Isl1基因及其表达产物在促进HCN4表达中的应用的制作方法

Isl1基因及其表达产物在促进HCN4表达中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了Isl1基因及其表达产物在促进HCN4表达中的应用。具体地，本发明提供了一种Isl1基因、蛋白或其促进剂的用途，用于制备促进HCN4基因或蛋白表达的药物组合物，或用于制备HCN4的转录激活剂。本发明还提供了诱导型表达Isl1的重组动物细胞，以及一种构建心脏病模型动物的方法。本发明可用于先天性心脏病动物模型的研究，以及用于先天性心脏病的早期干预。
【专利说明】IsM基因及其表达产物在促进HCN4表达中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及先天性心脏病诊断治疗领域，具体地，本发明涉及Isll基因、蛋白在 诊断窦房结异常相关疾病中的应用。

【背景技术】
[0002] 心脏起搏传导系统是一种特殊的心肌组织，其产生和传播电脉冲，在调控心脏的 节律性收缩中起重要作用。起搏传导系统发育和功能的异常可导致心律失常及心源性猝 死。
[0003] 在中国，每年有超过50万例发生心源性猝死。而心律失常是心源性猝死的首要原 因。
[0004] 心脏起搏传导系统由起搏器（窦房结/SAN)、房室节（AVN)和浦肯野纤维组成。在 小鼠，在胚胎第8天（E8. 0)心脏流入道开始记录到心脏起搏信号。在胚胎第9. 5天（E9. 5)， 心脏流入道的静脉窦（sinus venosus)为原始起搏区域。而形态学上的起搏器在E11. 5形 成，其后进一步成熟，形成为一个功能完整的起搏器。起搏器的形成是一个复杂的、精细调 节的过程，涉及多种不同来源的心脏谱系。
[0005] 近年来，对心脏传导系统形成的分子调控机制的研究取得了显著进展。研究表明， 来源于心室内膜和冠状动脉的Endothelin-I在浦肯野纤维的诱导分化中起着关键性的作 用。Notch和Neuregulin信号通路在斑马鱼的AV(房-室)传导系统的形成中发挥重要作 用。在心脏和心肌细胞体外培养中，Neuregulin-I和Endothelin-I能够诱导小鼠心肌细 胞分化为起搏传导系统细胞。转录因子Nkx2. 5、Tbx5和GATA4相互作用，形成一个重要的 心脏转录调控网络，在心脏的发育，包括AV传导系统的形成和功能中起重要作用。这些因 子的变异导致了人类先天性心脏病，伴有AV传导系统异常。
[0006] 但相对而言，由于已知与起搏相关基因的缺失会造成胚胎大量早期死亡，起搏器 细胞在组织结构上也难以分辨，且起搏细胞数量有限，难以分离纯化，造成了现有技术中对 心脏起搏传导系统，特别是对心脏起搏细胞形成和功能调节机制的了解非常有限。
[0007] 因此，为了深入了解人类心律失常发生机理，有助于优生优育以及提供治疗手段， 本领域迫切需要开发与心脏系统发育和功能相关的基因及其调控通路。


【发明内容】

[0008] 本发明的目的就是提供一种与心脏系统发育和功能相关的基因及其调控通路和 应用。
[0009] 本发明第一方面，提供了一种Isll基因、蛋白或其促进剂的用途，用于制备促进 HCM基因或蛋白表达的药物组合物，或用于制备HCM的转录激活剂。
[0010] 在另一优选例中，所述的药物组合物或转录激活剂还用于预防或治疗窦房结 (SAN)异常相关疾病。
[0011] 在另一优选例中，所述的Isll基因或蛋白来自于哺乳动物，更佳地来源于小鼠、 大鼠或人。
[0012] 在另一优选例中，所述的Isll基因、蛋白或其促进剂包括的Isll基因表达产物、 促进型microRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
[0013] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括所述Isll基因、蛋白或其促进剂以及药 学上可接受的载体。
[0014] 在另一优选例中，所述的药物组合物还含有HCM蛋白或激活HCM蛋白活性的促 进剂（活性促进剂）。
[0015] 在另一优选例中，所述的窦房结细胞异常相关疾病包括：病窦综合征或心脏传导 系统相关心律失常。
[0016] 在另一优选例中，所述的心脏传导系统相关心律失常包括房颤、房扑、房早、室早、 预激综合征、窦性心律不齐。
[0017] 本发明第二方面，提供了一种用于促进HCM基因或蛋白表达的药物组合物，所述 的药物组合物含有Isll基因、蛋白或其促进剂以及药学上可接受的载体。
[0018] 本发明第三方面，一种筛选用于促进HCM基因或蛋白表达和/或活性的化合物的 方法，包括步骤：
[0019] ⑴在实验组，向细胞培养体系中添加测试化合物，并测定细胞培养体系中Isll 表达量和/或活性；在对照组，向相同的细胞培养体系中不添加测试化合物，并测定细胞培 养体系中Isll表达量和/或活性；
[0020] 其中，如果实验组中的Isll表达量和/或活性大于对照组，则说明该测试化合物 为用于促进HCM基因或蛋白表达和/或活性的化合物。
[0021] 在另一优选例中，还包括步骤：
[0022] (ii)对⑴中获得的化合物，进一步测定其对HCM表达量和/或活性的促进作 用；其中，如果实验组中HCM的表达量和/或活性明显大于对照组，则说明该化合物为用于 促进HCM基因或蛋白表达和/或活性的化合物。
[0023] 本发明第四方面，提供了一种基因重组的动物细胞，所述动物细胞含有一诱导型 表达盒，所述诱导型表达盒包括诱导型启动子，以及与所述诱导型启动子操作性连接的 Isll编码序列和终止密码子，从而可以在诱导条件下表达所述的Isll蛋白，并且Isll蛋白 表达量与诱导条件相关；
[0024] 并且，所述动物细胞不是组成型表达Isll编码序列的细胞。
[0025] 在另一优选例中，所述的动物细胞包括心肌细胞、起搏细胞、和心内膜细胞、肺动 脉和主动脉的平滑肌细胞。
[0026] 在另一优选例中，所述的动物细胞为体细胞。
[0027] 在另一优选例中，所述的诱导型表达盒是外源的表达盒。
[0028] 在另一优选例中，所述的Isll蛋白表达量与诱导条件呈正相关。
[0029] 在另一优选例中，所述的Isll蛋白表达量与诱导剂的水平或浓度呈正相关。
[0030] 本发明第五方面，一种体外非治疗性的处理方法，包括步骤：
[0031] (a)在一定浓度的诱导剂存在下，培养本发明第四方面所述的基因重组的动物细 胞，从而诱导所述动物细胞中表达Isll蛋白；和
[0032] (b)检测所述动物细胞中蛋白的表达情况和/或活性水平。
[0033] 在另一优选例中，步骤（b)中，所述的蛋白包括：Isll蛋白、HCM蛋白、或其他蛋 白。
[0034] 在另一优选例中，步骤（b)中，还包括检测所述动物细胞中与心脏细胞功能（尤其 是起搏细胞功能）相关的参数。
