干扰素α1b突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白的制作方法

干扰素α1b突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及干扰素α1b突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白。所述的干扰素α1b突变体是将干扰素α1b氨基酸序列中从N端计的第162-166位中的一个精氨酸突变为丝氨酸。所述的干扰素α1b突变体与人血清白蛋白的融合蛋白中所述的干扰素α1b突变体位于所述的融合蛋白的N端，所述的人血清白蛋白位于所述的融合蛋白的C端；或者所述的人血清白蛋白位于所述的融合蛋白的N端，所述的干扰素α1b突变体位于所述的融合蛋白的C端。本发明的干扰素α1b突变体比较干扰素α1b，干扰素α1b突变体与人血清白蛋白的融合蛋白比较干扰素α1b与人血清白蛋白的融合蛋白，均具有更高的生物学活性、更好的稳定性与更可靠的安全性。
【专利说明】干扰素a 1b突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白
【技术领域】
[0001]本发明一般的涉及干扰素α突变体及其融合蛋白，特别的涉及干扰素a Ib突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白。
【背景技术】
[0002]干扰素(Interferon，IFN)是一种最初由动物机体产生，具有广谱抗病毒、抗增殖与免疫调节作用的细胞因子类蛋白质药物，根据其产生部位与作用机理不同可以分为α、β、Y、λ等大的类型，而每种大的类型又可分为若干小的亚型，同一大的类型中不同的亚型间在一级结构上差异很小，在二级以上高级结构上非常接近。在几种大的类型中，α型是应用最广的一种，目前临床应用的此型干扰素主要包括干扰素a 2a、干扰素ci2b、干扰素a lb、复合干扰素等。
[0003]与其他亚型的α型干扰素，如干扰素a 2a、干扰素a 2b、复合干扰素相比，干扰素alb是唯一完全获取自健康中国人外周血的α型干扰素，因此是在临床上最适合中国人使用的α型干扰素。但是，干扰素a Ib与干扰素a 2a、干扰素a 2b、复合干扰素等其他α型干扰素相比，也存在稳定性较低与活性较低的缺点，尤其是稳定性方面的缺点更为突出；而包括干扰素alb在内的干扰素α则都存在半衰期较短的缺点。以上这些缺点都制约着干扰素a Ib在临床上的进一步推广应用。
[0004]众所周知，定点突变是改善蛋白质性质，尤其是安全性、有效性、半衰期、稳定性、溶解性的一种重要技术手段，而现有技术中也有一些通过定点突变技术改善干扰素α，尤其是干扰素a Ib的性质的报道。例如侯云德、王伟、李燕发表在《自然科学进展-国家重点实验室通讯》1991年第I期第71-73页上的文章“人a I型干扰素突变体(HuIFN-a 1、86D)具有较高的生物学活性和热稳定性”公开了一种a I型干扰素的突变体，其是将a I型干扰素氨基酸序列中第86位的半胱氨酸(Cys)突变为天冬氨酸(Asp)，结果突变后的干扰素较突变前的干扰素生物学活性与热稳定性均有明显提高。又如本 申请人:的中国在先申请201010189352.8公开了一种干扰素a Ib的突变体，其是将干扰素a Ib氨基酸序列中第31位的甲硫氨酸(Met)突变为赖氨酸(Lys);或在将干扰素a Ib氨基酸序列中第31位的甲硫氨酸(Met)突变为赖氨酸(Lys)的基础上进一步将第26位的脯氨酸(Pro)突变为亮氨酸(Leu)，第27位的的丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe)。结果前一种突变体体外抗病毒活性较未突变的干扰素a Ib有74%的提高，后一种突变体体外抗病毒活性是未突变的干扰素a Ib的5.18倍。但是定点突变改善蛋白质性质技术的缺点是突变位点较难设计，突变后蛋白质的性质较难预测或预测准确性差，而突变后的蛋白质在提高或出现某一或某些方面的性质同时往往会降低乃至丧失某一或某些方面的性质。
[0005]此外，对于蛋白质半衰期性质的提高，根据现有技术的报道，还可以通过融合蛋白技术、化学修饰技术(包括聚乙二醇修饰、糖基修饰等)与制剂技术实现。其中融合蛋白技术是一种目前热度很高的技术，最常见的是将目标蛋白与人血清白蛋白融合或与人抗体的Fe段融合。由于人血 清白蛋白与人抗体的Fe段都是人体内源性蛋白，分子量均很大，免疫原性均很低，稳定性与溶解性均很好，所以目标蛋白与它们融合后均可以降低免疫原性，提高稳定性与溶解性，并明显延长半衰期。例如中国专利申请200410042814.8公开了一种干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，其是将人血清白蛋白与干扰素直接连接，由此得到的融合蛋白较未融合的干扰素体内半衰期有3-10倍的延长。经本 申请人:进一步的试验验证表明其中的人血清白蛋白与干扰素a Ib的融合蛋白在没有连接肽连接的情况下，无论人血清白蛋白与干扰素a Ib何者位于融合蛋白的N端，得到的融合蛋白的体外抗病毒活性均不足未融合的干扰素a Ib的1%，融合蛋白在室温25°C放置6月后体外抗病毒活性保留不足80%。又如本 申请人:的中国在先申请201010189355.1公开了一种干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白，其是将人血清白蛋白与干扰素a Ib自N端至C端通过连接肽连接。试验结果表明该融合蛋白的体外抗病毒活性是干扰素a Ib的1.03%，大鼠药代半衰期是干扰素a Ib的10倍以上。但是，融合蛋白技术，尤其是目标蛋白与人血清白蛋白融合技术的主要缺点是融合后蛋白质的生物学活性下降明显，且体内半衰期的延长也有待进一步改善。

【发明内容】

[0006]本发明的首要目的是提供一种干扰素a Ib突变体，以在首要提高干扰素a Ib稳定性，次要提高干扰素a Ib的生物学活性的基础上保持或进一步提高干扰素a Ib的安全性。
[0007]为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供干扰素α Ib突变体，其是将SEQID N0.3所示氨基酸序列的干扰素a Ib中从N端计的第162-166位中的一个精氨酸(Arg)突变为丝氨酸(Ser)。
[0008]本发明设计将干扰素a Ib氨基酸序列中从N端计的第162-166位中的一个精氨酸突变为丝氨酸，是基于突变前后分子计算机空间结构预测结果、已知的干扰素α与受体结合原理及己知的干扰素a2a与干扰素a 2b的空间结构，而该设计对本发明目的的实现得到了实验结果的确证。
[0009]为了获得干扰素α Ib突变体，需要先后进行表达干扰素a Ib突变体分子的基因工程菌或基因工程细胞的构建、基因工程菌或基因工程细胞的发酵和发酵产物的纯化和检测，优选进行表达干扰素a Ib突变体分子的大肠杆菌工程菌的构建、发酵和发酵产物的纯化、检测。
