重组固氮微生物及其用途

重组固氮微生物及其用途
【专利摘要】本文提供一种重组微生物，特别地，一种固氮菌科家族的重组微生物。重组固氮菌微生物能在氧和外部固定的氮源的存在下连续地固定大气氮。本发明进一步提供用于制备重组微生物的方法和用作生物肥料和/或用于制备肥料组合物的包含重组微生物的组合物。本发明所制备的重组微生物是环境友好的、非常有益的微生物。
【专利说明】重组固氮微生物及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学和基因工程领域。本发明涉及重组微生物，特别地，涉及能够 在固定的氮、氧或其组合存在下固定大气氮的重组固氮菌。
[0002] 发明背景
[0003] 生物固氮（BNF)发生在大气氮被称为固氮酶的酶转化成氨时。仅一些选定的微生 物能够将氮从丰富的气体形式转换成可利用的结合的氮化合物。固定氮的微生物称为固氮 细菌。负责固氮酶活性的酶很容易受到氧的破坏。nif基因负责编码固氮酶蛋白和涉及并 与将大气氮固定成植物可用的氮形式相关的其他蛋白质。nif基因有正调控因子和负调控 因子二者。除固氮酶外，nif基因还编码大量的涉及氮固定的调控蛋白。nif基因的表达 是作为对固定的氮的低浓度和低氧浓度的反应诱导的（低氧浓度是在根环境中主动维持 的）。在大多数固氮微生物中，nif基因转录的激活由NifA蛋白完成。当没有足够的固定 的氮可供固氮菌使用时，nifA基因的天然启动子引发NifA表达，而NifA蛋白反过来导致 剩余nif基因转录的激活。如果有足够量的还原氮或存在氧，那么nifA基因启动子不会被 激活且没有NifA蛋白表达发生。另一方面，另一种蛋白质，NifL，在还原氮或氧存在下被激 活，该激活的NifL通过与NifA蛋白相互作用抑制其活性，导致抑制固氮酶和所有其他氮固 定所必需的辅助蛋白的形成。
[0004] 在自养菌、需氧菌、异养菌、固氮的革兰氏阴性土壤细菌属、固氮菌种群中的氮固 定是由nifLA操纵子调控的。在此，NifA蛋白也激活所有nif基因的转录，而NifL蛋白对 固定的氮和分子氧反应来对抗转录激活因子NifA。固氮菌的nif操纵子的表达由sigma-54 转录因子而不是由更常见的sigma-70转录因子调控。sigma-54转录因子的典型特征是需 要必须在启动子上游约100或更多个碱基的位置结合至DNA的激活因子。nifA基因存在于 固氮菌nifLA操纵子中并位于nifLA操纵子的远端。nifA基因还存在于固氮菌nifLA操 纵子中并位于nifLA操纵子的近端。在此，NifL还是负调控因子，其在氧或氨存在下被激 活。NifL通过与NifA相互作用使其失效。除了 NifA，天然nifLA操纵子的启动子还被氧 和氨抑制。nifLA操纵子作为氮固定整个过程的主要调控操纵子。Raina等人[1993, Mol. Gen. Genet. 237:400-406]已经充分表征 了掠色固氮菌（Azotobacter vinelandii)的 nifL基因并已经阐明其调控。与肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)的情况 不同，棕色固氮菌中nifLA操纵子的表达不是自发调控的。Bali等人[1992, App. Env. Microbiol. 58:1711-1718]在棕色固氮菌nifA上游插入了一个抗生素抗性盒并观察到了 提高的氮固定和氮排泄。Brewin等人[1999, J.Bacteriol. 181:7356-7362]研究了通过插 入抗生素抗性盒获得的棕色固氮菌的nifL突变体的铵排泄并推断铵被动地从细胞排泄。 在棕色固氮菌中，目前的证据表明NifL通过相对稳定的蛋白质-蛋白质相互作用来控制 NifA活性，所述蛋白质-蛋白质相互作用受氧化还原变化、配体结合、和与其他信号转导蛋 白和膜组件的相互作用调控。棕色固氮菌NifL包含在组氨酸激酶的递质区域发现的保守 组氨酸残基，表明NifL可能使用传统的磷酰基转移机制来将环境信号传达至NifA。然而， 用许多其他氨基酸取代这种保守组氨酸不会使信号转导失效。另外，NifL能够在体外ATP 不存在下抑制NifA，而信号转导需要两个调控蛋白之间化学计量的蛋白质-蛋白质相互作 用（Martinez-Argudo 等人，J BacterioL，2004,186 (3): 601-610)。
[0005] 在谷类农作物和非谷类农作物中，都需要用工业固定的氮或生物固定氮提供额外 的固定的氮以补充土壤中的可用性氮。通过矿化释放到可用池中的氮期望是取决于所收获 农产品中移除的土壤氮的量、无机氮（例如，N03'_N)浸析到地下水的量、土壤氮以凡0或队 脱氮的量、N固定化的程度和持续时间以及N在土壤生物量中的再活化比例（I. R. Kennedy et al, 2004, Soil Biology & Biochemistry 36:1229-1244)。接种生物肥料，特别地，接种 固定氮的细菌固氮菌可帮助确保维持有助于最佳产量的营养供应。然而，在化学含氮肥料 存在下，没有生物固氮，因为化学肥料产生的铵关闭了 nifLA操纵子并因此关闭了随后的 所有nif操纵子。
[0006] 美国专利6548289描述了一种用于通过在诱导型或组成型启动子下引入包含 nifA基因的质粒、通过增加激活蛋白NifA的细胞内水平来增加根瘤菌（Rhizobium)属中 大气氮转化成氨的比例的方法。这种方法的问题是质粒具有从环境考虑所不期望的抗生素 抗性基因。此外，介质或土壤中抗生素的存在对质粒在细菌内的稳定维持将是必不可少的。 因此，需要连续的选择压力以维持质粒在细菌中的稳定性。
[0007] 美国专利申请20060270555描述了利用过氧化氢酶基因导致提高固氮能力的根 瘤菌的转化、用于含有作为活性组分的根瘤菌的豆科农作物的制备、以及包括用转换的细 菌接触农作物种子的培养豆科农作物的方法。
[0008] 其他研究者通过插入抗生素抗性盒至nifL基因已经研究了表现出不间断的生物 固氮的重组微生物。然而，由于环境问题，携有抗生素抗性基因的这种微生物对农业使用而 言是不能接受的。存在降低与化学肥料相关的成本并降低这些化学肥料对环境污染的加重 的迫切需要。因此，非常有必要的是：应当开发使得在对环境具有有利影响的情况下降低 农业成本的新的创造性产品和方法。


【发明内容】

[0009] 本发明的一方面提供一种重组微生物，其包含经破坏的染色体nifL基因和操作 性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因，其中该微生物能够在固定的氮和氧存在 下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0010] 本发明的另一方面提供用于制备重组微生物的方法，其中该方法包括：（a)通过 与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子和抗生素抗性标记基因的nifA基因的 重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因插入到微 生物的染色体中以获得经转化的微生物，其中nifL基因是通过插入诱变、删除基因组DNA、 靶标基因破坏或引入基因组或游离载体被破坏；和（b)通过与包含组成型异种启动子的重 组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化微生物的nifA基因的上游以获 得包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组微生物， 其中重组微生物能在固定氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0011]已知固氮菌具有倍数染色体[Punita 等人 J.Bacteriol 171 (1989)3133-3138]。 采用这个两步骤程序以致发挥强的选择压力来确保突变被传至每一个复制染色体是必不 可少的，因为否则一段时间后将发生回复突变。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 图1显示以下元素：
