重组人干扰素样蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及重组人干扰素样蛋白。在一个实施方案中，描述了通过基因改组技术获得的重组蛋白，其具有相比天然存在的人干扰素α2b（HuIFN-α2b）而言增强的抗病毒和抗增殖活性。本发明包括编码所述蛋白质的多核苷酸以及含有该多核苷酸的重组载体和宿主细胞。优选地，所述多核苷酸选自其中每个多核苷酸具有与SEQ?ID?No：1至少93％同一的序列的多核苷酸的组，和所述蛋白质选自其中每个蛋白质具有与SEQ?ID?No：2至少85％同一的氨基酸序列的蛋白质的组。所述蛋白质和包含所述蛋白质的组合物可用于治疗对干扰素疗法作出响应的病状，例如病毒疾病和肿瘤。
【专利说明】重组人干扰素样蛋白
[0001]本申请是申请号为200780000441.X、申请日为2007年6月22日，发明名称为“重组人干扰素样蛋白”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本申请涉及具有人干扰素样生物学活性的重组蛋白。
[0003]背景
[0004]在本申请中采用在Nature (I)中公布的干扰素(IFN)术语。
[0005]人干扰素(HuIFN)由Isaacs和Lindenmann在1957年发现(2)，其是一个熟知的细胞因子家族，所述细胞因子由各种真核细胞在暴露于各种不同刺激如病毒感染或者接触促细胞分裂原后分泌。IFN可以引起细胞行为的多种变化，包括影响细胞的生长和分化以及调节免疫系统(3-7)。HuIFN 分为 6 个亚型，即 IFN-a，IFN-β，IFN-Y，IFN-ω，IFN-ε 和IFN-κ。HuIFN-α (白细胞衍生的干扰素)在人白细胞中产生，而少量HuIFN-β (成纤维细胞衍生的干扰素)在类淋巴母细胞中产生。HuIFN根据其化学和生物学特征进一步分为两大类型，即类型I和类型II。类型I包括IFN-α和IFN-β亚型以及最近发现的IFN-ω，IFN- ε和IFN-κ亚型。类型II只有一个成员:IFN-Y (免疫干扰素)。
[0006]不同的干扰素亚型具有不同的结构和生物学特征。HuIFN-β是N-联糖蛋白(8，9)，其已被纯化至具有均一性并进行了表征。其大小是不均一的，可能是由于它的糖部分。但是，只存在一个人IFN-β基因，其编码含166个氨基酸的蛋白质。IFN-β与IFN-α的同源性低，共享大约30-40%的同一性。
[0007]与IFN-β基因的单一性不同，HuIFN-α是由大体上14个基因的多基因家族组成的亚型。由一个或两个氨基酸`差异形成的小变体说明了复等位基因的存在(10)。除了假基因IFNAP22以外，存在13个基因，其编码13种蛋白质。每种蛋白质由165-166个氨基酸组成。IFNA13基因所编码的蛋白质与IFNAl蛋白相同。因此，存在12种不同的干扰素-α蛋白:IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAlO, IFNA14、IFNA16、IFNA17 和IFNA21。IFN-α亚型之间的氨基酸序列同一性通常为80-85% (11)。
[0008]成熟的IFN-ω与IFN-α种类的家族显示出60%的核苷酸序列同源性，但其C-末端长了 6个氨基酸。IFN-ω与干扰素-β的相关性更远(共享大约30%的序列同源性)。人IFN-ω没有归类到IFN-α组，这是因为它在抗原性方面与IFN-a不同，以及在其与I型IFN-a受体的相互作用方面不同(12)。IFN-ω由感染了病毒的白细胞分泌，作为人白细胞干扰素的主要组分。
[0009]成熟的人IFN-ε蛋白含有185个氨基酸，分别与IFN-a 2和IFN-β共享大约33 %和37%的序列同源性(13，14)。IFN- ε的功能和生物物理学特性还没有得到有效的详细表征；但是，它像I型干扰素一样发挥作用。IFN-ε也可能在生殖功能上发挥作用(15)。
[0010]IFN- K是含180个氨基酸的人细胞因子，其是一种最近鉴定的I型IFN。IFN- κ的编码序列与在人中发现的其他I型干扰素具有~30%的同一性。IFN-κ的一个区别性特征是:在未诱导的细胞特别是角质形成细胞中其转录物的可检测的组成性表达。IFN-κ可能通过影响先天免疫系统的细胞而在调节全身或局部免疫功能中发挥作用(16)。但是，IFN-κ表现出低的抗病毒活性(17)。
[0011]人I型干扰素看来似乎结合2个受体亚基，即IFNAR-1和_2，它们广泛分布在各种细胞类型的细胞表面。配基的参与诱导了分别耦联至IFNAR-1和-2的酪氨酸激酶TYK2和JAK-1的磷酸化。一旦发生磷酸化，STAT蛋白就从受体上释放出来并形成同源二聚体和异源二聚体(18，19)。释放后，STATA的二聚体结合干扰素应答因子9 (IRF-9)(其是一种DNA结合蛋白)，从而形成称作IFN刺激的基因因子-3 (ISGF-3)的复合物，其迁移入细胞核中。接着，ISGF-3复合物与在所有IFN可诱导的基因的上游存在的一个DNA元件相结合。这就是所谓的“经典的”信号转导途径。
[0012]目前不断发现了受I型IFN调控的新的作用方式和生化途径。例如，在所述信号转导途径中PI3K的下游，核因子κ-Β (即-1^8)和？1((:-(1与在用IFN-β孵育的嗜中性粒细胞中观察到的抗凋亡效应相关(20 )。
[0013]超过300个基因(称作干扰素诱导的基因)对IFN处理起反应。研究最多的IFN蛋白是具有抗病毒特性的那些。例如，2，5寡腺苷酸合成酶家族的酶(0AS-1和-2)催化合成短的寡腺苷酸，其结合并活化RNAseL (为一种切割病毒和细胞RNA的酶)，从而抑制蛋白质的合成。经DsRNA活化的蛋白激酶(PKR)使翻译抑制因子eIF2a磷酸化，还可导致病毒和细胞蛋白质合成的抑制。最近，还发现PKR是活化转录因子NF- κ B所必需的，NF- κ B是在炎性细胞因子诱导、免疫调节和凋亡中的中心作用物。Mx (粘病毒抗性)蛋白通过阻止细胞内病毒颗粒的转运或者病毒RNA的转录来抑制RNA病毒的复制。RNA-特异的腺苷脱氨酶(ADAR)将腺苷转化成肌苷，从而造成病毒RNA基因组的超变(21)。
[0014]HuIFN具有广谱的生物学活性，包括抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节功能。已经广泛研究了人干扰素的临床潜能，并总结在下面。
[0015]在抗肿瘤应用方面，HuIFN可能通过调控免疫调节和抗血管生成应答而间接地或通过影响肿瘤细胞的增殖或细胞分化而直接地介导抗肿瘤效应(22)。干扰素疗法已经用于治疗各种白血病(23)，例如多毛细胞白血病(24)、急性和慢性髓细胞白血病(25-27)、骨肉瘤(28)、基底细胞癌(29)、神经胶质瘤(30)、肾细胞癌(31)、多发性骨髓瘤(32)、黑色素瘤(33)、卡波西肉瘤(23)和何杰金氏病(34)。对于IFN-α与阿糖胞苷(ara_C)、5_FU、羟基脲(hydroxyura)以及IL_2的联合治疗进行了彻底研究，多数都表现出显著好于单独的HuIFN- α的结果(3)。联合HuIFN和替莫唑胺来协同治疗晚期癌症也已经被报道(35)。
[0016]在抗病毒应用方面，HuIFN已经在临床上用于抗病毒疗法，例如，治疗AIDS (36)，病毒性肝炎包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎(37，38)，乳头瘤病毒感染(39)，疱疹病毒感染
(40)，病毒性脑炎(41)，以及预防鼻炎和呼吸道感染(40)。
[0017]HuIFN也已经在临床上用于抗菌疗法(42)，例如，雾化的HuIFN-Y (43)和HuIFN- α已经用于多药耐性肺结核患者(44)。HuIFN-Y已经用于治疗多药耐性脑结核
(45)。
[0018]HuIFN也已经在临床上用于免疫调节疗法，例如，预防移植物抗宿主的排斥反应，或减缓自身免疫疾病例如多发性硬化症(46，47)和斯耶格伦综合征(48)的进展。IFN-β在美国已经被FDA批准用于治疗多发性硬化症。最近，已经有报道指出多发性硬化症患者的I型干扰素和白细胞介素_2的产生减少(49)。此外,使用HuIFN-α的免疫调节治疗看起来在进行骨髓移植后复发的慢性髓细胞白血病(CML)患者中是一种有效疗法(50)。
[0019]在疫苗辅佐方面，HuIFN已经作为佐剂在临床上用于治疗黑色素瘤(51)，并且也可以在许多其他疾病的预防或治疗性疫苗接种中用作佐剂或协佐剂以增强或刺激免疫反应(52)。[0020]HuIFN- a 2a是第一种在临床试验中使用的血管生成抑制剂，其对于治疗危及生命的血管瘤在儿童中是有效的(53，54)。另一种临床适应症是骨巨细胞瘤。Kaban等人报道了下颌骨的大的、快速生长的复发性的巨细胞瘤的显著消退(55)。
[0021]虽然HuIFN有许多重要的临床应用，但它们也表现出显著的副作用和其他限制。大多数细胞因子(包括HuIFN)具有相对较短的循环半衰期，这是因为它们在体内产生从而局部且短暂地发挥作用。由于它们通常作为全身性治疗剂进行施用，因此需要频繁地并且以相对较高的剂量进行施用。频繁的肠胃外施用既不方便又痛苦。此外，与HuIFN施用相关的毒性副作用经常很严重，以至于一些患者不能忍受该治疗。这些副作用很可能与高剂量的全身施用相关。此外，在临床研究中已经发现，一些患者产生针对rHuIFN的抗体,该抗体中和rHuIFN的生物学活性(56)。
[0022]很明显，多种应用(例如，抗癌疗法，以及抗病毒疗法、免疫疗法、抗寄生虫疗法、抗菌疗法，或者任何需要干扰素活性增强和/或副作用降低的医疗状况或情形)都迫切需要发展新的、效力增强的干扰素蛋白。总之，HuIFN很有可能在下一代新型抗肿瘤和抗病毒疗法中发挥重要作用(10)。
[0023]在现有技术中熟知，改善细胞因子药物的药物学性质的最有效方式是使细胞因子蛋白本身发生突变。随着时间变化，用于突变干扰素肽的多种策略和技术得到发展。一般来说，目前有3种策略可用于产生HuIFN-a突变体。
[0024]第一种策略是制备IFN杂合体。一些研究者已经利用IFN编码序列中具有天然存在的限制性内切酶(RE)酶切位点这一点来连接同源编码片段(57，58)。Horisberger和DiMarco已经对许多杂合体IFN的产生进行了综述(11);该文章提供了构建此类分子的过程的概览。描述了用于构建杂合体干扰素的方法的具体实例。一些研究者已经利用PCR扩增来构建突变型IFN-a，从而产生有特殊需要的核苷酸片段，进而获得将不同IFN的新片段进行连接的可能性(59)。美国专利6，685，933 (60)还描述了制备人IFN杂合体的PCR扩增技术。所述干扰素杂合体可以在一种干扰素亚型中产生，例如美国专利5，137，720 (61)和美国专利6，685，933 (60)所描述的，或者在至少2种不同的干扰素类别组之间产生，例如美国专利6174996 (62)和美国专利6，685，933 (60)所描述的。此外，杂合体的亲本基因可以来自一个物种(主要来自人)，例如HuIFN-a和HuIFN-?之间的杂合体，或者来自超过一个的动物物种，例如人和鼠干扰素- a之间的杂合体(63)。
[0025]第二种构建干扰素突变体的策略是利用位点定向点诱变，其通过在IFN的DNA分子中引入一个或多个核苷酸的变化(64)。最近，将系统突变和计算机方法用作蛋白质诱变的指导(65)。
[0026]第三种构建I型HuIFN的策略是将通过RE消化、PCR扩增、化学合成或DNA酶消化获得的IFN基因片段进行改组，随后进行PCR以将所述片段进行随机连接，接着进行扩增。得到的PCR产物事实上是重排的干扰素a基因片段的库，其可用于构建DNA库，从中可以分离出具有所需表型的DNA克隆(66)。例如，Chang等人已经描述了一种构建和筛选HuIFN改组文库的方法，以鉴定在小鼠细胞中抗病毒和抗增殖活性增强的HuIFN衍生物(67)。
