用于疾病治疗的嵌合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种嵌合蛋白，其是由(i)来自清道夫受体的病原体识别模块和(ii)来自不同清道夫受体的锚定域制备得到的。这种嵌合蛋白与特定的病原体相结合，并且可用于许多治疗中。
【专利说明】用于疾病治疗的嵌合蛋白
【背景技术】
[0001] 本申请要求2012年3月12日提交的、申请号为No. 61/609,523美国临时专利申 请的优先权。其公开的全部内容以引用的形式并入本申请。
[0002] 本申请包括于2013年3月12日创建的序列表，该文件为ASCII格式，名称为 "5〇八1?200003_5125411'，大小为123,236字节。该文件的全部内容以引用的方式并入本申 请。
[0003] 本发明涉及与重组嵌合蛋白的产生和使用相关的方法、材料、组合物、应用以及治 疗，这种重组嵌合蛋白在本文中可以被称为混杂清道夫受体。
[0004] 脓毒症通常被定义为病理感染和生理变化的组合，统称为全身炎症反应综合征 (SIRS)。相关术语败血症是指血液中存在病原微生物，会导致脓毒症。在本文中这两个术 语通常互换使用。
[0005] 脓毒症的死亡率很高，据报道，尽管经过抗生素的治疗，在受严重影响的患者中仍 有20%至50%的死亡率。脓毒症是非冠脉重症监护病房（"I⑶"）患者的第二大死亡原 因，还是美国的第十大死亡原因，欧洲的数据与此类似。此外，脓毒症是幼年个体死亡的主 要原因，并且对于幸存的人来说其终生的生活质量也降低了。目前脓毒症的治疗主要包括 广谱抗生素和器官支持治疗，并且往往是无效的。随着病原体之间抗生素抗性的增加，治疗 的功效则会减少。
[0006] 尽管整体住院死亡率下降，在过去22年中脓血症的发病率已经大幅上升并且死 亡数目仍在增长。根据医院的出院记录，使用ICD-9编码创建了美国的脓毒症记录，并且据 估计，每年超过751，000例重症脓毒症发生，占住院的2. 1 %至4. 3%和所有接诊的重症监 护病房的11%。据估计，在过去的20年里，脓毒症在美国的发生率已经显著地增加。发病 率增加的可能原因包括侵入性操作应用的增加，免疫抑制药物、化疗和移植，人类免疫缺陷 病毒（HIV)感染疫情的出现，以及微生物抗性的增加。随着时间的推移，具体的致病微生物 的相对频数发生了转变，最近革兰氏阳性菌特别明显。令人担忧的是，脓毒症导致的器官衰 竭越来越多，并且成为死亡的主要原因。在欧洲可能有类似的情况。
【发明内容】
[0007] 本文公开了可用于与病原体结合的多种嵌合蛋白。简单地说，每种蛋白包含来源 自哺乳动物清道夫受体的病原体识别模块。每种蛋白还包含用于将所述嵌合蛋白固定在适 当位置的锚定域。
[0008] 本文在各种实施方案中公开的重组嵌合蛋白包含：来自哺乳动物清道夫受体的病 原体识别模块、和锚定域。
[0009] 该蛋白还可包含介于所述病原体识别模块和所述锚定域之间的连接体。该连接体 可以为约2至约5个氨基酸的序列。该连接体可以包含至少两种不同的氨基酸。在一些实 施方案中，这两种不同的氨基酸选自由丙氨酸、组氨酸和甘氨酸组成的组。
[0010] 该蛋白质还可包含亲和标记。亲和标记可以选自由血凝素、V5、Myc、I7、FLAG、HSV、 VSV-G、6-His、生物素/链霉亲和素和STREP所组成的组。
[0011] 所述病原体识别模块可以为病原体结合域，其来自哺乳动物细胞表面受体家族， 例如SCARA3、CD36、CD163、CD68、L0X-1、SREC-I或SCARA5。这些清道夫受体含有病原体结 合域，例如保守SRCR结构域，C型凝集素样结构域（CTLD)，或胶原序列。
[0012] 所述锚定域可以是免疫球蛋白的Fc段。可替代地，所述锚定域可以是来自哺乳动 物清道夫受体的Ct -螺旋卷曲螺旋域（ctHielical coiled coil domain)。所述锚定域也 可以是亲和标记。在本发明的特定实施方案中，获得病原体识别模块的哺乳动物清道夫受 体与获得锚定域的哺乳动物清道夫受体不同。
[0013] 该蛋白还可包含信号肽。
