专利名称：神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构的制作方法
技术领域：
本发明提供了单独的或与抗神经毡蛋白抗体复合的神经毡蛋白I(Nrpl)和神经毡蛋白2(Nrp2)片段的晶体结构及其用途。本发明进一步提供了结合Nrpl和/或Nrp2的抗体及其使用方法。发明背景 血管系统的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要，所述促血管发生因子经由一般称为血管发生(angiogenesis)的过程促进新血管形成和维持。血管形成是复杂但有序的生物学事件，涉及所有或许多以下步骤:a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC ;b)EC迁移并接合以形成索样结构；c)血管索然后发生管发生(tubulogenesis)以形成具有中央内腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及f)内皮周细胞(per1-endothelial cell)被募集来包围内皮管，为血管提供维持和调节功能，此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan, D.Science277:48-50 (1997) ；Hogan, B.L.和 Kolodzie j, P.A.Nature ReviewsGenetics.3:513-23 (2002) ；Lubarsky, B.和 Krasnow, M.A.Cell.112:19-28(2003)。现在完全确立了血管发生涉及多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病变例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman等，J.Biol.Chem., 267:10931-10934(1992) ；Klagsbrun 等，Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991)；GarnerA.，〃Vasculardiseases〃，在 Garner A 和 Klintworth GK 编的《Pathobiology ofOcular Disease.ADynamic Approach》第 2 版(Marcel Dekker, NY, 1994)中，ppl625_1710。在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman等，Nature339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到T相关性。Weidner等,N.Engl.J.Med324:1-6 (1991) ；Horak等，Lancet340:1120-1124(1992) ；Macchiarini 等，Lancet340:145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman, Nat Medl (I):27-31 (1995))。血管发育的过程受到紧密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为涉及刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara等，Endocr.Rev.见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤 中过表达。Berkman 等，J.Clin.1nvest.91:153-159 (1993) ； Brown等，HumanPathol.26:86-91(1995) ;Brown 等，Cancer Res.53:4727-4735(1993) ；Mattern等，Brit.J.Cancer73:931-934(1996) ；Dvorak 等，Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995)。同样，眼部液体中VEGF的浓度水平与糖尿病性和其它缺血相关视网膜病患者中的活泼血管增殖的存在高度相关。Aiello等，N.Engl.J.Med.331:1480-1487 (1994)。此夕卜，研究证明了 VEGF在AMD患者脉络膜新血管膜中的定位。Lopez等，Invest.0phthalmol.Vis.Sc1.37:855-868(1996)。抗VEGF中和性抗体在裸鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等,Nature362:841-844(1993) ；ffarren 等,J.Clin.1nvest.95:1789-1797 (1995)；