[0027]人干扰素alfacon-1 (复合干扰素(consensus interferon))是一种重组的非天然存在的HuIFN-a，含166个氨基酸。它是通过根据已知的经克隆的HuIFN-a序列来评估每段相应区域中最高度保守的氨基酸而产生的。在氨基酸水平上，它与HuIFN-a 2b具有89%的序列同源性,和其特异性抗病毒活性为大约109IU/mg。人干扰素alfacon-1已经被批准用于治疗18岁或18岁以上的代偿性肝病患者的慢性HCV感染(68)。
[0028]尽管现有技术中已知一些重组干扰素蛋白，但仍然需要生物学活性增强的新型干扰素样蛋白和蛋白质组合物。
[0029]发明概述
[0030]根据本发明，公开分离的多核苷酸，其编码具有人干扰素样生物学活性的蛋白质。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID No:1至少93%同一的核苷酸序列。在其他实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID No:1至少95%同一或至少98%同一。
[0031]在一个实施方案中，本发明所包括的蛋白质选自其中每个蛋白质具有与SEQ IDNo:2至少85%同一的氨基酸序列的蛋白质的组。优选地，所述蛋白质不是天然存在的，并且具有与人干扰素a2b(HuIFN-a2b)相比而言增强的抗病毒和抗增殖活性。例如，所述蛋白质的抗病毒活性为HuIFN-a 2b的至少2倍，和抗增殖活性为HuIFN-a 2b的至少10倍。在特定的实施方案中，蛋白质氨基酸序列与SEQ ID No:2至少90%同一或至少95%同一。
[0032]本发明包括包含所述多核苷酸序列的重组载体以及包含所述载体的宿主细胞。本发明还包括表现出人干扰素样生物学活性的多肽片段。本发明进一步包括表现出干扰素样生物学活性的蛋白质构建体和其他组合物，例如包含所述蛋白质和另一部分例如无机聚合物的缀合物。本发明进一步包`括所述蛋白质和所述组合物用于治疗目的的方法和用途，例如作为抗病毒剂或抗癌剂。本发明还可用于治疗其他对干扰素疗法作出响应的病状。
[0033]附图简述
[0034]图1描绘了编码本发明的新型蛋白质的完整DNA序列(SEQ ID No:1)，所述新型蛋白质在此称为Novaferon? (A)。图1还显示了 Novaferon的预期氨基酸序列(SEQ ID No:2)(B),以及Novaferon氨基酸序列和Novaferon DNA序列的比对(C)。成熟Novaferon蛋白的第一个氨基酸半胱氨酸被指定为残基I。
[0035]图2 显示了 Novaferon 基因和 HuIFN- a 14 基因(Genebank 编号:NM_002172)的核苷酸序列比对(A),以及Novaferon蛋白和HuIFN- a 14蛋白(从Genebank编号:NM_002172翻译的)的氨基酸序列比对(B)。成熟Novaferon蛋白的第一个氨基酸半胱氨酸被指定为残基I。Novaferon与HuIFN-a 14在核苷酸水平上共享大约93%的序列同一性(462/498)，和在氨基酸水平上共享大约87%的序列同一性(144/166)。不同的核苷酸用中间线中的空缺来进行标示。
[0036]图3 显示了 Novaferon 基因和 HuIFN- a 2b 基因(Genebank 编号:NM_000605)的核苷酸序列比对(A),以及Novaferon蛋白和HuIFN- a 2b蛋白(从Genebank编号为NM_000605的HuIFN-a 2b基因翻译出的)的氨基酸序列比对(B)。成熟Novaferon蛋白的第一个氨基酸半胱氨酸被指定为残基I。Novaferon与HuIFN- a 2b在核苷酸水平上共享大约89%的序列同一性(445/498 )，和在氨基酸水平上共享大约81 %的序列同一性(135/166 )。不同的核苷酸用中间线中的空缺来进行标示。[0037]图4的图显示了，与HuIFN-a 2b相比，Novaferon对于Daudi细胞的体外抗增殖抑制。
[0038]图5的图显示了，Novaferon和HuIFN-a 2b在具有人前列腺癌PC-3异种移植物的裸鼠中的体内抗肿瘤效应。
[0039]图6的图显示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人肝癌H印G2异种移植物的裸鼠中的体内抗肿瘤效应。
[0040]图7的图显示了，Novaferon和HuIFN-a 2b在具有人黑色素瘤A-375异种移植物的裸鼠中的体内抗肿瘤效应。
[0041]图8的图显示了，Novaferon和HuIFN-a 2b在具有结肠癌细胞LS180异种移植物的裸鼠中的体内抗肿瘤效应。
[0042]图9的图显示了，Novaferon和HuIFN-a 2b在具有人白血病HL60 (S)异种移植物的裸鼠中的体内抗肿瘤效应。
[0043]发明详述
[0044]在以下整个说明书中，提供了具体的细节以便更彻底地了解本发明。但是，本发明的实施可以不受这些特殊说明的限制。在其他情况下，没有显示或详细描述众所周知的元素以避免不必要地使得本发明含糊不清。相应地，本说明书和附图应当被认为具有举例说明性的而不是限制性的意义。
[0045]术语的定义
[0046]在详细描述本发明以前，应当了解本发明不限于所述的特定蛋白质分子、方法、操作规程、细胞系、载体和试剂 ，因为都可以改变。还应当了解，在此使用的术语只在于描述特定的实施方案，而不希望限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求书来限定。
[0047]为了更完全地了解在此描述的本发明，采用以下术语，它们的定义如下所示。应当了解，在此使用的术语只在于描述特定的实施方案，而不希望限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求书来限定。
[0048]除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。所有在此提及的出版物引入本文作为参考，以用于描述和公开在所述出版物中所报道的细胞系、载体和方法，其可用于本发明。在此没有任何事物可被认为承认了，本发明没有位于依据在前发明的此类公开内容之前的权利。
[0049]术语“干扰素”指由多种真核细胞在暴露于各种不同的环境刺激(包括病毒感染或者接触促细胞分裂原)后产生的分泌型蛋白质家族。除了具有抗病毒特性以外，干扰素还显示出影响多种细胞功能。所有在此表述的干扰素单位都参考WHO国际标准，94/786 (复合rHuIFN-a (rHuIFN-a consensus))和 95/650 (rHuIFN-a 2a)。
[0050]术语“干扰素样”指由已知干扰素或干扰素类似物所表现的功能和/或结构特征或与其相似的功能和/或结构特征。例如，“干扰素样生物学活性”包括抗病毒和抗增殖活性。干扰素样生物学活性的其他例子在此处进行了描述，并且会被本领域技术人员所理解。术语“活性”复数形式包括单数形式；即，本发明包括表现出至少一种干扰素样活性的重组蛋白或其他蛋白质构建体或组合物。
[0051]术语“复合干扰素(consensus interferon)”指一种类型的合成干扰素,其的氨基酸序列是所有已知人a干扰素亚型的大致平均的序列。已经报道了，复合干扰素具有比任何天然人IFN-a亚型更好(约5倍)的抗病毒、抗增殖和激活NK细胞的活性。
[0052]在此使用的术语“分离的”指已经离开其天然环境的分子，例如DNA或RNA。例如，根据本发明的目的，包含在载体中的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的进一步例子包括在异源宿主细胞中维持的重组DNA分子或在溶液中的(部分或基本上)纯化的DNA分子。“分离的^DNA还包括，从含有天然或人工目的DNA片段的文库中回收的DNA分子以及化学合成的核酸。因此，分离的核酸可以重组产生。
[0053]术语“核苷酸序列”指包括寡核苷酸、多核苷酸或核苷酸分子及其片段或部分的一连串核苷酸。在DNA分子的情况下，所述序列可以包含一系列脱氧核糖核苷酸，而在RNA分子的情况下，所述序列可以包含相应的一系列核糖核苷酸。寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子可以是单链或双链的，而核苷酸序列可以代表正义链或反义链。
[0054]术语“寡核苷酸片段”或“多核苷酸片段”、“部分”、或“区段”或“探针”或“引物”可互换使用，其是指长度为至少大约5个核苷酸的一连串核苷酸残基。优选地，所述片段可用于与靶核苷酸序列杂交。引物用作DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶所催化的核苷酸聚合的起始点。片段或区段可唯一地鉴定本发明的每种多核苷酸序列。优选地，所述片段包含与SEQ ID NO: I基本上相似的序列。
[0055]术语“蛋白质”或“肽”或“寡肽”或“多肽”是指包含一连串氨基酸的天然存在的或合成的分子。
[0056]术语“开放阅读框”或ORF表示不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体，并通常表示可翻译成蛋白质的序列。
[0057]术语“成熟的蛋白编码序列”指编码不含信号序列或前导序列的蛋白质或肽的序列。所述蛋白质可以通过在去除任何前导/信号序列的细胞内进行加工来产生。蛋白质可以合成产生，或利用仅编码`成熟蛋白质编码序列的多核苷酸来产生。
[0058]在此使用的术语“纯化的”或“基本上纯化的”表示所示的蛋白质以基本上不存在其他生物大分子例如其他蛋白质、多肽等等的形式存在。纯化所述蛋白质，从而其组成了所存在的所示生物大分子的至少95重量％ (但水、缓冲剂和其他小分子，尤其是分子量小于1000道尔顿的分子可以存在)。
[0059]术语“重组表达媒介物或载体”指用于从DNA (RNA)序列表达蛋白质的质粒或噬菌体或病毒或载体。表达媒介物可以包含转录单元，所述转录单元包括(I)在基因表达中具有调节作用的一个或多个遗传元件，例如启动子或增强子，(2)结构或编码序列，其被转录成mRNA并翻译成蛋白质，以及(3)适当的转录起始和终止序列。希望在酵母或真核表达系统中使用的结构单元优选地包含前导序列，其使宿主细胞能够将翻译的蛋白质分泌到细胞外。备选地，当重组蛋白以没有前导或转运序列进行表达时，其可以在氨基末端包含甲硫氨酸残基。随后，该残基可以或可以不从表达的重组蛋白上切割下来从而获得最终产物。
[0060]术语“基本上的相似性”涉及当与其他核苷酸或其互补链进行最佳比对时，与另一个核酸具有高度序列同一性的核酸或其片段。序列同一性或同源性可以用序列分析软件例如BLASTN进行测定。如果第一个核酸与第二个核酸在进行最佳比对时显示出至少大约85-95%或更高的序列同一性，则认为两者是基本上相似的。例如，为了测定两个不同核酸之间的序列同一性或同源性，采用BLASTN程序“BLAST2seqUenCes”。该程序可以通过因特网(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)从National Center forBiotechnology Information (NCBI)获得以供公众使用(69)。作为非限制性实例,可以利用默认的软件设置进行这种比较(预期=10，过滤器=缺省，开放缺口 = 5，延伸缺口 =2罚分，缺口 X降低=50)。同样，如果第一个蛋白质或多肽与第二个蛋白质或多肽在用采用默认设置的BLAST软件(blastp)进行最佳比对和比较时显示出至少大约85-95%或更高的序列同一性，则认为两者是基本上相似的。
