一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法
【专利摘要】本发明涉及多肽纯化领域，特别涉及一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法。该纯化方法包括：获得粗肽，经前处理，得到第一粗肽溶液，经第一调节pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；取第二粗肽溶液与还原剂混合，经第二调节pH值至4.0～7.0，经过滤、纯化，即得；还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫；易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。本发明提供的纯化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肽中的颜色，提高了药品的质量，且提高了精肽的收率，操作简单，成本低，适于工业化生产。
【专利说明】-种含易被氧化氨基酸的多化的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肤纯化领域，特别涉及一种含易被氧化氨基酸的多肤的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代 末开始一直呈上升趋势。乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%。据国家癌症中也和卫生 部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示；全国肿瘤登记地区乳腺癌 发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率全国合计约为42. 55/10万，城市约 为51. 91/10万，农村约为23. 12/10万。目前乳腺癌已成为威胁女性身也健康的常见肿瘤。
[0003] 常见的治疗乳腺癌的药物包括醋酸甲轻孕丽片、甲睾丽片、希罗达、倍美力、戈舍 瑞林等。其中，戈舍瑞林是一种合成的十肤化合物，属于促黄体生成素释放激素的类似物， 长期使用可抑制垂体的促黄体生成激素的分泌，从而引起女性血清雌二醇的下降，达到治 疗乳腺癌的作用。
[0004] 戈舍瑞林肤序中具有色氨酸残基，色氨酸极易被氧化而产生非常明显的颜色，一 般为红色或紫红色。采用固相合成法、液相合成法合成戈舍瑞林粗肤时，由于合成过程较为 复杂，会用到多种缩合剂和催化剂，因此肤序中的色氨酸残基易被氧化而使产品带有红色 或紫红色，影响戈舍瑞林药物的质量。其它的含有色氨酸等易被氧化氨基酸的多肤类药物 在合成时也会发生不同程度的氧化而使产品带有颜色，因此在合成含有易被氧化氨基酸的 多肤类药物过程中，需要去除颜色W保证药品的质量。一般采用采用HPLC纯化法和活性炭 吸附法将氧化杂质去除。在利用HPLC纯化法去除颜色时，由于氧化并没有使整个肤序列发 生变化，其性质与被氧化前差别很小，因此需要多次HPLC纯化才能将颜色去除，导致产品 的收率较低；在利用活性炭吸附法去除颜色时，由于活性炭的吸附作用不具备选择性，在吸 附颜色的同时，还会吸附目标产物，一旦吸附上目标产物就很难解离下来，导致目标产物的 收率偏低，该种情况对于分子量在2000 W下的多肤尤为明显。因此，提供一种既能有效去 除多肤产品中的颜色，又能保证产品的收率较高的多肤纯化方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种含易被氧化氨基酸的多肤的纯化方法。该方法通过 调整粗肤溶液的抑值至6. 0?8. 0,再加入还原剂，从而可去除粗肤溶液中的颜色，且提高 了精肤的收率。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种含易被氧化氨基酸的多肤的纯化方法，包括如下步骤：
[0008] 获得粗肤，经前处理，得到第一粗肤溶液，经第一调节pH值至6. 0?8. 0,得到第二 粗肤溶液；
[0009] 取第二粗肤溶液与还原剂混合，经第二调节抑值至4. 0?7. 0。
[0010] 还原剂选自含有琉基的有机酸，含有硫离子或硫氨离子的酸或无机盐，含有还原 性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氨根的无机盐，或二氧化硫；
[0011] 易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。
[0012] 多肤作为药物，具有生理活性强、免疫原性低、疗效高等诸多优点，但多肤类物质 自身固有的特点如口服利用率较低、酶降解性高W及半衰期极短等，使其作为药物的开发 应用受到诸多的局限。而导致多肤药物不稳定的一个重要原因就是含有易被氧化氨基酸 的多肤极易被氧化。含有易被氧化氨基酸的多肤在合成过程中被氧化后会致使多肤带有颜 色，影响多肤产品的质量，因此需要去除被氧化的多肤。本发明提供了一种利用还原剂的还 原性质去除被氧化的多肤的方法，并提供了还原剂的种类，还提供了被氧化的多肤与还原 剂反应时适宜的抑值范围，本发明提供的纯化方法可避免多肤被过度的还原，不会破坏多 肤的结构，保持了多肤原有的活性。为了避免多肤被过度的还原，多肤的结构不会被破坏， 保持多肤原有的活性作用，作为优选，还原剂选自含有琉基的有机酸，含有硫离子或硫氨离 子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氨根的无机盐，或 二氧化硫。
