一种净化三聚氰胺的层析柱及含有该层析柱的试剂盒及利用该试剂盒净化三聚氰胺的方法
【专利摘要】本发明为一种用于牛奶、奶粉和鸡蛋等动物源性食品中三聚氰胺残留样品净化的试剂盒，由净化三聚氰胺的免疫亲和层析柱，淋洗液，洗脱液，再生液，平衡保存液组成；该净化三聚氰胺的免疫亲和层析柱装载的吸附剂是由固相载体和与其偶联的三聚氰胺多克隆抗体组成；所述三聚氰胺多克隆抗体是以三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述三聚氰胺半抗原是三聚氰胺结构类似物4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸。本发明的净化方法结合色谱法或者色谱串联质谱法高效检测三聚氰胺的含量，具有高选择性，且方法操作简单，净化效果好，避免杂质对测定结果产生的干扰，免疫亲和色谱柱可重复使用，降低分析成本和环境污染。
【专利说明】一种净化三聚氰胺的层析柱及含有该层析柱的试剂盒及利用该试剂盒净化三聚氰胺的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种三聚氰胺免疫亲和色谱柱的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及三聚氰胺检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]三聚氰胺(Melamine)(化学式:C3H6N6)，俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“ 1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水(3.lg/L常温)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类、对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。
[0003]三聚氰胺是制造三聚氰胺甲醛的原料。该树脂常用于制造日用器皿、装饰贴面板、织物整理剂等，在日常生活中最常见的应用是塑料碗碟。这类器皿的物理性质非常类似陶瓷，坚硬不变形但又不像陶瓷那样易碎。而且标有“不可以在微波炉中使用”的警示，因为三聚氰胺甲醛加热超过120°C后有可能散发毒性。三聚氰胺还可以与乙醚配合作纸张处理齐U，在一些涂料中作交联剂，以及阻燃化学处理剂等。
[0004]三聚氰胺本身为低毒性，三聚氰胺对大鼠的半数致死量为每千克3248mg。一般成年人身体会排出大部分的三聚氰胺，不过如果与三聚氰酸并用，会形成无法溶解的氰尿酸三聚氰胺，造成严重的肾结石。已经有报道称，三聚氰胺在人体的消化过程中，特别是在胃酸的作用下，自身即可能部分转化为三聚氰酸，而与未转化部分形成结晶。一项毒物学研究也证实回收的受污染宠物饲料中，三聚氰酸与三聚氰胺并用，是造成猫严重肾衰竭的主因。长期摄取三聚氰胺可能造成生殖能力损害、膀胱或肾结石、膀胱癌等。
[0005]食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用一种叫做凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺(含氮量66%)与蛋白质(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象，从而造成诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等严重的食物安全事故。
[0006]2007年3月中旬以来，美国发生4000多起猫、狗等宠物死亡事件，被认定是宠物食品中含有的三聚氰胺所致。2008年的三聚氰胺奶粉事件中，约30万婴幼儿受到影响，有6例死亡报道。这一事件发生之后，我国政府对食品中的三聚氰胺污染进行了严格的监管，但仍不时曝出有奶粉或饲料产品检出三聚氰胺阳性。2009年末，上海市食品安全联席会议办公室公布消息称上海熊猫乳品有限公司由于涉嫌生产和销售含三聚氰胺的乳制品而被监管部门依法查处。就在上述消息发布的三周前，陕西金桥乳业有限公司也被相关部门查出5.25吨问题奶粉，其中11袋275公斤奶粉的三聚氰胺含量超标。2010年初，贵州卫生厅发布了经检测后发现三聚氰胺含量超标的食品“黑名单”，包括来自辽宁和河北的两个厂家生的冰棒和山东某乳品公司的牛奶。2011年4月，重庆市公安局查获了一批重达26吨由内蒙古某乳业公司供给重庆某雪糕生产商的三聚氰胺超标的原料奶粉，抓获5名涉案人员，刑拘3人。2012年，农业部在全国30个省(区、市)进行了饲料产品的质量安全监测工作。抽检结果发现河南某饲料厂的鱼粉产品和山东省某畜牧科技公司的水解羽毛粉产品中含有三聚氰胺。这些问题的不断出现，表明三聚氰胺进入食品体系的可能性仍然存在，仍需要保持对三聚氰胺的严格监控状态。
[0007]美国食品和药品管理局(FDA)于2007年5月25日发布的风险评估报告指出:人体可容忍的三聚氰胺每日摄取量(tolerable daily intake, TDI)为0.63 mg/ (kg.d)。2008年10月3日，FDA把TDI值调整到0.063 mg/ (kg.d)(对应健康无害的摄取量)。2009年6月农业部公告第1218号规定饲料原料和饲料产品中三聚氰胺限量值为2.5mg/kg。2011年4月，我国卫生部、农业部等5部委发公告规定婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为lmg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。2012年7月，国际食品法典委员会第35届会议审查通过了液态婴儿配方食品中三聚氰胺限量标准，液态婴儿配方食品中三聚氰胺限量为0.15mg/kg。