[0014] 本文还公开了编码所述嵌合受体蛋白的核酸序列、包含该核酸序列的载体、以及 包含该载体的宿主细胞。
[0015] 本文还公开了一种含有嵌合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述 嵌合蛋白包含来自清道夫受体的病原体识别模块、和锚定域。
[0016] 本文还公开了一种含有固相和固定在该固相上的嵌合蛋白的亲和介质，其中，所 述嵌合蛋白包含来自清道夫受体的病原体识别模块、任选的连接体、和锚定域，所述锚定域 附着在所述固相上。
[0017] 此外，本发明描述了一种选择性地再生所公开的亲和介质的方法，其中通过对所 述介质进行处理，从而使所结合的病原体或病原体衍生分子脱落，同时使固相之间的连接 以及嵌合蛋白与固相之间的连接保持原状。
[0018] 本发明还描述了一种用于治疗与病原体或病原体衍生分子相关的疾病的方法，其 包括：接收含有固相和固定在该固相上的嵌合蛋白的亲和介质，所述嵌合蛋白包含（i)来 自清道夫受体的病原体识别模块和（ii )锚定域；将所述亲和介质与生物样品接触，从而使 病原体或病原体衍生分子与亲和介质结合。
[0019] 本文还描述了一种用于确定受试亲和介质对于病原体的有效性的方法，其包括： 接收含有病原体的生物样品；使生物样品与所述受试亲和介质的病原体识别模块接触；以 及检测病原体和病原体识别模块之间结合的量。此方法可进一步包括将病原体和受试亲和 介质的病原体识别模块之间结合的量与参考值进行对比。
[0020] 本文的多个实施方案公开了一种用于预防和治疗与病原体或病原体衍生分子相 关的疾病的药物，包含位于适于局部施用的载体中的嵌合蛋白。
[0021] 本文还公开了一种重组嵌合蛋白，由以下构成：信号肽、至少一种亲和标记、任选 的连接体、来自哺乳动物清道夫受体的病原体识别模块和锚定域。
[0022] 本文还公开了用于诊断患者是否患有与病原体或病原体衍生分子相关的疾病的 方法，其包括：接收包括固相和固定在该固相上的固定空间内的嵌合蛋白的亲和介质，所述 嵌合蛋白包含（i)来自清道夫受体的病原体模块和（ii)锚定域；接收由患者获得的生物样 品；使生物样品与亲和介质接触，从而使病原体或病原体衍生分子结合到固定空间；检测 固定空间是否存在所结合的病原体或病原体衍生分子。该检测可通过使任何所结合的病原 体或病原体衍生分子与标记探针杂交来进行。
[0023] 下面将更具体地描述这些和其他非限制性的特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 本专利或申请文件包含至少一个用彩色显示的附图。在提出请求并缴纳所需费用 的基础上，官方将会提供包含彩色附图的本专利或专利申请公布文本的副本。
[0025] 以下提供附图的简要说明，其用于说明本发明所公开的示例性实施方案，而不是 为了限制这些实施方案。
[0026] 图IA和图IB为示出了不同类别的清道夫受体蛋白在结构上的相似和差异的图。 通过对 Piatt, N.et al. Trends Cell Biol. Volume 8, Issue 9, ISeptember 1998, Pages 365-372进行修订得到图IA和IB。这些图未精确地显示这些蛋白质的相对尺寸。
[0027] 图2为示出本发明的嵌合蛋白一种可能的应用的图。
[0028] 图3为用于密度分析的显微照片，其显示了与固相（此处为珠子）结合的蛋白。
[0029] 图4示出用于分析与固相结合的蛋白量的Bradford分析标准曲线。
[0030] 图5为组图，其示出当四种不同的细菌暴露在含有第一嵌合蛋白的亲和介质下的 结果。这组图示出在由亲和介质洗漆连续级分（consecutive fraction)的过程中活菌的 数量，以及在该实验过程总存活细菌的计数。
[0031] 图6为组图，其示出当四种不同的细菌暴露在含有第二嵌合蛋白的亲和介质下的 结果。这组图示出在由亲和介质洗涤连续级分的过程中活菌的数量，以及在该实验过程总 存活细菌的计数。
[0032] 图7为组图，其示出当产超广谱@ -内酰胺酶（ESBL)的大肠杆菌（E. coli)暴露 在含有第三嵌合蛋白的亲和介质下的结果。这组图示出在由亲和介质洗涤连续级分的过程 中活菌的数量，以及在实验结束时留存在柱子中的存活细菌的计数。