[0061]作为进一步举例说明，具有与编码蛋白质的参考核苷酸序列至少例如95% “同一的”核苷酸序列的多核苷酸，表示所述多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是同一的，除了在每100个编码所述蛋白质的所述参考核苷酸序列的核苷酸中，所述多核苷酸序列可以包含多达5个的点突变。换言之，为得到具有与参考核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可以被删除或用另一核苷酸置换，或者高达参考序列总核苷酸的5%的核苷酸数目可以被插入到参考序列中。
[0062]在此使用的术语“互补的”或“互补性”指多核苷酸在许可的盐和温度条件下通过碱基配对的自然结合。例如，序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。两条单链分子之间的互补性可以是“部分的”，即其中只有一些核酸结合，或者，当单链分子之间存在全部互补性时，则可以是完全的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度有显著的影响。这对于依赖于核酸链之间的结合的扩增反应来说特别重要。
[0063]术语“转化”表示将DNA导入生物体从而使所述DNA能够作为染色体外元件或者通过染色体整合进行复制。术语“转染”指表达载体被合适的宿主细胞所吸收，而不管编码序列实际上是否表达。
[0064]术语“治疗”及其语法上的等价词以最广泛的含义进行使用，包括治疗性处理、阻止、预防和改善某些不希望的症状或病状。
[0065]在此使用的术语“生物学活性”指在活系统中的结构、调控、生化或其他生物学功能，例如与天然或非天然存在的分子相似或同一。
[0066]在此使用的术语“抗增殖”和“抗增殖的”指减慢和/或阻止细胞的生长和分裂，导致细胞总数的减少和/或在任一细胞周期阶段或所有细胞周期阶段中靶细胞百分比的降低。细胞静止在某一特定的细胞周期时相时，可以进一步分为:G1期(Gapl)，S期(DNA合成)，G2期(Gap2)或M期(有丝分裂)。在此使用的术语“抗增殖活性”指蛋白质、蛋白质构建体或组合物在体外或体内抑制细胞增殖的活性，尤其是赘生性细胞如癌细胞的增殖。
[0067]在此使用的术语“抗肿瘤”或“抗癌”指阻碍或阻止恶性肿瘤的形成。在此使用的“抗肿瘤活性”或“抗癌活性”指蛋白质、蛋白质构建体或组合物在体外或体内抑制细胞增殖的活性，尤其是赘生性细胞如癌细胞的增殖。
[0068]术语“ IC5tl”或“半最大抑制浓度”表示在体外抑制50 %细胞生长所需要的抑制剂例如蛋白质的浓度。
[0069]在此使用的术语“抗病毒的”和“抗病毒”指在体外和/或在体内减缓和/或阻止细胞的病毒感染或者干扰细胞内的病毒复制，导致病毒繁殖减慢或停止，或者病毒颗粒总数降低。在此使用的“抗病毒活性”表示蛋白质、蛋白构建体或组合物在体外或体内抑制病毒感染或干扰病毒复制的活性。
[0070]Novaferon 蛋白
[0071]本发明涉及制备和鉴定新型人干扰素样蛋白，其在此称为“Novaferon”?。正如下面所详细描述的，根据在标准体外测试中所测量的，Novaferon蛋白表现出相比天然存在的HuIFN-a 2b而言增强的抗病毒和抗增殖生物学活性。特别地，在相同测试系统中，与HuIFN- a 2b相比，Novaferon蛋白显示出当在Wish-VSV系统中进行测试时抗病毒活性增加至12.5倍，和Daudi细胞生长的抗增殖抑制提高至大约400倍。
[0072]在一个实施方案中,Novaferon蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸由498个核苷酸组成,如SEQ ID No:1和图1 (A)所示。成熟的Novaferon蛋白由166个氨基酸组成，如SEQ ID No:2和图1 (B)所示。本发明所包括的多核苷酸和氨基酸序列及其变体在下面进一步详细描述。
[0073]为了比较，
【发明者】对Novaferon和天然存在的HuIFN的同源性进行了研究。BLAST检索表明，Novaferon在核苷酸和氨基酸水平上与HuIFN-a 14均具有最高的同源性。如图2所示，编码Novaferon的多核苷酸序列(SEQ ID No:1)与HuIFN-a 14具有大约93%(462/498)的同源性，而氨基酸序列与HuIFN-a 14具有大约87% (144-166)的同源性。与最广泛使用的人干扰素产品HuIFN-a 2b相比，核苷酸水平上的同源性为大约89%(445/498)，而氨基酸水平上的同源性为大约81 % (135/166)，如图3所示。
[0074]对于合成的IFN alfacon-1 (复合干扰素)，Novaferon在核苷酸水平上具有大约91 %的序列同一性(453/498 )，而在氨基酸水平上具有大约84 %的序列同一性(140/166 )。
[0075]正如下面实验部分所详细描述的，多核苷酸序列(SEQ ID No:1)选自I型人干扰素的DNA改组文库。简言之，Novaferon蛋白是通过用含有完整的SEQ ID No:1的多核苷酸序列的重组载体转染宿主细胞来产生的。纯化在宿主细胞系的上清液中所含有的Novaferon蛋白，并显示表现出人干扰素样生物学活性，例如抗病毒和抗增殖功能。
[0076]多核苷酸和变体
`[0077]本发明的新型多核苷酸序列/核酸分子由498个核苷酸组成，如在图1 (SEQID No:1)中所示的。利用在此提供的信息例如核苷酸序列，可以通过重组表达、化学合成或者通过使用其他标准分子生物学程序例如用于DNA诱变的那些来获得本发明的编码Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)的核酸分子。
[0078]除了分尚的核酸分子(SEQ ID No:1)之外，本发明还包括其序列不同于SEQ IDNo:1中所示DNA序列的DNA分子,但由于遗传密码的简并性,仍编码与Novaferon蛋白(SEQID No:2)相同或基本上相同的氨基酸序列。遗传密码和物种特异的密码子偏爱在本领域中是已知的。因此，对于本领域技术人员来说常规的是，产生不同于SEQ ID No:1的DNA序列的DNA序列简并变体，以便例如对于特定宿主优化密码子表达(例如，将人mRNA的密码子变成细菌宿主如大肠杆菌(E.coli)偏爱的密码子)。
[0079]本发明进一步提供了具有图1 (SEQ ID No:1)所示核苷酸序列的分离的核苷酸分子，或具有与SEQ ID No:1的核酸序列互补的序列的核酸分子。本发明还提供了相关信息，并涉及包含本发明的分离的核酸分子的重组载体，和涉及含有所述重组载体的宿主细胞，以及涉及制备此类载体和形成表达Novaferon蛋白的宿主细胞以及利用所述宿主细胞来通过重组技术产生Novaferon的方法。
[0080]根据本发明的核酸序列(SEQ ID No:l，图1 (A))，本发明包括与其基本上相似的核酸分子，例如，当进行最佳比对时与SEQ ID No:1具有至少大约85-95%或更高的序列同一性的核酸。例如，在一个方面，与SEQ ID No:1所不核苷酸序列具有大约93、96^^97^^98%或99%序列同一性的核酸在本发明的范围之内，无论其是否编码具有相似于Novaferon的生物学活性的蛋白质或多肽(此类活性包括但不限于，相比HuIFN而言增强的抗病毒、抗增殖和抗肿瘤功能)。此类核酸分子例如可用作用于检测细胞内的mRNA的探针，所述细胞已经用包含本发明核苷酸序列的载体转染以产生Novaferon。换言之,这些与SEQ ID No:1所示序列至少大约93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列可用作用于测定宿主细胞中异源基因的表达的标记。
[0081]此外，本发明包括多核苷酸，其包含SEQ ID No:1的至少大约30个连续核苷酸，优选地至少大约50个连续核苷酸的任何部分。
[0082]更一般地，本发明包括和涵盖了，与图1 (SEQ ID No:1)所示核苷酸序列的部分序列同一的任何及所有分离的核酸分子的片段。在一个实施方案中，这些片段的长度为至少大约15个核苷酸，并可用作在此所讨论的诊断探针和引物。此外，本发明包括和涵盖了更大的片段，其长度为大约50个核苷酸或更长。
[0083]除了 SEQ ID No:1中所示的编码Novaferon蛋白的核酸序列之外,本发明还包括但不限于编码完整Novaferon蛋白的氨基酸序列以及额外的氨基酸/肽/多肽例如所添加的分泌前导序列的核酸序列。
[0084]本发明还包括这样的核酸序列，其具有SEQ ID No:1中所示的核酸序列，以及另外的非编码序列，例如包括但不限于内含子以及5’和3’非编码序列例如转录的但不翻译的序列(它们在转录、mRNA加工(即剪接和多腺苷酸化信号、核糖体结合和稳定mRNA)中发挥作用)，和编码有或无功能的另外氨基酸的另外的编码序列。
[0085]本发明进一步涉及本发明核苷酸分子(SEQ ID No:1)的变体,其编码Novaferon蛋白的部分、类似物或衍生物。可通过筛选干扰素改组文库或者利用诱变技术或/和其他本领域中所描述的已知技术来 获得变体。
[0086]如上所说明的，此类变体可包括通过核苷酸插入、缺失或置换而产生的那些。插入、缺失或置换可牵涉一个或多个核苷酸。这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任何地方，单独地散布在参考序列的核苷酸中，或散布在参考序列内的一个或多个连续组中。所述变化可产生保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。在这些之中尤其优选的是沉默置换、添加和/或缺失，其不改变Novaferon蛋白或其部分的性质和活性。在这方面也尤其优选的是保守置换。
[0087]本发明还提供了分离的核酸分子，其包含具有与选自下列的多核苷酸至少93%同一的，更优选地至少大约95%、96%、97%、98%或99%同一的核苷酸序列的多核苷酸:(a)编码具有SEQ ID No:2中的完整氨基酸序列(即SEQ ID No:2的1-166位)的Novaferon蛋白的核苷酸序列；和6)编码(a)的蛋白质的生物学活性片段的核苷酸序列；和((3)与上面(a)或(b)中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0088]由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将会马上认识到，大量其序列与图1所示核酸序列(SEQ ID No:1)至少大约93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸分子将编码具有与Novaferon蛋白相似或相同活性的蛋白质。实际上，由于简并变体都编码相同蛋白质，这对于本领域技术人员来说是清楚的，即使没有进行比较测定法。在本领域中将进一步认识到，对于不是简并变体的此类核酸分子，也有相当数目将编码具有干扰素样生物学活性的蛋白质。这是因为本领域技术人员完全知道较不可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸置换(例如，用另一个脂肪族氨基酸置换一个脂肪族氨基酸)，如下面所进一步描述的。例如，Bowie等人(70)提供了关于如何进行表型沉默氨基酸置换的指导，其中作者指出许多蛋白质都耐受氨基酸置换。
[0089]蛋白和多狀夺体和构律体
