棉花GhMATE1基因及其在改良棉花棕色纤维色泽中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种改良棉花纤维色泽基因技术，尤其涉及一种棉花基因及其构建的植物表达双元载体并在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。棉花GhMATE1基因，该基因的核苷酸序列如SEQ?ID：NO.1所示。一种由上述的基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ?ID：NO.2所示。本发明在前期克隆棉花GhTT12a基因（中国发明专利申请号：201310380270.5，申请日：2013-8-27）基础上，利用生物信息学分析及电子克隆的方法，克隆了一个新的含有MATE保守结构域的基因，但基因结构、剪切方式与GhTT12a基因完全不同，该基因与拟南芥种皮棕色素合成TT12基因核苷酸序列存在78%的序列同源性。
【专利说明】棉花GhMATEI基因及其在改良棉花棕色纤维色泽中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及ー种改良棉花纤维色泽基因技木，尤其涉及ー种棉花基因及其构建的植物表达双元载体并在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。
【背景技术】
[0002]天然彩色棉是ー种棉纤维具有自然色彩的特殊类型棉花，因其具有独特的自然色彩，在纺织及加工过程中无需漂染，对人类和环境无污染、穿着舒适，特别适合制作贴身衣物，是真正的“生态”、“环保”棉，从而引起国内外棉花育种家和纺织、服装エ业界的广泛关注，被誉为21世纪国际市场最具潜力的生态纺织品。中国彩色棉的研究与开发虽起步较迟，但发展很快。从1998年到2010年，中国天然彩色棉种植面积从每年I万亩扩大到毎年20多万亩，皮棉产量从每年800吨增加到每年2万多吨，10年间，彩棉种植面积和皮棉产量分别增长了 20倍和25倍。
[0003]彩色棉主要有棕色和绿色两大系列色彩，在彩色棉新品种选育方面，借助于常规育种技术，世界各国和我国一些育种单位纷纷开展研究并选育出ー批彩色棉新品种，在一定程度上改善了彩色棉的品质和性状。国内各研究单位选育出的彩色棉品种有:新彩棉系列品种(I号至20号)、中棉所51、浙彩棉2号、苏彩杂I号等品种。在这些选育的品种中，主要是棕色棉系列品种在纺织、服装エ业上得到了一定程度的应用。与白棉花相比，彩色棉品种依然存在着以下突出问题:纤维比强度不高，纤维长度偏短、衣分偏低，色素稳定性差，色彩単一，从而限制了棕色棉在纺织エ业中的应用。因此，创新彩色棉的纤维色泽并提高棕色棉的纤维强度、纤维长度是关系到我国纺织エ业和彩色棉产业发展兴衰成败的两个关键因素，也是广大棉花育种科研工作者面临的ー个重要课题。
[0004]在自然界 中，植物色素可分为光合色素(如叶绿素)和非光合色素(如类黄酮和类胡萝卜素)。研究表明，天然彩色棉纤维色素属于非光合色素，并且与棉纤维发育的特定时期有夫。国内外学者通过对棕色棉纤维色素形成过程及生化特征本质的研究，初歩认为存在以下2种推测:(1) Ryser、Xiao和詹等推测认为天然棕色棉纤维色素最初来源是位于液泡里的儿茶素衍化形成的原花色素(Proanthocyanidins),也称为缩合单宁(CondensedTannins)，并由缩合单宁接触空气氧化而形成具有棕色的醌类化合物；(2)赵等认为棕色棉纤维色素属于类黄酮化合物。而且，Xiao和詹的实验都证实棕色棉纤维色素的前体物质属于原花色素(缩合单宁)。詹等对棕色棉、白棉纤维和种皮中分布的色素含量进行了分析，研究认为:决定纤维颜色的主要原因是色素在纤维和种皮之间的分配比例。棉纤维是由种皮细胞分化而来，棉纤维的形成过程与种皮细胞的发育关系密切。拟南芥、棉花同属于双子叶植物，了解拟南芥种皮色素的合成代谢及调控途径对于掲示棉花种皮棕色素、棉纤维棕色素发育、纤维与色素的共沉积分子机理具有重要理论意义。
