含硒重组人血白蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明适用于基因工程【技术领域】，提供了含硒重组人血白蛋白的制备方法，包括构建毕赤酵母工程菌、发酵培养、纯化等步骤。本发明含硒重组人血白蛋白的制备方法，操作简单，成本低廉，产率高，所制备的含硒重组人血白蛋白即可作为白蛋白补充剂，起其保健作用，克服血源白蛋白安全性的问题，又可以作为有机硒抑制癌症，提高免疫力，增强组织修复能力，具有很大的市场潜力。含硒重组人血白蛋白作为单纯的营养保健品投放市场，与现有的硒营养品相比，其成分更加明确，安全性、有机纯度和营养价值更高。
【专利说明】含砸重组人血白蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种含硒重组人血白蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]人血清白蛋白在人血浆中含量极其丰富，是循环系统中用量最多的蛋白质，约占血浆总蛋白的60%，典型的血浆浓度HSA含量为50g/L，渗透压占全部血浆的80%。正常人血清白蛋白水平为每100mL3.9~4.5g,当每IOOmL血衆中白蛋白水平低于3g时,就会发生全身水肿，当病人受外伤而发生脑压升高，脑部水肿压迫神经时，白蛋白是最重要的抢救手段。因此，人血清白蛋白在临床上主要用于手术输血和危重病人补液，治疗创伤休克、发烧、水肿、低白蛋白血症和红细胞过多症等，而且能增强人体抵抗能力，是重要的临床药物。HSA的主要作用是维持血液的正常渗透压和运送许多亲水分子(如类固醇激素，胆色素和脂肪酸等大量医疗分子)。另外，人血清白蛋白也应用在生物产品的制备上，如临床和层析剂纯化胆红素，用做肝病毒疫苗和稳定剂等。目前市场上销售的HSA商品均来自人源血浆提取纯化。然而人血来源有限，艾滋病、乙肝等病毒的蔓延及检测技术方面的原因，使得因使用该种血液制品而感染艾滋病及肝炎的情况时有发生，以致有的国家禁止国外血液制品的进口，这就对血源人血白蛋白的生产要求和质量控制更加严格。
[0003]为了解决人血清白蛋白来源有限的矛盾，通过基因工程技术把人血清白蛋白基因克隆到微生物(细菌、真菌等)、动物、植物宿主上进行高效表达是最具有前景的方法，近20年以来，国际上许多实验室和公司陆续尝试通过遗传工程开发HSA，国内也有多家单位已经开展了重组人血清白蛋白的研究，HSA基因已被引入细菌、真菌、植物以及动物中进行表达。rHSA在细菌表达中的表达主要是在大肠杆菌E.coli和枯草杆菌Bacillus subtilis两种系统中的表达。rHSA在E coli中表达量可达细胞总蛋白的7%，但因为血清白蛋白分子中含有大量的二硫键，使得胞外折叠 很难正确完成，产物不具有生物活性，而且可能产生极个别的氨基酸序列变化；因而大肠杆菌蛋白表达量虽高，但应用到生产上意义不大。枯草杆菌作表达HSA时，产物聚集在细胞内或在胞外(细胞膜的外面)导致信号序列没有被酶解，阻碍了外源蛋白的分泌途径，使得表达量不高且信号肽去除率低，因而也不适合工业化生产。rHSA也可在大鼠，小鼠，山羊，奶牛等转基因动物中得到表达，在体内试验时，可通过微注射方法把HSA基因片断注射到受精卵中，基因通过同源重组来表达完整的HSA;也可以通过中间受体基因传送把HSA DNA输送到肝细胞中表达；另外，rHSA基因通过细胞外植培养也可进行分泌表达，在外植培养时能够很快地诱导，但基因的表达调控受到胞外基质的双重调控，操作复杂，FDA目前还没有批准任何一家公司用转基因动物生产的重组人血清白蛋白上市，动物细胞培养的高成本，也使得动物细胞的表达受到成本的限制；rHSA也可通过转基因技术在马铃薯和烟叶中得到成功的分泌表达，但与同样存在成本限制的问题。
[0004]硒是生物体所必需的微量营养元素之一，它具有重要的生物学功能。生物体硒缺乏可导致40多种病症，如人体的克山病、大骨节病和动物的白肌病等，因而补硒对生物体是非常必要的。近来的研究还表明，硒作为生物抗氧化剂，有清除有机体内的自由基，减少机体脂质过氧化反应的效应；砸具有抗癌和延缓裳老的作用；砸还有提闻机体免疫活力的作用。此外，硒还对重金属盐如Hg、N1、Pb、Cd等毒性有颉抗效应。研究证实，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH — Px)是哺乳动物体内最早确证其酶功能的含硒蛋白质，硒摄入量不足，血液中此酶的活性会下降。
[0005]到目前为止，人类营养中硒的补充形式大致有2类:第I类是无机硒化合物，这在我国克山病区已收到了较好的效果，但是硒的无机化合物多具有毒性，使用剂量不慎极易引起不良副作用；第2类是人工合成的有机硒化合物，用于注射，以期在体内逐渐释放硒，起到长效作用，但是注射用药的方式限制了它的应用。
