水稻转录因子Os03g50310基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os03g50310基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os03g50310基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而增加产量，如株高增高、每穗粒数增加。对于详细阐明调控水稻产量发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的产量，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】水稻转录因子0s03g50310基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s03g50310基因的应 用。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003] 水稻产量是一个复杂的农艺性状，由有效穗数、穗实粒数及粒重构成，多数表现为 数量性状，从植物学角度来说，分蘖与穗部发育都包括顶端生长和分枝，株型及穗型的最终 构成取决于这两者之间的平衡和协调，受到了基因型、激素、光周期、内部的发育信号及环 境因子等构成的复杂网络调控。粒重由稻谷的长、宽、厚以及充实度共同决定。迄今为止， 报道单株产量QTL (数量性状位点）的数量比较少，这可能是由于多数QTL同时具有正负效 应导致产量未发生变化，另外与产量的遗传力低有关。Xiao等在马来西亚普通野生稻中检 测到2个正效QTL，yldl. 1和yld2. 1可分别提高产量18%、17%。李德军等在东乡普通野生 稻的第2和11染色体上发现2个高产QTL，贡献率分别为17%、12%，He等对位于第2染色 体上的高产QTL进行了精细定位。相比较而言，以产量构成因子作为表型进行定位和克隆 的报道则较多，如基因Ghd7在长日下表达增强，从而延迟抽穗，使植株增高、穗粒数增多、 茎杆粗壮抗倒，从而提高单株产量。位于第1染色体短臂上的Gnla基因编码细胞分裂素氧 化/脱氢酶，能降解细胞分裂素含量Gnla是一个负向调控因子，表达量的降低可引起花序 分生组织中细胞分裂素的积累，促进生殖器官数量的增加，从而增加颖花数量，最终提高产 量。
[0004] VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动 物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转 录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转 录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出 现更明显的表型变化。
[0005] C0NSTANS-LIKE蛋白家族是一个转录因子家族，在拟南芥中含有17个基因成员， 含有2个保守区，B-box和CCT(C0, COL和T0C1)区。在拟南芥中C0NSTANS-LIKE家族多个 基因共同调节光周期途径开花时间。目前C0NSTANS-LIKE家族转录因子0s03g50310对作 物产量调控机制的研究及认识很少，因此该转录因子的研究在理论上为进一步理解作物产 量调控的分子机理提供了新的线索；在实践上也将为作物高产育种提供理论基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s03g50310基因的应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种融合蛋白，该融合蛋白为（VP16) n-Linker_0s03g50310 ;其中，n为彡1的整数；Linker由1?50个柔性氨基酸串联而成； VP16为来自单纯疱疫病毒（Herpes simplex virus)的VP16蛋白；0s03g50310为水稻转录 因子 0s03g50310。
[0008] 进一步地，所述融合蛋白为（VP16)4-Linker-0s03g50310 ;其中，Linker由39个柔 性氨基酸串联而成。
[0009] 所述水稻转录因子0s03g50310的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
[0010] 其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQ ID No. 9所示，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 3所示；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白；0s03g50310为水稻转 录因子 0s03g50310。
[0011] 所述水稻转录因子0s03g50310的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列也属于本发明的保护 范围。
[0012] 其中，（VP16) 4 即 VP64,是由 4个VP16 功能域基序（Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu)以Gly Ser两个氨基酸间隔融合在一起组成的增强子，其序列如SEQ ID No. 10所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0013] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。
[0014] 所述载体的构建方法如下：
[0015] (1)在植物转录因子数据库中找到0s03g50310基因，根据其序列设计PCR扩增引 物对，其为正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGCCGCCGCGGCG-3' 和反向引物 R : 5,-CAAGAAAGCTGGGTCAAAACGGTAGCGCCCGTG ;
[0016] (2)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s03g50310全序列；
[0017] (3)将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列；
[0018] (4)以双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter_Gateway-VP64 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35S promoter-bar 表 达单元与之融合构建，得到载体cVP64-bar_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示；
[0019] (5)通过LR反应将0s03g50310构建到融合了 VP64标签的植物表达载体 cVP64-bar-asRED 上，获得载体 ubi: :0s03g50310-VP64,载体全序列如 SEQ ID No. 6 所示。
[0020] 携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998， Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 页； Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0021] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0022] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方法， 将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0023] 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻产量(如增加每穗粒数）中的 应用。
[0024] 本发明还提供了用于扩增水稻转录因子0s03g50310基因的引物对，其为正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCGAGCGCCGCCGCGGCG-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC AAAACGGTAGCGCCCGTG-3,。