[0035] 在另一优选例中，在步骤（a)中，在对应于预定表达水平的诱导剂浓度下，培养所 述动物细胞，其中所述的预定表达水平是，与组成型表达Isll蛋白的且相同类型的野生型 动物细胞中Isll蛋白表达水平相比，Isll蛋白表达水平为野生型的约25%、30%、40%、 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、或120%。
[0036] 在另一优选例中，所述诱导剂为他莫昔芬。
[0037] 在另一优选例中，所述一定浓度的诱导剂为l-50mg/ml，更佳地，为5_20mg/ml。
[0038] 本发明第六方面，一种构建心脏病模型动物的方法，包括步骤：
[0039] (a)提供一动物细胞,所述动物细胞不是组成型表达Isll编码序列的细胞,并且 所述动物细胞含有一诱导型表达盒，所述诱导型表达盒包括诱导型启动子，以及与所述诱 导型启动子操作性连接的Isll编码序列和终止密码子，从而可以在诱导条件下表达所述 的Isll蛋白，并且Isll蛋白表达量与诱导条件相关；和
[0040] (b)将所述动物细胞再生成动物，从而制得心脏病模型动物。
[0041] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0042] 图1显示了小鼠胚胎发育和出生后Isll在窦房结（SAN)起搏细胞中的表达
[0043] E9. 5天，Isll和HCM同时表达于静脉窦（SV)心肌层中（图1A)，在E10. 5到P7 天则主要表达于SAN细胞中（图1B-E，图II)。在E10. 5天，Tbx3和Isll共表达于SV，包 括SAN的头尾区域和静脉瓣（vv)(图1F，G)。Cx40表达于心房心肌层，与Isll共表达（图 1H，J)。在图中方框区域内的K值如图II和图IJ所示。Isll的表达在小鼠胚胎发育和出 生后的过程中是逐渐降低的（图1L)。
[0044] 图2显示了 Isll的表达降低导致胚胎心律失常和SAN细胞的减少
[0045] Isll-nLacZ表达于SV心肌层，包括SAN区域（红箭头)，E9·5(图2A，A'）和Ell·5 (图2D，D'）背中胚层和心系膜。Isll和HCM在ISLl突变鼠 SV中的表达显著降低（图2C， C'）。Isll的表达和Isll阳性细胞在ISLl突变鼠 E9. 5(图2B，B'）和E11.5(图2E，E'）胚 胎SV心肌层，包括SAN(红色箭头)，心房心肌层和心系膜中显著降低。BrdU染色显示ISLl 突变鼠 E9. 5胚胎SV心肌层细胞增殖显著降低（图2F，F'）。TUNEL染色显示ISLl突变鼠 E10. 5胚胎SV细胞凋亡显著增加（图2G，G'）。超声心动图结果表明ISLl突变鼠 E9. 5和 E11. 5胚胎心率显著降低（图2H)。
[0046] 图3显示了 ISLl突变鼠胚胎SAN的HCN4, Tbx3和Shox2表达降低
[0047] HCM和Shox2表达于小鼠胚胎E9. 5天SV，包括SAN (图3A，A'，B，B'，红箭头)。 Tbx3表达于SV周围的间叶细胞（图3C，C'，箭头)。在Isl 1突变鼠胚胎，SV和SAN中HCN4， Shox2和Tbx3的表达都明显的降低（图3F，F'，G，G'，H，H'，红箭头）。Cx40和Nkx2. 5在心 肌层表达，不表达于SAN中（图3D，D'，E，E'，红箭头)。在Isll突变鼠胚胎，Cx40和Nkx2.5 在心房心肌层中显著降低，但是Cx40和Nkx2. 5在SAN中并无异位表达（图31，Γ，J，J'， 红箭头)。
[0048] 图4显示了胚胎早期使用HCN4-CreERT2在SAN中敲除Isll可导致心律失常和 SAN细胞数量减少
[0049] Isll 突变鼠（HCN4-CreERT2 ;Isllf/f)和对照组（HCH4-CreERT2 ;Isllf/+or+/+) 胚胎在E9. 5灌胃给予他莫昔芬，在给药后32小时和48小时分析胚胎表型。心脏超声心 动图显示Isll突变鼠胚胎在Ell天比ElL 5天心率降低更为明显（图4A)。整体和切片 X-gal染色显示在ElL 5天Isll突变鼠胚胎SAN中X-gal阳性细胞的数量（图4C，cl，c2， 红箭头和D)少于对照组（图4B，bl，b2,红箭头)。而HCM阳性细胞在Ell天突变鼠胚胎 SAN区域中的数量无明显改变（图4E，F，红色箭头)。Isll突变鼠（Ell)中，Isll，HCM和 Tbx3在SV的表达，包括SAN区域（红箭头)。Isll突变鼠（图4H，J，L)相对对照组（图 4G，I，K)有明显的减弱但是Isll在咽部和背心系膜区域的表达量是正常的。
[0050] 图5显示了在SAN形态发育晚期敲除Isll可导致心动过缓，Tbx3和HCM在SAN 中表达降低
[0051] 在El L 5天敲除Isll可导致突变体小鼠在E12. 5和E14. 5出现心率降低（图5A)。 在胚胎发育中，胚胎心率随胚胎发育逐渐增加（图5B)。当Isll在E13. 5胚胎敲除后，使用 心脏超声监测突变小鼠心率，在最初24小时突变小鼠心率未见明显改变，但24h后Isll突 变小鼠出现心率逐渐降低。整体和切片X-gal染色显示Isll突变胚胎SAN中X-gal阳性 细胞（图OT，D'）较对照组胚胎（图5C，C'）稍有减少。定量分析表明，Isll突变胚胎SAN 区域中X-gal阳性细胞数量（175. 5± 11. 7/切片，每个SAN计数10个切片）（D'）较对照 组（205·6±17·6/切片）（图 5C'）减少 15% (图 5E-H)。Isll，HCN4 和 Tbx3 在 Isll 突变胚 胎中的表达相对于对照组胚胎（图5E-G)显著降低（图5F，H)。
[0052] 图6显示了敲除Isll导致细胞周期相关基因、转录因子和离子通道的表达的降 低。
[0053] qPCR显示（图6A)敲除Isll导致细胞周期相关基因和Bcl-2的表达降低；Shox2， Mef2C，Tbx3和Nkx2. 5表达降低（图6B); -系列的离子通道，connexins和Myh6的表达 改变（图6C)。小鼠及人类Tbx3和HCM基因组区域对比图（E1-7:外显子为蓝色；未编码 区为黄色；保守区域为红色和粉红色）（图6D，E)。Nano-ChIP法检测出2个Isll分别在 Tbx3(Tbxl-l，-2)和 HCM (HCN4-l，-2)的可能的结合位点。qPCR 分析验证 Nano-ChIP 法 检测得2个Isll分别在Tbx3(Tbxl-l，-2)和HCM (HCN4-1，-2)的结合位点（图6F)。
[0054] 图7显示了 cTnT-Cre敲除Isll小鼠（cTnT-Cre ;Isll小鼠系）和Isll复合型突 变鼠的表现型类似，该突变鼠在胚胎期早期即E9. 5-E11. 5死亡，突变胚胎表现出明显的心 率变慢和早搏。
[0055] 图8A-图81显示了在HCM表达的SAN区域中，TUNEL标记的细胞数量显著增加， 而BrdU标记的细胞数量减少（箭头处）。

【具体实施方式】