[0033] 图8为组图，其示出当产生超广谱@ -内酰胺酶（ESBL)的大肠杆菌（E. coli)的 暴露在含有第四嵌合蛋白的亲和介质下的结果。这组图示出在洗涤亲和介质的连续级分过 程中活菌的数量，以及在实验结束时留存在柱子中存活细菌的数目。由三个独立的试验得 到的平均值和标准偏差如图所示。
[0034] 图9A和图9B示出暴露于来自实施例1的每个柱级分（即第一嵌合蛋白质）的外 周血单个核细胞（PBMC)中的TNF产量。
[0035] 图IOA和图IOB示出暴露于来自实施例2的每个柱级分（即第二嵌合蛋白质）的 外周血单个核细胞（PBMC)中的TNF产量。
[0036] 图11为一组照片，其示出热灭活的大肠杆菌和乙酰化低密度脂蛋白（acLDL)与两 种不同的嵌合蛋白质、完整SCARA5以及对照的结合情况。使用anti-SCARA5抗体对表达进 行确认。
[0037] 图12为一组图片，其示出与对照Crb2细胞相比，通过SCARA5转染细胞对细菌脂 多糖（LPS)的内化作用。使用anti-SCARA5和anti-Crb2的抗体对SCARA5和Crb2的表达 进行确认。
[0038] 图13为组图，其示出在外周血单个核细胞（PBMC)中诱导的TNF产量，所述外周血 单个核细胞来自于供体并暴露于使混合在人血清中的病原体通过下列柱子所获得的柱流 过物中，所述柱子包含与不同的嵌合受体蛋白相结合的珠子。对照组包括未与嵌合受体结 合的珠子。
[0039] 图14为与图13类似的第二组图表，但是含有不同的病原体。
[0040] 图15示出斑点印迹的结果，其中采用与图13和图14中相同的设备，但是使用不 同的洗涤溶液将结合的病原体从对照珠子和负载有嵌合受体（SEQ ID NO :35, SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO :41)的珠子上洗脱下来。这种情况下，使用抗生物素 HRP-偶联抗体（生物 素检测）使施加到柱子上（加载）的材料（在流过和洗涤后）中的生物素化的MRSA显示。 洗涤溶液1在任何环境条件下都不能洗脱所结合的MRSA，但洗涤溶液2对于负载有SEQ ID NO :41和SEQ ID NO :43的珠子而言则可以洗脱所结合的MRSA。在使用洗涤溶液3将珠子 上的所有物质都洗脱下来后，在对照珠子或负载有SEQ ID NO :35的珠子中没有检测到结合 的细菌碎片（生物素）。
[0041] 图16为经一组亲和标记标记的蛋白的五种免疫组织化学（IHC)照片，用来与图17 对比。其蛋白存在的量高。
[0042] 图17为经另一组亲和标记标记的蛋白的五个免疫组织化学（IHC)照片，用来与图 16对比。其蛋白存在的量更低。
[0043] 图18为一组Western印迹，其示出两种嵌合受体（由SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :41表达）对三种病原菌菌种或裸露基质的亲和性。左图示出每种受体蛋白在初始溶液 中的存在状态。右图示出在添加各种细菌和经过洗涤之后蛋白仍附着在珠子上。对于附着 于TALON珠子上的His-标记蛋白以及附着于经链霉亲和素包覆的琼脂糖上的Avi标记的、 生物素化的蛋白而言，也是同样的。可以看出，对于革兰氏阳性菌（除革兰氏阴性的大肠杆 菌或His-标记的蛋白之外），混合后嵌合受体的浓度下降-这表明在病原体分子/琼脂糖 和嵌合受体之间形成了结合，从而使溶液中不再含有某些蛋白。
[0044] 发明详述
[0045] 参考附图，可以更透彻地理解本文公开的组合物和方法。这些图仅仅是为了方便 和易于说明本发明的示意性表示，因此并非意在限定或限制示例性实施方案的范围。
[0046] 尽管在以下描述中为清楚起见使用了特定的术语，这些术语仅仅是为了指代附图 中用于说明的实施方案的具体结构，并非意在限定或限制本公开的范围。应当理解的是，在 附图和以下描述中，相似的数字标记指代具有相似功能的组件。
[0047] 此处所涉及的所有出版物、专利和专利申请均以全文引用的方式并入本文。