[0025] 本发明还进一步提供水稻转录因子0s03g50310基因在调控水稻产量性状中的应 用。
[0026] 前述的应用，是将水稻转录因子0s03g50310基因的CDS序列通过Gateway系统构 建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻产量的性状。
[0027] 本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水 稻转录因子0s03g50310基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而改良水 稻产量性状，如增加每穗的粒数、增加单株产量。对于详细阐明调控产量发育机理具有重要 的理论价值，并且可以通过转基因手段，增加水稻的产量，因此在生产实践中也具有重要意 义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例1中cVP64-bar-asRED载体图谱。
[0029] 图2为本发明实施例1中ubi: :0s03g50310-VP64载体图谱。
[0030] 图3为本发明Q-PCR检测0s03g50310-VP64转基因阳性株系，其中WT为野生型水 稻 'kitaake'，0E4、0E7 为 0s03g50310-VP64 转基因水稻株系。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032] 实施例0s03g50310基因的分离和植物表达载体构建
[0033] 在植物转录因子数据库中找到0s03g50310基因，根据其序列设计PCR扩增引物， 根据其序列设计PCR扩增引物(正向引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGCCGCCGCGG CG-3'和反向引物R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCAAAACGGTAGCGCCCGTG。以野生型日本晴水稻总 cDNA为模板，进行PCR获得0s03g50310全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0034] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第 一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物F和引物R，而第二轮的模板用第 一轮的 PCR 产物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物（attB5' adaptor :5' -GTGGGGACAAG TTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3 '。）。将PCR产物连接到pDONER克隆载体(购自Invitrogen)上，经测序鉴定得到与目的基 因完全相同的序列。通过LR反应将0s03g50310构建到cVP64-bar_asRED (图1，载体全序 列如3￡〇10此.5所示）上，获得载体111^::〇8〇385031〇- ￥?64(图2，载体全序列如5￡〇10 No. 6所示）。
[0035] 实施例2转基因水稻植株的获得
[0036] 取水稻'kitaake'成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将Ubi : : 0s03g50310-VP64转入水稻愈伤组织中，用含有100 i! M的 乙酰丁香酮和〇. D.值为0. 7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织 置于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每IOd继代一 次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿 色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获 转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。
[0037] 其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0038] 共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 2后加入植物 凝胶4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200iig/mL。
[0039] 筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物 技术有限公司）。
[0040] 分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/ L NAA+2.0mg/L Kinetin (激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0041] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0042] 为检测ubi: :0s03g50310-VP64基因在实施例2方法中的T2代转基因水稻中的过 表达情况，利用Q-PCR进行鉴定。实时定量PCR采用ABISt印One进行，利用SYBR Green I 检测荧光信号。引物序列为：
[0043] Q3g50310-F:TTCGATCCCAGCGAGTCATG
[0044] Q3g503IO-R:GCACCTCGTACCGGATCTTCTT。
[0045] 1)反应体系为15 ii 1 :
[0046]
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为（VP16)n-Linker-0 S03g50310 ;其中，η为 彡1的整数；Linker由1?50个柔性氨基酸串联而成；VP16为来自单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白；0s03g50310 为水稻转录因子 0s03g50310。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为（VP16) 4-Linker-0s03g50310 ;其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成。
3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述水稻转录因子0s03g50310的氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 编码权利要求1-3任一项所述融合蛋白的基因。
5. 含有权利要求4所述基因的载体。
6. 含有权利要求4所述基因的工程菌。
7. -种转基因水稻的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求5所 述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材 料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
8. 用于扩增水稻转录因子0s03g50310基因的引物对，其为： 正向引物 F :5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGCCGCC GCGGCG-3' ； 反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCAAAACGGTAGCGCCC GTG-3'。
9. 水稻转录因子0s03g50310基因在调控水稻产量性状中的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s03g50310基因的 ⑶S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良 转基因水稻产量的性状。
【文档编号】C07K19/00GK104292336SQ201310296096
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】万建民, 程志军, 刘军, 赵涛, 刘斌, 李宏宇, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所