[0056] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次克服了胚胎发育早期Isll基因缺失造成 动物模型大量死亡的技术难题，建立了 Isletl低表达和条件敲除的小鼠模型，经过对该表 达模型的实验研究发现，在胚胎发育中晚期，Isletl的低表达可导致了严重的心率减慢或 心律不齐，这类胚胎大多可以存活至出生。
[0057] 实验证明，即使Isll基因广泛表达于胚胎发育期间，但其早期表达与中晚期表 达所起的调控作用不同，胚胎中晚期低表达Isll会造成出生子代严重的先天性心律失常， 这种后果较早期Isll低表达或缺失造成的胚胎死亡，会为家庭和社会带来更大的痛苦和 负担。
[0058] 此外，本发明人还利用了 HCN4-CreERT2小鼠系在起搏器中特异性敲除Isletl，实 验表明，在发育早期（E9. 5)敲除Isletl导致了与Isletl低表达小鼠相似的表型，伴有起 搏细胞的丢失。在发育中晚期（E12. 5)敲除Isletl，变异小鼠表现出严重的心率缓慢和心 律不齐而不伴有起搏器起搏细胞的丢失，这说明Isletl对起心脏传导系统功能有重要的 调控作用。由此证实了，Isl 1基因作为HCM通路的上游基因，在起搏细胞的中晚期发育中， 起到了重要的调控作用。在此基础上，完成了本发明。
[0059] 术语
[0060] 如本文所用，术语"第二心脏领域"指心脏的形成和发育过程中，有部分心脏前体 细胞来源于前背侧中胚层，并将这一区域定义为第二心脏领域。
[0061] 术语"第二心脏领域前体细胞"指来源于第二心脏领域可以进一步分化发育成为 成熟心脏细胞的细胞群。
[0062] 术语"起搏器前体细胞"指的是能进一步分化发育成为成熟起搏器细胞的细胞群。 [0063] 如本文所用，术语"窦房结异常"指在病理或生理因素下，窦房结细胞的起搏自主 性和节律性受到影响导致的窦房结功能不全，并引起相关病理症状的情况。窦房结异常通 常由先天性因素以及自主神经影响因素等造成。
[0064] 如本文所用，术语"窦房结异常相关疾病"指在与窦房结起搏及传导相关的心律失 常。通常窦房结异常相关疾病包括病窦综合征、或心脏传导系统相关心律失常。
[0065] 如本文所用，术语"心脏传导系统相关心律失常"指直接或间接由于窦房结异常或 功能不全而影响心脏节律以及传导并引起心律失常的病理疾病，包括房颤、房扑、房早、室 早、预激综合征、窦性心律不齐。
[0066] 如本文所用，术语"Cre"、"Cre酶"可互换使用，均指Cre重组酶，为细菌噬菌体Pl 的I型拓扑异构酶，用于催化IoxP位点间的DNA进行位点特异性重组。本发明中，主要用 于敲除LoxP位点之间的特定基因。
[0067] 如本文所用，术语"胚胎发育早期"指早期胚胎发育包括受精、卵裂、囊胚和植入、 原肠胚和胚层形成、胚层分化与胚体雏型形成等若干阶段。对应的啮齿类动物胚胎发育早 期即E7. 5-E11. 5,对应的人类胚胎发育早期为1-3月。
[0068] 如本文所用，术语"胚胎发育中晚期"是指几乎全部组织器官形成和成熟直至出生 的时期。对应的啮齿类动物胚胎发育中晚期即E12.5-E21，对应的人类胚胎发育中晚期为 4-9 月。
[0069] 术语"Tbxl8谱系" ：TbxlS转录因子在前心外膜细胞及心外膜细胞中表达，对心脏 的发育形成起重要的调节作用，因此可以特异性标志心脏的，并将心脏的前心外膜细胞及 心外膜细胞谱系定义为Tbxl8谱系。
[0070] 如本文所用，术语"Isll复合型突变小鼠"指Isll复合型突变鼠（IsllnLacZ/ fne°)，即通过将IsllfNe°/+鼠系和Isll nLacZ/+鼠系杂交获得的小鼠模型。
[0071] "他莫昔芬"（他莫昔芬)是一种外源性雌激素类似物，可以与嵌合重组酶中的雌激 素受体相结合使Cre进入细胞核和LoxP位点结合以敲除特定基因。
[0072] 术语"Tbxl8谱系" ：TbxlS转录因子在前心外膜细胞及心外膜细胞中表达，对心脏 的发育形成起重要的调节作用，因此可以特异性标志心脏的，并将心脏的前心外膜细胞及 心外膜细胞谱系定义为Tbxl8谱系。
[0073] Isletl
[0074] Isll基因来源于第5号染色体长臂，全长大约2. 4kb，编码349个氨基酸、来源于 编码序列（Genbank登录号BC132609. 1)、蛋白信息（Genbank登录号AAI32610. 1)
[0075] Isletl是一个同源结构域转录因子，全身敲除Isletl导致来源于Isletl前体细 胞的心脏结构的完全缺失和胚胎早期死亡（E9. 5-10. 5)，这阻碍了对Isletl在起搏器中作 用的进一步研究。
[0076] 本发明Isll在多物种中有着高度的同源性，可用于本发明的Isll可来自于任何 哺乳动物，包括（但并不限于）：人、啮齿动物（如小鼠、大鼠)、黑猩猩、牛、犬、猫等。此外， Isll包括野生型Isll和突变型Isll及其活性片段。
[0077] HCM
[0078] HCN4 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4)基因来源于第9号染色体，mRNA全长3. 7kb，编码1201个氨基酸，其核苷酸序列如 SEQ ID Ν0·:3 所示（gene ID NM_001081192·)，其编码的蛋白序列如 SEQ ID Ν0·:4 所示 (NP_001074661. 1)〇
[0079] 在心脏新月期（Cardiac Crescent) HCM就已表达。在发育期及成人的心脏中， HCM特异性地标志窦房结。
[0080] 在人类，HCM的变异导致心率过缓。在小鼠等模型动物中，完全敲除HCM导致 严重的频发性窦性心跳停搏，以及胚胎早期死亡（E9. 5-10. 5)。然而在成年小鼠心脏敲除 HCM并不导致小鼠死亡，变异小鼠的基础心率/律正常，但有间歇性心跳骤停。这些研究表 明HCM对早期的心脏起搏功能是必需的。HCM和钙流时钟（Calcium clock)决定了起搏 细胞的高自主节律性，在心脏的窦性自主节律的产生和心跳速率的调节中起着关键作用。 在成年期，其他的机制包括钙流钟及其相关的调节蛋白可能共同发挥作用。
[0081] 检测方法和试剂盒
[0082] 本发明还涉及定量和定性检测人Isll蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这 些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人Isll蛋白水平，可以用于检测或预测窦房结 异常相关疾病。
[0083] -种检测样品中是否存在Isll蛋白的方法是利用Isll蛋白的特异性抗体进行检 测，它包括：将样品与Isll蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复 合物就表不样品中存在Isl 1蛋白。