[0006]目前或获取的蛋白质中，含有硒的较少，难以达到补硒的目的。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明提供一种含硒重组人血白蛋白的制备方法，解决现有技术中人血白蛋白制备成本高、产量低，并且硒含量差的技术问题。
[0008]本发明是这样实现的，
[0009]一种含硒重组人血白蛋白的制备方法，包括如下步骤:
[0010]构建含重组人血白蛋白基因的毕赤酵母工程菌；
[0011]将该毕赤酵母工程菌进行发酵培养；该发酵培养过程中向培养基中加入体积分数为0.001%~0.05%的亚硒酸钠；
[0012]将发酵培养的产物纯化，得到含硒重组人血白蛋白。
[0013]本发明含硒重组人血白蛋白的制备方法，操作简单，成本低廉，产率高，所制备的含硒重组人血白蛋白即可作为白蛋白补充剂，起其保健作用，克服血源白蛋白安全性的问题，又可以作为有机硒抑制癌症，提高免疫力，增强组织修复能力，具有很大的市场潜力。含硒重组人血白蛋白作为单纯的营养保健品投放市场，与现有的硒营养品相比，其成分更加明确，安全性、有机纯度和营养价值更高。
【具体实施方式】
[0014]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015]本发明实施例提供一种含硒重组人血白蛋白的制备方法，包括如下步骤:
[0016]步骤SOI，构建毕赤酵母工程菌；
[0017]构建方法采用基因工程领域 中常规技术手段:
[0018]通过RT-PCR克隆人肝细胞来源的rHSA，扩增后的产物经酶切和电泳回收后，插入质粒pPIC9K的多克隆位点，构建表达质粒pPIC9K-rHSA，双酶切鉴定阳性克隆后转化毕赤酵母GS115，PCR鉴定阳性克隆。具体如下:
[0019]总RNA的提取:
[0020]A.事先准备提取RNA专用的离心管、枪头、研钵及相关试剂等:
[0021]1.用氯仿浸泡1.5mL的离心管、10yL、200yL和ImL的枪头，分别装于用氯仿拭搽过的玻璃瓶和枪头盒中，于121°C (1.034X105Pa)固体模式灭菌20min。[0022]2.研钵和研锤洗净烘干后，先用乙醇浸泡一小时，再用氯仿浸泡半小时，用前先加液氮冷却。
[0023]3.DEPC水的准备:在双蒸水中加入DEPC，使终浓度达到0.1%(V/V)，用力摇匀后，继续置于摇床上以IOOrpm的速度摇过夜。于121°C (1.034X 105Pa)液体模式灭菌20min。冷却后密闭备用。
[0024]B.用Trizol Reagent试剂盒(INVITR0GEN)进行总RNA的提取，按试剂盒提供的说明书进行操作。
[0025]1.先将人胎盘组织在液氮中研磨成粉。将粉末分装到Eppendorf中，每管分装IOOmg左右。每管加入ImL Trizol试剂,混匀，室温放置5min。加入氯仿200 μ L,用力振荡15sec,室温孵育2~3min。
[0026]2.在4°C下以12000Xg的速度离心15min，混合物分为红色的酚一氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。总RNA分散在上层水相中。
[0027]3.将上层水相(500 μ L)转移到一个新的Eppendorf管中，加入ImL无水乙醇,混匀以沉淀RNA。
[0028]4.室温孵育IOmin以上，在4°C下以12000Xg的速度离心lOmin，可见白色的RNA
沉淀贴于试管底壁。
[0029]5.弃上清，用70%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，在4°C下以7500Xg的速度离心5min。
[0030]6.弃上清，空气中自然干燥，用60 μ L DEPC水溶解沉淀，一 70°C保存备用。
[0031]变性琼脂糖胶电泳检测总RNA的质和量
[0032]1.作一块1.5%的变性琼脂糖胶:称取0.9g琼脂糖，加入45mL DEPC水，用微波炉加热溶胶后，依次加入甲醛10mL、10XM0PS6mL，混匀，冷却到35 — 40°C后倒于插好梳子的水平托盘上，放置I小时使之凝固。
[0033]2.离心出总RNA沉淀，洗涤干燥后溶于20 μ L的DEPC水。
[0034]3.于65°C恒温干浴锅中变性IOmin.,马上冰浴5min.。
[0035]4.取5 μ L总RNA溶液,力卩5 μ L预冷的上样缓冲液(loading buffer)和10 μ L预冷的样品缓冲液(sample buffer),混匀。
[0036]5.用移液器小心将混合液滴加入琼脂糖凝胶的加样孔中。