[0090]本发明包括SEQ ID No:2的Novaferon蛋白以及与其基本上相似的蛋白质或多肽，例如与SEQ ID No:2具有至少大约85-95%或更高的氨基酸序列同一性的非天然存在的蛋白质。例如，与SEQ ID No:2所示氨基酸序列具有至少大约85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的非天然存在的蛋白质在本发明范围之内。此外，为了增强其功能和性质，本发明的Novaferon蛋白可通过将其融合至其他蛋白质或蛋白质片段或其他分子来进行结构修饰。例子包括但不限于将其融合至其他蛋白质/蛋白质片段以增加其表达或进一步稳定Novaferon蛋白。
[0091]在一个实施方案中，本发明的编码Novaferon的核酸序列和/或Novaferon蛋白可利用除支架以外的标记物进行标记。此处，“经标记的”表示核酸序列(SEQ ID No:l)或Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)的化合物已附着有至少一种元素、同位素或其他化学物质(标记物)以使得能够检测所述化合物。一般而言，标记物分为三类:a)同位素标记物，其可以是放射性同位素或重同位素；b)免疫标记物，其可以是抗体或抗原；和c)有色或荧光染料。标记物可以掺入到所述化合物的任何位置。
[0092]一旦制得，Novaferon蛋白还可以进行共价修饰。共价修饰的一种类型包括用能够与Novaferon蛋白的所选侧链或者N-或C-末端残基进行反应的有机衍生化剂(derivatizing agent)处理Novaferon蛋白。用双功能试剂进行衍生化可用于例如将Novaferon蛋白与水不溶性支持基质或表面交联，以用于纯化抗Novaferon抗体或筛选测定法。通常使用的交联剂包括1，1-双(重氮乙酰基)-2_苯基乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮基水杨酸形成的酯)，同基双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚氨基酯例如3，3’ - 二硫代双(琥`珀酰亚氨基丙酸酯)，双功能马来酰亚胺例如二 -N-马来酰亚胺基-1，8-辛烧，以及诸如甲基-3-[ (p-叠氮基苯基)联硫基]propioimidate的试剂。
[0093]Novaferon蛋白的其他修饰包括:谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰氨成谷氨酰和天冬氨酰残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰和苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基的甲基化(71);将N-末端胺的乙酰化；和将任何C-末端羧基的酰胺化。
[0094]本发明Novaferon蛋白的另一种类型的共价修饰包括改变所述蛋白质的天然的糖基化模式。这例如可以通过以下方式达到:(I)删除和/或添加一个或多个在Novaferon蛋白的天然序列中发现的糖部分，或者(2)添加和/或删除一个或多个在Novaferon蛋白的天然序列中不存在的糖基化位点。
[0095]向Novaferon蛋白添加糖基化位点可通过改变Novaferon蛋白的氨基酸序列来完成。例如，通过在Novaferon蛋白的天然序列中添加或置换为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来达到这种改变(对于0-联糖基化位点)。Novaferon蛋白的氨基酸序列的改变可通过DNA水平上的变化来达到,特别是通过在预选择的核苷酸碱基处突变编码Novaferon蛋白的DNA序列，从而改变的密码子可以翻译成所需的氨基酸。
[0096]增加Novaferon蛋白中糖部分的数目的另一种方式是将糖苷通过化学或酶促的方式偶联到所述蛋白质上。此类方法在现有技术中已有描述，例如，早在1981年，Aplin JD和Wriston JC Jr已经描述了蛋白质和脂质的糖缀合物的制备、性质和应用(72)。[0097]去除Novaferon蛋白中存在的糖部分可通过化学或酶促的方式来完成,或者通过突变置换编码用作糖基化靶标的氨基酸残基的密码子来完成。化学去糖基化技术在现有技术中是已知的，并例如由Edge AS等人(73)进行了描述。对多肽上的糖部分的酶促切割可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来达到，如Thotakura等人所描述的(74)。
[0098]此类衍生的构建体可包括改善溶解性、吸收、穿过血脑屏障的渗透性、生物学半衰期等的部分。Novaferon蛋白的此类部分或修饰可二者择一地清除或减弱所述蛋白质的任何可能的不希望的副作用等等。已经公开了能够介导此类效应的部分，例如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy (75)中。
[0099]Novaferon的另一种类型的共价修饰包括，例如以U.S.Pat.Nos.-A, 640, 835(76)；
4,496, 689 (77) ;4，791，192 (78)或 4，179，337 (79)中所示的方式，将 Novaferon 蛋白连接至各种非蛋白质聚合物之一上，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
[0100]此外，还可修饰本发明的Novaferon蛋白，以形成包含融合至另一个异源多肽或氨基酸序列的Novaferon蛋白的嵌合分子。在一个实施方案中，这样的嵌合分子包含Novaferon蛋白与标签多肽的融合化合物，所述标签多肽提供抗标签抗体能够选择性地结合的表位。该表位标签通常位于Novaferon蛋白的氨基或羧基末端。Novaferon蛋白的此类加有表位标签的形式的存在可以用抗该标签多肽的抗体进行检测。此外，表位标签的提供使得Novaferon蛋白能够容易地通过亲和纯化进行纯化，所述亲和纯化使用抗标签抗体或与所述表位标签结合的另一类型的亲和基质。在一个备选的实施方案中，所述嵌合分子可包含Novaferon蛋白与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域/片段的的融合化合物。例如，为了形成二价形式的嵌合分子，可将Novaferon蛋白融合至IgG分子的Fe区。
[0101]多种标签多肽和它们各自的抗体在现有技术中是熟知的。例子包括聚组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；flu HA标签多肽及其抗体12CA5
(80)；c-myc标签及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(81);以及单纯疱疹病毒糖蛋白D (gD)标签及其抗体(82)。其他标签多肽包括Flag-肽(83);微管蛋白表位肽(84);和17基因10蛋白肽标签(85)。
[0102]此外，本发明的Novaferon蛋白可通过本领域普通技术人员已知的化学合成程序来产生。例如，在商购可得的433A型号肽合成仪(Applied Biosystems, Inc.,Foster City,CA US)上可产生长度为高达大约80-90个氨基酸残基的多肽。此外，高达120个残基的更长的化学合成的肽也是商购可得的，例如，从Bio-synthesis, Inc.Lewisville, TX USA获得。因此，很容易理解，全长的成熟Novaferon蛋白能够合成产生(例如，先合成片段，然后将所述片段连接在一起)。
[0103]因此，本发明的Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)包括所有具有与SEQ ID No:2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质和多肽制备物和构建体，无论这些Novaferon蛋白和蛋白质衍生物是否是通过化学合成程序产生，和/或通过重组技术从原核或真核宿主细胞或其他细胞和宿主(包括但不限于细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组产生方法中所采用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化或非糖基化的、PEG化或非PEG化的。此外，本发明的蛋白质还可包括起始的经修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况下这是宿主介导的加工的结果。因此，现有技术中熟知，由翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸通常在所有真核细胞中于翻译后从任何蛋白上被高效去除。在大多数原核生物中，大多数蛋白质的N-末端甲硫氨酸也被有效去除，而对于某些蛋白质，这种原核去除过程是无效的，这依赖于N-末端甲硫氨酸所共价连接的氨基酸的性质。
[0104]
[0105]本发明还涉及包含本发明的分离的DNA分子的重组载体，用所述重组载体进行遗传工程改造/转染的宿主细胞，以及通过重组技术产生Novaferon蛋白或其片段。载体可以是，例如，质粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是能够复制的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒繁殖通常只发生在补充性宿主细胞中。详细描述Novafeixm产生的例子如下。
[0106]用于表达本发明的Novaferon蛋白的优选载体包括但不限于,包含有效连接至待表达的多核苷酸的顺式作用调控区的载体，所述顺式作用调控区对于在宿主中的表达是有效的。合适的反式作用因子由宿主提供，由补充性载体提供，或在导入宿主后由所述载体本身提供。
[0107]本发明所公开的核酸序列(SEQ ID No:1)可以有效连接至合适的启动子。此处“启动子”表示能够结合RNA聚合酶并起始Novafeixm蛋白的编码序列的外显子(通常在下游(3’))转录从而转录成mRNA的任何核酸序列。细菌启动子具有通常接近编码序列的5’末端的转录起始区。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。编码代谢途径酶的序列可提供特别有用的启动子序列。例子包括源自糖代谢酶例如半乳糖、乳糖和麦芽糖代谢酶的启动子序列，以及源自生物合成酶例如色氨酸合成酶的序列。还可以利用来自噬菌体的启动子，这些启动子在本领域中是已知的。此外，合成启动子和杂合启动子也是有用的；例如，tac启动 子是trp和Iac启动子序列的杂合体。此外,细菌启动子可包括天然存在的非细菌来源的启动子，其具有结合细菌RNA聚合酶并起始转录的能力。优选的细菌启动子包括但不限于，大肠杆菌lac1、trp、phoA和IacZ启动子，T3和17启动子，gpt启动子，X PR、PL启动子，和trp启动子。