[0084] Isll蛋白或其多核苷酸可用于Isll蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核 苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异 表达分析和基因诊断。抗Isll的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的Isll 蛋白。
[0085] 本发明还提供了一种检测窦房结异常相关疾病的试剂盒，它含有特异性扩增Isll 的引物对和/或Isll特异性抗体以及标签或说明书。
[0086] 其中，所述的标签或说明书注明以下内容：Isll基因或蛋白的表达和/或活性显 著低于正常人群，则说明，该检测对象患有窦房结异常相关疾病的概率高于正常人群。
[0087] 本发明方法和试剂盒可用于检测人羊水样品、组织样品、血液样品、血清样品或体 液样品，用于早期筛查窦房结异常有关的先天性心律失常，有利于优生优育。
[0088] 促进剂和药物组合物
[0089] 利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Isll蛋白发生相互作用的 物质，尤其是促进剂等。
[0090] 本发明Isll蛋白的促进剂，当在治疗上进行施用（给药）时，可促进Isll蛋白的 表达和/或活性，进而促进HCM基因或蛋白表达，或激活HCM的转录。在另一优选例中， 所述的Isll促进剂包括的Isll基因表达产物、促进型microRNA、促进型转录调控因子、或 促进型靶向小分子化合物。
[0091] 通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的 病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限 于）：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0092] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Isll蛋白或其促 进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡 萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以 被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制 备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、 溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微 克-10毫克/千克体重。
[0093] 通用方法
[0094] 转基因小鼠
[0095] Isll-nLacZ基因敲入小鼠（记为IsllnLacZ/+)的构建可通过常规方法，小鼠 1对染色体的其中一条于Isll起始位点插入nLacZ，一种优选的构建方法可见Song, M. R. , Sun, Y. , Bryson, A. , Gill, G. N. , Evans, S. M. , and Pfaffj S. L. 2009. Islet-t〇-LM0 stoichiometries control the function of transcription complexes that specify motor neuron and V2a interneuron identity. Developmentl36: 2923-2932。在该小鼠中， 一条染色体的Isll不能正常表达，另一条染色体可正常表达Isll。
[0096] TnT-Cre小鼠系（记为cTnT-Cre)、cTnT-Cre通过定点敲入的方法将小鼠1对染 色体的其中一条于cTnT的起始位点后插入重组酶基因 cre，Cre受cTnT启动子的调控只在 分化的心肌中表达。在该小鼠中，一条染色体能表达重组酶基因 ere。此小鼠购自上海南方 模式生物科技有限公司。
[0097] Isllfloxed 小鼠系的构建见 Jiao, K.，Kulessa，H.，Tompkins，K.，Zhou，Y.， Batts,L., Baldwin,H.S. , and Hogan,B.L. 2003. An essential roleof Bmp4in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes&development 17:2362-2367. 该鼠系通过同源重组的方法在小鼠 I对染色体的Isll第四外显子替换为两端带有LoxP位 点的第四外显子。
[0098] cTnT-Cre ;Isll小鼠系：是通过cTnT-Cre小鼠系和Isllfloxed小鼠系杂交所获 得。杂交小鼠可以表达重组酶基因 Cre可以识别插入Isll第四外显子两端的Ioxp位点从 而将Isll第四个外显子删除，使Isll基因无法正常表达。这种小鼠是cTnT-Cre小鼠系和 Isll floxed小鼠系杂交所获得。
[0099] Isll低表达（记为IsllfNe°/+)小鼠系的构建可通过同源重组将isll第四个外 显子替换为带有Ioxp位点以及筛选基因 neo的第四外显子。一种优选的构建方法可见 Sun, Y. , Dykes, I. Μ. , Liang, X. , Eng, S. R. , Evans, S. Μ. , and Turner, Ε. Ε. 2008. A central role for Isletlin sensory neuron development linking sensory and spinal gene regulatory programs. Nature neuroscience 11:1283-1293.在该小鼠中 neo 会干扰 neo 所在的Isll等位基因的正常表达，杂合小鼠中由于另外一条染色体的代偿作用Isll表达 正常；但在纯和小鼠中使Isll的表达水平显著降低，出生后Pl天死亡。
[0100] 他莫昔芬诱导型HCM-Cre ERT2 (记为HCN4-CreERT2)小鼠构建可用同源重组技 术进行。一种优选的方法是将一个包含CreERT2序列的cDNA片断在紧靠 HCM基因起始 密码子（ATG)的部位插入，构建转基因动物模型。一种优诜的构津方法可见Liang X, Wang G, Lin L, Lowe T. Zhang Q, Bu L, Chen YH, Chen T. Sun Y, Evans SM. HCN4 Dynamically Marks the First HeartField and Conduction System Precursors. Circ Res. 2013 Jun 6. Epublication此小鼠其中一条染色体可表达CreERT2,另一条表达HCN4。