[0037]6.以50伏的电压电泳90 — 120分钟(溴酚兰泳动到胶长2/3的位置)。
[0038]7.将琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察并照像。
[0039]RT-PCR 扩增 HSA cDNA
[0040]根据Lawn等发表的人血清白蛋白cDNA序列(Genebank V00495)设计上下游引物，引物序列如下:
[0041]SEQ ID NO:1PRIMER13:5’ -gatgcacacaagagtgaggtt-3’
[0042]SEQ ID NO:2PRIMER14:5’ _ttataagcctaaggcagcttg_3’
[0043]把所得RNA稀释10倍作为PCR摸板，用反转录酶和特定引物P14，将mRNA反转录成cDNA，再进行PCR。反转录的步骤和体系为:(1)在1.5或0.5mL EP管中加入primerl40.5μ L, RNA2 μ L, dNTP0.5 μ L，双蒸水 9 μ L，65C 水浴 5min 后冰浴，稍离心。(2)在上述管中加入 5Xbuffer2y L，0.1mol/mL DTTl μ L，Rnase out0.5 μ L，混匀后 42°C水浴2min。(3)加 0.2uL SupprscriptTMRT(Invitrogen)混匀。(4)在温箱中 42°C培养 50min。
(5)70°C, 15min灭活反转录酶。
[0044]以反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增，
[0045]反应体系:
[0046]
IOxbuffer5.0 μ L
Ex-Taq0.5 μ L
dNTP4.0 μ L
PRIM ER 131.0 μ L
PRIMER 14I ΟμΕ
cDNA2,0 μ L
^dciH2050.0 μ L
[0047]反应条件为:
[0048]
94 °C4 min 94 C I --ι in 56'C I min I for 30 cycles 72 °C 2 min」
12X15 mill
4 °Cpause
[0049]PCR扩增的HSA基因片段的纯化
[0050](I)配制琼脂糖凝胶，电泳以分离DNA片段。
[0051](2)电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来。并尽量去除多余的凝胶。
[0052](3)称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为Ig / ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml ;加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于55? -65?水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次.[0053](4)转移700 μ I的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBind DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10, OOOXg离心Imin,弃去液体。
[0054](5)将柱子重新套回收集管中，加300 μ LBinding Buffer至HiBind DNA柱子中；室温下，10，000 Xg离心I分钟，去弃滤出液。[0055](6)将柱子重新套回收集管中，加入700 μ L Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10，000 Xg离心I分钟，去弃滤出液。
[0056](7)将柱子重新套回收集管中，重复加入700 μ L Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10，000Xg离心I分钟，去弃滤出液；
[0057](8)弃去液体，将空柱子重新套回收集管中，10，000Xg离心Imin以甩干柱基质残余的液体。
[0058](9)把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入3-50 μ I洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10，OOOXg离心I分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20°c。
[0059]重组质粒pUCMT-HSA的构建