[0013] 不同种类的氨基酸稳定性有很大差别，有些氨基酸含有易被氧化的结构，在自然 胆存条件下，容易发生氧化反应，该些易被氧化的氨基酸包括色氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋 氨酸等。
[0014] 在本发明提供的一些实施例中，含易被氧化氨基酸的多肤为含有色氨酸的多肤， 但含易被氧化氨基酸的多肤并不局限于含有色氨酸的多肤，只要是本领域技术人员认可的 含易被氧化氨基酸的多肤均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
[0015] 在本发明提供的一些实施例中，含易被氧化氨基酸的多肤为戈舍瑞林。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，含有琉基的有机酸为半脫氨酸或还原型谷脫甘 肤，但本领域技术人员认为可行的含有琉基的有机酸均在本发明的保护范围之内，含有琉 基的有机酸种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，含有硫离子或硫氨离子的酸为氨硫酸，但本领域 技术人员认为可行的含有硫离子或硫氨离子的酸均在本发明的保护范围之内，含有硫离子 或硫氨离子的酸种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0018] 在本发明提供的一些实施例中，含有硫离子的无机盐为硫化轴，但本领域技术人 员认为可行的含有硫离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有硫离子的无机盐种类 并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，含有硫氨离子的无机盐为硫氨化轴，但本领域技 术人员认为可行的含有硫氨离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有硫氨离子的无 机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0020] 在本发明提供的一些实施例中，含有还原性金属离子的无机盐为含亚铁离子的无 机盐或含亚铜离子的无机盐，但本领域技术人员认为可行的含有还原性金属离子的无机盐 均在本发明的保护范围之内，含有还原性金属离子的无机盐种类并不局限于此，本发明在 此不做限定。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，含亚铁离子的无机盐为硫酸亚铁或氯化亚铁，但 本领域技术人员认为可行的含亚铁离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含亚铁离子 的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，含亚铜离子的无机盐为硫酸亚铜或氯化亚铜，但 本领域技术人员认为可行的含亚铜离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含亚铜离子 的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0023] 在本发明提供的一些实施例中，含有亚硫酸根的无机盐为亚硫酸轴或亚硫酸钟， 但本领域技术人员认为可行的含有亚硫酸根的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有亚 硫酸根的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0024] 在本发明提供的一些实施例中，含有亚硫酸氨根的无机盐为亚硫酸氨轴或亚硫酸 氨钟，但本领域技术人员认为可行的含有亚硫酸氨根的无机盐均在本发明的保护范围之 内，含有亚硫酸氨根的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0025] 为了保证被氧化的多肤充分去除，使多肤的颜色消失或变浅，提高多肤产品的质 量，在本发明提供的一些实施例中，还原剂与粗肤的质量比为（5?30) :100。
[0026] 作为优选，还原剂与粗肤的质量比为1:10。
[0027] 在本发明提供的一些实施例中，还原剂需配制成还原剂溶液使用，作为优选，还原 剂溶液的质量体积浓度为lOg/L。
[0028] 为了保证还原剂与第二粗肤溶液混合均匀，使被氧化的多肤充分被还原，在本发 明提供的一些实施例中，混合的时间为2?5min。
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，第一粗肤溶液的抑值小于6. 0,为了保证还原剂 能够很好的发挥还原作用，需要调节第一粗肤溶液的抑值至6. 0?8. 0,作为优选，第一调 节抑值采用的试剂为碱溶液。
[0030] 作为优选，第一调节抑值采用的碱溶液中的碱为易溶于水的碱。
