法包括： (a) 将根据权利要求1-29任意一项所述的非人动物与目标抗原接触， (b) 从所述非人动物中分离一个或多个B淋巴细胞，其中所述一个或多个B淋巴细胞表 达与目标抗原结合的抗体， (c) 鉴定编码与目标抗原结合的抗体的免疫球蛋白轻链的核酸序列，其中所述免疫球 蛋白轻链包括人源Vλ结构域和非人源轻链恒定结构域，以及 (d) 采用（c)中所述的核酸序列和人源免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列来制备与目标 抗原结合的人源抗体。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区是小鼠 Ck。
39. 根据权利要求37所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区是小鼠CA。
40. 根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体包括免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋 白重链包括人源VH结构域和非人源C H结构域。
41. 根据权利要求37-40任意一项所述的方法，其中所述非人动物是小鼠。
42. -种基因修饰的非人动物，所述动物包括： (a) 在非人动物内源性免疫球蛋白轻链基因座上的一个或多个未经重排的人源νλ基 因区段和一个或多个未经重排的人源Jλ基因区段， (b) 在非人动物内源性免疫球蛋白重链基因座上的一个或多个人源￥11基因区段、一个 或多个人源DH基因区段和一个或多个人源J H基因区段， 其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段。
43. 根据权利要求42所述的非人动物，其中所述非人动物表达包含重链和轻链的抗 体，所述重链包括人源VH结构域和非人源重链恒定区，所述轻链包括人源V λ结构域和非 人源轻链恒定区。
44. 根据权利要求42或41所述的非人动物，其中所述非人源轻链恒定结构域是Ck或 C入结构域。
45. 根据权利要求42-44任意一项所述的非人动物，其中所述ADAM6蛋白或其功能性片 段由在小鼠生殖细胞系中的异位序列来编码。
46. 根据权利要求42-45任意一项所述的非人动物，其中所述ADAM6蛋白或其功能性片 段由非人动物的内源性序列来编码。
47. 根据权利要求42-46任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的内源性轻链 基因座是免疫球蛋白λ轻链基因座。
48. 根据权利要求42-46任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的内源性轻链 基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。
49. 根据权利要求42-48任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物在内源性轻链 基因座缺乏内源性八和/或叉基因区段。
50. 根据权利要求49所述的非人动物，其中所述'和/或1基因区段是Vk和/或 Jk基因区段。
51. 根据权利要求49所述的非人动物，其中所述'和/或1基因区段是νλ和/或 JA基因区段。
52. 根据权利要求42-51任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的 '和1基因 区段被一个或多个人源Vλ和一个或多个人源Jλ基因区段取代。
53. 根据权利要求52所述的非人动物，其中所述'和1基因区段是κ基因区段。
54. 根据权利要求52所述的非人动物，其中所述'和1基因区段是λ基因区段。
55. 根据权利要求42-54任意一项所述的非人动物，其中所述一个或多个人源νλ基因 区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇Α的片段。
56. 根据权利要求55所述的非人动物，其中所述簇A的片段从人源V λ 3-27延伸至人 源 νλ 3-1。
57. 根据权利要求55所述的非人动物，其中所述簇Α的片段从人源V λ 3-12延伸至人 源 JA 1。
58. 根据权利要求42-54任意一项所述的非人动物，其中所述一个或多个人源νλ基因 区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇Β的片段。
59. 根据权利要求58所述的非人动物，其中所述簇Β的片段从人源V λ 5-52延伸至人 源 νλ 1-40。
60. 根据权利要求42-54任意一项所述的非人动物，其中所述一个或多个人源νλ基因 区段来自所述人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇Α的片段和簇Β的片段。
61. 根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少12个 人源νλ基因区段。
62. 根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少28个 人源νλ基因区段。
63. 根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少40个 人源νλ基因区段。
64. 根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述至少一个人源JA基因区 段选自下组：JX 1、0 2、0 3、0 7及其组合。
65. 根据权利要求42-64任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物是啮齿动物。
66. 根据权利要求65所述的非人动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
67. 权利要求42-66任意一项所述的非人动物制备抗原结合蛋白的用途。
68. 根据权利要求67所述的用途，其中所述抗原结合蛋白是人源的。
69. 根据权利要求67所述的用途，其中抗原结合蛋白是抗体。
70. -种来源于根据权利要求42-66任意一项所述的非人动物的细胞或组织。
71. 根据权利要求70所述的细胞或组织，其中所述组织来源于脾脏、骨髓或淋巴结。
72. 根据权利要求70所述的细胞或组织，其中所述细胞是Β细胞。
73. 根据权利要求70所述的细胞或组织，其中所述细胞是胚胎干（ES)细胞。
74. 根据权利要求68所述的细胞或组织，其中所述细胞是生殖细胞。
75. -种具有生育能力的雄性非人动物，所述动物表达包括人源V λ结构域或人源Vk 结构域的免疫球蛋白轻链和包括人源VH结构域的免疫球蛋白重链，其中所述雄性非人动物 包括经修饰的重链可变区基因座和在雄性非人动物中具有功能的异位ADAM6基因。
76. 根据权利要求75所述的具有生育能力的雄性非人动物，其中所述非人动物是小 鼠。
【文档编号】C07K16/46GK104159444SQ201280070209
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】L·麦克唐纳, C·古雷尔, K·A·霍西阿瓦, S·史蒂文斯, A·J·莫菲 申请人:瑞泽恩制药公司