[0008]目前，三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱法(GC-MS)，液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)等，但这些方法前处理过程均比较繁琐，如GC法需要衍生化，过程复杂，后经常规的SPE柱净化和分离，存在着净化效果差，有机溶剂掺杂，所需时间长等缺点。免疫亲和技术是90年代在分析领域发展起来的新技术，免疫亲和柱(IAC)是利用免疫亲和层析原理制作的分离分析预装柱，由于抗原与抗体作用的高度特异性，待测样品通过IAC柱后能有效，快速，灵敏，准确的去除绝大部分杂质从而净化富集目标物。但是，用免疫亲和柱净化基质中的三聚氰胺虽有文献报道，但文献中所用的多克隆抗体制备方法复杂，本专利采用商品化试剂4，6- 二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸作为半抗原，制备三聚氰胺的多克隆抗体，其制备方法简单，抗体得率和滴度高。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱，及由其为主组成的净化三聚氰胺的试剂盒，用于牛奶、奶粉和鸡蛋等动物源性食品中三聚氰胺残留样品净化。
[0010]本发明的技术方案:一种净化三聚氰胺的试剂盒，由净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱，淋洗液，洗脱液，再生液，平衡保存液和海绵托架所组成；所述净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱是将三聚氰胺多克隆抗体包埋于固相载体上而后作为填料装柱而成；所述的三聚氰胺多克隆抗体是以4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸为半抗原与载体蛋白偶联而成的完全抗原为免疫原得到的三聚氰胺兔多克隆抗体；
所述固相载体为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶，优选为溴化氰活化的Sepharose 4B ；
所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；
所述淋洗液为0.01M, ρΗ7.4，含0.05% Tween-20的PBS溶液;
所述洗脱液为甲醇一甘氨酸盐酸溶液，甲醇:甘氨酸盐酸溶液体积比为1:1 ;甘氨酸盐酸溶液为甘氨酸7.5g，12mol/L盐酸10mL，用高纯水定容至500mL，甲醇500mL ；
所述再生液为含0.01%叠氮钠、含0.05% Tween-20的0.01M, ρΗ7.4的PBS溶液; 所述平衡保存液为0.01Μ, ρΗ7.4的PBS溶液；
所述PBS缓冲液为IL溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，十二水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g。
[0011]用所述的净化三聚氰胺的试剂盒净化三聚氰胺残留样品的方法，步骤为:
1)样品的前处理:参照国家标准GB/T22388-2008:称取Ig的奶粉样品于50mL塑料离心管中，加入8mL三氯乙酸和2mL乙腈,斡旋混勻后,再震荡提取IOmin,然后以5000r/min离心5min,取上清液；
2)净化:免疫亲和色谱柱使用前用IOmL的PBS平衡保存液平衡；然后将步骤I)得到的上清液通过所述的免疫亲和层析柱；然后用所述的淋洗液及超纯水洗涤，再用所述的洗脱液洗脱，收集洗脱液经0.22Mffl孔径的有机滤膜过滤后即得到净化的试样液，用于后续仪器分析样品中三聚氰胺含量。
[0012]本发明的免疫亲和色谱柱基于免疫反应和色谱原理，适合从各种基质样品(如奶粉、液态奶、鸡蛋)中净化三聚氰胺，便于后续分析。在所述免疫亲和色谱柱中，三聚氰胺的多克隆抗体与S印harose 4B的偶联率为72.57±1.70。动态柱容量为1046.3±17.2 ng/mL，绝对柱容量为121.5ng/mg IgG。，使用了 8次后柱容量为总柱容量的47%左右，保存期为半年。
[0013]本发明的有益效果:本发明的免疫亲和色谱柱具有高选择性，将抗体的非结合活性区域Fe端定向的包埋于载体，更好的保持抗体的活性，且方法操作简单，净化效果好，避免杂质对测定结果产生的干扰，免疫亲和色谱柱可重复使用，降低分析成本和环境污染。本发明的净化方法结合色谱法可用于奶粉，液态奶，鸡蛋等样品中三聚氰胺的高效检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1三聚氰胺标准品的液相色谱图(0.5Pg/mL)。
[0015]图2空白牛奶样品的液相色谱图。
[0016]图3在空白牛奶样品中添加200ng/mL三聚氰胺的液相色谱图。
[0017]图4三聚氰胺不同浓度标准品的液相色谱标准曲线。
【具体实施方式】
[0018]为更好的理解本发明，下面结合具体的实施例来进一步阐明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0019]实施例1三聚氰胺多克隆抗体的制备