[0108]真核启动子具有通常接近编码序列的5’末端的转录起始区，通常位于转录起始位点上游25-30个碱基对(bp)的TATA盒。TATA盒被认为指导RNA聚合酶II在正确的位点开始RNA的合成。哺乳动物的启动子还含有上游启动子元件(增强子元件),其通常位于TATA盒上游100至200个碱基对以内。上游启动子元件决定转录起始的速率并能在任一方向发挥作用。特别可用作哺乳动物启动子的是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因通常高表达并具有广的宿主范围。例子包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子。优选的动物细胞启动子包括但不限于，腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子和CMV启动子。在已知的真核启动子中，适合这方面的是CMV即时早期启动子、延伸因子I a (EFlA)启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、以及逆转录病毒LTR的启动子例如劳斯肉瘤病毒(“RSV”)的那些。用于在酵母中进行表达的优选启动子序列包括可诱导的GAL1/10启动子，来自乙醇脱氢酶、烯醇化酶、葡糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、果糖磷酸激酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶基因的启动子。
[0109]用于增殖和表达的载体还通常包括一个或多个选择标记。此类标记适合于扩增，或者所述载体为此目的含有另外的标记。在这方面，表达载体优选地含有一个或多个选择标记基因从而为选择转染的宿主细胞提供表型性状，虽然本领域技术人员会识别到某些系统选择标记可以由分开的载体提供。对于在大肠杆菌和其他细菌中进行培养，优选的标记包括，例如氨苄青霉素(Amp)、四环素(Tet)或潮霉素(HYG)抗性基因。酵母选择标记包括ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7，其赋予对于衣霉素的抗性；新霉素磷酸转移酶基因，其赋予对于G418的抗性；以及CUPl基因，其使酵母能够在铜离子存在的条件下生长。动物细胞选择标记包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、新霉素(neo)或潮霉素(HYG)抗性基因。
[0110]此外，用于增殖和表达的载体通常含有一个或多个用于转录起始、终止的位点，以及在经转录的区域中含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分优选地在开始处含有翻译起始密码子，以及包含合适地位于待翻译的DNA序列的末尾处的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。启动子、终止子、选择标记、载体和其他元件的选择是在本领域技术人员能力范围之内的常规设计问题。许多此类元件在文献中有描述并能通过商业供应商获得。
[0111]下列载体是商购可得的，并优选地在细菌中使用:来自Shanghai Sangon的PBV220 (86)及其衍生物；来自Qiagen的pQE系列；来自Qiagen的pET载体；来自Stratagene 的 pBS 载体、Phagescript 载体、Bluescript 载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、PNH46A ;以及来自 Pharmacia 的 ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。其中优选的真核载体为来自Promega的pCI载体；来自Invitrogen的pcDNA载体；来自Stratagene的 pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG ；以及来自 Pharmacia 的 pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL。单独列出这些载体作为例子来证明，本领域技术人员可以获得许多商购可得的熟知的载体以用于通过遗传/重组方法产生本发明所公开的Novaferon蛋白。
[0112]在这方面的某些优选的实施方案中，载体提供特异表达的手段。此类特异表达可以是可诱导的表达或只在某些细胞类型中的表达，或者可以是可诱导的且细胞特异的。其中特别优选的可诱导的载体是能够被容易操控的环境因素例如温度和营养添加物诱导进行表达的载体。多种适合于`该应用的载体是熟知的并被本领域技术人员经常采用，包括在原核和真核宿主中使用的组成型和诱导型表达载体。
[0113]利用各种本领域已知的技术，例如可以将包含SEQ ID No:1所示DNA序列以及合适的启动子和其他合适的调控序列的载体导入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞适合于表达所需蛋白。此类合适的宿主的代表包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces)细胞；酵母细胞,例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞；昆虫细胞,例如果蚬(Drosophila) S2和灰翅夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；哺乳动物细胞，例如CHO和COS ;以及植物细胞。用于各种各样的表达构建体的宿主是熟知的，利用本发明所公开的信息，本领域技术人员能够容易地选取用于表达SEQ IDNo:2所示的Novaferon蛋白的宿主。
[0114]可以遗传工程改造宿主细胞以整合编码Novafeixm的多核苷酸和表达本发明的Novaferon蛋白。例如,可利用本领域中已知的转染技术将编码Novaferon的多核苷酸导入宿主细胞中。此类方法描述于许多标准实验手册中，例如Kingston所论述的那些(87)。编码Novaferon的多核苷酸可以单独地或与其他多核苷酸一起导入/转染。这样的其他多核苷酸可以独立地导入，或与SEQ ID No:1所示的编码Novaferon的多核苷酸共导入或联合导入。
[0115]例如,对于在哺乳动物细胞中的共转染和标记的选择,本发明的编码Novaf eron的多核苷酸可以与分开的编码选择标记的多核苷酸一起转染到宿主细胞中。备选地，对于诱导宿主细胞中的增殖，编码Novafeixm的多核苷酸可以整合到含有编码选择标记的DNA序列的载体中。
[0116]用含有编码Novafeixm的多核苷酸的载体转染的、经改造的宿主细胞可以在常规营养培养基中进行培养，所述营养培养基可为了激活启动子、选择转化体或扩增靶基因进行特殊的修饰。调整培养条件例如温度、PH等，以适合于所选的宿主细胞表达本发明的Novaferon 蛋白。
[0117]为了促进翻译的蛋白质多肽分泌到内质网的内腔、周质空间或细胞外环境中，可以将合适的分泌信号与Novaferon蛋白合并和共表达。
[0118]述化
[0119]通常根据靶蛋白的性质并考虑其他条件例如生产成本、扩大生产是否容易、工业生产的规模等等，来选择合适的宿主细胞类型用于表达重组靶蛋白。然后，选择出以最高产率表达靶蛋白的经转染的细胞克隆，并且将具有最佳表达的最终克隆命名为表达靶蛋白的细胞系并用于生产靶蛋白。表达靶蛋白的细胞系生长在含有各种营养物质的培养基中。为了获得细胞的最佳生长和/或靶蛋白的最佳表达，利用多种试剂或条件来诱导选择性启动子，其与靶蛋白的cDNA序列一起整合在转染载体中。如果宿主细胞类型/表达系统为细菌，通常通过离心从培养基中收获培养的细胞。通过物理或化学手段来破裂收获的细胞体，保留收获的、含有合成的靶蛋白的粗提物，以用于所述蛋白质的进一步纯化。应用于破裂微生物细胞的方法包括但不限于冷冻-解冻循环、超声处理、机械破裂或使用细胞裂解剂。此类方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
[0120]本
【发明者】利用大肠杆菌这种细菌作为用于表达重组Novaferon蛋白的宿主细胞。如下所述，用含有编码Novafeixm的多核苷酸序列的载体转染大肠杆菌，并选取具有Novaferon蛋白最佳表达的一种大肠杆菌菌株以用于生产Novaferon蛋白。一旦合成,所述蛋白质可以以不溶性颗粒的形式保留在细胞质中，或者可以以可溶形式分泌到细胞质中。在前一种情况下，所述颗粒在裂解细胞体后回收，并用例如异硫氰酸胍或尿素变性。然后，通过下列方式获得变性的多肽/Novaferon蛋白的重折叠:用过量的稀释溶液稀释变性剂，或者逆尿素与还原型和氧化型谷胱甘肽组合的溶液进行透析，随后逆缓冲盐水溶液进行透析。在后一种情况下，所述蛋白质能够在破裂收获的细胞后直接从周质空间中以可溶的且有功能的形式回收，而无变性。通过避免变性和重折叠过程，可溶的Novaferon蛋白没有遭到破坏并不含变形或错误折叠的蛋白质分子。
[0121]本
【发明者】发现，在大肠杆菌细胞系中产生的合成Novafeixm蛋白的很大部分被分泌到细胞质中。然后，如以下所描述的，纯化该部分。
[0122]活性分析和医学用途
[0123]如上所示，Novaferon蛋白与干扰素家族的许多成员显示出序列同源性，特别是与由HuIFN-a 14的mRNA所翻译的干扰素蛋白(图2)。HuIFN- a已经显示出宽范围的生物学活性，包括抗病毒、抗增殖和免疫调节活性(10)。
[0124]因为与HuIFN- a的同源性，预期Novaferon能表现出与HuIFN- a相似的生物学功能，包括但不限于，抑制肿瘤的增殖、抗病毒活性、激活NK细胞、以及调节免疫系统。特别重要的是不仅保留了 HuIFN-a样功能特性,而且与HuIFN-a相比,Novaferon蛋白的这些生物学功能的效力增强。为了验证和确定其功能特性的效力，因而用标准的常规体外测定法来测定Novaferon蛋白的生物学活性，所述测定法被涉及用于检测抗病毒和抗增殖特性。如以下实验部分中所描述的，在一些实验中，进一步在各种人癌症类型的动物模型中观察Novaferon蛋白的抗增殖特性的体内效力，并与HuIFN-a以及化学抗癌剂进行比较。
[0125]许多用于测定HuIFN活性的合适测定法是本领域中熟知的。本
【发明者】采用基于细胞的体外测定法系统来测定抗病毒和抗增殖活性。相同的体外测定法用于所有与本发明相关的程序和实验，包括但不限于筛选人I型干扰素基因改组文库，从人I型干扰素基因改组文库的所表达的蛋白质中选择Novaferon,以及测定纯的重组Novaferon蛋白的生物学活性。
[0126]有许多通过观察细胞对病毒的抗性程度来测量受试样品/试剂的抗病毒活性的测定法(88)。已经有3种主要的生物测定法用于测量HuIFN和它们的杂交体的抗病毒活性。根据用于测定病毒对于培养的细胞的各种不同方面的方法，将它们进行分类。
[0127]用于测定病毒诱导的致细胞病变效应的抑制的测定法测量在用IFN预处理的培养的细胞中病毒诱导的裂解性致细胞病变效应的减少程度。该测定法可以在96孔板中进行(89)，并已经广泛用于重组HuIFN-a，因为它为筛选大量样品提供了一种简便方法。
[0128]病毒噬斑形成的抑制是另一种定量HuIFN在组织培养物中的抗病毒活性的方法。噬斑减少测定法的结果不依赖于感染复数。此外，以高精确度可检量到噬斑形成的50%减少。例如利用普遍存在的水泡性口膜炎病毒(VSV)来诱导噬斑形成，能够通过筛选大量来自不同动物物种的细胞系来测定特定重组IFN的跨物种活性的特性(90)。
[0129]第三种测定法基于测定病毒产量的减少。通常在单个细胞生长周期内，通过释放的病毒数量来测量病毒的产生`。该测定法特别可用于测试IFN对于不引起致细胞病变效应的病毒或在靶细胞培养物中不形成噬斑的病毒的抗病毒活性。但是，在该测试中，感染复数影响由固定浓度的IFN所诱导的保护的表观程度(91)。