[0048] 本发明涉及一种基于哺乳动物清道夫受体蛋白（针对本发明的目的简称为清道 夫受体，或简称SR)的嵌合蛋白。大约有30种人类受体蛋白（都具有可溶性和膜结合性）， 其具有一个或多个古老的、高度保守的蛋白模块-清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR)的结构 域。SRCR结构域大概是90至110个氨基酸长，并具有高的和明确的半胱氨酸含量。基于 SRCR结构域的特征，曾经报道过两类SR成员：具有A类结构域的SR(SCARA ;由至少两个外 显子编码并且含有6个半胱氨酸残基）和具有B类结构域的SR(由一个外显子编码并且含 有8个半胱氨酸残基）。有时也有例外，包括一种呈现截断的SRCR结构域的SCARA，该SRCR 结构域中含有四个半胱氨酸。同样的，在B组成员之间也发现含有6个半胱氨酸的分离的结 构域，CD5、CD163、WC1 和 MC16 也有这种情况。另外，Spa/AIM，WC1/T19 以及 CRP-ductin (小 鼠 DMBT1)具有包含7个半胱氨酸的独立结构域。但是，还没有报道过在相同清道夫受体上 同时存在A类和B类结构域的情况。序列分析已表明，尽管SRCR结构域具有不同程度的同 源性，但是半胱氨酸的相对位置还是以二硫键的形式在结构域中很好的保留下来。因此，序 列分析揭示了半胱氨酸Cl和C4形成二硫键，因为它们总是在B类而不是A类中存在。蛋 白水解分析表明其他形成二硫键的半胱氨酸对为C2-C7、C3-C8和C5-C6。而这些结果也已 经通过结晶的独立蛋白结构域的结构分析得以确认。
[0049] 除了所讨论的SRCR结构域之外，任何SR通过其在造血谱系的免疫细胞亚群表面 上的位置得以表征。此外，不同数量和程度的SR表达可以在几乎所有其他类型的细胞中找 至IJ，并且它们能够从这些细胞中结合大量的内源性配体。这些包括乙酰化或氧化的低密度 胆固醇（LDL)，以及正常的高密度胆固醇（HDL)、血红蛋白、铁和碳水化合物。SR还结合革兰 氏阳性细菌以及革兰氏阴性细菌。
[0050] 图1示出不同类别的清道夫受体（SR)的结构特征。
[0051] A类SR为三聚体糖蛋白，其有以下几种亚型：SR-A类I和II (SCARAl)、 嫩尺0)(504狀2)、51?-(^类1和11(504狀4)、和504狀5。此处对504狀3亚型不予说明。三 聚体分子由包含胞浆区A、跨膜结构域B、隔离域C、a螺旋卷曲螺旋域D、胶原三螺旋结构 域E、富含半胱氨酸的结构域F或C型凝集素样结构域G的模块构建而成。I类SR-A受体 有6个结构域，而II类受体不含有富含半胱氨酸结构域F。MRCO受体不含有a螺旋卷曲 螺旋域D，而含有相对长的胶原三螺旋结构域E。在SR-CL I类受体中，富含半胱氨酸结构 域F由C型凝集素样结构域G代替。SCARA5受体与具有6个域的SR-A I类受体相似。在 A类SR，胶原结构域E中，富含半胱氨酸的结构域F或C型凝集素样结构域G包括结合位点 的乙酰化低密度脂蛋白或细菌和其他的配体，还应当注意的是，在A类SR中，N-末端是在 细胞质中。
[0052] B类SR包括，例如⑶36和⑶163。⑶36采取两极构型，具有胞外域H，H的两侧与 两个跨膜结构域B和两个胞浆结构域A相连接。胞外域包含疏水性结构域、富含脯氨酸结构 域、和几个结合位点。所述CD163蛋白具有位于其C端的胞浆区A、跨膜结构域B和胞外域， 该胞外域仅包括9个B类SRCR结构域J，通过其N-末端的SRCRl和靠近C-末端的SRCR9 进行编号。B类SRCR结构域有四个双硫键，而A类SRCR结构域有三个双硫键。
[0053] D类SR包括，例如⑶68 (也被称为巨噬唾液酸蛋白）。⑶68的C-末端在细胞质 中。CD68包括胞浆区A、跨膜结构域B、溶酶体相关膜蛋白（LAMP)样结构域K和粘蛋白样结 构域L。