[0013] 图 1A显不来自圆褐固氣菌（Azotobacter chroococcum) CBD15 的 7. 5kb Bam HI 片 段的局部限制性酶切图，所述圆褐固氮菌含有在PUC7中Bam HI位点克隆的与棕色固氮菌 UW的nifL和nifA同源的区域。该结构表示为pCL6。限制性内切酶位点表示为E :EcoRI ; B :BamHI ;Nc:Ncol ;Sa:SacII ;S:Sail ;K:Kpnl。与掠色固氮菌UW 的 nifL和 nifA 杂交的限 制性子片段是下划线部分。
[0014] 图1B显示来自pCL6的4.8kb EcoRI片段，所述pCL6含有在pUC7中克隆的与棕 色固氮菌UW的nifL和nifA同源的区域。该结构表示为pCL6. 2。
[0015] 图1C显示来自ρΗΡ45 Ω Km的2. OkbEcoRI片段，所述ρΗΡ45 Ω Km含有在pCL6. 2的 Sal I位点处插入的插入子ΩΚι?。该结构表示为pCL6. 3。
[0016] 图ID显示来自在pCL6. 2的Sal I位点附近删除1. lkb DNA片段并在相同位点插 入含有PBR322组合型启动子的0· 38kb EcoRI-BamHI片段。该结构表示为pCL6. 4。
[0017] 图1E显示通过电穿孔法将结构pCL6. 3插入圆褐固氮菌CBD15。
[0018] 图1F显示通过同源重组将Ω Km插入子结合到圆褐固氮菌CBD15基因组的nifL 基因中。
[0019] 图1G显示通过电穿孔法将在nifL基因中具有ΩΚι?插入子的结构pCL6. 4引入圆 褐固氮菌CBD15。
[0020] 图1H显示通过同源重组，用含有pBR322组合型启动子的pCL6. 4结构的 EcoRI-BamHI片段取代包含圆褐固氮菌基因组中的ΩΚπι插入子的nifL基因 Sal I位点附 近的1. lkb DNA片段。
[0021] 图2显示与圆褐固氮菌CBD15相比，提高的圆褐固氮菌HKD15的氨制造和排泄。
[0022] 发明目的
[0023] 本发明的一个目的是提供在固定的氮和氧存在下能够将大气氮转变成生物固定 氮的重组微生物。
[0024] 本发明的另一个目的是提供在固定氮和氧存在下具有增加的固定大气氮能力的 重组微生物,其中所述重组微生物不包含任何抗生素抗性标记基因。
[0025] 本发明的另一个目的是提供农作物接种菌和包含能够在固定氮和氧存在下连续 生物固氮的本发明的重组微生物、由此增加农作物产量并降低土壤退化的肥料组合物。
[0026] 本发明的另一个目的是提供降低农业中化学含氮肥料的应用和减少环境污染的 方式。

【具体实施方式】
[0027] 本领域技术人员将注意到本文所描述的发明可以进行不同于具体描述的那些的 变化方案和修改。应理解本文所描述的发明包括所有这种变化方案和修改。本发明还包括 所有这种单独地或共同地在本说明书中所提及或指示的步骤、特征、组合物和化合物，和任 意两个或更多个所述步骤或特征的任意组合与所有组合。'
[0028] 根据本发明，可采用现有技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技 术° 在文献(T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook ； 1982, Molecular Cloning:a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory ；F.M.Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith,和 K. Struhl, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/ffiley Interscience,纽约）中 充分解释了这类技术。
[0029] 定义
[0030] 为了方便，在进一步描述本发明前，在此提供说明书、实施例和所附的权利要求中 所使用的特定术语。这些定义应当是根据其余的公开理解并如本领域技术人员所理解。除 非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属【技术领域】普通技术人 员通常理解的含义相同的含义。
[0031] 名词的单数形式用于指一个或多于一个（即，至少一个）的该名词。
[0032] 整个说明书中，除非上下文需要，术语"包含/包括"及其变化形式将被理解为意 味着收录所陈述的元素或步骤或元素组或步骤组但不排除任何其他元素或步骤或元素组 或步骤组。它不意图被解释为"仅由· --组成"。
[0033] 术语"包括"意思是"包括但不限于"。
[0034] 术语"核酸"或"重组核酸"指的是多聚核苷酸如脱氧核糖核苷酸（DNA)，在适当的 情况下指的是核糖核苷酸（RNA)。
[0035] 本发明中描述的多聚核苷酸包括"基因"，描述的核酸分子包括"载体"或"质粒"。 因此，术语"基因"（也称作"结构基因"）指的是编码特定的氨基酸序列的多聚核苷酸，其 包含一种或更多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可以包括调控（非转录的）DNA序列，例 如确定如基因表达的条件的启动子序列。
[0036] 关于基因序列的术语"表达"指的是基因转录，在适当情况下指的是将产生的mRNA 副本翻译成蛋白质。因此，从上下文清楚可见，蛋白质的表达是来自开放阅读框序列的转录 和翻译的结果。
[0037] "载体"是通过其可以将核酸在生物体、细胞或细胞成分之间传播和/或转移的任 意方式。载体包括自主复制或能结合到宿主细胞染色体中的作为"游离体"的病毒、噬菌体、 病毒前体、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体如YAC(酵母人工染色体）、BAC(细菌人工染 色体）和PLAC(植物人工染色体）等。载体也可以是本质上为非游离的裸露的RNA多聚核 苷酸、裸露的DNA多聚核苷酸、在相同链内由DNA和RNA二者组成的多聚核苷酸、多聚-赖 氨酸配对的DNA或RNA、多肽配对的DNA或RNA、脂质体配对的DNA或类似物，或者载体也可 以是包含以上多聚核苷酸结构的一种或更多种的生物体，例如土壤杆菌或细菌。
[0038] "转化"指的是通过其将重组DNA分子引入宿主细胞的过程。转录（或转导或转 染）可以通过包括电穿孔、显微注射、基因枪（或离子撞击介导的传递）、或土壤杆菌介导的 转化的许多方式之一实现。