(I)动物免疫:以三聚氰胺结构类似物4，6- 二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸为半抗原，经活性酯法与载体蛋白BSA偶联为免疫原，选用三月龄健康、雄性、体重为1.5kg左右的新西兰大白兔为免疫动物，免疫剂量为lmg/kg体重，首免时混合等体积的完全弗氏佐剂，14天后，加等体积的不完全弗氏佐剂以同样剂量进行加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周、6周后进行。免疫注射方式采用背部皮下多点注射。每次加强免疫后7天时由兔子耳静脉取血，进行效价检测，直到血清效价和特异性达到要求。
[0020](2)抗体纯化
定时监测抗体效价，当抗体效价达到较高的水平则最后加强免疫一次，第7?10天后颈动脉采全血。将采集的全血置于37°C温箱I小时，再转移至4°C冰箱内放置4小时。3000rpm离心10分钟，吸取上清分装，_20°C保存备用。获得的血清用饱和硫酸铵法纯化，具体做法是:取兔抗血清IOmL,加IOmL的PBS混匀，边搅拌边逐滴加入20mL，PH=7.4的饱和硫酸铵溶液，使其成50%饱和度，充分混合后4 1:静置过夜后取出4 V离心6000rpm 15min，弃上清。沉淀用10mL，0.01mol/L，PH=7.4 PBS溶解，边搅拌边逐滴加入5mL饱和硫酸铵，使其成33%饱和度，室温沉淀一小时后6000rpm 15min，弃上清，将此过程重复两次。所得沉淀用适量PBS液溶解，小心地转移至透析袋内，用100倍体积的PBS 4°C透析48h，期间更换4-5次。透析完成后分装，-20°C保存。
[0021](3)三聚氰胺抗体特异性测定
将三聚氰胺的结构类似物环丙氨嗪配成0.1、1、10、50、100、200 μ g/mL,三聚氰酸、四环素、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、氨苄青霉素分别配成2000、1000、500μ g/mL，与包被抗原竞争抗血清中的抗体，按间接竞争ELISA操作步骤测定，得出各自IC5tl值，计算交叉反应率:
交叉反应率=(引起5 O %抑制的三聚氰胺的浓度/引起5 O %抑制的其他物质的浓度)X 100%
其中环丙氨嗪产生了一定的抑制作用，三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸、四环素、氨苄青霉素均不能抑制包被抗原与抗Mel血清的结合，无交叉反应性。
[0022]表1.几种物质与三聚氰胺抗体的交叉反应率结果
【权利要求】
1.一种净化三聚氰胺的免疫亲和层析柱，其特征在于，由固相载体和与其偶联的三聚氰胺多克隆抗体组成；所述三聚氰胺多克隆抗体其特征在于采用商品化试剂与载体蛋白BSA相连接合成的人工抗原，经免疫动物后采血，分离抗血清后纯化制得；所述三聚氰胺半抗原是二聚氰胺结构类似物4,6- 二氨基-1,3, 5- 二嗪-2-乙酸,结构式为
2.根据权利要求1所述的层析柱，其特征在于，所述固相载体为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶，优选为溴化氰活化的Sepharose 4Β ;所述三聚氰胺多克隆抗体为兔抗三聚氰胺多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的层析柱，其特征在于:所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
4.一种含有上述任一权利要求所述的层析柱的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液为甲醇。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还包括洗涤液和保存液；所述洗涤液为PH 7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述0.01mol/L磷酸盐缓冲液为IL溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，十二水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.Sg ;所述保存液为在IL 0.01mol/L, pH7.4磷酸盐缓冲液加入叠氮化钠0.2g。
6.一种利用上述试剂盒净化三聚氰胺的方法，包括以下步骤: 1)样品的前处理: 参照国家标准GB/T 22388-2008:称取Ig的奶粉样品于50mL塑料离心管中，加入8mL三氯乙酸和2mL乙腈,润旋混匀后,再震荡提取IOmin,然后以5000r/min离心5min,取上清液； 2)净化: 免疫亲和色谱柱使用前用IOmL的PBS平衡保存液平衡；然后将步骤I)得到的上清液通过所述的免疫亲和层析柱；然后用所述的淋洗液及超纯水洗涤，再用所述的洗脱液洗脱，收集洗脱液经0.22ΜΠ1孔径的有机滤膜过滤后即得到净化的试样液，用于后续仪器分析样品中三聚氰胺含量。
7.根据权利要求6所述的净化三聚氰胺的方法，其特征在于:所述动物组织样品包括肌肉、肝、肾、血液、牛奶和蛋。
【文档编号】C07D251/62GK103506094SQ201310297604
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】施祖灏, 张小燕, 高玉时, 唐修君, 唐梦君, 蒲俊华, 陈大伟, 葛庆联, 林伊莱 申请人:江苏省家禽科学研究所