[0005]拟南芥种皮色素的合成代谢途径受到多种基因的调控，属于植物次生代谢。通过对拟南芥种皮Transparent testa系列突变体的研究表明:苯丙氨酸(Phenylpropanoid)是形成缩合单宁的最初氨基酸，它在一系列酶的催化作用下，最終形成无色的缩合单宁，再经空气氧化而呈现出种皮的棕色特征。其中，TT4编码查尔酮合酶(CHS，chalconesynthase), TT5编码查尔酮异构酶(CHI, chalcone isomerase)等作为结构基因编码类黄酮代谢途径中的酶，TTl，TT2，TTGl，TTG2，TT8等作为转录因子对结构基因的转录进行调控，TT12和TT19则编码色素转运蛋白参与类黄酮物质的转运与积累。在棕色棉纤维色素发育的相关研究中，国内外学者采用不同的分子生物学手段，从棉花中克隆了多个与拟南芥种皮色素合成代谢途径相关的同源基因，如GhCHS，GhCHI, GhF3H, GhDFR, GhANS, GhANR等，这些基因参与色素合成的蛋白质功能推测均基于同源序列分析及生物信息学的功能推测，究竟是否同时参与棉花种皮色素、纤维的色素合成代谢有待进一步证实。针对棉花棕色素研究中存在的上述重要理论课题，迫切需要以拟南芥种皮棕色素合成途径相关基因为参照，在棉花中克隆相关同源基因，并通过分子生物学和转基因技术加以功能验证，以明确这些相关基因是否同时参与棉花纤维棕色素的合成。上述问题的研究证实，将为我们进一步开展棕色棉纤维色素合成代谢途径的研究提供理论支持，并通过分子生物学手段改良棕色棉纤维品质、突破棉纤维色泽多样性研究具有重要的理论和实践意义。
[0006]近年来,随着基因克隆技术的快速进展,在差异显示(differential display)技术的基础上，发展了引物退火控制技术(Annealing Control Primer, ACP),也称为GeneFish ing技术。本发明利用Gene Fishing技术,在陆地棉棕色纤维浙彩棉2号和白色纤维棉浙棉11号纤维发育的特定阶段，筛选参与棉纤维棕色素代谢的特异表达基因，从而克隆了 GhTT12a基因，依据于生物信息学分析，初步明确了 GhTT12a基因与其它物种TT12基因的同源性和进化性关系。同进，利用荧光定量PCR方法分析了 GaTT12a基因在亚洲棉纤维及种皮发育中的表达特征，为进一步研究该基因在棉纤维棕色素代谢中参与的生物学功能奠定了一定研究基础。
[0007]在植物基 因功能研究中，转基因功能互补和基因沉默是揭示基因功能的有效技术手段。功能互补通过构建目的基因的正义表达载体转化该基因缺失突变体，从而验证该基因在植物体内执行的功能。对于同源基因功能的验证，也可以采用转化近似物种的突变体，从而快速完成同源基因的功能验证。对于棉花转基因周期较长、单一性状突变体库缺乏，采用转化拟南芥突变体进行同源基因或相似基因结构域的功能验证是一种比较快捷的方法。基因沉默是生物体的一种古老机制，它在生长和发育过程中通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。近年来，该技术作为一个重要的遗传操作工具在植物分子生物学研究和遗传改良方面得到广泛应用，多种植物基因沉默技术相继建立，包括反义RNA、dsRNAi (双链RNA干涉)和人工microRNA，特别是dsRNAi和microRNA在基因沉默的精确性和高效性等方面有了新突破。dsRNAi和microRNA在降解目标基因mRNA的效率上比反义RNA技术更高，能在低于反义RNA几个数量级的浓度下使目标基因表达降到极低的水平甚至功能完全丧失；而且，在转基因过程中，不存在插入位点随机性的问题，理论上任何基因都可被针对性的dsRNAi或m icroRNA特异性沉默。
【发明内容】
[0008]为了克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因并进而对棕色棉纤维品质进行改良，利用生物技术等手段实现棉花纤维色泽多样化，本发明的第一个目的是提供棉花GhMATEl基因和由该基因编码的蛋白质，并通过实验证明该基因既参与种皮棕色素的形成，又參与纤维棕色素的形成，有望在棕色棉育种上得以应用。本发明的第二个目的是提供含有上述的基因的表达载体和宿主细胞。本发明的第三个目的是提供上述的基因在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。
[0009]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