[0101] Isll 复合型突变鼠（记为 IsllnLacZ/fNe。）:通过将 IsllfNe。/+ 鼠系和 IsllnLacZ/+ 鼠系杂交获得。杂交获得的小鼠1对染色体，其中一条在Isll起始位点插入nLacZ，使Isll 不能正常表达。另一条染色体中Isll基因的内含子中插入neo基因，干扰Isll的表达。
[0102] HCN4-CreERT2/Rosa_LacZ、YFP 小鼠：HCN4_CreERT2 小鼠系与具有 Rosa-LacZ 或 YFP遗传背景的Isll flox/flox小鼠系杂交，以便得到HCN4-CreERT2/Rosa-YFP或LacZ小 鼠。此小鼠可表达CreERT2可识别Rosa-YFP或Rosa-LacZ中间的IoxP位点并将其中间基 因序列删除，是Rosa可启动YFP或LacZ的表达。
[0103] 为了诱导HCN4-CreERT2小鼠系的Cre酶活性，给不同胚胎期的怀孕母鼠在所需时 间点口服给予150_300ul他莫昔芬（10mg/ml)。对胚胎早期，他莫昔芬在小鼠胚胎E9. 5给 药，胚胎样品在给药后32-36小时，约胚胎期Ell天收获。对胚胎晚期，他莫昔芬在小鼠胚 胎ElL 5给药，胚胎样品在给药后约胚胎期E14. 5天收获。转基因小鼠具有的Rosa26-YFP 遗传背景使能在他莫昔芬诱导Cre表达后观察到HCN4-CreERT2的表达。
[0104] 免疫荧光染色和RNA原位杂交
[0105] X-gal染色，免疫荧光和RNA原位杂交的方法可用常规方法进行，代表性的方法可 见：
[0106] Liang, X. , Zhou, Q. , Li, X. , Sun, Y. , Lu, Μ. , Dalton, Ν. , Ross, J. , Jr. , and Chen, J. 2005. PINCHlplays an essential role in early murine embryonic development but is dispensable in ventricular cardiomyocytes. Molecular and cellular biology25:3056-3062 ；
[0107] Liang, X. , Sun, Y. , Schneider, J. , Ding, J. H. , Cheng, H. , Ye, M. , Bhattacharya, S. ,Rearden, A. , Evans, S. , and Chen, J. 2007. Pinchl is required for normal development of cranial and cardiac neural crest-derived structures. Circ Res 100:527-535。
[0108] 使用一抗如下：小鼠 anti-Isletl/2 单克隆抗体（DSHB),兔 anti-Isletl(abcam), 大鼠 anti_HCN4 (abeam),兔 anti_Cx40 (Santa Cruz),羊 anti_Tbx3 (Santa Cruz),小 鼠 anti_Nkx2.5 (Santa Cruz)，大鼠 anti-Brdu (abeam)。二抗使用了 Alexa 488 or 594 labeled (Invitrogen)。TUNEL染色法使用了试剂盒手册（购自Roche)。
[0109] BrdU染色法：特定时间点的怀孕母鼠腹腔注射500 μ I BrdU(预混和液，Ambion) 3次，间隔3小时，BrdU染色可通过常规方法进行，代表性的方法见Sun, Y.，Dykes, I. Μ. , Liang, X. , Eng, S. R. , Evans, S. Μ. , and Turner, Ε. Ε. 2008. A central role for Isletl in sensory neuron development linking sensory and spinal gene regulatory programs. Nature neuroscience 11:1283-1293。
[0110] 细胞计数：对特定发育期的心脏SAN区域样品切片，切片厚度10um，每个样品选取 4张连续切片进行染色并计数阳性细胞。细胞增殖实验和细胞凋亡实验中，对突变胚胎和对 照胚胎右侧静脉窦和SAN区域的BrdU阳性和TUNEL阳性细胞进行计数。为了研究Isll在 发育过程中的表达情况，Isll阳性和HCM阳性细胞被计数，用以计算Isll和HCM阳性细 胞的比例。对每个时间点的不同样品，每个样品最少分析4至6个相对应的切片，每个实验 最少分析3对样品。
[0111] Nano-ChIP 和实时定量 PCR (qPCR):
[0112] 本发明Nano-ChIP和实时定量PCR (qPCR)可通过常规方法进行，代表性的方法如 下：
[0113] 采用 FACS-sorted 法，分离 HCN4-CreERT2 ;Isllf/f 突变鼠胚胎和 HCN4-CreERT2 ; Isll对照组胚胎（Rosa-YFP背景）SAN起搏细胞用于qPCR分析。收获并手术分离Ell天 YFP 阳性的 Isll 突变和对照组胚胎 SANs,使用 collagenase/dispase (lmg/ml，Roche)/ trypsin (0. 1%)混合消化液消化10分钟。收集起搏消化液中悬浊的起搏细胞（YFP阳性)， FACS sorted(BD FACSAria)分离细胞并储存于-80C。RNA 使用 RNeasy Mini kit(Qiagen) 制备。qPCR使用SYBR green法。
[0114] Nano-ChIP实验方法：HCN4-nEGFP胚胎SAN细胞在胚胎晚期收集（E13. 5 to E18. 5)，细胞收集和FACS-sorted方法如前所述。大约40, OOOSAN细胞使用l%formaldehyde 在室温交联10分钟。细胞使用甘氨酸冷淬5分钟并用冰水预冷PBS冲洗2遍。Chromatin 使用超声波碎裂成200-800bp大小片断，并使用1 μ g Isll抗体（39. 4D5, DSHB)共沉淀。 随后反向交联并纯化，ChIP DNA和输入的DNA被扩增（60)。扩增后DNA使用qPCR鉴定，相 关调控区域通过分析数据后确认。
[0115] 超声心动仪检测：
[0116] 怀孕小鼠使用isof Iurane麻醉。所使用超声心动仪型号为Visualsonics VeV〇770高解析度超声系统，使用RMV704 (40MHz)探头。每个胚胎都单独检测，并获得独立 的图像和数据。通过获得B-mode和脉冲多普勒图像得到心率和各项心脏功能参数。超声心 动仪检测后，解剖出胚胎，分别和超声心动仪检测结果对应，并进行基因型和表现型检测。
[0117] 统计分析法
[0118] 所有数据使用平均值（mean) 土SEMb表示，t-test使用2组独立测试结果相互验 证。当P〈0. 05时认为实验结果有显著性差异.