[0031] 在本发明提供的一些实施例中，第一调节抑值采用的碱溶液中的碱为氨水、氨氧 化轴或氨氧化钟。但本领域技术人员认为可行的易溶于水的碱均在本发明的保护范围之 内，易溶于水的碱的种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0032] 在本发明提供的一些实施例中，碱溶液的质量百分浓度为5%?40%。
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，纯化方法中的前处理为将粗肤溶解、稀释。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，前处理中将粗肤溶解、稀释具体操作为；将醋酸、 己膳和水混合，获得混合溶剂；将粗肤溶解于混合溶剂中，再加入水进行稀释，得到第一粗 肤溶液。
[00巧]在本发明提供的一些实施例中，将醋酸、己膳和水混合后获得的混合溶剂中，醋 酸、己膳与水的体积比为（6?12): (1?4): (4?13)。
[0036] 在前处理中将粗肤溶解于混合溶剂后粗肤的质量体积浓度优选为20?50g/L。
[0037] 在本发明提供的一些实施例中，将粗肤溶解于混合溶剂后粗肤的质量体积浓度为 20 ?25g/L。
[0038] 在多肤的纯化方法中，粗肤经溶解、稀释后得到第一粗肤溶液，作为优选，第一粗 肤溶液的质量体积浓度为2?45g/L。
[0039] 在本发明提供的一些实施例中，第一粗肤溶液的质量体积浓度为5?14. 3g/L。
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，过滤操作后的纯化具体采用HPLC系统纯化，流动 相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为18%?38%、40min的梯度洗脱分段收 集样品。
[0041] 在本发明提供的另一些实施例中，过滤操作后的纯化具体采用HPLC系统纯化，流 动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为25%?45%、40min的梯度洗脱分段 收集样品。
[0042] 本发明提供了一种含易被氧化氨基酸的多肤的纯化方法，该纯化方法包括；获得 粗肤，经前处理，得到第一粗肤溶液，经第一调节抑值至6. 0?8. 0,得到第二粗肤溶液；取 第二粗肤溶液与还原剂混合，经第二调节抑值至4. 0?7. 0,经过滤、纯化，即得；还原剂选 自含有琉基的有机酸，含有硫离子或硫氨离子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机 盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氨根的无机盐，或二氧化硫；易被氧化氨基酸为易发生氧化反应 的氨基酸。利用本发明提供的纯化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肤中的颜色， 提高了药品的质量；利用本发明提供的方法获得的精肤收率可达90. 9%，而利用活性炭吸 附去除颜色的方法获得的精肤收率只有43. 1%，利用HPLC纯化去除颜色的方法获得的精肤 收率只有49. 8%，表明本发明提供的纯化方法大大提高了精肤的收率。由此可见，本发明提 供的纯化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肤中的颜色，提高了药品的质量，且提 高了精肤的收率，操作简单，成本低，适于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1示实施例1提供的戈舍瑞林的质谱图。
【具体实施方式】
[0044] 本发明公开了一种含易被氧化氨基酸的多肤的纯化方法，本领域技术人员可W借 鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域 技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过 较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述 的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0045] 本发明提供的含易被氧化氨基酸的多肤的纯化方法中所用试剂或原料均可由市 场购得。
[0046] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0047] 实施例1戈舍瑞林粗肤的制备
[004引将lOg替代度为0. 7mmol/g的Sieber Resin,加入到固相反应柱中，加入DCM溶胀 树脂30min后，用20%脈巧/DMF溶液两次去除Fmoc保护，时间分别为lOmin和15min。DMF 洗涂六次，将12g N，N-二玻巧醜亚胺碳酸醋用20血DMF溶解，加入0. 51g DMAP冰水浴预 活化5min，加入固相反应器中，室温反应2.化。反应终点W巧H丽法检测为准。反应结束 后DMF洗涂6次，加入25血DMF作为溶剂，慢慢加入14. 1血水合脱，室温反应3h，反应结束 后，DMF洗涂6次。
[004引 将1. 15g Fmoc-Pro-OH，4. 86g册At在冰浴情况下溶于DMF中，加入上述树脂中反 应平衡lOmin后，加入5. 6血DIC，室温反应化。DMF洗涂3次后，DCM洗3次，用甲醇收缩 3 次，时间分别为 3min、5min、8min，得到11.9gFmoc-P;ro-Azagl5f-SieberResin，检测替代 度为 0. 495mmol/g。