[0054] 现在已知的E类SR是L0X-1。L0X-1的N-末端在细胞质中。L0X-1包括胞浆区A、 跨膜结构域B、和C-类凝集素域G。含有凝集素的C-类凝集素样结构域（CTLD)是Ca 2+-依 赖性、碳水化合物结合蛋白。此结构超家族还包含Ca2+-非依赖性凝集素、以及具有凝集素 样结构域但不与碳水化合物结合的蛋白。但是，可以通过它的四个（有时为六个）保守半 胱氨酸残基来识别CTLD折叠。具有CTLD的蛋白并非必须为SR，还包括一些可溶性蛋白，例 如甘露糖结合凝集素（MBL)和表面活性蛋白（SP-A和SP-D)。尽管如此，CTLD被公认为存 在于SR甘露糖受体、L0X-1和SCARA4中。
[0055] 目前已知的F类SR为SREC-I。SREC-I的C-末端是在细胞质中。SREC-I包括胞 浆区A、跨膜结构域B和具有5个EFG样结构域M的胞外域。
[0056] SCARA3蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :46。SCARA3结构与SCARAl的剪接变体 II相似，其包含N-末端胞浆结构域、跨膜结构域、间隔域、卷曲螺旋结构域和胶原结构域。 C-末端胶原结构域氨基酸残基440-543和513-572包括与配体结合的位点，例如断裂和聚 腺苷酸化特异性因子3 (CPSF3)和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP)。
[0057] CD36蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :47。CD36蛋白包括在氨基酸155-183、氨基 酸28-93、和氨基酸120-155之间的多个OxLDL结合位点。其他结合位点在氨基酸93-120 之间。氨基酸139-184、氨基酸146-164和氨基酸145-171之间的结构域也被显示其介导与 PfEMP-I的结合。
[0058] ⑶163蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :48。每个单独的SRCR结构域J是结合结 构域，其与相邻的SRCR结构域组合在一起。SRCRl结构域由氨基酸1-148编码。SRCR2结 构域由氨基酸149-255编码。SRCR3结构域由氨基酸256-362编码。SRCR4结构域由氨基 酸363-469编码。
[0059] ⑶68蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :49。LAMP样结构域K和粘蛋白样结构域L 都是结合位点。
[0060] L0X-1蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID NO :50。C-类凝集素结构域G是结合位点。
[0061] SREC-I蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID NO :51。每个EGF样结构域M都是结合位 点。一个EGF样结构域包含30-40个氨基酸残基和2-3个二硫键，并且还具有2个P -折 叠。
[0062] 不同于合成抗生素，SR与人类病原体共同进化，其通过作为模式识别受体构成天 然免疫防御的重要组成部分，特别是在对抗细菌病原体方面。一些SR表达于巨噬细胞和树 突状细胞，它们在这些细胞中充当吞噬受体，介导结合并摄取包括革兰氏阳性和革兰氏阴 性细菌、细胞内细菌和病毒RNA的病原微生物。SR也用作Toll样受体（TLR)的共同受体， 调节对TLR激动剂的炎性反应。已经报道的SR通常结合脂多糖（LPS)和脂磷壁酸（LTA)， LPS和LTA分别存在于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的表面上。最近，有资料表明细菌表面 蛋白也称为SR的重要目标分子。此外，细胞内的病原体，包括病毒和恶性疟原虫，使用SR 可进入到宿主细胞中，这样使得它们强制地与SR结合。与非特异性细菌性配体（如硫酸肝 素）不同，SR除了识别多个致病性配体，还表现出与靶向病原体的牢固结合，这样使得它们 有可能成为用于在体外除去血液中的细菌的候选物质。