[0010]在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达干扰素a Ib突变体的基因，采用的方法包括但不局限于全基因合成、PCR法等，优选本领域技术人员公知的PCR法，并更加优选本领域人员公知的重叠延伸PCR法。在大量获得表达干扰素a Ib突变体的基因后选择适宜的载体，用本领域技术人员公知的构建重组载体的方法将表达干扰素a Ib突变体的基因转入所述载体从而构建重组载体。所述载体和重组载体优选质粒载体，该质粒载体应具有一组或多组双酶的各自单一的酶切位点，并适宜被转入对应的宿主菌或宿主细胞。
[0011]然后利用电穿孔法、PEG法、氯化锂法、原生质体转化法等本领域技术人员公知的方法将重组载体转入宿主菌或宿主细胞构建表达干扰素a Ib突变体的基因工程菌或基因工程细胞。所述的宿主菌或宿主细胞优选大肠杆菌、毕赤酵母和CHO细胞，并更优选大肠杆菌。[0012]工程菌或工程细胞的发酵应选择适宜其生长的培养基组成、pH、温度、通气量、培养时间与补料操作等条件。对于大肠杆菌工程菌的发酵，优选LB培养基，培养过程中的温度控制在30-37°C之间，pH控制在6.0-8.0之间(必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种各种有机氮源，优选氨水)，通气量应满足菌体或细胞的生长需要及产物表达合成的需要，培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的情况下培养时间为6-24小时之间。
[0013]干扰素a Ib突变体蛋白如果表达在工程菌或工程细胞内，需要对发酵培养收获的菌体或细胞进行破碎处理以释放出其中的干扰素alb突变体蛋白。而对于大肠杆菌等原核的工程菌，更需要破碎处理以释放出以包涵体形式表达的干扰素a 1b突变体蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超声波破碎、球磨机破碎、溶菌酶处理等。
[0014]对于以包涵体形式表达的干扰素a 1b突变体蛋白，需要对破碎处理得到的粗包涵体进行洗涤操作以尽可能除去其中含有的少量菌体蛋白、膜蛋白等杂蛋白。洗涤过程中使用的缓冲液包括但不局限于Tris-HCl、PB，洗涤过程的pH值应控制在7.0-9.0之间。为了溶解较难溶解的疏水蛋白质杂质，可在洗涤缓冲液中加入一定量的盐，常用的为NaCl，浓度范围在0.05-0.5mol/L之间；为了溶解疏水性更强的膜蛋白，可在洗涤缓冲液中加入一定量的表面活性剂，常用的此类表面活性剂包括但不限于吐温-80、十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-100，浓度在 0.01-5%之间。
[0015]由于在破碎过程中菌体或细胞会释放出一些蛋白水解酶，从而有可能降解干扰素a Ib突变体，因此需要在破碎过程中及破碎后的洗涤过程中加入一些物质来抑制这些蛋白水解酶的活性。最直接的方法是加入蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂，间接的方法也可加入金属离子螯合剂，如EDTA，因为金属离子螯合剂可以螯合这些蛋白水解酶发挥水解作用所必须依靠的金属离子。
[0016]洗涤得到的包涵体变性溶解可以使用7-10mol/L的尿素或5_8mol/L的盐酸胍，必要时还需要加入巯基试剂以提高变性剂的溶解效力，所述的巯基试剂包括但不局限于巯基乙醇、二硫苏糖醇。溶解所采用的包涵体/变性剂的质量/体积比(g/ml)可以在1:3到1:50之间，优选的在1:5到1: 30之间，最佳的在1:7到1:20之间。变性溶解时间应该在2小时以上。
[0017]包涵体复性可以采用稀释复性法、透析复性法或柱上复性法。稀释复性法是通过一步或多步稀释用复性液将变性剂的浓度稀释到0.5mol/L以下，以使蛋白质分子在摆脱变性剂影响的情况下逐渐复性；透析复性法是用10倍以上体积的复性液对变性液进行透析以使变性剂的浓度降低到0.5mol/L以下，同样起到复性的作用；柱上复性法是将变性液直接上离子交换、疏水等吸附色谱柱，然后用含不断降低变性剂浓度的洗脱溶液进行梯度洗脱以同时实现目标蛋白的分离纯化与复性。
[0018]复性液的基本组成是pH在7.0-10.0之间的缓冲溶液，以保证复性所需的基本碱性环境，可以满足这种要求的缓冲溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸钠缓冲液。为了防止复性过程中复性速度过快形成二硫键错配，需要在复性液中加入一些氧化型和还原型巯基试剂对物质以形成氧化还原平衡体系，如加入氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽以形成氧化还原平衡体系。同时为了防止复性速度过快造成蛋白质折叠不完全、二硫键错配，可以在上述基本组成的复性液中添加一些其它物质，如精氨酸、EDTA、金属离子及各种分子伴侣物质等。这些物质的选择及加量在现有技术中有很多报道，这里不再赘述。
[0019]上述稀释复性法和透析复性法得到的复性液，以及通过破碎直接得到的含有可溶性形式表达的干扰素a Ib突变体的离心上清，以及以可溶性形式表达的干扰素a Ib突变体的发酵培养液离心上清，都需进行进一步的色谱或层析(chromatography)分离纯化。利用干扰素a Ib突变体分子与杂质分子在电荷性质、疏水性质、亲和性质、分子量大小性质上的差异可以先后选择离子交换色谱(或离子交换层析，ion exchange chromatography,IEC)、疏水色谱(或疏水层析，hydrophobic interaction chromatography, HIC)、亲和色谱(或亲和层析，affinity chromatography, AF)、凝胶分离色谱(或凝胶分离层析，gelfiltration chromatography, GFC)中的一种或几种的组合进行纯化。为了更好的达到分离作用，在色谱或层析分离纯化前可对待分离液进行浓缩处理，可以选择的方法包括但不局限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、聚乙二醇浓缩、超滤及色谱处理等。
[0020]色谱或层析分离纯化获得的干扰素a Ib突变体分子可用本领域技术人员公知的SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法或高效液相色谱(HPLC)法确定纯度；用质谱法确定分子量；用《中华人民共和国药典2010版(三部)》附录部分规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”分别确定干扰素体外抗病毒活性(干扰素生物学活性)以及蛋白质浓度，并以测定得到的干扰素体外抗病毒活性除以蛋白质浓度确定干扰素a Ib突变体的比活性。
[0021]其中高效液相色谱纯度检测法可以采用反相高效液相色谱法或分子排阻高效液相色谱法，但优选分子排阻高效液相色谱法，因为此种方法更为方便、准确、快捷。采用分子排阻高效液相色谱法时要求色谱柱的理论板数大于10000，上样量在5-100 μ I之间，优选10-50 μ I之间，色谱分离时 间为主峰出峰时间的3倍。