BorgStrdm 等,Cancer Res.56: 4032-4039 ( 1996) ； Me I ny k 等,Cancer
Res.56:921-924(1996))，而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生。Adamis等，Arch.0phthalmol.114:66-71 (1996)。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年I月14日公开的EP817, 648和1998年10月15日公开的W098/45331和W098/45332。抗VEGF抗体之一，贝伐单抗(bevacizumab)已获FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。而且，贝伐单抗正在许多进行中的治疗各种癌症适应证的临床试验中进行研究。在神经系统的发育过程中，神经元伸出缆样轴突，所述轴突迁移长距离以到达它们的祀点。见综述 Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005)Nature436:193-200。生长中的轴突的领先尖端是高度能动的感觉结构，称为生长锥。通过丝足伸展(filopodialextension)的伸展和收缩的动态循环，生长锥不断感觉和评估其空间环境中的众多提示，并精确选择正确航迹来向其最终靶点延伸。在过去的十年里，在了解轴突导向机制方面取得了可观的进展。见综述Dickson (2002) Science298:1959-64。导向提示来自四种:引诱物和驱除物；可以作用于近程(即细胞或基质相关的)或远程(即可扩散的)。迄今为止，已鉴定了四大族轴突导向分子:netrins (神经生长因子)、semaphorins (脑信号蛋白)、ephrins和slits。见综述Huber等(2003)Annu Rev Neurosci26:509-63。脑信号蛋白(Sema),也称作脑衰蛋白(collapsin),属于一大族在系统发生上保守的分泌性和膜结合性蛋白质。脑信号蛋白家族的成员能够在神经发育过程中介导驱除性和引诱性轴突导向事件。Raper(2000)Curr Opin Neurobiol 10:88-94。迄今为止鉴定的超过三十种脑信号蛋白都享有大约500个氨基酸的保守N-末端Sema结构域。脑信号蛋白成员根据它们的结构相似性和物种起源归入八个亚家族。关于脑信号蛋白统一命名法的更多详情见 SemaphorinNomenclature Committee (1999) Cell97:551-552。神经租蛋白(neuropilin, NRP)家族由两种同源蛋白质构成，神经租蛋白-1 (NRPl)和神经毡蛋白-2 (NRP2) 0NRP1首先鉴定为在生长中的轴突的生长锥中表达的I型130kDa跨膜糖蛋白。NRP2随后通过表达克隆得到鉴定。Fujisawa and Kitsukawa(1998)Curr Opin Neurobiol8:587-592。发现NRP是脑信号蛋白的一个子集(即第3类脑信号蛋白)的受体。有人提出NRP与另一个脑信号蛋白受体家族(B卩神经丛素(plexin))—起发挥非信号传导性共同受体的功能。尽管最初描述为轴突导向的介导物，已发现NRP在血管发育中发挥至关重要的作用。Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005) 它被鉴定为在肿瘤和内皮细胞上表达的同等型特异性VEGF受体，大大促进了对NRP在血管和肿瘤生物学中的作用的了解。Soker等(1998) Cell92:735-745 ;Klagsbrun 等(2002)Adv Exp Med Biol515:33-48。遗传研究提供了有力的证据来证明Nrpl是血管形态发生所要求的。Nrpl功能的丧失导致血管重塑和分支缺陷，这种表型可以因Nrp2功能丧失而进一步增强。Kawasaki等(1999)Developmentl26:4895_4902 ;Takashima等(2002)Proc Natl Acad Sci USA99:3657-3662。这些结果说明在发育早期Nrpl和Nrp2可能具有重叠的功能。然而，每一种Nrp的表达在发育晚期隔开，Nrpl主要在动脉中表达，而Nrp2主要在静脉和淋巴管中表达。Yuan等(2002)Developmentl29:4797-4806 ;Herzog 等(2001)MechDevl09:115-119。注意，仅仅Nrp2 功能的丧失特异性的削弱淋巴发育。