[0060]将纯化的HSA基因和pUCMT载体用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a受体菌。涂布含Amp、IPTG、X-gal的SOC琼脂平板，37°C培养过夜后，平板上长出许多蓝色、白色菌落。
[0061]重组质粒的鉴定
[0062](I)利用蓝白斑筛选，从每个平板上挑取10个白色菌落，分别接种于含ImL(加ampicilli)液体LB培养基的Ep管中。
[0063](2)于37°C摇床上以250rpm的速度振荡培养36h，中间在净化工作台上打开管盖，换气I次。
[0064](3)室温以12, OOOrpm离心5min,收集菌体沉淀,弃上清,加入100 μ L冰预冷的溶液I，在涡旋器上剧烈振荡使 沉淀完全悬浮。
[0065](4)加入200 μ L溶液II，颠倒数次混匀，室温放置5min。
[0066](5)加入150 μ L冰预冷的溶液III，轻微颠倒数次混匀，冰浴lOmin，澄清的溶液中会出现絮状沉淀。
[0067](6)室温以12, OOOrpm离心5min,将上清转移到另一新的Ep管中。
[0068](7)加入2倍体积的无水乙醇，反复颠倒几次混匀，室温下放置15min以上，以沉淀质粒DNA。
[0069](8)室温以12，OOOrpm离心5min，弃上清。用75%乙醇洗涤DNA沉淀一次。
[0070](9)干燥后将质粒 DNA 溶于 50 μ L TE (ρΗ8.0)中，并加入 I μ L RNase A(10mg/mL)，置于37°C过夜以除去RNA。
[0071](10)对每种重组质粒进行PCR检测，以确定是否含有目的基因.[0072]重组质粒的序列测定
[0073]提取阳性克隆菌带有的重组质粒送南京金思瑞生物技术有限公司测序。采用T7通用引物进行测序，得到的结果为HSA cDNA基因的反向互补序列。利用软件DNAMAN处理后得到HSA基因序列，序列对齐结果显示克隆得到的HSA基因序列与GENBANK数据库中登记号为V00495的序列完全一致，结果如下:
[0074]SEQ ID NO:3 1758bp;
[0075]Composition 548A;350C;403G;457T;OOTHER
[0076]Percentage:31.2%A; 19.9%C; 22.9%G; 26.0%T;0.0%0THER
[0077]Molecular Weight(kDa):ssDNA:544.19dsDNA:1083.68
[0078]ORIGIN
【权利要求】
1.一种含硒重组人血白蛋白的制备方法，包括如下步骤: 构建含重组人血白蛋白基因的毕赤酵母工程菌； 将所述毕赤酵母工程菌进行发酵培养；所述发酵培养过程中向培养基中加入体积分数为0.001%-0.05%的亚硒酸钠； 将发酵培养的产物纯化，得到含硒重组人血白蛋白。
2.如权利要求1所述的含硒重组人血白蛋白的制备方法，其特征在于，所述发酵培养步骤为: 将所述毕赤酵母工程菌在30°C条件下用YPD培养基培养12~18h ； 将种子液转移至BMGY培养基中，在温度为28°C，pH值为6的条件下培养，检测菌液OD600为0.6时向培养基中加入甲醇溶液； 将温度调整至28°C，PH值调节为5-9发酵培养72-120小时，每隔12小时向培养基中加入甲醇和甘油混合溶液及体积分数为0.001%-0.05%的亚硒酸钠。
3.如权利要求2所述的含硒重组人血白蛋白的制备方法，其特征在于，所述甘油溶液的质量浓度为0.01%-5%，所述甲醇溶液的质量浓度为0.01%-5%。
4.如权利要求1、2或3所述的含硒重组人血白蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤前还包括如下灭活步骤: 将发酵培养后的溶液离心，收集上清液； 将所述上清液在温度为30~80°C条件下热处理1-5小时，离心处理后收集上清液，得到热处理后上清液。
5.如权利要求4所述的含硒重组人血白蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤如下: 将所述热处理后上清液经过(NH4)2SO4沉淀、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤分离纯化及使用相对分子量为5000~100，000中空纤维超滤膜进行脱盐处理，得到含硒重组人血白蛋白。
【文档编号】C07K1/18GK103468769SQ201310188214
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】徐东, 杨艳群 申请人:深圳市亚太兴实业有限公司