[0022]稳定性考察是将色谱或层析分离纯化得到的干扰素a Ib突变体溶液在20_45°C的环境下长期存放3-6个月，在此过程中定期取样观察外观的变化，并检测纯度、活性等主要质量控制指标的变化。
[0023]色谱或层析分离纯化获得的干扰素a Ib突变体分子还需进行动物药代动力学试验评价与动物急性毒性试验评价。
[0024]在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素α Ib突变体是将干扰素a Ib氨基酸序列中从N端计的第163位的精氨酸突变为丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素a Ib突变体是将干扰素a Ib氨基酸序列中从N端计的第164位的精氨酸突变为丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0026]本发明的第二个目的是提供编码如上所述的干扰素a Ib突变体的核酸分子，该核酸分子优选采用表达工程菌(即宿主菌)或表达细胞(即宿主细胞)的偏爱密码子。
[0027]本发明的第三个目的是提供如上所述的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，以在解决干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白生物学活性低、半衰期较干扰素a Ib延长有限的技术问题的基础上保持或进一步提高融合蛋白的安全性。
[0028]为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供如上所述的干扰素α Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，其中所述的干扰素a Ib突变体位于所述的融合蛋白的N端，所述的人血清白蛋白位于所述的融合蛋白的C端；或者所述的人血清白蛋白位于所述的融合蛋白的N端，所述的干扰素a Ib突变体位于所述的融合蛋白的C端。[0029] 为了获得干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，需要先后进行表达干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白分子的基因工程菌或基因工程细胞的构建、基因工程菌或基因工程细胞的发酵和发酵产物的纯化、检测。
[0030]在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，可以进行原核表达系统基因工程菌或基因工程细胞的构建，也可以进行真核表达系统基因工程菌或基因工程细胞的构建。但是由于要表达的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的分子量较大，优选采用真核表达系统，在真核表达系统中又优先采用酵母、CHO表达系统，并更优选采用毕赤酵母、汉逊酵母等真核表达系统。干扰素alb突变体与人血清白蛋白的融合蛋白在原核表达系统中将以包涵体的形式表达，而在真核表达系统中将以胞内可溶或分泌的形式表达。
[0031]无论采用何种表达系统表达干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，首先都需要获得并扩增表达该融合蛋白分子的基因，采用的方法包括但不局限于全基因合成、PCR法等。在大量获得表达该融合蛋白分子的基因后应选择适宜的载体，用本领域技术人员公知的构建重组载体的方法将表达该融合蛋白分子的基因转入所述载体从而构建重组载体。所述载体和重组载体优选质粒载体，应适宜被转入对应的宿主菌或宿主细胞。当选择的表达系统为真核表达系统时，还需进一步选择分泌表达或胞内可溶性表达的载体。当用毕赤酵母作为表达系统时前者包括但不局限于口1111^-31、？？109、？？1091(、？？102(1、pGAPZ a、pYAM75P,后者包括但不局限于 pHIL_D2、pA0815、pPIC3K、pPIC3.5K、pPICZ、pHW010、pGAPZ。
[0032]典型的重组载体中含有启动子、多克隆位点(MCS)和终止子。对于毕赤酵母表达系统，启动子可选择的有PAOXl (醇氧化酶I启动子)、PA0X2 (醇氧化酶2启动子)、PGAP (三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)、PFLDl (甲醛脱氢酶启动子)、PICL (柠檬酸裂合酶启动子)，优选PA0X1。由于PAOXl的甲醇诱导性很强，因而可用它的控制实现外源基因的高效表达；但当表达产物为胞内可溶性表达时，选择PA0X2也有一定的优势(PA0X1与PA0X2的同源性大于92%)，因为虽然PA0X2的甲醇诱导性明显弱于PA0X1，和后者相比属于弱启动子，但利用它诱导表达得到的蛋白产物中AOX较少而目的蛋白量较多，便于之后的纯化。而对于分泌表达型重组载体，在构建过程中还需在启动子后加入一段编码信号肽的序列，该信号肽序列优选宿主菌或宿主细胞自身的信号肽序列。此外，在重组载体中还优选含有筛选标记，以便于筛选高拷贝稳定表达的工程菌。对于毕赤酵母表达系统，可选择的筛选标记包括但不局限于组氨酸脱氢酶基因营养缺陷型标记(His4)、shble (用zeocin筛选)、kan (用G418筛选)、adel、arg4、ura3,并优选 His4。
[0033]然后利用电穿孔法、PEG法、氯化锂法、原生质体转化法等本领域技术人员公知的方法将重组载体转入宿主菌或宿主细胞构建表达干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白分子的基因工程菌或基因工程细胞。对于毕赤酵母表达系统来说，如本领域技术人员所知，重组载体转入后将与宿主菌的核染色体发生交换整合，整合的方式有三种:第一种是双位点互换整合，发生在重组载体中的启动子基因区(如PAOXl)和染色体对应的启动子基因区，以及转录终止基因区；第二种是启动子单位点互换整合，发生在染色体和重组载体的启动子基因区(如ΡΑ0Χ1)，外源基因的表达单位插入在染色体启动子基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入到基因组中；第三种是筛选标记单位点置换整合，发生在染色体筛选标记基因区(如His4)和重组质粒的筛选标记基因区，使得一个或多个表达单位插入在筛选标记基因区。
[0034]工程菌或工程细胞的发酵应选择适宜其生长的培养基组成、pH、温度、通气量、培养时间与补料操作等条件。原核表达系统工程菌或工程细胞，尤其是大肠杆菌工程菌的发酵条件在前文干扰素a Ib突变体的发酵条件部分已有详细论述，在此不再赘述。而对于真核表达系统工程菌的发酵条件，尤其是毕赤酵母工程菌的发酵条件，常用的诱导表达前培养基包括但不局限于LB培养基、YPD培养基、YPDS+Zeocin培养基、MGY培养基、MGYH培养基、BMG培养基、BMGY培养基、BSM培养基、RD培养基、RDH培养基、MD培养基、MDH培养基、SOC培养基、MM培养基；诱导表达后的培养基中需含有一定浓度的甲醇以全部替代或部分替代诱导表达前培养基中的碳源物质，由于甲醇浓度过低不利于产物的诱导表达，而甲醇浓度过高时会对产物的诱导表达形成抑制，所以培养基中甲醇的浓度优选在0.l-10g/L之间，并更优选在0.5-5g/L之间；菌体生长过程中的温度一般应控制在28-30°C之间，不可超过32°C，而诱导表达时的温度一般应低于菌体生长过程中的温度，在20-28°C之间；培养过程中的pH应控制在3.0-7.0之间(必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种各种有机氮源，优选氨水)，且菌体生长和诱导表达时适宜的pH往往有所不同；通气量应满足菌体生长需要及产物表达合成的需要，一般应控制在20-30%之间；培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的情况下培养时间为12-180小时之间。