因为Nrpl在发育过程中在许多其它细胞类型中表达，所以通过生成EC特异性敲除(其导致与无效等位基因中所看到的类似的血管缺陷)得出了血管Nrpl的作用。Gu等(2003)Dev Cell5:45_57。有趣的是，此研究还显示出Sema3A与NRPl结合不是血管发育所要求的。在另一项研究中，在Nrpl敲除胚胎的发育中的后脑的内皮顶端细胞的导向中观察到缺陷。Gerhardt 等(2004) Dev Dyn231:503-509。尽管对NRPl在血管发育中的作用进行了广泛研究，仍然不清楚NRPl是否是专门通过VEGF-VEGF受体2 (VEGFR2)途径(作为VEGF结合VEGFR2的增强剂并由此作为VEGFR2信号传导的增强剂)或通过不依赖VEGFR2的信号传导途径或二者的组合来发挥其血管功能的。单克隆抗体可以使用重组DNA技术来制备。单克隆抗体得到了广泛使用，特别是那些衍生自啮齿类的单克隆抗体，然而非人抗体在人体中常常是抗原性的。本领域试图通过构建“嵌合”抗体来克服这个问题，在嵌合抗体中非人抗原结合结构域与人恒定域偶联(Cabilly等，美国专利N0.4，816，567)。人恒定域的同种型可以选择成适合嵌合抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性的。在试图解决抗体的抗原结合功能和将人抗体中异源序列的使用最小化的另一项努力中，对多种抗原生成了人源化抗体，其中基本上少于整个人可变域被来自非人物种的相应序列替代。例如，将啮齿类残基用于替代人抗体的相应区段。在实践中，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些互补决定区(CDR)残基及可能的一些框架区(FR)残基用啮齿类抗体中类似位点的残基替代。Jones 等(1986)Nature321:522-525 ;Riechmann 等(1988)Nature332:323-327 ；Verhoeyen等(1988)Science239:1534-1536。
在对人施用治疗性抗体之前，一般需要在非人哺乳动物中进行临床前研究以评估抗体的疗效和/或毒性。理想的是，进行这些研究的抗体能够识别靶抗原并以高效力与靶抗原起作用，其中所述靶抗原对于宿主动物诸如小鼠或非人灵长类是内源的。噬菌体展示技术提供了用于生成和选择能与配体诸如抗原结合的新蛋白质的有力工具。使用噬菌体展示技术，可以生成蛋白质变体的大型文库并快速分拣那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列。将编码变异多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发了单价噬菌体展示系统，其中将编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass，S.(1990)Proteins8:309 ；Lowman andffells(1991)Methods:ACompanion to Methods inEnzymology3:205)。在单价曬菌体展示系统中，基因融合物以低水平表达,而野生型基因III蛋白也表达，使得(病毒)颗粒的感染性 得到保留。生成肽文库和筛选那些文库的方法已经公开于许多专利(例如美国专利N0.5，723，286、美国专利N0.5，432，018、美国专利N0.5，580，717、美国专利 N0.5，427，908 和美国专利 N0.5，498，530)。证明肽在丝状噬菌体表面上表达和功能性抗体片段在大肠杆菌周质中表达对于开发卩遼菌体展示抗体文库是重要的。(Smith等(1985) Science228:1315 ;Skerra andPluckthun (1988) Science 240:1038)。已经以多种方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过插入随机DNA序列来改变单一基因或者通过克隆一族相关基因。使用噬菌体展示来展示抗体或抗原结合片段的方法已经记载于美国专利N0.5，750，373,5, 733，743、5，837，242,5, 969，108,6, 172，197,5, 580，717 和 5，658，727。然后对文库筛选具有期望特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。噬菌体展示技术在制备具有期望特征的抗体方面相对于常规杂交瘤和重组方法具有数项优势。此技术容许以较少的时间、无需使用动物就开发出具有多样序列的大型抗体文库。杂交瘤的制备或人源化抗体的制备动则就需要数月制备。另外，由于不需要进行免疫，可以对有毒的或具有低抗原性的抗原生成噬菌体抗体文库(Hogenboom(1988)Immunotechniques4:1-20)。曬菌体抗体文库还可用于生成和鉴定新的治疗性抗体。噬菌体展示文库已经用于自经免疫的、未免疫的人、种系序列、或未接触过抗原的B 细胞 Ig 全集生成人抗体(Barbas 和 Burton (1996) Trends Biotechl4:230 !Griffiths 等(1994)EMBOJ.13:3245 ;Vaughan 等(1996)Nat.Biotech.14:309 ；ffinter EP0368 684B1)。已经使用多种淋巴样组织生成了未接触过抗原的或非免疫的抗原结合文库。