[0039] 本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的退化性质，多种其核苷酸序列不同的 DNA化合物可以用来编码本公开的给定氨基酸序列。在本文中引用编码所描述的生物合成 酶的天然DNA序列仅以说明公开的一个实施方案，所述公开包括编码本公开的方法中所利 用的多肽的氨基酸序列和酶的蛋白质的任何序列的DNA化合物。同样，多肽可以典型地耐 受在其氨基酸序列中一个或更多个氨基酸的取代、删除、和插入而不缺失或显著缺失期望 的活性。本公开包括具有不同氨基酸序列的这种多肽，而本文中所显示的DNA序列编码的 氨基酸序列仅说明本公开中的实施方案。
[0040] 本公开提供以重组DNA表达载体或质粒形式的核酸分子。通常，这种载体或者可 以在宿主微生物的细胞质中复制或者可以结合到宿主微生物的染色体DNA。在结合到宿主 染色体DNA的情况下，载体可以是稳定载体（即，经过多次细胞分裂后载体仍然存在，即使 仅具有选择压力）或是瞬时载体（即，随着宿主微生物具有逐渐增加的细胞分裂次数，载体 逐渐丢失）。
[0041] 本公开提供经分离形式的DNA分子（S卩，不纯，但以自然界中未发现的丰度和/或 浓度存在于制备中）和经纯化形式的DNA分子（即，基本不含污染材料或基本不含自然界 中用其可以发现相应DNA的材料）。
[0042] 术语"启动子"指的是能控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在多数时 间或在多数环境条件下在多数细胞类型中引起基因表达的启动子通常被称为"组合型启动 子"。仅在特定化合物或特定环境条件存在下引起基因表达的启动子通常被称为"诱导型启 动子"。
[0043] 术语"操作性连接"指的是核酸序列在单个核酸片段上的缔合，所述缔合使得其中 一个的功能受另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子与该编码序 列操作性连接。编码序列可以以有义方向或反义方向操作性连接至调控序列。
[0044] 本发明不限于本文中所描述的仅用于举例说明的目的的具体实施方案的范围。如 本文中描述的，功能上等同的产品、组合物、和方法明显地在本发明的范围内。
[0045] 表现出组成型氮固定的固氮菌突变体可用作生物肥料。因此，从任意负调控释放 涉及氮固定的所有基因应当导致甚至在铵或其他固定的氮存在下提高的生物固氮，使得化 学肥料和细菌肥料可以一起使用。
[0046] 本发明提供能在固定的氮和氧存在下固定大气氮的重组微生物，其中所述微生物 的染色体包含经破坏的nifL基因、操作性连接至组合型异种启动子的nifA基因且不包含 任何抗生素抗性标记基因，其中nifL基因被插入诱变破坏。本发明的重组微生物也不含有 其他对环境有害的任何外部基因如毒性基因。重组微生物中的期望特征通过操控其染色体 而没有必要维持质粒的情况下获得。
[0047] 本发明还提供具有如SEQ ID NO :l(GenBank:X70993. 1)中所列出的核苷酸序列并 编码如SEQ ID N0:2中所列出的氨基酸序列和SEQ ID N0:3中所列出的核苷酸序列的nifL 基因的多聚核苷酸。
[0048] 本发明还提供具有如SEQ ID NO :4(GenBank:Y00554. 1)中所列出的核苷酸序列并 编码如SEQ ID N0:5中所列出的氨基酸序列的nifA基因的多聚核苷酸。
[0049] nifLA操纵子作为微生物中氮固定整个过程的主要调控操纵子。nifA基因的天然 启动子是受固定的氮和氧调控的诱导型启动子。当发明人通过部分删除nifL破坏负调控 成分并在用于在自养微生物、固氮微生物中连续表达的组合型异种启动子存在下操作性连 接正调控成分和nifA来操控作为一种二成分调控系统的nifLA操纵子时，发现了出乎意料 的结果。出人意料地发现：重组微生物不包含任何抗生素抗性标记基因，且存在氮敏感的 NifA转录激活因子的成功的、不受限制的连续表达，所述NifA转录激活因子增加了重组微 生物中生物固氮水平。还发现，与非重组微生物相比，重组微生物产生并排泄高水平的氨。 使用组合型启动子使得重组微生物固定大气氮非常有效。通过部分删除破坏nifL使得不 可能回复突变成活性负调控成分，由此，使重组微生物非常稳定。因为因此获得的重组微生 物例如登记号为MTCC 5679的重组固氮菌不包含任何抗生素抗性标记基因、或任何其他外 部基因如Bt基因、或任何毒性基因，所以它是理想的生物肥料成分。
[0050] 本发明还提供用于制备能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮的重组微生物的 方法，其中该方法包括：（a)通过与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子和抗生 素抗性标记基因的nifA基因的重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和具有天 然启动子的nifA基因插入到微生物的染色体中以获得经转化的微生物，其中nifL基因是 通过插入诱变、删除基因组DNA、靶标基因破坏或引入基因组的或游离的载体；和（b)通过 与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化 微生物的nifA基因的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动 子的nifA基因的重组微生物，其中重组微生物能在固定氮和氧存在下固定大气氮并且不 包含抗生素抗性标记基因。
[0051] 本发明的方法包括用于通过同源重组转化微生物的方法，其中重组微生物的染色 体包含经破坏的nifL基因、操作性连接至组合型异种启动子的nifA基因并且不包含任何 抗生素抗性标记基因。因此，通过本发明的方法制备的重组微生物能够以连续方式固定大 气氮并且不受外部调控因子控制。本发明的原理应当可应用至所有的氮固定微生物，特别 在其中通过正的和负的调控元素使用二成分调控的氮固定微生物的情况下如此。
[0052] 在本发明中，进行了圆褐固氮菌CBD15的部分nifL基因的删除，所述圆褐固氮菌 CBD15是一种在印度德里的印度农业研究所（Indian Agricultural Research Institute) 从土壤分离的一种菌株。将含有从质粒PBR322分离的组合型tet启动子的DNA片段插入 包含经破坏的nifL基因的圆褐固氮菌CBD15nifA基因的上游。这种新创造的删除突变的 菌株不包含抗生素抗性标记基因并已经被指定为圆褐固氮菌HKD15。已经将重组微生物递 交到印度的MTCC，MTECH。该菌株的登记号为MTCC 5679。首先通过插入插入子并选择nif 负型的表现型（没有固定大气氮的能力）破坏nifL基因和随后用部分删除的nifL基因和 异种组合型启动子取代破坏nifL基因的插入子以驱动正调控元素产生nif正型的表现型 (有固定大气氮的能力），该两步骤策略是新的且不是显而易见的。