[0010]棉花GhMATEl基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
[0011]—种由上述的基因编码的蛋白质，该蛋白质的氣基酸序列如SEQ ID:N0.2所不。
[0012]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:[0013]棉花GhMATEl基因的植物正义互补双元表达载体，该表达载体以植物表达双元载体PFGC5941为骨架载体，选取含有GhMATEl基因完整蛋白质编码框的一段序列作为该基因的正义表达结构，并分别引入BamHI和XhoI酶切位点，从而构建了含有GhMATEl基因的正义表达载体。
[0014]ー种宿主细胞，该宿主细胞采用所述的棉花GhMATEl基因的植物正义互补双元表达载体转化。作为优选，所述的转化用的菌株采用农杆菌EHA105。进ー步，所述的宿主细胞采用渗透法转化拟南芥突变体ttl2。
[0015]棉花GhMATEl基因的双链RNA干涉表达载体，该表达载体以植物表达双元载体pCAMBia2301为骨架载体，选取植物表达双元载体pBI121的表达核结构，酶切、连接构建成载体PCAMBIA2301-121，再以SEQ ID:N0.1所示的棉花基因组中一段序列作为构建双元干涉载体的中间Loop环状结构，Loop环状结构的序列SEQ ID:N0.3所示，引物为上游引物:AGAAGCGAGATGAGGGATGT，下游引物:CATTT TCATGCGAAGGATTC。
[0016]ー种宿主细胞，该宿主细胞采用所述的棉花GhMATEl基因的双链RNA干涉表达载体转化。
[0017]为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案:
[0018]核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示的基因在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。
[0019]本发明在前期克隆棉花GhTT12a基因(中国发明专利申请号:2013103802705，申请日:2013-8-27)基础上，利用生物信息学分析及电子克隆的方法，克隆了一个新的含有MATE保守结构域的基因，但基因结构、剪切方式与GhTT12a基因完全不同，该基因与拟南芥种皮棕色素合成TT12基因核苷酸序列存在78%的序列同源性。随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因，命名为GhMATEl，该基因编码497个氨基酸残基，分子量约53.6KD，属于MATE超基因家族中的ー个成员。利用荧光定量PCR分析了 GhMATEl基因在发育不同阶段纤維、种皮的表达特征，结果表明=GhMATEl基因在二倍体棉和四倍体棉的棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达，在白色棉纤维中几乎不表达，说明该基因既參与种皮棕色素的形成，又參与纤维棕色素的形成。针对棉花GhMATEl基因的功能分析，构建植物正义双元表达载体启动子35S::GhTT12a::Nos终止子表达核结构互补拟南芥突变体ttl2，分子鉴定及转基因生理学分析均表明该基因能使拟南芥突变体ttl2恢复野生型表型，从而证明该基因參与种皮棕色素的合成；根据该基因的分子结构及保守结构域特征，构建2种不同类型的双链RNA干涉载体(dsRNAi，载体序列见附件)，通过损伤的花粉管通道法转化棕色棉花，对棕色棉30个转基因株系Ttl代及T1代的分子鉴定及转基因棉花生理学指标分析均表明该基因均能不同程度降低棉花棕色纤维的色泽，从而证明该基因參与棉花纤维棕色素的代谢。在研究过程中，利用GhTT12a基因并通过生物技术方法获得不同深浅程度的棕色纤维棉种质资源10份，创新的这些种质材料有望在棕色棉纤维品质改良上得以应用。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为棉花GhMATEl基因的内含子和外显子示意图。
[0021]图2为棉花GhMATEl基因与其他物种TT12同源基因的氨基酸序列比较图。