[0119] 本发明的有益效果
[0120] 1.本发明证实了在胚胎发育过程中，Isll基因或蛋白对窦房结细胞整个发育周 期中的形成及功能调节起到重要作用，尤其是对于窦房结细胞中晚期的形成和功能而言， Isll的缺失或变异不会造成胚胎死亡，而是造成出生后的胎儿患有以心律不齐为主要症状 的各种先天性心脏病。
[0121] 2.本发明还证实了作为HCM的上游基因，Isll对HCM的调控起到重要作用，从 而调控胚胎窦房结细胞的中晚期发育。
[0122] 3.本发明可用于先天性心脏病，尤其是以心律不齐为主要症状的各种先天性心脏 病的产前筛查和诊断，有利于优生优育。
[0123] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0124] 实施例IIsll和HCM在心脏SAN细胞中表达
[0125] 为了研究Isll在SAN形成和功能中的作用，首先分析了 Isll在SAN发育过程中 的表达，并使用数个SAN细胞和心房心肌细胞抗体（HCN4 Tbx3 Cx40购自abeam公司）作 为标记。
[0126] HCM是起搏细胞通道蛋白，在心脏发育早期开始表达，在SAN分化发育过程中起 了关键作用。在￡9.5，1811表达于心肌层的静脉窦（8；[11118￥61108118(5\0)，早期胚胎的起 搏细胞生发区域高表达HCM (图1A)。
[0127] 在E10. 5, Isll和HCM共表达于胚胎SAN头部（图1B)和尾部（图1C)，静脉瓣 (vv)，以及围绕背心系膜的心房心肌层（DM)(图1A，B，箭头)。
[0128] 在胚胎发育晚期和出生后早期，Isll和HCM共表达于窦房结细胞（图1D，E，I)。
[0129] Isll在SAN中的表达随着年龄逐渐降低。Isll和HNC4共表达的起搏细胞数量比 例在出生后2周显著降低，并随着年龄增加逐渐降低（图1L)。
[0130] Tbx3和CX40共染色可标记出SAN和心房心肌层之间的界限。发现在胚胎E10. 5 天，Tbx3在SAN头部和尾部以及静脉瓣中和Isll共表达（图1F，G)。Cx40表达在心房心 肌层而Isll表达于SAN (图1H，J)。
[0131] 结果表明了 Isll在SAN发育和功能中的起着重要的作用。
[0132] 实施例2在Isll复合型突变鼠胚胎中Isll表达的降低导致窦性心律不齐和SAN 细胞的减少
[0133] 2. 1构建一个Isll不完全表达的Isll复合型突变小鼠模型（IsllnLacZ/fNe°+)，其 表现型较全身敲除小鼠为轻，能存活稍长时间（E12. 5天死亡），但较Isll不完全表达小鼠 系表现型更重。
[0134] Isll复合型突变小鼠模型使用Isll核LacZ敲入小鼠系（Isl-nLacZ)，和Isll低 表达小鼠系（Isllf ne°/+，该小鼠 Isll内含子中含有neomycin位点，能够干扰Isll正常表 达）杂交而成。
[0135] 结果：Isll复合型突变小鼠 （Isll nLacZ/fne°)较Isll不完全表达小鼠系表达更 少量的Isll，可导致胚胎在ElL 5死亡（54)。组织切片X-gal染色显示Isll-nLaz小鼠中 IslΙ-nLaz显色和内源性Isll的表达部位完全一致。
[0136] 与图1所示一致，在E9. 5Isll_nLacZ在背心系膜，SAN和SAN周围心房内膜表达 (图2A，A'箭头)。
[0137] 在 ElL 5, Isll-nLacZ 表达于 SAN (图 2D，D'）。
[0138] 在E9. 5和E11.5Isll复合型突变体小鼠在SV心肌层，SAN，背心系膜部位的 Isll-nLacZ阳性细胞数量显著减少（图2B，B'，E，E'，箭头)。
[0139] I s11和HCM抗体进行免疫荧光染色表明在E9. 5天I s11复合型突变体SV中I s11 和HCM阳性细胞显著减少（图2C，C'）。
[0140] 结论：Isll对SAN细胞，SV心肌细胞，心脏后部的心脏祖细胞的增殖和存活都是必 须的。为此，使用BrdU作为细胞增殖标记，使用TUNEL染色观察细胞凋亡。发现在E9. 5胚 胎，SV心肌层BrdU标记细胞数量显著减少，SV右角细胞凋亡数量显著增加（图2G，G'）。
[0141] 2. 2为了进一步研究Isll复合型突变体起搏细胞的功能，应用超声心动仪检测突 变小鼠 E9. 5至ElL 5的心率变化。标记了每个胚胎在子宫中的位置并检测每个胚胎心率。
[0142] 结果：Isll复合型突变体在E9. 5的心率和对照组E9. 5的心率相比明显变慢，在 Isll复合型突变体ElL 5心率减慢更加显著（图2H)。同时发现Isll复合型突变胚胎会 出现间歇性的心脏早搏，其发生频率随着胚胎的发育而增加。在实验检测过程中有部分胚 胎发生长时间心脏停搏。
[0143] 结论：Isll早期低表达的突变鼠死于心律失常。
[0144] 实施例3Isll复合型突变胚胎中Isll表达降低引起SNA功能相关的关键基因表 达降低
[0145] RNA原位杂交结果显示，HCN4，Shox2和Tbx3在对照组E9. 5的SV中表达（图3A-C， A'-C'，箭头)，而在Isll复合型突变体E9. 5的SV中表达显著降低（图3F-H，F'-H'，箭头)。
[0146] Cx40和Nkx2. 5在对照组胚胎心肌层表达，但不表达于SAN(图3D，D'，E，E'，箭 头)。在Isll复合型突变胚胎中发现Shox2和Tbx3出现异位表达，而没有发现CX40和 NKX2. 5出现异位表达的现象（图31，Γ，J，J'，箭头)。
[0147] 结论：Isll复合型突变胚胎中Isll表达降低可造成HCN4, Shox2和Tbx3等SNA 功能相关的基因表达降低，Isll调控了这些基因的表达，为其上游基因。
[0148] 实施例4Isll对已分化心肌细胞仍是必需的
[0149] 在Isll复合型突变胚胎中，已分化SAN起搏细胞（E9. 5-E11. 5)，第二心区心脏祖 细胞和SV，SAN心肌层中Isll的表达都显著降低。因此，使用Troponin-Cre (CTnT-Cre) 小鼠在已分化心肌细胞中特异性敲除Isll,用以观察Isll在已分化窦房结细胞中的作用。