[0050]称取 20. 2g 替代度为 0. 495mmol/g 的 Fmoc-Pr〇-Azagl5f-Sieber Resin (lOmmol) 加入反应器中，用DCM溶胀0.化，再用20%脈巧/DMF两次去除Fmoc保护，时间分别为lOmin 和 15min。洗涂后连接 Fmoc-Arg(N〇2)-〇H。将 12. 9g Fmoc-Arg(N〇2)-〇H，4. 9g 册Bt，6. 1 血 Die溶于DCM中（可W加入少量DMF助溶)，冰水浴活化5min后，加入固相反应器中，室温反 应化。反应终点W巧H丽法检测为准。按照上述连接Fmoc-Arg (N02) -0H的方法依次偶联 Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-D-Ser (tBu) -〇H、Fmoc-Tyr 炬 zl) -〇H、Fmoc-Ser (Trt) -〇H、Fmoc-Trp-〇H、 Fmoc-His (ht) -〇H、Pyr-〇H，得到序列如SEQ ID NO ; 1所示的肤树脂37. 2g，其序列为Pyr-H is (T;rt)-化p-Ser (Trt) -Tyr 炬zl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02) -Pro-AzaGly-Sieber Resin。 [005。 配制裂解试剂380mU其中H氣己酸38111以水19mL，0〔1323111以在-5°C的条件下预 冷30min ;将上述肤树脂37. 2g加入到500mL圆底烧瓶中，将裂解试剂加入到上述圆底烧瓶 中，揽拌的同时冰水浴，通入氮气。反应30min后撤走冰浴，室温下继续反应2h。过滤树脂， 收集滤液。用少量DCM洗涂树脂，合并滤液。减压浓缩到60mU将浓缩液缓慢加入600mL冰 己離中沉淀，离也，冰己離洗涂5次，减压干燥得到序列如SEQ ID NO ;1所示的粗肤16. 2g， 其序列为 Pyr-His-T;rp-Se;r-Ty;r 炬zl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg(N02) -Pro-Azagly-NHg。
[005引将上述粗肤16. 2g溶到160血4. 4%甲酸甲醇溶液中，16. 2gl0%把碳，室温反应 0. 5h，检测原料消失，滤掉把碳，滤液检验浓缩至30mL，加入到500血冰己離沉淀，离也，干 燥，得到序列如SEQ ID NO ;1所示的戈舍瑞林粗肤11. Og，颜色呈红色，粗肤收率86. 7%， HPLC纯度93. 7%，戈舍瑞林粗肤中戈舍瑞林精肤的含量为5. 28g，由质谱确定结构为Pyr-Hi s-T;rp-Se;r-Ty;r-D-Se;r (tBu) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NHs,其质谱数据为 1269. 7,质谱图见图 10
[0053] 实施例2戈舍瑞林精肤的制备
[0054] 按体积比6/1/13的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的 戈舍瑞林粗肤lOg溶解于200血上述混合溶剂中，加入500血水进行稀释，得到质量体积浓 度为14. 3g/L的戈舍瑞林第一粗肤溶液。滴加质量百分浓度为30%的氨水溶液，调节戈舍 瑞林第一粗肤溶液的抑值至7. 0,得到戈舍瑞林第二粗肤溶液。
[0055] 向上述戈舍瑞林第二粗肤溶液中加入200mL10g/L的亚硫酸轴溶液，揽拌4min，颜 色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节抑值至6. 0,过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗 肤溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为18%? 38%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99%的戈舍瑞林精肤溶液， 戈舍瑞林精肤溶液中戈舍瑞林精肤的含量为4. 36g，收率为90. 8%。
[0056] 实施例3戈舍瑞林精肤的制备
[0057] 按体积比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的 戈舍瑞林粗肤lOg溶解于400血上述混合溶剂中，加入600血水进行稀释，得到质量体积浓 度为lOg/L的戈舍瑞林第一粗肤溶液。滴加质量百分浓度为10%的氨氧化轴溶液，调节戈 舍瑞林第一粗肤溶液的抑值至6. 0,得到戈舍瑞林第二粗肤溶液。
[0058] 向上述戈舍瑞林第二粗肤溶液中加入50mL10g/L的半脫氨酸溶液，揽拌5min，颜 色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节抑值至5. 5,过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗 肤溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为25%? 45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99. 1%的戈舍瑞林精肤溶 液，戈舍瑞林精肤溶液中戈舍瑞林精肤的含量为4. 22g，收率为87. 9%。