[0053] 在本发明中，用限制性内切酶BamHI将来自圆褐固氮菌CBD15的微生物DNA消化 以获得包含nifL和nifA基因的基因组片段。nifA基因是基于与现有技术中已知的与nifA 和nifL基因同源性来鉴别和分离的。包含nifL和nifA基因的7. 5kb的基因组片段是基 于与棕色固氮菌UW(图1A)的nifA和nifL的同源性分离的。该7. 5kb基因组片段被克隆 至pUC7载体并经受进一步限制酶内切以获得包含nifL和nifA基因的4. 8kb基因组片段。 该4. 8kb片段被克隆至pUC7载体，该结构被指定为pCL6. 2 (图1B)。pCL6. 2结构还包含 "第二"抗生素抗性标记基因（氨苄青霉素，Amp+)并被用于进一步转化实验。
[0054] 在该方法中可以使用在用于制备期望的包含关注的nifL和nifA基因的结构的任 何宿主细胞中稳定复制、但在被转化的微生物中不稳定且不复制的任何载体。
[0055] 在第一组转化实验中，nifL基因通过插入诱变而被破坏。将具有"第一"抗生素 抗性标记基因（卡那霉素，Km+)的2. Okb的插入子插入pCL6. 2结构的nifL基因的Sal I 限制位点，该位点为nifA基因的上游而并且结构被指定为pCL6. 3 (图1C)。这种插入诱变 使nifL基因无功能。将pCL6. 3重组质粒通过电穿孔进入固氮菌细胞并允许发生同源重组 (图1E)，其中插入子进入细胞染色体的整合通过同源重组发生。已经通过两点交叉而进行 成功同源重组的转化细胞是通过其对"第一"抗生素标记（Km+)的抗性、对"第二"抗生素 标记（Amp-)的敏感性以及其不能固定大气氮来检测的。
[0056] 在第二组转化实验中，在pCL6. 2结构的Sail位点附近删除1. lkb的DNA，这使 得nifL基因被部分删除；并将如SEQ ID N0. :6中所列出的含有组成型sigma-70启动子 /pBR322的tet启动子的375bp EcoRI-BamHI片段插入Sail位点以获得结构pCL6. 4(图 1D)。可以使用的合成的或天然的、但与微生物相容的其他组合型启动子是合成启动子和天 然启动子如PI、bptII、CAT启动子等。含有组合型异种启动子的重组结构pCL6. 4被进一步 电穿孔进入从第一组转化实验获得的经转化的固氮菌细胞中。通过组合型启动子的侧翼区 和第一转化的固氮菌细胞之间的两点互换的成功同源重组导致删除"第一"抗生素抗性标 记基因（Km)、成功将操作性连接至nifA基因的组合型异种sigma-70/tet启动子结合到染 色体和成功抑制微生物nifL蛋白的产生。通过第二转化步骤获得的重组固氮菌包含无功 能nifL基因、过表达nifA基因并缺乏任何抗生素抗性（Km-)。基于通过该方法获得的重 组固氮菌对"第一"抗生素（Km_)的敏感性和其固定大气氮的能力，测试其成功转化。nifL 基因的部分删除和在nifA基因上游的组合型异种启动子的插入通过本领域可用的常规方 法进一步被确认。这种重组固氮菌已经被指定为圆褐固氮菌HKD15并已经在2011年12月 14日在印度MTCC，MTECH递交。该菌株的登记号为MTCC 5679。
[0057] 重组微生物一登记号为MTCC 5679的圆褐固氮菌HKD15在固定的氮存在下的生物 固氮被提高超过了非重组的、天然的圆褐固氮菌CBD15的生物固氮。与非重组天然圆褐固 氮菌CBD15菌株的氮固定相比，在登记号为MTCC 5679的圆褐固氮菌HKD15中观察到氮固 定的增加3倍（表1)。登记号为MTCC 5679的圆褐固氮菌还显示提高的氨表达和排泄，其 中氨排泄与非重组天然圆褐固氮菌CBD15菌株的相比增加了 9倍。另外，观察到表达不受 以尿素或铵盐形式的固定的氮的存在影响。重组微生物一登记号为MTCC 5679的圆褐固氮 菌HKD15的生物肥料效力高于圆褐固氮菌CBD15,如当用登记号为MTCC 5679的重组圆褐固 氮菌HKD15接种相比于非重组天然圆褐固氮菌CBD15菌株接种农作物植物时所观察到的。
[0058] 本发明的一个实施方案提供一种重组微生物，其包含经破坏的染色体nifL基因 和操作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因，其中该微生物能够在固定的氮和 氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0059] 在本发明的另一个实施方案中，提供了一种包含经破坏的染色体nifL基因和操 作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中该微生物能够在固 定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因，其中所述微生物选自：绿色 硫细菌（Green sulfur bacteria)、厚壁细菌（Firmibacteria)、放线菌（Thallobacteria)、 日光杆菌（Heliobacteria)、蓝细菌（Cyanobacteria)、弯曲杆菌（Campylobacter)、变形菌 (Proteobacteria)、古细菌（Archaeobacteria)和丙酸螺菌（Propionispira)。
[0060] 在本发明的另一实施方案中，提供包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连 接至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中该微生物能够在固定的 氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因，其中所述微生物是固氮菌种群 (Azotobacter spp.)〇
[0061] 在本发明的另一实施方案中，提供包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接 至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中该微生物能够在固定的氮和 氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因，其中所述固氮菌选自：圆褐固氮菌、棕 色固氮菌、Azotobacter armenaicus、拜叶林克氏固氮菌、Azotobacter nigricans和雀稗 固氮菌。
[0062] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了登记号为MTCC 5679的重组固氮菌，其 中所述固氮菌能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
[0063] 在本发明的另一个实施方案中，提供了登记号为MTCC 5679的重组固氮菌，其中 所述固氮菌能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮，其中所述固氮菌包含经破坏的染色体 nifL基因和操作性连接至异种组合型启动子的染色体nifA基因且不包含抗生素抗性标记 基因。
[0064] 本发明的另一个实施方案中，提供了包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连 接至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中所述微生物能够在固定的 氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因，其中nifL基因通过插入诱变、 删除基因组DNA、靶标基因破坏或引入基因组的或游离的载体被破坏。
