一种檵木中银椴苷的提取纯化方法及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种檵木中银椴苷的提取纯化方法及检测方法，取檵木药材粉末，60%乙醇回流，提取物采用大孔树脂进行分离纯化，70%乙醇洗脱物以甲醇溶解，减压硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，流份A以甲醇溶解，过滤，沉淀反复重结晶，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱。反复ODS柱层析，甲醇水梯度洗脱，再经MCI-gel柱层析，甲醇/水梯度洗脱，得银椴苷。经核磁及质谱鉴定为银椴苷C30H26O13，经本发明检测方法测定，含量为96.14%。
【专利说明】一种繼木中银椴苷的提取纯化方法及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种檣木中银椴苷的提取纯化方法及检测方法，特别是涉及一种白花檣木中银椴苷的检测方法。
【背景技术】
[0002]银椴苷（11111'081(16)，又名山奈酚-3-0-0-0-(6 ‘’-0-反式-对羟基桂皮酰基）吡喃葡萄糖苷，是一种黄酮类化合物，为黄色针晶，mp. 246~248°C，分子式C3tlH26O13,分子量594. 52。研究显示银椴苷在植物中分布比较普遍，在白花檣木、红花檣木、地桃花、巴西甘薯叶、蜀葵 花、白头翁地上部分等植物中均有分离得到，其中在白花檣木茎中含量达0. 018%，白花檣木叶中含量达0. 13% ;红花檣木茎中含量达0. 0018%，红花檣木叶中含量达0. 12%。据报道，银椴苷具有较强的抗氧化性、清除自由基活性和抗炎活性，对补体系统的补体途径显示出非常有潜力的抗补体活性（IC5(I=5.4X10_5M)，其活性甚至比公认的补体系统抑制剂迷迭香酸活性还强。
[0003]银椴苷的提取分离方法一般都采用95%乙醇回流提取、浓缩后用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等非极性溶剂萃取，这些分离纯化工艺都需经过反复柱层析步骤，存在分离时间长、重现性差、使用大量有毒溶剂等缺点。本发明克服了以上现有技术中的不足，提供了一种从檣木中提取分离高纯度的银椴苷的新方法。同时建立了其检测方法，该检测方法未见文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种檣木中银椴苷的提取纯化方法及检测方法，以克服现有工艺的不足，填补檣木中银椴苷检测的空白，更好地满足研发需要。
[0005]为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种檣木中银椴苷的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取檣木药材，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，回收溶剂，减压干燥；
(2)提取物采用大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物；
(3)70%乙醇洗脱物，甲醇溶解，硅胶拌样后进行减压硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，共得10个流份(Fr. A^J)；
(4)取Fr.A，甲醇溶解，过滤，沉淀反复重结晶得Lor-4，上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，共得8个流份（Fr. Af 8)。取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇/水梯度洗脱，再经柱层析，甲醇/水梯度洗脱，即得到高纯度银椴苷。银椴苷ESI质谱图见附图1，核磁氢谱图见附图2，核磁碳谱图见附图3，高效液相色谱图见附图4。
[0006]步骤（2)中大孔树脂型号为HPD 400。[0007]步骤（3)中硅胶为100-200目，减压硅胶为300-400目。
[0008]步骤（3)、（4)中乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱比例为：l:(Tl:l。
[0009]步骤（4)中最后阶段层析柱型号为MCI-gel，甲醇/水梯度洗脱比例为：l:(Tl:l。
[0010]采用上述技术方案的有益效果是：采用乙酸乙酯/甲醇、甲醇/水梯度洗脱，与以往技术相比，具有分离能力强、样品损失少、产品质量优等特点。
[0011]一种檣木中银椴苷的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)精密称取上述自制银椴苷5.13mg,置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml置IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得每Iml中含0. 0252mg的溶液，摇匀，得银椴苷对照溶液；
(2)取檣木药材粉碎，过4号筛，取白花檣木药材粉末lg，精密称定，置平底烧瓶瓶中，精密加入甲醇约50ml，称定重量，回流提取I小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0. 45 ii m微孔滤膜，即供试品溶液。
[0012](3)以上两种溶液各取10 U I注入高效液相色谱仪测定，色谱条件为：Waters高效液相色谱仪（Waters2695分离单元,Waters2996 二极管阵列检测器，Empower色谱工作站);Cosmosil C18色谱柱（4.6X250_ 5 y m);流动相：甲醇-0. 1%磷酸水溶液（55 :45);检测波长320nm ;流速1.0ml/min。在此色谱条件下,银锻苷峰型较好,并且能够较好的分离。以本发明检测方法测定白花檣木中银椴苷高效液相色谱图见附图5。
[0013]
下面结合实施例详细说明本发明。
[0014]具体实施例：`
实施例I:
取白花檣木药材12 kg，粉碎，以10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶剂，减压干燥。提取物采用HPD 400大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物。70%乙醇洗脱物（456. 8 g)，甲醇溶解，100-200目硅胶拌样后进行减压硅胶（300-400目）柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1 )，共得10个流份（Fr. A-J)。取Fr. A(75. 2g)，甲醇溶解，过滤，沉淀反复重结晶得Lor_4，上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1 )，共得8个流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇水梯度洗脱，再经MCI-gel柱层析，甲醇水梯度洗脱，得银椴苷。经本发明检测方法测定，其含量为95. 22%。
[0015]实施例2:
取白花檣木药材12 kg，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶剂，减压干燥。提取物采用HPD 400大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物。70%乙醇洗脱物（365. 4 g)，甲醇溶解，100-200目硅胶拌样后进行减压硅胶（300-400目）柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1)，共得10个流份（Fr.A-J)。取Fr.A (60. 15g),甲醇溶解,过滤,沉淀反复重结晶得Lor_4,上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱(1:0-1:1),共得8个流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇水梯度洗脱，再经MCI-gel柱层析，甲醇水梯度洗脱，得银椴苷。经本发明检测方法测定，其含量为95. 38%。