[0059] 实施例4戈舍瑞林精肤的制备
[0060] 按体积比3/1/1的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的 戈舍瑞林粗肤lOg溶解于500mL上述混合溶剂中，加入1500mL水进行稀释，得到质量体积 浓度为5g/L的戈舍瑞林第一粗肤溶液。滴加质量百分浓度为40%的氨氧化钟溶液，调节戈 舍瑞林第一粗肤溶液的抑值至8. 0,得到戈舍瑞林第二粗肤溶液。
[0061] 向上述戈舍瑞林第二粗肤溶液中加入300mL10g/L的硫化轴溶液，揽拌2min，颜色 消失。滴加醋酸调节抑值至5. 7,过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肤溶液上HPLC 系统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为18%?38%、40min的梯 度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99. 3%的戈舍瑞林精肤溶液，戈舍瑞林精肤 溶液中戈舍瑞林精肤的含量为4. 31g，收率为90. 1%。
[0062] 实施例5戈舍瑞林精肤的制备
[006引按体积比3/1/1的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的 戈舍瑞林粗肤lOg溶解于500mL上述混合溶剂中，加入lOOOmL水进行稀释，得到质量体积 浓度为6. 7g/L的戈舍瑞林第一粗肤溶液。滴加质量百分浓度为20%的氨水溶液，调节戈舍 瑞林第一粗肤溶液的抑值至6. 5,得到戈舍瑞林第二粗肤溶液。
[0064] 向上述戈舍瑞林第二粗肤溶液中加入lOOmLlOg/L的氨硫酸，揽拌4. 5min，颜色由 红色转为淡黄色。滴加醋酸调节pH值至6. 3,过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肤溶 液上HPLC系统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为25%?45%、 40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99. 2%的戈舍瑞林精肤溶液，戈 舍瑞林精肤溶液中戈舍瑞林精肤的含量为4. 26g，收率为90. 5%。
[0065] 实施例6戈舍瑞林精肤的制备
[0066] 按体积比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的 戈舍瑞林粗肤lOg溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓 度为lOg/L的戈舍瑞林第一粗肤溶液。滴加质量百分浓度为5%的氨氧化轴溶液，调节戈舍 瑞林第一粗肤溶液的抑值至7. 5,得到戈舍瑞林第二粗肤溶液。
[0067] 向上述戈舍瑞林第二粗肤溶液中加入250血lOg/L的氯化亚铁溶液，揽拌2. 5min， 颜色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节抑值至5. 3,过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二 粗肤溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为18%? 38%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99. 2%的戈舍瑞林精肤溶 液，戈舍瑞林精肤溶液中戈舍瑞林精肤的含量为4. 27g，收率为90. 5%。
[006引实施例7戈舍瑞林精肤的制备
[0069] 按体积比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的 戈舍瑞林粗肤lOg溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓 度为lOg/L的戈舍瑞林第一粗肤溶液。滴加质量百分浓度为25%的氨氧化钟溶液，调节戈 舍瑞林第一粗肤溶液的抑值至7. 8,得到戈舍瑞林第二粗肤溶液。
[0070] 向上述戈舍瑞林第二粗肤溶液中加入250血lOg/L的亚硫酸，揽拌2. 5min，颜色消 失。滴加醋酸调节抑值至4. 0,过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肤溶液上HPLC系 统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为25%?45%、40min的梯度 洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99. 1%的戈舍瑞林精肤溶液，戈舍瑞林精肤溶 液中戈舍瑞林精肤的含量为4. 38g，收率为90. 9%。
[0071] 对比例1戈舍瑞林精肤的制备