[0065] 在本发明的一个实施方案中，提供了包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连 接至异种组合型启动子的染色体nifA基因的重组DNA分子。
[0066] 在本发明的另一个实施方案中，提供了包含重组DNA分子的重组载体，所述重组 DNA分子包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至异种组合型启动子的染色体nifA 基因。
[0067] 在本发明的另一个实施方案中，提供了用于制备重组微生物的方法，其中所述方 法包括：（a)通过与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子和抗生素抗性标记基 因的nifA基因的重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和nifA基因插入到微生 物的染色体中以获得经转化的微生物，其中nifL基因是通过插入诱变、删除基因组DNA、靶 标基因破坏或引入基因组或游离载体而被破坏的；和（b)通过与包含组成型异种启动子的 重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化微生物的nifA基因的上游 以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组微生 物，其中重组微生物能在固定氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。 [0068] 在本发明的一个实施方案中，提供了用于制备重组微生物的方法，其中所述方法 包括（a)通过与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子和抗生素抗性标记基因的 nifA基因的重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和nifA基因插入到微生物的 染色体中以获得经转化的微生物，其中nifL基因通过利用插入插入子进行的插入诱变而 被破坏；和（b)通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启 动子插入至经转化微生物的nifA基因的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接 至组成型异种启动子的nifA基因的重组微生物，其中重组微生物能在固定的氮和氧存在 下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0069] 在本发明的另一个实施方案中，提供了一种重组微生物，其通过包含以下的方法 制备：(a)通过与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子和抗生素抗性标记基因 的nifA基因的重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和nifA基因插入到微生物 的染色体中以获得经转化的微生物，其中所述nifL基因是通过插入诱变、删除基因组DNA、 靶标基因破坏或引入基因组的或游离的载体被破坏，和（b)通过与包含组成型异种启动子 的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化微生物的nifA基因的上游 以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组微生 物，其中所述重组微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标 记基因。
[0070] 在本发明的另一个实施方案中，提供了通过包含以下步骤的方法制备的重组固氮 菌种群：（a)通过与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子和抗生素抗性标记基 因的nifA基因的重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和nifA基因插入到固氮 菌的染色体中以获得经转化的固氮菌，其中nifL基因是通过插入诱变、删除基因组DNA、靶 标基因破坏或引入基因组或游离载体被破坏的，和（b)通过与包含组成型异种启动子的重 组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化固氮菌的nifA基因的上游以获 得包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌， 其中所述重组固氮菌能在固定氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0071] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种用于制备重组固氮菌的方法，其中 所述方法包括：（a)提供一种包含经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因的重 组DNA结构，其中所述nifL基因通过插入诱变、删除基因组DNA、靶标基因破坏或引入基因 组的或游离的载体被破坏；(b)通过用步骤a的重组DNA结构转化固氮菌细胞的同源重组， 将经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因插入至微生物的染色体中；（c)选择 经转化的固氮菌，其中所述经转化的固氮菌不能固定大气氮；（d)通过与包含组成型异种 启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化固氮菌的nifA基因 的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重 组固氮菌；和（e)在缺少氮源的营养培养基上选择来自步骤（d)的重组固氮菌，其中所述重 组固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
[0072] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种用于制备重组固氮菌的方法，其中 所述方法包括：（a)提供一种包含经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因的重 组DNA结构，其中所述nifL基因通过利用插入插入子进行的插入诱变破坏；(b)通过用步 骤a的重组DNA结构转化固氮菌细胞的同源重组，将经破坏的nifL基因和具有天然启动子 的nifA基因插入至微生物的染色体中；（c)选择经转化的固氮菌，其中所述经转化的固氮 菌不能固定大气氮；（d)通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成 型异种启动子插入至经转化固氮菌的nifA基因的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操 作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌；和（e)在缺少氮源的营养培养基 上选择来自步骤（d)的重组固氮菌，其中所述重组固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大 气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