[0016]实施例3:取白花檣木药材15 kg，粉碎，以10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶剂，减压干燥。提取物采用HPD 400大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物。70%乙醇洗脱物（685. 2 g)，甲醇溶解，100-200目硅胶拌样后进行减压硅胶（300-400目）柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1)，共得10个流份（Fr.A-J)。取Fr.A (112. 8g),甲醇溶解,过滤,沉淀反复重结晶得Lor_4,上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱(1:0-1:1),共得8个流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇水梯度洗脱，再经MCI-gel柱层析，甲醇水梯度洗脱，得银椴苷。经本发明检测方法测定，其含量为95. 55%。
[0017]实施例4: 取白花檣木药材15 kg，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶剂，减压干燥。提取物采用HPD 400大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物。70%乙醇洗脱物（576. 2 g)，甲醇溶解，100-200目硅胶拌样后进行减压硅胶（300-400目)柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1 )，共得10个流份（Fr. A-J)。取Fr. A(98. 8g)，甲醇溶解，过滤，沉淀反复重结晶得Lor_4，上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1 )，共得8个流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇水梯度洗脱，再经MCI-gel柱层析，甲醇水梯度洗脱，得银椴苷。经本发明检测方法测定，其含量为95. 73%。
[0018]实施例5:
取白花檣木药材17 kg，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶剂，减压干燥。提取物采用HPD 400大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物。70%乙醇洗脱物（516. 2 g)，甲醇溶解，100-200目硅胶拌样后进行减压硅胶（300-400目）柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱（1:0-1:1 )，共得10个流份（Fr. A-J)。取Fr. A (98. 75 g)，甲醇溶解，过滤，沉淀反复重结晶得Lor_4，上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脱(1:0-1:1)，共得8个流份（Fr.Al-8)。取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇水梯度洗脱，再经MCI-gel柱层析，甲醇水梯度洗脱，得银椴苷。经本发明检测方法测定，其含量为96. 14%。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图I为以本发明提取纯化方法所得银椴苷ESI质谱图。
[0020]图2为以本发明提取纯化方法所得银椴苷核磁氢谱图。
[0021]图3为以本发明提取纯化方法所得银椴苷核磁碳谱图。
[0022]图4为以本发明检测方法测定银椴苷高效液相色谱图。
[0023]图5为以本发明检测方法测定白花檣木中银椴苷高效液相色谱图。
【权利要求】
1.一种檣木中银椴苷的提取纯化方法及检测方法，其特征在于： (1)取檣木药材，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，回收溶剂，减压干燥； (2)提取物采用大孔树脂进行分离纯化，得水洗脱物、10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物； (3)70%乙醇 洗脱物，甲醇溶解，硅胶拌样后进行减压硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，共得10个流份(Fr. A^J)； (4)取Fr.A，甲醇溶解，过滤，沉淀反复重结晶得Lor-4，上层溶液，挥干溶剂，再用乙酸乙酯溶解，进行聚酰胺柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，共得8个流份（Fr. Af 8). 取Fr. A6反复ODS柱层析，甲醇/水梯度洗脱，再经柱层析，甲醇/水梯度洗脱，即得到高纯度银椴苷。
2.—种檣木中银椴苷的检测方法，其特征在于： (1)精密称取权利要求1制备得到的银椴苷5.13mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml置IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得每Iml中含0. 0252mg的溶液，摇匀，得银椴苷对照溶液； (2)取檣木药材粉碎，过4号筛，取白花檣木药材粉末lg，精密称定，置平底烧瓶瓶中，精密加入甲醇约50ml，称定重量，回流提取I小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0. 45 ii m微孔滤膜，即供试品溶液. (3)以上两种溶液各取IOiU注入高效液相色谱仪测定，色谱条件为：Waters高效液相色谱仪（Waters2695分离单元，Waters2996 二极管阵列检测器，Empower色谱工作站);Cosmosil C18色谱柱（4.6X250_ 5 y m);流动相：甲醇-0. 1%磷酸水溶液（55 :45);检测波长320nm ;流速1.0ml/min.在此色谱条件下,银锻苷峰型较好,并且能够较好的分离。
3.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：大孔树脂型号为HPD400。
4.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：硅胶为100-200目，减压硅胶为300-400 目。
5.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱比例为：1:0~1:1。
6.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：最后阶段层析柱型号为MCI-gel，甲醇/水梯度洗脱比例为：l:(Tl:l。
【文档编号】C07H1/08GK103694293SQ201310189414
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】饶毅, 冯育林, 魏慧珍, 张武岗, 杨世林, 金浩鑫, 吕尚 申请人:江西本草天工科技有限责任公司