[0035]干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白如果表达在工程菌或工程细胞内，需要对发酵培养收获的菌体或细胞进行破碎处理以释放出其中的融合蛋白。而当用原核表达系统表达该融合蛋 白时，得到的以包涵体形式表达的该融合蛋白需进行破碎、变复性等处理，处理方法如前文干扰素a Ib突变体的纯化部分所述。而如果融合蛋白为分泌型表达，则需要对发酵液进行固液分离后的浓缩处理，浓缩处理方法同样如前文干扰素a Ib突变体的纯化部分所述。
[0036]然后进行色谱或层析分离纯化。利用干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白分子与杂质分子在电荷性质、疏水性质、亲和性质、分子量大小性质上的差异可以先后选择离子交换色谱(或离子交换层析)、疏水色谱(或疏水层析)、亲和色谱(或亲和层析)、凝胶分离色谱(或凝胶分离层析)中的一种或几种的组合进行纯化。
[0037]色谱或层析分离纯化获得的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白纯品可如前文干扰素a Ib突变体的检测部分所述的项目与方法测定纯度、分子量、活性、蛋白质浓度、比活性，并考察稳定性，进行动物药代动力学试验评价与动物急性毒性试验评价。
[0038]在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白无需连接肽直接连接，由此形成的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.11 所示。
[0039]在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白通过适宜的连接肽连接。该连接肽的长度优选2-100个氨基酸，更优选5-50个氨基酸，并最优选15-40个氨基酸。在干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白之间加入连接肽的目的是尽可能的减小人血清白蛋白大分子对干扰素空间结构形成的位阻。
[0040]在一种优选的实施方案中，本发明的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白通过连接肽连接，所述的连接肽的氨基酸序列为DDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGS,由此形成融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10或SEQID N0.12 所示。
[0041]本发明的第四个目的是提供上述干扰素α Ib突变体或干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的药物组合物。
[0042]在基础的实施方案中，所述的组合物中含有治疗有效量且安全量的所述的干扰素a Ib突变体或所述的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，以及适宜量的可药用载体。
[0043]本发明的最后一个目的是提供上述干扰素α Ib突变体或干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。 [0044]本发明的干扰素a Ib突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白与未突变的干扰素a Ib具有相同的目标适应症，由于干扰素对病毒复制的广泛抑制作用，所以它们对几乎所有的病毒感染性疾病都有疗效，尤其是在治疗乙型肝炎和/或丙型肝炎方面较干扰素a Ib分子具有相当或更好的体内或体外药效。
[0045]本发明中使用的术语“干扰素a lb”包括人体或动物体在外界病原性物质刺激下由白细胞产生的天然干扰素a Ib分子，也包括通过基因工程方法选择适宜的表达载体表达的与上述天然分子序列完全相同的重组干扰素a Ib分子。
【具体实施方式】
[0046]通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。实施例中涉及的百分比浓度如无特别指出，均为质量体积比浓度。
[0047]实施例1:表达干扰素a lbl64位点丝氨酸突变体的工程菌的构建与表达序列的确认
[0048]提取干扰素a Ib的质粒pET23b/IFN质粒作为模板，反应体系引物为:
[0049]Pl:5’-TGCAGGAACGTCTGCGTAGTAAAGAATAACGAATTC-3’，
[0050]P2:5’-GAATTCGTTATTCTTTACTACGCAGACGTTCCTGCA-3’ ，
[0051]反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性 lmin，53°C退火 lmin，72°C延伸 90s，30个循环，72 °C延伸5min。
[0052]PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段。
[0053]将pET_23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切，经琼脂糖电泳回收并和上述PCR产物经琼脂糖电泳回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为:2XRapid buffer4_5yl、T4DNA Lagasel μ 1、目的片段1-2 μ 1、载体3 μ 1，4°C过夜连接。
[0054]制备大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37 °C过夜培养。
[0055]挑取单菌落作为模板，用上述设计的引物P1、P2进行扩增，产物经琼脂糖电泳检测，阳性克隆在720bp左右出现特异条带；取阳性克隆小量培养，提取质粒用Nde I/EcoR I双酶切。分别在3kb左右和500bp左右出现特异性的条带,与预计情况相符，初步说明重组质粒构建成功。以T7通用引物对ABI377测序仪进行全自动序列测定，进一步确认表达序列正确。[0056]实施例2:干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体的发酵、纯化与检测