[0073] 在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于制备登记号为MTCC 5679的圆褐 固氮菌HKD15的方法，其中所述方法包括（a)提供一种包含经破坏的nifL基因和具有天然 启动子的nifA基因的重组DNA结构，其中所述nifL基因用通过插入插入子进行的插入诱 变破坏；(b)通过用步骤a的重组DNA结构转化固氮菌细胞的同源重组，将经破坏的nifL基 因和具有天然启动子的nifA基因插入至微生物的染色体中；（c)选择经转化的固氮菌，其 中所述经转化的固氮菌不能固定大气氮；（d)通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分 子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化固氮菌的nifA基因的上游以获得包含 经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌；和（e) 在缺少氮源的营养培养基上选择来自步骤（d)的重组固氮菌，其中所述重组固氮菌能在固 定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
[0074] 在本发明的另一个实施方案中，提供了通过包含以下步骤的方法制备的重组固氮 菌：（a)提供一种包含经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因的重组DNA结构， 其中所述nifL基因通过插入诱变、删除基因组DNA、靶标基因破坏或引入基因组的或游离 的载体被破坏；(b)通过用步骤a的重组DNA结构转化固氮菌细胞的同源重组，将经破坏的 nifL基因和具有天然启动子的nifA基因插入至微生物的染色体中；（c)选择经转化的固氮 菌，其中所述经转化的固氮菌不能固定大气氮；（d)通过与包含组成型异种启动子的重组 DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子插入至经转化固氮菌的nifA基因的上游以获得 包含经破坏的nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌；和 (e)在缺少氮源的营养培养基上选择来自步骤（d)的重组固氮菌，其中所述重组固氮菌能 在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
[0075] 在本发明的另一个实施方案中，提供了通过包含以下步骤的方法制备的重组固氮 菌：（a)提供一种包含经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因的重组DNA结构， 其中所述nifL基因被通过插入插入子进行的插入诱变破坏；(b)通过用步骤a的重组DNA 结构转化固氮菌细胞的同源重组，将经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因插 入至微生物的染色体中；（c)选择经转化的固氮菌，其中所述经转化的固氮菌是不能固定 大气氮的；（d)通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启 动子插入至经转化固氮菌的nifA基因的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接 至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌；和（e)在缺少氮源的营养培养基上选择来 自步骤（d)的重组固氮菌，其中所述重组固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不 包含抗生素抗性标记基因。
[0076] 本发明的一个有益实施方案中，提供了包含重组微生物的组合物，所述重组微生 物包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因， 其中该微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0077] 在本发明的另一个实施方案中，提供了包含重组微生物的组合物，所述重组微生 物通过包含以下步骤的方法制备：（a)提供一种包含经破坏的nifL基因和具有天然启动子 的nifA基因的重组DNA结构，其中所述nifL基因被插入子插入破坏；(b)通过用步骤a的 重组DNA结构转化固氮菌细胞的同源重组，将经破坏的n i fL基因和具有天然启动子的n i fA 基因插入至微生物的染色体中；（c)选择经转化的固氮菌，其中所述经转化的固氮菌不能 固定大气氮；（d)通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种 启动子插入至经转化固氮菌nifA基因的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连接 至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌；和（e)在缺少氮源的营养培养基上选择来 自步骤（d)的重组固氮菌，其中所述重组固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不 包含抗生素抗性标记基因。
[0078] 本发明的另一个实施方案中，提供了包含以下的组合物：(a)包含经破坏的染色 体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中所 述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因，和（b) 载体。
[0079] 本发明的另一个实施方案中，提供了包含以下的组合物：(a)包含经破坏的染色 体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组固氮菌，其中所 述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因，和（b) 载体。
[0080] 在本发明的另一个实施方案中，提供了包含以下的组合物：(a)包含经破坏的染 色体nifL基因和操作性连接至异种组合型启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中 所述微生物能在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因；和（b)农 业上可接受的载体。