[0072] 取实施例1制得的戈舍瑞林粗肤lOg，利用活性炭吸附的方法对其进行纯化，具体 操作为：按体积比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，将戈舍瑞林粗肤溶 解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为lOg/L的戈舍 瑞林第一粗肤溶液。加入lOg活性炭揽拌化，过滤，取滤液上HPLC系统纯化，流动相A为 0. 1%TFA水溶液，流动相B为己膳，按照B%为25%?45%、40min的梯度洗脱分段收集样品， 检测纯度，即得到纯度为99. 1%的戈舍瑞林精肤溶液，戈舍瑞林精肤溶液中戈舍瑞林精肤 的含量为2. 07g，收率为43. 1〇/〇。
[0073] 对比例2戈舍瑞林精肤的制备
[0074] 取实施例1制得的戈舍瑞林粗肤lOg，利用HPLC纯化的方法对其进行纯化，具体操 作为：按体积比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶剂500ml，将戈舍瑞林粗肤溶解 于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为lOg/L的戈舍瑞林 第一粗肤溶液。将戈舍瑞林第一粗肤溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0. 1%TFA水溶液， 流动相B为己膳，按照B%为25%?45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，纯度在 99% W上的部分合并后加1. 5倍体积的水稀释后得到第二溶液，将第二溶液再用此条件纯 化一次得到第H溶液，将第H溶液用再进行HPLC系统纯化，流动相A为0. 2%醋酸馈水溶液 (氨水调抑值6. 5)，流动相B为己膳，按照B%为26%?46%、40min的梯度洗脱分段收集样 品，检测纯度，纯度在99% W上的部分合并后加1. 5倍体积的水稀释后得到第四溶液，将第 四溶液再用此条件纯化一次检测纯度，得到无任何颜色的溶液，即得到纯度为99. 3%的戈 舍瑞林精肤溶液，戈舍瑞林精肤溶液中戈舍瑞林精肤的含量为2. 39g，收率为49. 8%。
[0075] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： 获得粗肽，经前处理，得到第一粗肽溶液，经第一调节pH值至6. 0?8. 0,得到第二粗肽 溶液； 取所述第二粗肽溶液与还原剂混合，经第二调节pH值至4. 0?7. 0,经过滤、纯化，即 得； 所述还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原 性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫； 所述易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述易被氧化氨基酸为色氨酸。
3. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述多肽为戈舍瑞林。
4. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有巯基的有机酸为半胱氨酸 或还原型谷胱甘肽。
5. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有硫离子或硫氢离子的酸为 氢硫酸。
6. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有硫离子的无机盐为硫化钠。
7. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有硫氢离子的无机盐为硫氢 化钠。
8. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有还原性金属离子的无机盐 为含亚铁离子的无机盐或含亚铜离子的无机盐。
9. 根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述含亚铁离子的无机盐为硫酸亚 铁或氯化亚铁。
10. 根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述含亚铜离子的无机盐为硫酸亚 铜或氯化亚铜。
11. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有亚硫酸根的无机盐为亚硫 酸钠或亚硫酸钾。
12. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有亚硫酸氢根的无机盐为亚 硫酸氢钠或亚硫酸氢钾。
13. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述还原剂与所述粗肽的质量比为 (5 ?30) : 100。
14. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述混合的时间为2?5min。
【文档编号】C07K1/14GK104447942SQ201310416314
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】赵忠卫, 刘建, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司