[0022]图3为棉花GhMATEl基因的核苷酸序列系统进化分析图。
[0023]图4为GhMATEl基因在二倍体、四倍体棕色、白色棉纤维不同发育时期的表达水平图。
[0024]图5为含有GhMATEl基因植物正义表达载体的构建图。
[0025]图6、图7为含有GhMATEl基因2个不同结构双元干涉载体的构建流程图。
[0026]图8为棉花GhMATEl基因转拟南芥ttl2突变体所获得的阳性株的PCR扩增鉴定图；M:DNA marker DL2000, 1:含有棉花 GhMATEl 基因的阳性质粒 pFGC5941_GhMATEl ;2、3、
4、5、6:喷洒Basta具有抗性的拟南芥单株；7:野生型拟南芥植株。
[0027]图9为转棉花GhMATEl基因在互补拟南芥ttl2突变体阳性株根、茎、叶、角果和花中的表达水平图。
[0028]图10为转棉花GhMATEl基因在互补拟南芥ttl2突变体阳性株中的含量图。
[0029]图11为棉花GhMA TEl基因干涉载体中部分片段在转深棕色纤维棉中的PCR扩增鉴定图；M:DNA marker DL2000, 1:含有棉花GhMATEl基因干涉载体的阳性质粒PFGC5941-GhMATElRA ;2、3、4、5、6、7:喷洒千分之四卡钠霉素具有抗性的转基因棉单株；8:野生型棉T586单株。图12为棉花GhMATEl干涉深棕色棉纤维的应用图；ZM11:未转基因白色棉浙棉11 ；T586:深棕色棉T586品系(转基因亲本株);TO-1:深棕色棉干涉株I ;T0_2:深棕色棉干涉株2 ;T0-3:深棕色棉干涉株3 ；T0-4:深棕色棉干涉株4 ；T0-5:深棕色棉干涉株5 ;T0-6:深棕色棉干渉株6。
【具体实施方式】
[0030]1.材料与方法
[0031]1.1植物材料和生长条件
[0032]陆地棉棕色纤维浙彩棉2号、白色纤维棉花浙棉11、二倍体棕色纤维棉慈溪紫棉和白色纤维棉余姚中棉均由浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所经济作物研究室提供并于2011年5月初直播播种于本院杭州院本部实验田。在棉花开花后的第9d (开花后，DPA，Day Post Anthesis)、12d、15d、18d、21d和24d，分别选取正在发育的棉纤维组织和种皮组织开展相关研究。
[0033]1.2实验方法
[0034]1.2.1棉花基因组DNA和棉纤维、种皮组织总RNA的提取
[0035]棉花基因组DNA提取采用CTAB法(Li et al.，2001)。采用多酚、多糖类植物RNA提取试剂盒提供的方法提取棉花纤维组织、种皮组织总RNA，试剂盒购自北京百泰克Bioteck生物技术有限公司。
[0036]1.2.2利用生物信息学分析筛选并克隆棉花GhMATEl基因
[0037]根据已经克隆的棉花棕色纤维色素GhTT12a基因和拟南芥种皮棕色素AtTT12基因的蛋白质保守结构域序列，搜索棉花ESTs数据库(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/),共选出 3 条序列(GenBank 登录号为 DT563323.1，DT568479.1，ES823453.1)。再以这3条EST序列搜索ESTs数据库并拼接，最终获得一条序列，该序列含有一个完整开放阅读框(ORF, Opening Reading Frame ),根据该序列ORF预测的蛋白质与拟南芥TT12蛋白存在约82%的同源性。依据与ORF的序列特征，设计I对PCR扩增的特异引物(P1:TGTAAAGCATGGGTTCAGAGG 和 P2:ACATCTCAAGTGCCATCTACCT)。[0038]分别以浙彩棉2号发育MDPA的棉纤维组织总RNA反转录获得的cDNA第一链为模板，结合PCR技术，扩增条件为:94°C预变性4min ;94°C变性30s，56°C退火30s，68°C延伸2min ;30个PCR循环，最后68°C延伸lOmin，15°C保温。扩增体系为50ul:2X KOD扩增反应液，IOul dNTP，2ul Pl引物，2ul P2引物，Iul KOD FX，5ul转录后产物，5ul超纯水；再将PCR产物加A，加A反应体系为IOul:5ul连接缓冲液，Iul pTA2载体，Iul连接酶，Iul加A连接液，2ul KOD扩增产物。