[0057]用同实施例1原理相同的方法构建得到表达干扰素α lbl63位点丝氨酸突变体的大肠杆菌工程菌，然后经涂平板活化后挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中(每升用蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g配制，调节pH为7.0)，37°C、210转/分摇床摇瓶培养至OD6tltol为0.6-0.8。然后以5%的体积接种量接种于50L的LB培养基中在80L发酵罐中进行发酵培养(每升含0.1%的氨苄青霉素)，培养温度为37°C，培养过程中用氨水调节pH在
6.5-7.5之间，用转速控制溶氧值在4-8%之间。在OD6tltol达到1.0后按质量体积比1:5000的比例加入IPTGlOg继续诱导培养3小时，诱导培养温度为37°C，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后放罐，室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, pH8.0)洗涤离心两次以除去发酵液中的主要杂质。
[0058]取上述处理得到的菌体40g以1:15的质量体积比加入600ml TE缓冲液置超声波破碎仪上进行超声破碎，条件为打5秒，歇5秒，共60分钟，所得破碎液室温6000转/分离心20分钟弃上清，沉淀先后以1:10的质量体积比加入TE缓冲液洗涤离心两次，得分离包涵体。
[0059]所得IOg包涵体以1:10的质量体积比加入100ml7mol/L盐酸胍后在适度搅拌条件下变性处理2小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以稀释复性法进行复性处理，复性液组成为:0.15mol/L硼酸钠缓冲液，4mmol/L氧化型谷胱甘肽，lmmol/L还原型谷胱甘肽，调节pH为9.5。复性过程在2_8°C低温冷库中进行，首先用复性液将上清稀释4倍，放置8小时后再用复性液稀释5倍继续复性6小时，然后再用复性液稀释5倍，最后复性6小时以达到最终的复性效果。复性完成后4°C 8000转/分离心复性液30分钟，取上清按1:10的体 积比对25mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液进行透析处理，透析时间为12-24小时，中间换透析液1-2次。
[0060]透析后的复性液经4°C，8000转/分离心30分钟后上用25mmol/L Tris-HCl,pH8.0溶液平衡的DEAE Sepharose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱1-3个柱体积，然后以含有0.3mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl, pH8.0溶液进行洗脱收集洗脱峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0061]DEAE Sepharose FF洗脱峰用50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5缓冲液以1:10的体积比稀释后上用同样缓冲液平衡的CM Sepharose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱1-3个柱体积，然后在用含有0.1-0.15mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5缓冲液洗脱除去主要杂质峰后用含有0.5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5缓冲液洗脱收集目标峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。洗脱收集目标峰用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行换溶液处理，使缓冲溶液转换为含0.15mol/L NaCl的25mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，PH7.0溶液，转换后的溶液体积与转换前相同。
[0062]用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述CMSepharose FF色谱柱分离纯化并超滤转换缓冲液得到的干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体的纯度，结果均在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测其分子量为19277.10(还原状态)，与理论值偏差为0.57 (还原状态下理论值为19276.53)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为2.24X IO7IU/mg，对照未突变干扰素a Ib的比活性为1.36X 107IU/mgo
[0063]实施例3:干扰素a lbl64位点丝氨酸突变体的发酵、纯化与检测
[0064]将用实施例1的方法构建得到大肠杆菌工程菌按实施例2的方法进行菌种活化和摇瓶培养。以6%的体积接种量接种140L的LB培养基于200L发酵罐中后进行发酵培养，条件如实施例2。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用上述TE缓冲液洗涤两次以除去发酵液中的主要杂质。
[0065]取上述处理得到的菌体40g以1:12的质量体积比加入480ml上述TE缓冲液，并按体积质量比100:1的比例加入4.8g溶菌酶处理4小时以上，所得破碎液室温6000转/分离心20分钟弃上清，沉淀先后以1:10的质量体积比加入含表面活性剂SDS的TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, 0.3%SDS，pH8.0)洗涤离心两次，然后再先后以同样的质量体积比加入不含表面活性剂的TE缓冲液洗涤离心三次，以除去破碎后上清中引入的杂质与洗涤过程中引入的SDS。