[0081] 在本发明的一个优选的实施方案中，提供了包含重组微生物的生物肥料组合物， 所述重组微生物包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的染色 体nifA基因，其中所述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素 抗性标记基因。
[0082] 在本发明的另一个的实施方案中，提供了包含重组固氮菌的生物肥料组合物，所 述重组固氮菌包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的染色体 nifA基因，其中所述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性 标记基因。
[0083] 在本发明的另一个实施方案中，提供了一种包含登记号为MTCC 5679的重组固氮 菌的生物肥料组合物，所述重组固氮菌包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组 成型异种启动子的染色体的nifA基因，其中所述固氮菌能够在固定氮和氧存在下固定大 气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0084] 本发明的另一个实施方案中，提供了包含以下的组合物：(a)包含经破坏的染色 体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因的重组微生物，其中所 述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因，和（b) 选自钾、磷、碳、氮、铁、硫、钙、镁、锌、微量元素、生长因子、杀虫剂、抗白蚁剂、细菌和/或藻 类的一种或更多种成分。
[0085] 本发明的一个实施方案提供重组微生物用于制备提高土壤肥力的肥料组合物的 用途，所述重组微生物包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组成型异种启动子 的染色体nifA基因，其中所述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不包含 抗生素抗性标记基因。
[0086] 本发明的另一个实施方案中，提供了重组固氮菌用于制备用于提高土壤肥力的肥 料组合物的用途，所述重组固氮菌包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组成型 异种启动子的染色体nifA基因，其中所述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮 并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0087] 本发明的另一个实施方案中，提供了登记号为MTCC 5679的重组固氮菌用于制备 用于提高土壤肥力的肥料组合物的用途，所述重组固氮菌包含经破坏的染色体nifL基因 和操作性连接至组成型异种启动子的染色体nifA基因，其中所述固氮菌能够在固定的氮 和氧存在下固定大气氮并且不包含抗生素抗性标记基因。
[0088] 本发明不限于本文中所描述的仅用于举例说明的目的的具体实施方案的范围。如 本文中描述的，功能等价的产品、组合物、和方法明显地在本发明的范围内。尽管根据本主 旨的一些优选实施方案已经非常详细地描述了主旨，其他实施方案仍是可能的。因此，所附 的权利要求的精神和范围不应当被限制于本文中含有的优选实施例的描述。
[0089] 实施例
[0090] 现将用操作实施例来说明本公开，所述操作实施例意在说明公开的操作并不意在 对本发明的范围限制性地采取任何限制。
[0091] 发明人期初进行了限制性删除从威斯康星大学获得的菌株棕色固氮菌UW的nigL 基因的一小部分。将含有从质粒PBR322分离的具有375个碱基的组合型sigma70启动子 的限制酶片段插入棕色固氮菌UW nifA基因的上游。nifA基因的表达，即铵的产出和排泄 被增加若干倍，且这种表达不受尿素或铵盐的存在影响。
[0092] 实施例1
[0093] 圆褐固氣菌CBD15的nifL和nifA基因的分离
[0094] 在本研究中使用了圆褐固氮菌CBD15, 一种在印度德里的印度农业研究所从土壤 分离的菌株。
[0095] 利用常规方法并基于与棕色固氮菌UW的nifL和nifA基因的已知序列的同源性， 分离了来自含有nifL基因和nifA基因的圆褐固氮菌CBD15的7. 5kb大小的基因组片段， 所述nifL基因包含如SEQ ID N0 :6中所列出的核苷酸序列。将该片段纯化并在BamHI限 制位点连接进入克隆载体PUC7以获得第一重组载体。这种包含7. 5kb片段的重组载体被 指定为pCL6(图1A)并被引入至感受态大肠杆菌（E.coli)细胞。利用放射标签的探针和 克隆杂交技术筛选经转化的细胞。
[0096] 用各种限制性内切酶将来自拥有7. 5kb插入物的经转化细胞的质粒进一步酶切。 通过用EcoRI限制性内切酶酶切，获得含有nifL基因和nifA基因4. 8kb的片段。将该片 段纯化并随后克隆进入载体PUC7以获得第二重组载体。这种包含4. 8kb片段的重组载体 被指定为PCL6. 2(图1B)并被用于进一步实验。
[0097] 基因库登记号为 X70993.1(SEQ ID N0:1)，SEQ ID N0:3，NC_012560. 1，X64832. 1，.3.也可以用于基因操作和制备能够在固定的氮、氧或其组 合存在下固定氮的重组微生物。
[0098] 基因库登记号为 Y00554. 1(SEQ ID N0:4)、J03411. 1 和 M26751. 1 的关于 nifA 基 因的其他已知DNA序列也可以用于基因操作和制备能够在固定的氮、氧或其组合存在下固 定氮的重组微生物。
[0099] 实施例2
[0100] nifL的定点插入诱变
[0101] 将插入子Ω Km插入至圆福固氮，菌CBD15的nifL
[0102] 将含有插入子 ΩΚι? 的来自 pH F45QKm(R. Fellay, J. Frey, Η· Krisch, 1987 ; Gene;52:147)的2.0kb EcoRI片段在nifL基因的Sal I位点插入至pCL6.2,所述Sal I位 点是nifA的上游。这种结构被指定为pCL6. 3且其包含"第一"抗生素抗性标记基因（Km+) (图1C)。质粒的氨苄青霉素抗性标记基因被指定为"第二"抗生素抗性标记基因（Amp+)。
[0103] 用dCL6. 3电穿孔圆福固氮菌CBD15以在其某闵鉬的nifL某闵处插入插入子 Ω Km
[0104] 用重组质粒结构pCL6. 3将圆褐固氮菌CBD15电穿孔以获得第一组经转化的细胞。 选择显示卡那霉素 （kanamycin)抗性（m+)的经转化的细胞。将细胞用于没有氨苄青霉素 抗性（Amp-)和没有氮固定的分析。这确保了 pCL6. 3在圆褐固氮菌CBD15中不稳定，且细 胞的卡那霉素抗性是PCL6. 3中插入子Ω Km的侧翼区和圆褐固氮菌CBD15之间的两点交叉 的同源重组的结果（图1E和图1F)。
[0105] 实施例3
[0106] nifL基因的部分删除与pBR322组合型启动子的克隆