转化大肠杆菌感受态TG1，筛选阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。采用MBI公司的反转录试剂盒合成cDNA第一链，利用KOD FX酶扩增获得推测的GhMATEl基因(Τ0Υ0Β0，上海，东洋纺生物科技有限公司)。本实验所涉及到的引物均合成自上海生工生物技术工程服务有限公司。[0039]1.2.3引物设计和生物信息学分析[0040]研究中涉及到的引物设计利用Primer Premier5.0[0041](http: //www.premierbiosoft.com/index, html)完成，利用 DNAman6.0 软件[0042](http://www.lynnon.com)对氨基酸序列进行同源性比较和核酸系统进化树分析，蛋白质保守结构域的推测采用Genbank数据库中的Blast在线分析系统[0043](http://blast.ncb1.nlm.nih.gov),具体的结构域位置分析利用SMART在线软件分析[0044](http://smart.embl~heidelberg.de)。[0045]1.2.4棉花GhMATEl基因的结构特征分析[0046]连接后的阳性克隆经测序后，分4段设计引物，扩增其对应的基因组DNA片段，经加A，切胶回收，克隆至pTA2载体，经测序拼接获得该基因的DNA序列。实验中所用的酶和载体同上。[0047]1.2.5利用荧光定量PCR分析二倍体棉和四倍棉中GhMATEl基因的表达特征[0048]根据棉花不同发育时期的纤维组织、种皮组织的cDNA，用实时荧光定量RT-PCR技术检测GhTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮组织中的相对表达水平。棉花GBQ7基因用作荧光定量PCR的内参基因(扩增引物)(Tu et al.，2007)，GhTT12a基因的特异性扩增引物见表2。实验操作均参考试剂盒说明书(Τ0Υ0Β0 SYBR Green Supermixture，上海，东洋纺生物科技有限公司)，荧光定量PCR的温度循环:50°C，Imin ;94°C预变性3min ;94°C变性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸45s ;共计30个PCR循环。[0049]表2荧光定量PCR中所用的引物及序列[0050]
【权利要求】
1.棉花GhMATEl基因，其特征在于:该基因的核苷酸序列如SEQID:N0.1所示。
2.权利要求1所述的基因的植物正义互补双元表达载体，其特征在于:该表达载体以植物表达双元载体PFGC5941为骨架载体，选取含有GhMATEl基因完整蛋白质编码框的一段序列作为该基因的正义表达结构，并分别引入BamHI和XhoI酶切位点，从而构建了含有GhMATEl基因的正义表达载体。
3.一种宿主细胞，其特征在于:该宿主细胞采用权利要求2所述的表达载体转化。
4.根据权利要求2所述的一种宿主细胞，其特征在于:转化用的菌株采用农杆菌EHA105。
5.权利要求1所述的基因的双链RNA干涉表达载体，其特征在于:该表达载体以植物表达双元载体pCAMBia2301为骨架载体，选取植物表达双元载体pBI121的表达核结构，酶切、连接构建成载体PCAMBIA2301-121，再以SEQ ID:N0.1所示的棉花基因组中一段序列作为构建双元干涉载体的中间Loop环状结构，Loop环状结构的序列SEQ ID:N0.3所示，引物为上游引物:AGAAGCGAGATGAGGGATGT，下游引物:CAITT TCATGCGAAGGATTC。
6.一种宿主细胞，其特征在于:该宿主细胞采用权利要求5所述的表达载体转化。
7.—种蛋白质，其特征在于该蛋白质的氣基酸序列如SEQ ID:N0.2所不。
8.权利要求1所 述的基因在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK103602687SQ201310557520
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】李付振, 祝水金, 邱新棉, 吴学龙, 王美兴 申请人:浙江省农业科学院, 浙江大学