[0150] cTnT-Cre敲除Isll小鼠（cTnT-Cre ;Isll小鼠系）和Isll复合型突变鼠的表现 型类似，该突变鼠在胚胎期早期即E9. 5-E11. 5死亡，突变胚胎表现出明显的心率变慢和早 搏，见图7。
[0151] 结论：实验表明，即使心肌细胞已经成熟，Isll的表达对心肌细胞的起搏功能仍 是必需的。
[0152] 实施例5在E9. 5使用HCN4-CreERT2敲除小鼠 SAN细胞ISll可导致胚胎Ell. 5 窦性心律不齐，窦房结细胞减少和胚胎期致死
[0153] 由于Isll在SAN中持续表达且表达时间要长于cTnT-Cre ;因此需要使用其他方 法研究发育晚期Isll在SAN中的作用。
[0154] 5. 1在E9. 5天，SV作为心脏的主要起搏区域，而SAN最早在ElL 5天形成可分 辨的组织结构，在E13. 5天成熟并行使功能。因此主要研究的是以上所述的SAN发育阶 段。通过他莫昔芬诱导，HCN4-Cre可在心脏传导系统中表达。使用HCN4-CreERT2和带 有Rosa26-LacZ或YFP背景的Isllf/f小鼠杂交，以追踪Cre的表达部位。采用可诱导的 HCMCre小鼠系（HCN4-CreERT2)构建特异性的Isll在SAN起搏细胞中的基因敲除小鼠模 型。
[0155] 结果：通过在E9. 5天给予他莫昔芬后每天用超声心动仪检测胚胎心率。发现， 和对照组相比，HCN4-CreERT2 ;Isll突变鼠心率在E10. 5天显著变慢。HCN4-CreERT2 ; Isll突变体心率随着发育过程逐渐降低，在Ell. 5天发生心脏长时间停跳，大多数的 HCM-CreERT2 ;Isll突变体胚胎在ElL 5天死亡（图4A)。
[0156] 5. 2为了检测SAN细胞在HCN4_CreERT2 ;Isll中分布情况，使用Rosa-LacZ染色 来跟踪SAN细胞发育和分布情况。在胚胎E9. 5给予他莫昔芬后，于E10. 5-E11和ElL 5取 胚胎进行X-gal染色（图4B-F)。
[0157] 结果：在对照组E10. 5和11. 5胚胎，HCN4-CreERT2所标记的X-gal阳性细胞存 在于SV和SAN(图4B，E，红箭头，bl，b2)，这个和内源性HCMmRNA的表达部位一致（图 3A)。但是在E10. 5-E11突变胚胎，SV区域内的部分X-gal阳性细胞缺失（图4E，F)。在 ElL 5, X-gal+阳性细胞分布区域和对照组相似，但是SV中HCN4-CreERT2阳性细胞数量显 著减少（图 4B，C，红箭头，bl，b2, cl，c2, D)。
[0158] 5. 3应用免疫荧光染色检测在SAN细胞丢失前的Ell天Isll的表达情况。
[0159] 结果：在E9. 5天他莫昔芬的诱导显著降低了 Isll在SV和SAN中的表达（图4G， H)，而同时Isll在咽部和背心系膜区域的表达未见改变。
[0160] HCN4-CreERT2 ;Isll突变胚胎的SV和SAN区域中HCM和Tbx3的表达则显著降 低（图4I-L)，这表明Isll同时调控了 HCM和Tbx3的表达。
[0161] 此外，实验证明，在HCM表达的SAN区域中，TUNEL标记的细胞数量显著增加（图 8),而BrdU标记的细胞数量减少。
[0162] 结论：Isll在SAN细胞的存活和增殖过程发育早期中都发挥了重要作用。
[0163] 实施例6使用HCN4-CreERT2在ElL 5胚胎SAN细胞中敲除Isll可导致窦性心律 不齐，减少SAN细胞的增殖。
[0164] 为了研究Isll在SAN发育晚期和其起搏功能中的作用，在SAN发育晚期敲除了 Isll0
[0165] 6. 1在ElL 5天给予他莫昔芬，Isll突变胚胎心率在24和72小时后的心超检测 中显著变缓（图5A)。但是和胚胎早期敲除Isll不同，晚期敲除Isll后大部分的突变胚胎 仍然可以存活。
[0166] 在E13. 5天给予他莫昔芬，发现突变胚胎心率在48小时后显著降低（图5B)。研 究还发现在小鼠胚胎发育过程中对照组胚胎心率是逐渐增加的，但是HCN4-CreERT2 ;Isll 突变胚胎心率未见增加，并表现出心率变化不规则。（图5B)。
[0167] 对E14. 5天心脏（E1L 5他莫昔芬诱导）整体和切片的X-gal和galactosidase 免疫荧光共染色显示，Isll突变胚胎SAN中X-gal阳性细胞数量（图D'，H)较对照组 (图5C，C'，G)略降低。定量分析显示（每个SAN计数10个切片)，Isl突变胚胎的SAN中 X-gal阳性细胞的数量（175. 5± 11. 7/切片）（图）较对照组（205. 6± 17. 6/切片）（图 5C'）减少了 15%。
[0168] 结论：SAN发育晚期敲除Isll后，大部分胚胎可以存活，但仍会造成严重的心律失 堂 巾。
[0169] 6. 2Isll 突变胚胎 SAN 中 HCN4-CreERT2 ;Rosa-YFP 阳性细胞的增殖细胞（BrdU+) 明显减少。相反的，在发育早期，HCN4-CreERT2 ;Isll突变胚胎SAN细胞凋亡未见增多。
[0170] HCN4-CreERT2 ;Isll突变鼠的SAN切片免疫荧光染色结果显示Isll，HCN4和Tbx3 的表达显著降低（图5E-H)。但是尽管Tbx3的表达降低，并无证据显示Isll突变体SAN中 有NKX2. 5的异位表达。
[0171] 结论：Isll的减少造成了多个基因（如HCN4)的减少，因此，Isll在心脏传导系统 中可能起到了重要的上游调控作用。
[0172] 实施例7Isll调控了 SAN发育和功能必须的关键转录因子，离子通道，以及细胞周 期，细胞存活基因的表达。
[0173] 为了研究可能导致前述Isll突变鼠表现型的Isll潜在的下游靶基因，使用 qRT-PCR对ElL 5天HCN4-CreERT2 ;Isll突变鼠和对照组SAN细胞进行了分析（他莫昔芬 在E9. 5进行了诱导）（图6A-C)。选择与Isll相关或与Isll表现型相关的基因进行分析。