[0130]使用WISH细胞和水泡性口膜炎病毒(VSV)，通过标准的致细胞病变效应一抑制测定法来测量Novaferon的抗病毒活性。使用WHO国际标准的标准参考样品:95/650(rHuIFN- a 2a)和94/786 (复合rHuIFN- a )，来测定并校准抗病毒活性。I个单位的抗病毒活性定义为，对于达到50%抑制VSV对培养的细胞的致细胞病变效应时所需要的蛋白质量。正如下面进一步描述的，Novaferon蛋白的活性为2.5X 109IU/mg,这为HuIFN-a 2b的活性的大约12.5倍。这些测试表明，与HuIFN- a 2b相比，Novaferon的抗病毒特性极大增强。Novafeixm蛋白表现出这种增强的抗病毒效力，这为预测在人体内的增强的抗病毒效应提供了基础。基于HuIFN的性质，预期Novaferon具有非常广的抗病毒特性是合理的。换言之，对于宽范围的病毒，Novaferon应当比天然的HuIFN更有效。Novaferon的增强的抗病毒效力可以转化为在临床情况下对于具有多种病毒疾病的患者的更好的抗病毒效应或更好的治疗效应。
[0131]正如上面所解释的，IFN还通过多种机制来抑制细胞增殖和表现出潜在的抗肿瘤效应。利用细胞培养系统，已经建立了几种体外抗增殖测试，这在现有技术中进行了充分描述。在这些测定法中，可以通过下列方式来测量细胞增殖:细胞计数；结晶紫生物测定法(92，93);对中性红染料的化学敏感性(94~96);整合经放射性标记的核苷酸(97);将
5-溴-2’ -脱氧尿苷整合入正在增殖的细胞的DNA中(98);使用四唑盐(99，100)。
[0132]人类淋巴母细胞Daudi细胞系对于HuIFN-a的抗增殖效应是非常敏感的，并且它的悬浮培养生长有助于定量其细胞数目(101)。该细胞系用于测量HuIFN-a和杂交体的抗增殖活性已经有很多年了(102)。其他细胞系也可用于测试受试试剂的抗增殖活性。[0133]通过观察由于向具有各种不同人肿瘤异种移植物的动物模型施用Novaferon而引起的肿瘤块生长的抑制，而在体内观察到Novaferon蛋白的抗增殖活性。将Novaferon的体内抗肿瘤效应与HuIFN-a 2b进行比较，并在一些异种移植模型中还与化学抗肿瘤试剂进行比较。
[0134]正如下面所详细描述的，本
【发明者】发现，用标准Daudi细胞方法测得的Novaferon的体外抗增殖活性的效力为天然HuIFN- a 2b的400倍，在所有天然HuIFN中，HuIFN- a 2b可能表现出最有效的抗增殖活性。Novaferon的增强的抗增殖效力是广泛的和普遍的，因为它对于本
【发明者】在体外所测试的所有人癌症细胞系都表现出比天然HuIFN- a 2b更有效或增强的抑制。这表明，Novaferon对人癌症的有效抑制没有选择性。虽然Novaferon对于所有受试类型的人癌症细胞系的增强的抗增殖活性程度不同，但它具有成为临床情况下的广谱抗癌剂的潜力。这是超过化学抗癌剂、单克隆抗体和其他靶特异性抗癌剂的显著优点。
[0135]下面所描述的异种移植动物模型进一步确立了:
[0136](I)与天然HuIFN-a 2b相比,Novaferon的体内抗增殖效应极大地增强或更有效。
[0137](2)在相同的异种移植模型中，剂量低得多的Novaferon的体内抗增殖效应比受试化学试剂5-氟尿嘧啶(5-FU)更好。
[0138](3)在异种移植模型中，Novaferon能够达到癌症生长的超过90%的抑制，但在受试动物中不引起体重减少、活力改变和其他消极的副作用，这与在经5-FU治疗的动物中显著的体重减少和活力降低形成鲜明对比。
[0139]这些结果表明，与天然HuIFN-a 2b相比，Novaferon的体外和体内抗增殖特性极大增强。Novafeixm的增强的抗增殖效力被转化成小鼠动物模型中人肿瘤生长的有效抑制(>90% )，并且这种抑制似乎非常广泛地作用于所有受试人癌症类型，并且比传统的抗癌剂5FU更好。这些结果还表明，Novaferon对于癌细胞生长的有效抑制对于所述癌细胞是非常特异的，而不针对正常细胞，其支持依据是，在经Novaferon治疗的动物中观察到正常饮食和动作行为并且体重没有减少。因此，Novaferon具有在所有或大部分人癌症中发挥作用的可能性。
[0140]在一个优选的实施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)分子(使用SEQ ID No:1的多核苷酸序列通过重组技术制备或化学合成)，可在人和/或非人物种中用于治疗和/或预防任何和/或所有人来源或非人来源的肿瘤和癌症。这些肿瘤例如包括但不限于，骨原性肉瘤；多发性骨髓瘤；何杰金病；结节性低分化淋巴瘤；急性淋巴细胞白血病；急性髓细胞白血病；乳腺癌；黑色素瘤；乳头瘤；以及鼻咽癌，结肠癌，肝癌和黑色素瘤。
[0141]在另一个实施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)分子(使用SEQ ID No:1的多核苷酸序列通过重组技术制备或化学合成)，可在人和/或非人物种中用于治疗和/或预防任何和/或所有病毒疾病。易感的病毒感染的例子包括但不限于，病毒性脑心肌炎，流行性感冒和其他呼吸道病毒感染，狂犬病和其他病毒性动物传染病，和虫媒病毒感染，以及单纯疱疹性角膜炎，急性出血性结膜炎，水痘带状疱疹，和乙型和丙型肝炎，SARS和禽流感，人免疫缺陷综合征(AIDS，HIV)。
[0142]在另一个实施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)分子(使用SEQ ID No:1的多核苷酸序列通过重组技术制备或化学合成)，可在人中用于治疗和/或预防任何和/或所有免疫系统相关的病症。免疫病症的例子包括但不限于风湿性关节炎、多发性硬化症和斯耶格伦综合征糖尿病。Novaferon蛋白还可以用于预防移植物抗宿主的排斥反应。
[0143]在另一个实施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)分子(使用SEQ ID No:1的多核苷酸序列通过重组技术制备或化学合成)，可作为免疫佐剂用于治疗和/或预防任何和/或所有血管发生疾病。血管发生疾病的例子包括但不限于血管瘤、肿瘤诱导的新血管系统、与年龄相关的黄斑变性以及糖尿病性视网膜病。
[0144]Novaferon蛋白可以单独地或与任何其他蛋白质/载体材料或其他构建体一起，以任何药学上可接受的制剂/配剂，通过任何施用/递送途径/方法，施用给人和/或非人物种，所述施用/递送途径/方法包括但不限于口服摄取、吸入、鼻内喷雾、腹膜内、静脉内、肌内、损伤内或皮下注射。
[0145]包含Novaferon蛋白作为活性成分的药物学制剂/配剂可通过掺入合适的固体或液体载体来制备，其形式有液体、固体、半固体和/或任何其他临床上可接受的形式，例如片剂、丸剂、粉末、液体溶液或悬浮液、脂质体、栓剂、可注射溶液和可输注溶液。含Novaferon的制剂/配剂可通过使用本领域中描述的或制药工业实践所普遍接受的常规载体、材料、方法来制备。含Novaferon的制剂/配剂还可通过使用本领域中还没有描述的或制药工业还没有使用的非常规 方法、材料来制备。
[0146]例如，肠胃外配剂通常是注射液，其由药物学和生理学上可接受的材料组成，例如水、生理盐水、其他平衡的盐溶液、含水葡萄糖、甘油等。此外，除了 Novaferon蛋白外，注射液还可以包含其他蛋白质，如载体，例如人血清白蛋白或血浆制品。药物学制剂/配剂还可以包含少量无毒性的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂(例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯)。配制方法在现有技术中是熟知的，并例如描述在Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Phamaceutical Sciences (75)中。
[0147]具体的Novaferon蛋白制剂/配剂可以由所期望的临床应用和/或使用方法来决定，并且可以由任何一个本领域技术人员使用已知技术来制备。例如，除了注射液之外，还可以采用局部和口服配剂。局部制剂可包括但不限于滴眼剂、软膏剂和喷雾剂。口服配剂包括但不限于液体形式(例如糖浆剂、溶液或悬浮液)，或固体形式(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊)。对于固体制剂/配剂，常规的无毒性固体载体包括但不限于制药级别的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。制备这些制剂/配剂的实际过程和/或方法是已知的，或者对于本领域技术人员来说将会显而易见的(75 )。
[0148]可通过各种途径将药学上可接受的Novaferon蛋白的制剂/配剂施用给人和/或非人物种，所述途径包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、经皮、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠或眼内递送，以及在治疗伤口时，直接局部用药。
[0149]根据临床实践,Novaferon蛋白在制剂/配剂中的浓度/数量可以为从>0至1.0M和/或从>0至100% (重量/重量)。每一个和/或所有Novaferon制剂/配剂的确切剂量、施用间隔和治疗持续时间由临床试验、疾病状况、患者状态和卫生保健提供者决定。在一个优选的实施方案中，由于蛋白质降解、全身与局部递送的差异、合成新蛋白酶的速率、以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病状的严重性等等，可能需要调整Novafeixm的施用，包括但不限于单次和/或总剂量、施用间隔、治疗持续时间和必需的疗程，并且可由本领域技术人员通过常规实验来确定。
[0150]在一个优选的实施方案中，在施用至人和/或非人物种的体内后，Novaferon蛋白的循环半衰期可发生改变。这些改变包括但不限于Novaferon体内半衰期的延长或缩短。Novaferon蛋白的体内半衰期的延长可通过多种途径来获得,包括但不限于:
[0151](I) Novaferon分子和单克隆抗体之间的复合物形成。此类抗体优选地在不从本质上削弱其治疗功能的位点上与Novaferon蛋白连接(103)。
[0152](2)Novaferon与其他蛋白质/多肽的融合复合物。Novaferon分子可以重组融合于其他蛋白质/多肽，例如免疫球蛋白的恒定区片段(Fe) (104)。
[0153](3)Novaferon蛋白的缀合。例如,Novaferon蛋白可以缀合有非抗原性聚合物,例如聚乙二醇或相关的聚亚烷基二醇部分(105-108)。
[0154]在另一个优选的实施方案中，治疗性化合物可缀合至抗体，优选抗Novafeixm蛋白抗体。所述治疗性化合物可以是细胞毒性试剂。在该方法中，通过经缀合的抗体与Novaferon分子的结合，细胞毒性试剂可以被靶向肿瘤组织或细胞，从而破坏患病细胞并减少患病细胞的数目以达到癌症症状的降低。细胞毒性试剂包括但不限于，细胞毒性药物，毒素或此类毒素的活性片段，和放射性化学试剂。合适的毒素及其相应片段包括白喉毒素A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、伊诺霉素等等。
`[0155]在一个优选的实施方案中，编码Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID No:1)的全长序列、部分序列和/或调控序列可由任何一个本领域技术人员用于基因疗法相关的施用。基于编码Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID No:1)的反义应用也可作为基因疗法(即整合到基因组中)或作为反义组合物进行使用，这是本领域技术人员将会意识到的。