[0063] 本发明使用进化上保守的SR系统对病原体进行治疗和诊断。已经建立起多种表 达相关哺乳动物和嵌合蛋白SR的重组细胞系。已经开发出将这些SR末端附着至固相（例 如珠子基质、平坦表面或者机械）的技术。因此，创建可以用于治疗诸如体外血液处理的亲 和介质是可行的。
[0064] 本文所公开的重组嵌合蛋白，其可用于与病原体结合。简单来说，每种蛋白包含来 自清道夫受体的病原体识别模块（PRM)。每种蛋白还包含锚定域，其用于将嵌合蛋白固定在 支持物的合适位置。这些蛋白可被称为嵌合清道夫受体（cSR)。
[0065] 所述病原体识别模块可能来自哺乳动物清道夫受体的结合域，并且可能由此将 其定制成针对病原体或病原体衍生分子的特定种群。例如，结合域可以是A类清道夫受 体成员2 (SCARA2,已知其与污泥梭状芽胞杆菌结合）的结合域，或B类的清道夫受体成员 L0X-1 (已知其与金黄色酿脓葡萄球菌结合）的结合域。结合域与特定的原子或分子结合。 参照图IA和图IB所示清道夫受体的该部分，任何上述的结合域可以被认为是病原体识别 模块。在具体的实施方案中，病原体识别模块位于该嵌合受体蛋白的C-末端。
[0066] 锚定域直接或间接地附着至病原体识别模块，并且用于将该蛋白端点固定至固相 或支持物。锚定域也可允许的病原体识别模块的受限的特定重新配置或允许多个PRM结合 到单个目标分子。在一些实施方案中，锚定域可以是免疫球蛋白的Fe区。在其它具体实施 方案中，所述锚定域是来自哺乳动物SR的卷曲螺旋结构域（图IA中字母D)。可替代地，所 述锚定结构域可以是亲和标记（本文将进一步阐述）。锚定域通常位于嵌合蛋白的一端。 [0067] 在具体设想的实施方案中，所述病原体识别模块和锚定域来自不同的A类清道夫 受:体蛋白。
[0068] 如果需要，在病原体识别模块和所述锚定域之间可以存在连接体。该连接体增加 了 PRM和cSR的锚定域之间的距离，使得其具有针对不同病原体的特异性和结合强度。在制 造过程中，该连接体还允许正确的蛋白质折叠和分泌。在实施方案中，连接体可以是具有大 约2-15个氨基酸的长度的序列。连接体可包括至少两种不同的氨基酸。在一些实施方案 中，连接体包含选自由丙氨酸（A)、组氨酸（H)和甘氨酸（G)组成的组中的至少两种不同的 氨基酸。非限制性的五个有用的连接体序列实例是SVEA(SEQ ID N0:1)、DMDF(SEQ ID NO: 2)、GAAGG (SEQ ID NO :11)、AAAGG (SEQ ID NO :12)和 HHK (SEQ ID NO: 14)。
[0069] 此外，cSR可以含有一种或多种亲和标记，其与所述蛋白（即在其一端处）串联或 处于所述蛋白中的一个位置（例如PRM和锚定域之间）。亲和标记是一个序列，其通常允 许使用亲和技术纯化嵌合蛋白和/或将嵌合蛋白附着至具有已知方向的亲和表面。现有技 术中已知几种不同类型的亲和标记。在具体的实施方案中，亲和标记选自血凝素、Avi标记 (AviTag?)、V5、Myc、17、FLAG、HSV、VSV-G、His、生物素或 STREP 形成的组合。血凝素标记 的序列是SEQ ID N0:22。AviTag?标记的序列是SEQ ID N0:32。V5标记的序列是SEQ ID NO :23。Myc标记的序列是SEQ ID NO :24。FLAG标记的序列是SEQ ID NO :25。HSV标记 的序列是SEQ ID NO :26。VSV-G标记的序列是SEQ ID NO :27。His标记的序列是SEQ ID NO :28。17标记的序列是SEQ ID NO :29。生物素标记的序列是SEQ ID NO :30。STREP标 记的序列是SEQ ID NO :31。当多于一个的亲和标记以串联的方式使用时，可以存在连接体 序列，从而使连接亲和标记与病原体识别模块和锚定域相连接。例如，亲和标记His (SEQ ID N0:28)和生物素 （SEQ ID N0:30)之间的连接体序列是SEQ ID N0:13。但是应当注意的 是，锚定域可以是未和标记。
[0070] 嵌合蛋白还可以包括信号肽，其用于指导合成细胞中蛋白的分泌和/或运输。该 信号肽可以位于嵌合蛋白的一端。这样的信号肽的两个例子是来自于TMP2和BM-40蛋白 的肽（分别为 SEQ ID NO : 15 和 SEQ ID NO : 16)