[0066]所得IOg包涵体以1:15的质量体积比加入150ml含4mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)的8mol/L尿素后在适度搅拌条件下变性处理4小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以柱上复性法在室温进行复性处理。具体方法为:变性液上DEAESepharose FF 柱后先用 50mol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, 4mol/L 尿素，ρΗ8.0 溶液洗脱3-5 个柱体积；再用 50mol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA，2mol/L 尿素，pH8.0 溶液洗涤 3-5 个柱体积；再用 50mol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, lmol/L 尿素，pH8.0 溶液洗漆 3-5 个柱体积；再用50mol/L Tris-HCl缓冲液,4mmol/L氧化型谷胱甘肽，lmmol/L还原型谷胱甘肽，5mmol/L EDTA, 50mmol/L 精氨酸,pH8.0 溶液洗漆 5-8 个柱体积；在用 50mmol/L Tris-HCl,pH8.0溶液冲洗3-5个柱体积后以含有0.3mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl,pH8.0溶液洗脱收集洗脱峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0067]DEAE Sepharose FF洗脱峰按2:3的体积比与50 %硫酸铵(质量体积浓度)混合，调节pH为8.0后上用含20%硫酸铵的50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液平衡的PhenylSepharose6FF (Low sub)色谱柱,在用含 20%硫酸铵的 50mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.0 溶液冲洗柱3-5个体积后用50mmol/L Tris-HCl, pH8.0溶液洗脱收集目标峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。洗脱收集目标峰用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行换溶液处理，使缓冲溶液转换为含0.15mol/L NaCl的25mmol/L磷酸氢二钠磷酸二氢钠，pH7.0溶液，转换后的溶液体积与转换前相同。
[0068]用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述PhenylSepharose6FF (Low sub)色谱柱分离纯化并超滤转换缓冲液得到的干扰素a lbl64位点丝氨酸突变体的纯度，结果均在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测其分子量为19276.25(还原状态)，与理论值偏差为-0.28 (还原状态下理论值为19276.53)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为2.35X 107IU/mg，对照未突变干扰素a Ib的比活性为1.36 X 107IU/mg。
[0069]实施例4:表达干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的工程菌的构建与表达序列的确认
[0070]由上海生工生物工程有限公司合成SEQ ID N0.5所示氨基酸序列的干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的基因序列，并将该基因序列连接到pBluescript II KS(+)质粒载体上。以BamH1、EcoRI双酶切pBluescript II KS(+)质粒载体，酶切产物以0.8%的琼脂糖凝胶电泳,用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的基因，与经过相同酶切的毕赤酵母表达载体PPIC3.5K连接，得pPIC3.5K_IFNa Ibml63-HSA重组质粒。
[0071] 将2-4 μ g Sail线性化处理的重组质粒pPIC3.5K-1FN a Ibml63-HSA电击转化感受态毕赤酵母GS115。电击结束后立即加入lmLlmol/L山梨醇，混匀后取200 μ I涂布于MD平板(1.34%ΥΝΒ，4Χ 10_5%生物素，2%葡萄糖，1.5%琼脂)，30°C培养至菌落出现。筛选阳性克隆。
[0072]用TIANamp Yeast DNA Kit 提取重组子 GS115/pPIC3.5K-1FN a Ibnil63-HSA 基因组DNA。在50 μ L的PCR反应体系中加入:
[0073]I) 20 μ mo I/L 的上游引物 5 ’ TCAAAGATTCCCAAAGGC3 ’ I μ I ;
[0074]2) 20 μ mol/L 的下游引物 5’ CAGCGAAGTCGTCCATAA3’ I μ I ；
[0075]3)提取的重组子基因组2.5ng，4XdNTP混合液(各2.5mmol/L) 4μ I ；
[0076]4) Pyrobest DNA 聚合酶(0.5U/μ I) 2.5 μ I ;
[0077]5) IOXPyrobest 缓冲液 5 μ L，
[0078]并用双蒸水H2O调整体积至50 μ I。
[0079]PCR 条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 lmin，53°C退火 lmin，72°C延伸 90s，30 个循环，72 °C延伸5min。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在预期位置出现目标条带。
[0080]用同样的方法构建表达SEQ ID N0.6-12所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的工程菌，经ΑΒΙ377测序仪全自动序列测定进一步确认表达序列正确。
[0081]实施例5:干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化与检测(一)
[0082]将筛选得到的表达量较高的表达SEQ ID N0.5所示氨基酸序列的干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的工程菌接种于装有50ml MGYH培养基(34%YNB, 4X 10-5%生物素，1%甘油，0.004%组氨酸)的500ml三角瓶中，30°C，320r/min培养至A6tltl值为2.0-6.0,离心收集菌体，MMYH(用0.5%甲醇代替MGYH中的甘油)重悬细胞至A600值为1.0, 30°C, 320r/min下进行诱导表达,每隔24h补加一次甲醇,诱导表达96h。
[0083]诱导表达结束后将发酵液8000转/分离心5分钟，收集上清。上清在超滤杯中用截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，在用A液(20mmol/L PB, pH7.0溶液)平衡超滤膜后将IL上清液浓缩10倍至100ml。超滤浓缩液加入2倍A液继续超滤浓缩，使最终收集浓缩样品溶液的体积达到50ml。
[0084]将浓缩液上样到用A液(20mmol/L PB, pH7.0溶液)充分平衡的Bio-Rad公司的Aff1-Gel Blue-Gel层析柱，在用1_3个柱体积的A液冲洗柱后用B液(20mmol/L PB，