[0156]在基因疗法应用中，将基因导入细胞，从而获得由这些基因编码的靶蛋白的体内合成。常规基因疗法通过单次治疗或重复施用治疗有效的DNA或mRNA来获得持续的疗效。另一方面，反义RNA和DNA还可用作治疗剂，以在体内阻断某些基因的表达。已经表明，可以将短的反义寡核苷酸递送至细胞，在那里它们作为抑制剂发挥作用(109)。
[0157]在一个优选的实施方案中，全长或部分长度的编码Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID No:1)可用作DNA疫苗。裸露的DNA疫苗在本领域中一般是已知的(110)。本领域普通技术人员熟知将全长或部分长度的编码Novaferon的基因(SEQ ID No:1)作为DNA疫苗进行应用的方法，包括但不限于，将Novaferon基因或部分Novaferon基因置于启动子的调控之下，以用于在人和/或非人物种中表达全长或部分长度的Novaferon蛋白。
实施例
[0158]下列实施例用于更完整地描述施用上述发明的方式，以及阐明考虑用于实现本发明的各种不同方面的最佳模式。应当了解，这些实施例决不限制本发明的真正范围，而只是为了举例说明目的而给出。所有在此引用的参考文献作为整体引入本文作为参考。
[0159]实施例1.从人白细胞cDNA中PCR扩增出人IFN-a基因
[0160]从人外周血白细胞中提取总mRNA。使用Advantage? RT-for-PCR试剂盒(Clontech, Mountain View, CA, US)以及厂家推荐的 cDNA 合成引物(oligo dT18)来制备cDNA。
[0161]在MG PTC热循环仪上通过PCR技术进行人IFN-a cDNA的扩增，采用以下条件:2.5 u IlOXpfx 扩增缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA, US),
0.75 u IlOmM dNTP, 0.5 u 125mM MgSO4, 0.25 u I Platinum pfx DNA 聚合g|(2.5U/u I ； Invitrogen, Carlsbad, CA, US),0.75u I cDNA, 0.75 u 15'引物(10 ii M ;IFNa05:5，-TGGTGCTCAGCT (A/G) CAAGTC-3，)(SEQ ID No:3)),
0.75 u 13'引物混合物(每个 1.7 ii M ;IFNa03-l:5’-AATCATTTCCATGTTG(A/g)accag-3' (seq id No:4)；iFNa03-2:5'-Aatcatttcccggttgtaccag-S'(SEQ ID No:5) ;IFNa03-3:5，-AATCATTTCCATGTTGAAACAG-3，(SEQ ID No:6) ;IFNa03-4:5’-AATCATTTCAAGATGAGCCCAG-3’ (SEQ ID No:7) ；IFNa03-5:5’-AATGATTTTCATGTTGAACCAG-3’ (SEQ ID No:8) ;IFNa03_6:5’-AATCATTT(C/G)(C/G)ATGTTGAACCAG-3’ (SEQ ID No:9);IFNa03_7:5’-GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3’ (SEQ IDNo:10)；IFNa03-8:5’-GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3’ (SEQ ID No:11))。
[0162]将扩增出的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，切取条带，进行凝胶纯化，并根据厂家推荐克隆入 pCRI1-T0P0 或 pCR-4-TOPO 载体(Invitrogen, Carlsbad, CA, US)中。在 ABI 自动测序仪(P E Applied Biosystems, CA, US)上，在 Prism Ready ReactionDye Termination混合物中进行自动测序。
[0163]由于在以上克隆中没有发现所希望的关于IFNa6、IFNa7和IFNal6编码序列的插入片段，所以在以上条件下再次进行PCR，除了类型特异引物外。对于特异性地扩增IFNa6，5’ 和 3’ 引物分别为 IFNa05:5’-TGGTGCTCAGCT(A/G)CAAGTC-3’ (SEQ ID No:3)，和IFNa03-8:5’-GAGTCGITTCTGTGITGGATCAG-3’(SEQ ID No:11)。对于特异性地扩增 IFNa7，5’和3’ 引物分别为 IFNa07U0:5’-ATGCCCCTGTCCITTTCTTTAC-3’(SEQ ID No:12)，和 IFNa03_5与IFNa03-6的等摩尔混合物。对于特异性地扩增IFNal6，所用5’和3’引物分别为IFNa7U0和 IFNa03-7:5’-GATCAITTCCATGITGAATGAG-3’ (SEQ ID No:10)。将扩增出的片段克隆入pCRI1-T0P0或pCR-4-TOPO载体中，并如上进行测序。
[0164]将所有克隆的I型人IFN-a基因单独地与Genebank中的那些DNA序列进行比对。本文所涉及的这些基因的GeneBank核苷酸登录号为:NM_024013( IFN-a 1),NM_000605(IFN-a 2), NM_010504 (IFN-a 4), NM_010505 (IFN-a 5), NM_008335 (IFN-a 6), NM_008334(IFN-a 7)，NM_008336 (IFN-a 8)，匪_002171 (IFN-a 10)，匪_002172 (IFN-a 14)，NM_002173 (IFN-a 16), NM_021268 (IFN-a 17), NM_002175 (IFN-a 21)。
[0165]实施例2.构建携带有I型HuIFN的质粒的改组文库
[0166]为了构建携带有I型人IFN-a之一的编码序列的质粒，基于成熟人I型IFN蛋白的单独cDNA编码区，合成了具有BamHI核EcoRI限制性酶切位点的15个碱基对的寡核苷酸(Genentech, South San Francisco, CA, US)。本文所涉及的这些蛋白质的GeneBank核苷酸登录号为:NM_024013 (IFN-a 1),NM_000605 (IFN-a 2), NM_010504 (IFN-a 4), NM_010505(IFN-a 5),NM_008335 (IFN-a 6),NM_008334 (IFN-a 7),NM_008336 (IFN-a 8),NM_002171(IFN-a 10)，NM_002172 (IFN-a 14)，NM_002173 (IFN-a 16)，NM_021268 (IFN-a 17)，NM_002175 (IFN-a 21)。将在实施例1中构建的质粒作为模板，和引物一起用于标准PCR
(111)。得到的产物用限制性内切酶(RE) BamHI和EcoRI进行酶切，并克隆入大肠杆菌表达载体pBVB中，这是pBV220的衍生表达质粒，其在它的多克隆区域中含有BamHI位点和EcoRI位点(86)。这些最终构建体都通过DNA序列分析进行验证(PE Applied Biosystems,US)。
[0167]使用一对寡核苷酸BVF4:5’-AGGGCAGCAITCAAAGCAG-3’ (SEQ ID No: 13)和 BVR3:5’ -TCAGACCGCTTCTGCGITCTG-3’ (SEQ ID No:14),以及使用前面构建的携带有 I 型 HuIFN的质粒，通过PCR来扩增含有人IFN ORF的DNA片段。将得到的产物等量混合并用DNA酶
I进行消化，并根据Stemmer (112)所描述的程序进行PCR组装。
[0168]组装的PCR产物进一步通过一对内部引物进行扩增:BVF:5’-GAAGGCTTTGGGGTGTGTG-3’ (SEQ ID No: 15)和 BVR:5’-AATCTTCTCTCATCCGC-3’ (SEQ IDNo: 16)，接着用BamHI和EcoRI进行消化，并重新克隆入经RE BamHI和EcoRI酶切的大肠杆菌表达载体PBVB中。这些最终构建体都通过DNA序列分析进行验证。将携带有改组的HuIFN- a基因的质粒转化入大肠杆菌DH5 a感受态细胞中。
[0169]在以上所有PCR程序中，无论PCR扩增还是PCR组装，都使用常规的DNA聚合酶(New England Biolab, MA, US),而不是高保真 DNA 聚合酶。
[0170]实施例3.筛选改组文库
[0171]让新转染的大肠`杆菌DH5 a细胞在LB平板上于37°C培养过夜。分别挑取单个菌落，并接种于在96孔板中的100 ill含50 ii g/ml氨苄青霉素的LB培养基之中。菌落在30°C以250rpm摇动。在培养过夜后，将IOyl细菌培养物一式两份地接种于在96孔板中的IOOiU含50 ii g/ml氨苄青霉素的LB培养基之中。最初的平板(所谓的原种板(stockplate))暂时保存在4°C。将一式两份的板中的细胞在30°C下培养，直到0D600变为0.4，然后用42°C诱导。经4小时热诱导后，将细菌培养物直接转移到_80°C冷冻室中以开始冷冻-解冻循环。2个循环的冷冻-解冻后，将细菌悬浮液/裂解产物稀释至所需浓度，并在将其暴露于Daudi细胞培养物以进行抗增殖测试(101)或暴露于Wish细胞培养物以进行抗病毒测试(113)。
[0172]在每一轮筛选步骤中，将20，000个菌落进行初步筛选，并挑选出大约100个具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落以用于进一步的验证性测试。将在原种板上的所挑选出的细菌培养物在含有50 u g/ml氨苄青霉素的LB平板上划线。单个菌落在37°C下培养过夜，挑取之，并接种于在试管中的Iml含50 ii g/ml氨苄青霉素的LB培养基之中。试管中的细菌在30°C下以250rpm摇动培养过夜。然后，将40 U I经培养的细菌接种在另一组试管之一中，所述试管含有Iml具有氨节青霉素(50 ii g/ml)的LB。然后,按上文中关于初步筛选步骤时所描述的，让样品经历以下步骤:诱导表达，收集细胞培养物，冷冻-解冻循环处理，和抗增殖或抗病毒测试。
[0173]在每一轮筛选步骤中，在验证性测试后挑选出大约20个具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落，以对质粒及其插入片段进行自动测序。具有独一无二的DNA序列的插入片段用一对 PCR 引物进一步扩增，即 BVBF:5’ -ACCATGAAGGTGACGCTC-3’ (SEQ ID No:17);和BVR:5’-AATCTTCTCTCATCCGC-3’(SEQ ID No: 16)，它们分别是pBVB载体的多克隆位点上游和下游的侧翼序列。扩增出的PCR产物用于下一轮改组文库的构建。
[0174]基于抗增殖或抗病毒活性的增加，进行5个循环的筛选步骤。