[0071] 但是应当注意的是，由于本文所公开CSR的病原体识别模块和锚定域各自来自与 不同的哺乳动物SR，本发明无意于涵盖天然的SR。这可以通过使用术语"重组"和"嵌合" 得以表现出来，"重组"和"嵌合"指的是该蛋白是人工合成并且可以包括功能单元以及不同 的蛋白质片段的事实。图IA和图IB中所描绘的SR明确排除在本发明的范围之外。
[0072] 本文还公开了编码上述嵌合蛋白的核酸序列。该核酸序列可以是DNA或RNA。本 领域公知，蛋白质中的氨基酸序列是由核酸序列定义，此核酸序列被转录和/或翻译以产 生所述蛋白质。公认的，核酸序列中的每组三联体的核苷酸表示一个特定的氨基酸，如果蛋 白质是已知的，适当的核酸序列就是已知的，且反之亦然。
[0073] 本发明的嵌合蛋白可以通过将cSR的核苷酸序列插入表达载体中来制备，载体随 后被转染到宿主细胞中。示例性载体包括质粒和病毒。然后由宿主细胞产生嵌合蛋白，并 且可以随后对嵌合蛋白进行分离。这些方法是本领域技术人员所熟知的。
[0074] 嵌合蛋白可用于制备药物组合物，其包含嵌合蛋白和药学上可接受的载体。该载 体可以是可注射的载体、局部载体、透皮的载体和类似物。有利地，其制备可以是针对局部 给药的形式，例如作为软膏、凝胶、乳膏、喷雾、分散剂、悬浮剂或糊剂的形式。该制剂可以进 一步有利地在组合物中包括防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗氧化剂、渗透剂和类似的材料，且 它们的量是常规的。适合与本发明结合使用的溶液是无菌的，对所提议的应用是无害的， 并且可以经受常规的药物操作如灭菌和/或可以含有常规的佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿 齐II、乳化剂、缓冲剂等。可以参照 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed. ,Mack Publishing Co. ,Easton, Pa. (1975)，用于协助配制本发明的组合物。
[0075] 嵌合蛋白可以固定在支持物或固相上以得到亲和介质，其在本文中也可以称为抗 病原体免疫粘附素（API)。嵌合蛋白的锚定域附着于固相，允许病原体识别模块与它的特定 病原体或病原体衍生分子相互作用。固相可以是（例如）珠子、片或条、褶片等形式。本文 还考虑了使用嵌合蛋白的方法。一种预防或治疗与病原体或病原体衍生分子相关的疾病的 方法，其中包括上文所述的亲和介质，其构成固相和附着在该固相上的一个或多个cSR。每 种嵌合蛋白（cSR)包括病原体识别模块和锚定域，以及任选的一个或多个连接体。从患病 个体得到生物样品（如血液），并使其接触亲和介质，以结合所述样品中的任何病原体或病 原体衍生分子。然后，将除去已结合粒子的样品返回到患病个体。这样可以从所述生物中 去除作为所述嵌合蛋白目标的病原体/病原体衍生分子。任选地，亲和介质可以随后通过 如本文所公开的洗脱所结合分子的方式进行再生，并且随后重新作为介质用于相同或不同 的目的。
[0076] 嵌合蛋白也可作为药物用于与病原体或病原体衍生分子相关疾病的预防或治疗。 在这样的实施方案中，一个或多个cSR用于上文所述的药物组合物中，同时使用或不使用 亲和介质。亲和介质本身可以进一步直接或间接地影响目标病原体，使得cSR将固相带给 特定生物或分子。所述药物组合物为局部施用，或者根据病原体或病原体衍生分子决定其 施用方式。例如，在本发明一个实施方案中，含有对人类免疫缺陷病毒的（HIV)高亲和性的 cSR的乳膏可以施用在生殖器区域，以灭活HIV和/或防止其侵入宿主细胞。在本公开的 另一实施方案中，含有一个或多个cSR的凝胶，其可以结合细菌，通过在伤口敷料来固定和 /或破坏干扰伤口愈合的细菌。所述药物组合物可用于预防性或治疗性应用。