[0107] 使用了包含如SEQ ID N0 :6中所列出的组合型启动子（核苷酸1至377)的来自 PBR322 的 375bp EcoRI-BamHI 片段。
[0108] 将在pCL6. 2的Sal I位点附近的1. lkb DNA片段删除并在pCL6. 2的Sal I位点 附近的1. lkb DNA片段删除位点处插入含有pBR322组合型启动子（SEQ ID N0:6)的375kb 的EcoRI-BamHI片段。这种含有组合型启动子的结构被表示为pCL6. 4(图ID)。
[0109] 实施例4
[0110] 将部分删除的nifL和nifL上游的组合型启动子结合到微生物的基因组
[0111] 用重组质粒结构pCL6.4(图1G)电穿孔第一组包含ΩΚπι插入子和"第一"抗生素 抗性标记基因的转化圆褐固氮菌CBD15。将通过pCL6. 4中插入子Ω Km的侧翼区和圆褐固 氮菌CBD15的第一组转化细胞（Km+)之间的两点交换的同源重组的结果被成功转化的那些 细胞用于没有"第一"抗生素抗性标记基因的分析和其固氮能力的分析（图1H)已经经过 成功同源重组的转化细胞对"第一"抗生素抗性标记基因、卡那霉素敏感。该重组微生物已 经被指定为圆褐固氮菌HKD15. 2011年12月14日在印度MTCC，MTECH已经递交了该重组 微生物。该菌株的登记号为MTCC 5679。
[0112] 在圆褐固氮菌HKD15的染色体中nifL基因的部分删除和pBR322组合型启动子的 插入已经通过Southern印迹和PCR分析得到确认。
[0113] 实施例5
[0114] 重组圆褐固氮菌HKD15的特征
[0115] 在固定的氮，存在下圆福固氮，菌HKD15的固氮，定會g力
[0116] 氮的还原很难分析。然而，已知固氮酶也能够还原乙炔。因此，乙炔至乙烯的还原 被接受为固氮酶的测量。向盖螺盖的管中培养的细菌供给特定量的乙炔并在30°C孵育。24 小时后，通过气象色谱检测产生的乙烯量和剩余的乙炔量并与乙炔的起始量比较。
[0117] 与天然菌株圆褐固氮菌CBD1相比，通过圆褐固氮菌HKD15中的组合型启动子，乙 炔还原增加了三倍（参见表1)。
[0118] 表1 :固定氮源（乙酸铵）对圆褐固氮菌CBD15和圆褐固氮菌HKD15还原乙炔的 影响
[0119]

【权利要求】
1. 一种重组微生物，其包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至组成型异种启 动子的染色体nifA基因，其中所述微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮并且不 包含抗生素抗性标记基因。
2. 权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物选自绿色硫细菌、厚壁细菌、放线 菌、日光杆菌、蓝细菌、弯曲杆菌、变形菌、古细菌和丙酸螺菌。
3. 权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物是固氮菌种群。
4. 权利要求3所述的重组微生物，其中所述固氮菌选自圆褐固氮菌、棕色固氮菌、 Azotobacter armenaicus、拜叶林克氏固氮菌、Azotobacter nigricans 和雀稗固氮菌。
5. -种登记号为MTCC 5679的重组固氮菌，其中所述固氮菌能够在固定的氮和氧存在 下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
6. 权利要求1所述的重组微生物，其中所述nifL基因通过插入诱变、删除基因组DNA、 靶标基因破坏、或引入基因组的或游离的载体而被破坏。
7. -种重组DNA分子，其包含经破坏的染色体nifL基因和操作性连接至异种组合型启 动子的染色体nifA基因。
8. -种重组载体，其包含权利要求7所述的重组DNA分子。
9. 一种用于制备重组微生物的方法，其中所述方法包括： (a) 通过与包含经破坏的染色体nifL基因、具有天然启动子的nifA基因、和抗生素抗 性标记基因的重组DNA分子的同源重组，将经破坏的nifL基因和nifA基因插入到所述微 生物的染色体中以获得经转化的微生物，其中所述nifL基因是通过插入诱变、删除基因组 DNA、靶标基因破坏、或引入基因组的或游离的载体而被破坏的； (b) 通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子 插入至所述经转化的微生物的nifA基因的上游，以获得包含经破坏的nifL基因和操作性 连接至组成型异种启动子的nifA基因的重组微生物； 其中所述重组微生物能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标 记基因。
10. 权利要求9所述的方法，其中所述插入诱变是通过插入子插入来进行的。
11. 一种重组微生物，其通过权利要求9所述的方法制备。
12. 权利要求11所述的重组微生物，其中所述微生物是固氮菌种群。
13. -种用于制备能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮的重组固氮菌的方法，其中 所述方法包括： (a) 提供包含经破坏的nifL基因和具有天然启动子的nifA基因的重组DNA结构，其中 所述nifL基因是通过插入子插入而被破坏的， (b) 通过用步骤（a)的所述重组DNA结构转化固氮菌细胞的同源重组，将经破坏的 nifL基因和具有天然启动子的nifA基因插入至微生物的染色体中， (c) 选择经转化的固氮菌，其中所述经转化的固氮菌不能固定大气氮， (d) 通过与包含组成型异种启动子的重组DNA分子的同源重组，将组成型异种启动子 插入至所述经转化的固氮菌的nifA基因的上游以获得包含经破坏的nifL基因和操作性连 接至组成型异种启动子的nifA基因的重组固氮菌，和 (e) 在缺少氮源的营养培养基上选择来自步骤（d)的重组固氮菌， 其中所述重组固氮菌能够在固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标 记基因。
14. 一种根据权利要求13所述的方法获得的重组固氮菌，其中所述重组固氮菌能够在 固定的氮和氧存在下固定大气氮且不包含抗生素抗性标记基因。
15. -种包含权利要求1所述的重组微生物或权利要求14所述的固氮菌的组合物。
16. 权利要求15所述的组合物，其中所述组合物任选地包含载体。
17. 权利要求16所述的组合物，其中所述载体为农业上可接受的载体。
18. 权利要求15所述的组合物，其中所述组合物是生物肥料。
19. 前述权利要求中任一项所述的组合物，其任选地包含选自钾、磷、碳、氮、铁、硫、钙、 镁、锌、微量元素、生长因子、杀虫剂、抗白蚁剂、细菌、藻类的一种或更多种成分。
20. 权利要求1所述的重组微生物、或权利要求14所述的固氮菌、或前述权利要求中任 一项所述的组合物用于制备用于提高土壤肥力的肥料组合物的用途。
【文档编号】C07K14/195GK104204211SQ201380012076
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2012年3月3日
【发明者】希伦德拉·库马尔·达斯 申请人:科技部生物技术局, 尼赫鲁大学