[0174] 7. 1实验发现，一系列信号通路基因表达下调，包括细胞增殖（Ccndl，Ccnd2， Ccnel，Ccnbl，Plkl，Aurka and Cdknl),细胞存活（Bcl2)(图 6A)和心脏以及 SAN 发育 所必需的转录因子（Shox2，Isll，Mef2c，Tbx3)(图6B)。在这些基因中，Ccndl (encoding cyclin Dl)和Mef2c已被证明是Isll的直接下游祀基因。同时，还有一系列和传导系统功 能相关的离子通道基因的表达下调（Atplbl，Atplb2, Atp2al，Kcnel，Kcna5和Cacnalh)。 Gja5和Gjd3 (分别编码了 Cx40和Cx30. 2)的表达也明显降低。Gjal和Gja4 (分别编码了 Cx43和Cx37)的表达则有增高（图6C)。此外，还发现和人类病窦综合征相关的基因 Myh6 在Isll突变胚胎SAN中的表达降低（图6C)。
[0175] 7. 2SAN发育过程中的关键因子HCM和Tbx3在HCN4-CreERT2 ;Isll突变胚胎SAN 中的表达显著降低。为了研究这2个基因是否是Isll的直接下游靶基因，对FACS纯化后 E14. 5 至 E17. 5HCN4-nEGFP 突变鼠 SAN 细胞进行了 nano-ChIP 分析（60) (51)。
[0176] qPCR分析ChIP结果中不同DNA的表达丰度。为了鉴定Isll在进化保守区域 (ECRs)可能的结合位点（YTAATR)，检查了小鼠 HCM和Tbx3基因组上游和下游各5kb的 区域。
[0177] 结果：2个ECRs可能包含了 Isll结合位点（图6D，F)。 Tbx3-l(chr5:119671762-119672016)位于Tbx3的5'非编码区域，在转录起始位点（TSS) 下游 1271bp 和 1270bp 包含有 2 个相邻的 TAAT 位点。Tbx3-2(chr5:119684628-119685046) 在一个Tbx33'端相邻的465bp的ECR中，含有多个潜在的Isll结合位点。
[0178] ChIP-PCR 在 HCM 也发现了 2 个高丰度位点 locus (图 6E，F)。HCN4-2 (chr9:58842538-58842979)定位于一个442bp内含子ECR中，该位点已被证明为是一个有 效的增强子，该区域有多个Isll结合位点。HCM-I (chr9:58820136-58820197)位于一个 非保守区域内，位于HCM转录起始位点上游3376bp处，包含有一个潜在的I s11结合位点。 [0179] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一 种 LIM 同源结构域转录因子（LIM homeodomain transcription factor， Isletl，Isll)基因、蛋白或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备促进HCN4基因 或蛋白表达的药物组合物，或用于制备HCN4 (超极化激活性环核苷酸门控性通道4， hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4)的转录激活剂。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Isll基因或蛋白来自于哺乳动物，更 佳地来源于小鼠、大鼠或人。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Isll基因、蛋白或其促进剂包括的 Isll基因表达产物、促进型microRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括所述Isll基因、蛋白 或其促进剂以及药学上可接受的载体。
5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的窦房结细胞异常相关疾病包括：病窦 综合征或心脏传导系统相关心律失常。
6. -种用于促进HCN4基因或蛋白表达的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物 含有Isll基因、蛋白或其促进剂以及药学上可接受的载体。
7. -种筛选用于促进HCN4基因或蛋白表达和/或活性的化合物的方法，其特征在于， 包括步骤： (i) 在实验组，向细胞培养体系中添加测试化合物，并测定细胞培养体系中Isll表达 量和/或活性；在对照组，向相同的细胞培养体系中不添加测试化合物，并测定细胞培养体 系中Isll表达量和/或活性； 其中，如果实验组中的Isll表达量和/或活性大于对照组，则说明该测试化合物为用 于促进HCN4基因或蛋白表达和/或活性的化合物。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤： (ii) 对⑴中获得的化合物，进一步测定其对HCN4表达量和/或活性的促进作用；其 中，如果实验组中HCN4的表达量和/或活性明显大于对照组，则说明该化合物为用于促进 HCN4基因或蛋白表达和/或活性的化合物。
9. 一种基因重组的动物细胞，其特征在于，所述动物细胞含有一诱导型表达盒，所述诱 导型表达盒包括诱导型启动子，以及与所述诱导型启动子操作性连接的Isll编码序列和 终止密码子，从而可以在诱导条件下表达所述的Isll蛋白，并且Isll蛋白表达量与诱导条 件相关； 并且，所述动物细胞不是组成型表达Isll编码序列的细胞。
10. -种体外非治疗性的处理方法，其特征在于，包括步骤： (a) 在一定浓度的诱导剂存在下，培养权利要求9所述的基因重组的动物细胞，从而诱 导所述动物细胞中表达Isll蛋白；和 (b) 检测所述动物细胞中蛋白的表达情况和/或活性水平。
11. 一种构建心脏病模型动物的方法，其特征在于，包括步骤： (a)提供一动物细胞，所述动物细胞不是组成型表达Isll编码序列的细胞，并且所 述动物细胞含有一诱导型表达盒，所述诱导型表达盒包括诱导型启动子，以及与所述诱导 型启动子操作性连接的Isll编码序列和终止密码子，从而可以在诱导条件下表达所述的 Isll蛋白，并且Isll蛋白表达量与诱导条件相关；和 (b)将所述动物细胞再生成动物，从而制得心脏病模型动物。
【文档编号】C07K14/47GK104338149SQ201310326495
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】孙云甫, 梁兴群 申请人:上海市东方医院（同济大学附属东方医院）