2.5mol/L NaCl，pH7.0溶液)进行洗脱，收集洗脱峰组分。Aff1-Gel Blue-Gel洗脱峰组分上样到用 C 液(20mmol/L PB, 0.2mol/L NaCl,pH7.0 溶液)充分平衡好的 S印hacryl S-200 分子筛层析柱，上样后C液继续冲洗1-3个柱体积收集洗脱峰组分。上述Aff1-Gel Blue-Gel层析柱上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在30-120cm/h之间；Sephacryl S-200分子筛层析柱上样、冲洗过程中的线性流速应控制在10-40cm/h之间。[0085]用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述Sephacryl S-200分子筛层析柱分离纯化得到的SEQ ID N0.5的干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的的纯度，结果在97 %以上。用MALD1-T0F质谱法检测其分子量为86103.11 (还原状态)，与理论值偏差为-0.73 (还原状态下理论值为
86103.84)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为9.61X 105IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白(中国在先申请201010189355.1中于序列表1公开序列，并于实施例1_4公开制备方法，以下提及“未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白”时相同)的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0086]用相同的方法可进行SEQ ID N0.7所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化。纯化产物用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别测定纯度，结果在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测纯化产物分子量为86102.78 (还原状态)，与理论值偏差为-1.06 (还原状态下理论值为86103.84)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定纯化产物比活性为1.06X 106IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0087]用相同的方法可进行SEQ ID N0.9所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化。纯化产物用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别测定纯度，结果在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测纯化产物分子量为
86104.67 (还原状态)， 与理论值偏差为0.83 (还原状态下理论值为86103.84)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定纯化产物比活性为9.55X 105IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0088]用相同的方法可进行SEQ ID N0.11所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化。纯化产物用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别测定纯度，结果在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测纯化产物分子量为
86105.12 (还原状态)，与理论值偏差为1.28 (还原状态下理论值为86103.84)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定纯化产物比活性为1.04X 106IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0089]实施例6:干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化与检测(二)
[0090]将筛选得到的表达量较高的表达SEQ ID N0.6所示氨基酸序列的干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的工程菌接种于装有50ml BMGY培养基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB ,4X10_5%生物素，1%甘油)的500ml三角瓶中，30°C，300r/min培养至A_值为2.0-6.0,离心收集菌体，BMMY (用0.5%甲醇代替BMGY中的甘油)重悬细胞至A6tltl值为1.0, 30°C, 300r/min下进行诱导表达,每隔24h补加一次甲醇,诱导表达 96h。
[0091]诱导表达结束后发酵液上清的离心、超滤浓缩处理方法同实施例5。
[0092]将浓缩液上样到用A液充分平衡的Blue Sepharose FF层析柱，在用1-3个柱体积的A液冲洗柱后用B液(20mmol/L PB, 2mol/L NaCl，pH7.0溶液)进行洗脱，收集洗脱峰组分。Blue Sepharose FF洗脱峰组分上样到用C液(25mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.5)充分平衡好的CM Sepharose FF阳离子交换层析柱,在用1_3个柱体积的C液冲洗柱后用D液(25mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，0.3mol/L NaCl，pH4.5溶液)进行洗脱，收集洗脱峰组分。上述全部上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0093]用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述CMSepharose FF阳离子交换层析柱分离纯化得到的SEQ ID N0.6的干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的的纯度，结果在97 %以上。用MALD1-T0F质谱法检测其分子量为89207.46 (还原状态)，与理论值偏差为-1.84 (还原状态下理论值为 89209.30)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为1.llX106IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为1.40X 105IU/mg。