这些文库中的一些可以通过商业途径购买，诸如那些由Cambridge Antibody Technology和Morphosys开发的文库(Vaughan 等(1996)Nature Biotechl4:309 ;Knappik 等(1999)J.Mol.Biol.296:57)。然而，这些文库中的许多具有有限的多样性。自噬菌体展示文库中鉴定和分离高亲和力抗体的能力在分离用于治疗用途的新抗体中是重要的。自文库中分离高亲和力抗体依赖于文库的容量、细菌细胞的生产效率、和文库的多样性。参见例如Knappik等(1999) J.Mol.Biol.296:57。由于抗体或抗原结合蛋白的不正确折叠和终止密码子的存在，文库的容量会因低效生产而缩小。如果抗体或抗原结合结构域没有得到正确折叠，那么在细菌细胞中的表达会受到抑制。可以通过突变可变/恒定界面的表面转角中的残基或选定的CDR残基来提高表达。(Deng等(1994) J.Biol.Chem.269:9533 ；Ulrich 等(1995)PNAS, 92:11907-11911 ；Forsberg 等(1997)J.Biol.Chem.272:12430)。在细菌细胞中生成噬菌体抗体文库时，框架区的序列是提供正确折叠的
一个因素。生成抗体或抗原结合蛋白的多样性文库对于分离高亲和力抗体也是重要的。已经使用多种方法生成了在有限CDR中具有多样性的文库。参见例如Tomlinson(2000)NatureBiotech.18:989-994。⑶R3区是受关注的，部分因为常常发现它们参与抗原结合。重链上的CDR3区的长度、序列和结构构象变化极大。其他人也已经通过在每个位置使用所有20种氨基酸来随机化重链和轻链可变域CDR区而产生了多样性。认为使用所有20种氨基酸会产生变异抗体序列的大量多样性并增加鉴定到新抗体的机会。(Barbas (1994) PNAS91:3809 ; Ye I ton, DE (1995)J.1mmunologyl55:1994 ; Jackson, J.R.(1995)J.1mmunology 154:3310 ；Hawkins, RE(1992)J.Mo1.Biology226:889)。发明概述本发明提供了单独的或与选择性阻断脑信号蛋白或VEGF结合的抗体复合的神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2 (Nrpl和Nrp2)片段的晶体结构。Nrp采取出乎意料的结构域排列，其中a2、bl、和b2结构域形成一个紧密核心。抗体表位的位置与体外实验一起显示了 VEGF和脑信号蛋白不直接竞争Nrp结合。基于由al结构域介导的结晶Nrp 二聚体，本发明另外为受体二聚化或配体结合提供了模型。基于这些结果，一方面，本发明提供了一种由Nrplblb2片段形成的晶体，其衍射X射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数
权利要求
1.Nrp2ala2blb2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛NrpA抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体衍射X射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常
2.权利要求1的晶体，其以2.75A的分辨率衍射X射线。
3.权利要求1的晶体，其中所述Fab片段包含在SEQID Ν0:10中。
4.一种组合物,其包含权利要求1的晶体。
5.Nrp2ala2blb2片段与抑制脑信号蛋白结合Nrp2的抗泛NrpA抗体的Fab片段之间形成的复合物的晶体，其中所述晶体衍射X射线辐射以生成代表所述复合物三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数
6.权利要求5的晶体,其以3.1A的分辨率衍射X射线。
7.权利要求5的晶体，其中所述Fab片段包含在SEQID N0:10中。
8.—种组合物,其包含权利要求5的晶体。
9.权利要求1或5的晶体，其用于鉴定脑信号蛋白拮抗剂的筛选测定法。
10.一种由Nrplblb2片段形成的晶体，其衍射X射线辐射以生成代表所述片段三维结构的衍射图样，该衍射图样大致具有晶胞常数A
全文摘要
本发明涉及神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构。本发明提供了单独的或与抗神经毡蛋白抗体复合的神经毡蛋白1(Nrp1)和神经毡蛋白2(Nrp2)片段的晶体结构，及其使用方法。本发明进一步提供了抗Nrp抗体及其治疗应用的方法。
文档编号C07K19/00GK103193888SQ20131012244
公开日2013年7月10日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者布伦特.A.阿普尔顿, 克里斯琴.威斯曼, 吴雁 申请人:健泰科生物技术公司