[0175]实施例4.在大肠杆菌中表达并纯化重组Novaferon蛋白[0176]在大肠杆菌中表达Novaferon蛋白(SEQ ID No:2)。将人工添加了起始密码子ATG的SEQ ID No:1的阅读框克隆入温度可诱导的pBVB载体中从而置于入PRPL启动子的调控之下(114)。将Novaferon表达质粒pBVBNF转化到DH5 a细胞中。分别挑取单个菌落，接种于2ml含50 ii g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在30°C下培养8小时。然后，取2ml培养的细菌，进一步用50ml含50 ii g/ml氨苄青霉素的培养基在30°C下搅动培养过夜。第二天早上，将过夜培养的细菌按1:10~1:20的比例接种于含50 ii g/ml氨苄青霉素的大体积的LB培养基中，并于30°C搅动培养。当培养物达到生长对数中期时(A550=0.5-0.6)，将培养温度快速升高至42°C并维持4小时，以便诱导Novaferon的表达。经4小时的热诱导后，将细菌离心并用 PBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)洗涤 3 次，然后保存在-80°C直至进行纯化。
[0177]大多数Novafeixm蛋白分子在此处描述的大肠杆菌生产系统中是可溶的，尽管它们在细胞质中过表达。因此，通过细胞裂解缓冲液I (50mM Tris-Cl (pH8.0)，lmM EDTA(pH8.0), IOOmM NaCl)中的溶菌酶消化来破裂细胞。裂解产物进一步进行超声处理以破裂剩余的完整细胞并剪接DNA分子。然后将裂解产物离心。
[0178]上清液中的可溶性Novaferon蛋白分子依次通过疏水、离子交换层析和凝胶过滤进行纯化。首先，将上清液加载到Phenyl Sepharose6快速流动柱(GE Healthcare,US)上并通过其。其次，将含有Novaferon蛋白的级分施加至P0R0S50D柱(Applied Biosystem,US)上。第三,将含有 Novaferon 分子的级分用 P0R0S50HS 柱(Applied Biosystems,US)进行纯化。最后，将收集的 Novaferon 分子进一步用 HiLoad26/100Superdex75pg(Amersham,US)进行纯化。
[0179]纯的Novaferon蛋白的纯度通过15% SDS-PAGE分析进行验证。纯的重组Novaferon蛋白显示为单一的条带，分子量(丽)为19_20KDa。质谱法分析表明，纯化的Novaferon分子的纯度>98%，分子量为19313道尔顿，这与从其氨基酸序列推测的19315道尔顿的分子量相一致。
[0180]实施例5.在大肠杆菌中表达并纯化重组HuIFN-a 2b
[0181]HuIFN- a 2b的表达质粒pBV2b包含成熟HuIFN- a 2b蛋白的cDNA编码区(GeneBank核苷酸登录号:NM_000605)，其处于热可诱导的入PRPL启动子的控制之下。HuIFN- a 2b的表达根据Jos印h S和David WR所描述的操作规程来进行(116)。
[0182]将表达质粒pBV2bF转化到DH5a细胞中。分别挑取单个菌落，接种于2ml含50 u g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在30°C下培养8小时。然后，取2ml培养的细菌，进一步用50ml含50 ii g/ml氨苄青霉素的LB培养基在30°C下搅动培养过夜。第二天早上，将细菌培养物按1:10~1:20的比例接种于含50 u g/ml氨苄青霉素的大体积的LB培养基中，并于30°C搅动培养。当培养物达到生长对数中期时(A550=0.5-0.6)，将培养温度快速升高至42°C并维持4小时，以便诱导HuIFN-a 2b的表达。经4小时的热诱导后，将细胞离心并用 PBS (137mM NaCl,2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)洗涤 3 次，然后保存在 _80°C直至进行纯化。
[0183]HuIFN-a 2b在此处描述的大肠杆菌表达系统中以不溶形式表达，因此根据Molecular Cloning (115)所描述的操作规程来进行内含体的回收和洗涤程序。简言之，将收获的细菌细胞重悬在细胞裂解缓冲液I (50mM Tris-Cl (pH8.0),lmM EDTA (pH8.0)，IOOmM NaCl)中，并通过溶菌酶和超声处理来进行裂解。内含体用冰冷的细胞裂解缓冲液
II(补充有0.5% (v/v) Triton X-100的细胞裂解缓冲液I)洗涤3次。
[0184]通过在室温下伴随搅动在7N胍中悬浮4小时来破裂回收的内含体。在4°C离心15分钟后，使变性的蛋白质在0.15M pH9.5Borex缓冲液中于4°C再折叠48小时。在最后一步再折叠时，用HCl将pH调整到7.4。
[0185]然后,通过疏水、离子交换层析和凝胶过滤来纯化含有经折叠的HuIFN- a 2b的溶液。首先，将溶液加载到Phenyl Sepharose6快速流动柱(GE Healthcare, US)上并通过其。其次，将含有HuIFN-a 2b的级分施加至P0R0S50D柱(Applied Biosystem, US)上。第三，将含有HuIFN-a 2b的级分用P0R0S50HS柱(Applied Biosystems，US)进行纯化。最后，将收集的 HuIFN-a 2b 分子进一步用 HiLoad26/100Superdex75pg (Amersham, US)进行纯化。在15% SDS-PAGE分析中，纯的HuIFN- a 2b蛋白显示为单一的条带，并且通过质谱法证实其纯度为>98%。
[0186]实施例6.测定Novaferon的抗病毒活性
[0187]使用在Armstrong JA (113)所描述的传统操作规程中的WISH-VSV系统来测定抗病毒活性。第一天，将WISH细胞(ATCC，目录号CCL25)以14，000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并于37°C孵 育。24小时后，在每孔中加入2倍系列稀释的Novaferon、HuIFN-a 2b, WHO人IFN国际标准品或空白培养基，并于37°C再孵育24小时。第三天，去除培养基，替换成含有1，000PFU的水泡性口膜炎病毒(VSV，ATCC,目录号VR-1421)的培养基。细胞再次在37°C孵育24小时，接着用0.85%的NaCl洗涤以去除死细胞。然后，将培养板在染料固定溶液(dye-fixer solution) (0.5%结晶紫，5%福尔马林(V/V)，50%乙醇(V/V)，和0.85% NaCl)中浸泡I小时。接着，轻轻倒出染料固定溶液，并用自来水充分漂洗微量培养板并让其干燥。用0.2ml2-甲氧基乙醇来溶解染色的细胞。对于结晶紫生物测定法，在 Model Opsys MR (Thermo Labsystems, US)中于 550nm 读取平板。
[0188]所有实验重复3次，Novaferon和HuIFN- a 2b样品在同一块平板中测试。对于在此制备的Novaferon和HuIFN- a 2b的抗病毒活性作平行分析，参照WHO国际标准品94/786(复合rHuIFN-a )和95/650 (rHuIFN-a 2a)来测定抗病毒单位(国际单位或IU)，这些WHO国际标准品可从 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC,USA)购得。
[0189]测得的经纯化的Novaferon蛋白在WISH中针对VSV的抗病毒活性为2.5 X IO9IU/mg,而HuIFN-a 2b的抗病毒活性为2.0X 108IU/mgo该数据表明，Novaferon蛋白的抗病毒活性为HuIFN- a 2b的大约12.5倍。
[0190]实施例7.Novaferon的抗增殖活性
[0191]抗增殖活性分析基本上如Evinger和Pestka所述的来进行(101)。
[0192]A.人肿瘤细胞系的细胞培养[0193]人肿瘤细胞系从不同机构购买得到(下表1)，即ATCC (American Type Culture
Collection，P.0.Boxl549, Manassas，VA20108，USA)，DSMZ (German National Resource
Centre for Biological Material， Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weglb,38124Braunschweig, Germany), JCRB (Japanese
Collection of Research Bioresources-Cell Bank， National Institute of Biomedial
Innovation，7-6-8Saito_Asagi，Ibaraki_shi，0saka567_0085，Japan)。
[0194]表1.人肿瘤细胞系
【权利要求】
1.表现出人干扰素样生物学活性的非天然存在的蛋白质，其中所述蛋白质选自其中每个蛋白质包含与SEQ ID No:2至少85%同一的氨基酸序列的蛋白质的组。
2.权利要求1的蛋白质，其中所述序列与SEQID No:2至少90%同一。
3.权利要求1的蛋白质，其中所述序列与SEQID No:2至少95%同一。
4.权利要求1-3中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质具有相比HuIFN-α2b而言增强的抗病毒和抗增殖活性。
5.权利要求4的蛋白质，其中所述蛋白质的抗病毒活性为HuIFN-a2b的至少2倍。
6.权利要求5的蛋白质，其中所述蛋白质的抗病毒活性为HuIFN-a2b的至少5倍。
7.权利要求6的蛋白质，其中所述蛋白质的抗病毒活性为HuIFN-a2b的至少10倍。
8.权利要求4的蛋白质，其中所述蛋白质的抗增殖活性为HuIFN-a2b的至少10倍。
9.权利要求8的蛋白质，其中所述蛋白质的抗增殖活性为HuIFN-a2b的至少50倍。
10.权利要求9的蛋白质，其中所述蛋白质的抗增殖活性为HuIFN-a2b的至少100倍。
11.权利要求10的蛋白质，其中所述蛋白质的抗增殖活性为HuIFN-a2b的至少200倍。
12.权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质是重组的。
13.权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质的分子量为大约19315道尔顿。
14.权利要求1的蛋白质，其可选地在N-末端包含甲硫氨酸残基。
15.包含与SEQID No:2具有O至25个氨基酸差异的序列的非天然存在的蛋白质，其中所述蛋白质表现出人干扰素样生物学活性。
16.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质具有相比HuIFN-a2b而言增强的抗病毒和抗增殖活性。
17.权利要求16的蛋白质，其中所述蛋白质的抗病毒活性为HuIFN-a2b的至少2倍。
18.权利要求16的蛋白质，其中所述蛋白质的抗增殖活性为HuIFN-a2b的至少10倍。
19.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质是干扰素类似物。
20.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质是重组的。
【文档编号】C07K14/555GK103483443SQ201310296591
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2007年6月22日 优先权日:2007年6月18日
【发明者】王海涛, 毛春生, 李季枝, 王凌, 杜勇, 刘龙斌, 徐静, 张瑞 申请人:诺瓦根控股公司