[0094]用相同的方法可进行SEQ ID N0.8所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化。纯化产物用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别测定纯度，结果在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测纯化产物分子量为
89210.51 (还原状态)，与理论值偏差为1.21 (还原状态下理论值为89209.30)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定纯化产物比活性为1.25X 106IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0095]用相同的方法可进行SEQ ID N0.10所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化。纯化产物用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别测定纯度，结果在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测纯化产物分子量为89209.90 (还原状态)，与理论值偏差为0.60 (还原状态下理论值为89209.30)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定纯化产物比活性为1.04X 106IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0096]用相同的方法可进行SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的干扰素a Ib突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的纯化。纯化产物用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别测定纯度，结果在97%以上。用MALD1-T0F质谱法检测纯化产物分子量为89208.44 (还原状态)，与理论值偏差为-0.86 (还原状态下理论值为89209.30)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定纯化产物比活性为1.14X106IU/mg，对照未突变干扰素a Ib与人血清白蛋白的融合蛋白的比活性为 1.40X 105IU/mg。
[0097]实施例7:干扰素a Ib突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白的25°C稳定性试验结果
[0098]表1干扰素a lbl63位点丝氨酸突变体25°C稳定性试验结果
[0099]
【权利要求】
1.干扰素a1b突变体，其特征是将SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的干扰素a1b中从N端计的第162-166位中的一个精氨酸突变为丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的干扰素a1b突变体，其特征是将SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的干扰素a 1b中从N端计的第163位的精氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
3.根据权利要求1所述的干扰素a1b突变体，其特征是将SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的干扰素a 1b中从N端计的第164位的精氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
4.编码权利要求1-3之一所述的干扰素alb突变体的核酸分子。
5.根据权利要求1所述的干扰素a1b突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是所述的干扰素a 1b突变体位于所述的融合蛋白的N端，所述的人血清白蛋白位于所述的融合蛋白的C端；或者所述的人血清白蛋白位于所述的融合蛋白的N端，所述的干扰素a 1b突变体位于所述的融合蛋白的C端。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征是所述的干扰素a1b突变体与所述的人血清白蛋白无需连接肽直接连接，由此形成的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.5,SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.11 所示。
7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征是所述的干扰素aIb突变体与所述的人血清白蛋白通过适宜的连接肽连接。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征是所述的连接肽的氨基酸序列为DDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGS，由此形成融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.6、SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.10 或 SEQ ID N0.12 所示。
9.根据权利要求1-3之一所述的干扰素a1b突变体或权利要求5-8之一所述的干扰素a 1b突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的药物组合物，其特征是含有治疗有效量且安全量的所述的干扰素a 1b突变体或所述的干扰素a 1b突变体与人血清白蛋白的融合蛋白，以及适宜量的可药用载体。
10.根据权利要求1-3之一所述的干扰素a1b突变体或权利要求5-8之一所述的干扰素a 1b突变体与人血清白蛋白的融合蛋白在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
【文档编号】C07K19/00GK103641905SQ201310682502
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】刘金毅, 徐晨, 周敏毅, 田硕, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司