[0077] 本文还考虑了用于确定受试亲和介质对病原体功效的方法。接收含有病原体的生 物样品，然后使其与含有病原体识别模块的亲和介质接触。检测/测定病原体和病原体识 别模块之间结合的量，例如通过使用免疫组化装置如比色法，相连二级抗体，表面等离子体 共振成像，或高效液相色谱（HPLC)进行。病原体和受试亲和介质中的病原体识别模块之间 的结合量可以与参考相比。配体与亲和介质的结合表明亲和介质很可能对病原体的固定化 /靶向很有效。可选地，剩余样品中存活的病原体的数量，或者所述样品诱导组织体外反应 (例如分离的PBMC)的能力可以通过样品对亲和介质的传代进行测定。也可以使用表达病 原体识别模块的测试细胞进行这种类型的测试。该测试细胞包含信号装置，其通过病原体 识别模块运作。然后信号水平会显示结合的程度。信号下降则说明测试细胞表达的特定 cSR对于固定病原体是好的选择。
[0078] 图2示出嵌合蛋白的示例性使用。此处，在标记的SRAl和SRA2柱中，嵌合蛋白结 合到固相上并用于过滤。血浆分离装置，例如尺寸排阻过滤器，从患者得到血液，并分离血 液，得到含有病原体血浆。然后，血浆通过体外循环泵传递到SRAl或SRA2的过滤器中，在 过滤器中病原体与血浆分离。然后血浆返回到血浆分离装置并回到患者体内。柱切换装置 的存在使得当一个过滤器在清洁血浆时，另一个过滤器中可以再生。其可以（例如）通过 用低PH甘氨酸-HCl混合物洗脱，接着用PBS洗涤的方式再生。输入到每个过滤器的可以 是（i)血浆或（ii)清洗溶液。每个过滤器输出的可以是（a)清洗的血浆或（ii)废液。抗 凝血剂是可选的，但在这里已经示出。分离的肝素、柠檬酸盐和/或其他这样的抗凝血剂及 方法是本领域普通技术人员所熟知的。
[0079] 可以通过参照下列实施例进一步理解本发明的各方面。这些实施例是说明性的， 并非是为了限制其实施方式。 实施例
[0080] 实施例1?具有部分MARCO锚蛋白的MARCO PRM
[0081] 可以通过已建立的分子生物学方法产生编码cSR截断可溶性MARC0(SEQ ID NO: 7)的构建体，其包含位于pcDNA3.1/Zeo(_)哺乳动物表达载体（Invitrogen)中的以下元 素：
[0082] 1)来自BM-40蛋白的分泌信号肽（SEQ ID NO :16);
[0083] 2)用于蛋白质纯化的8-组氨酸-长标记和连接体（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 14)；
[0084] 3)缺失残基300-419 (核苷酸897-1257)的小鼠 MARCO残基75-518 (对应于核苷 酸223-1557)的胞外部分（SEQ ID NO :21)。这种形式的MARCO缺少小鼠 MARCO的89-重 复-长的胶原结构域的最后40个Gly-X-Y重复单元；并且作为跨膜蛋白，其已被证明是清 道夫受体配体、热灭活的E. coli和乙酰化LDL(低密度脂蛋白）的强结合剂。
[0085] 一个类似的cSR截断可溶性人类MARCO序列可以表示为SEQ ID NO :8。此类似序 列的人类MARCO部分为SEQ ID NO :32。
[0086] 实施例2
[0087] 实施例2?具有SCARA5锚蛋白的SR-A PRM。
[0088] 编码具有小鼠 SR-Al SRCR (清道夫受体、富含半胱氨酸）结构域（SEQ ID NO :9) 的cSR可溶性小鼠 SCARA5的构建体被克隆进pcDNA3. l/Ze〇(_)载体，并且该构建体包含以 下元素：
[0089] 1)来自TMP2蛋白（SEQ ID NO :15)的分泌信号肽；
[0090] 2)用于蛋白质纯化的6-组氨酸-长标记和连接体（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0091] 3)小鼠 SCARA5的胞外部分，所不同的是该蛋白的SRCR结构域置换为来自小鼠 SR-A的SRCR结构域。换言之，该嵌合形式包含来自SCARA5(核苷酸247-1140)的残基 83-380,随后是来自SR-A (残基345-454对应于核苷酸1035至1362)的SRCR结构域（SEQ ID NO :33)。作为一种跨膜蛋白，这种形式SCARA5的牢固结合热灭活大肠杆菌和乙酰化 LDL (比完整的SCARA5更强），图11进一步对此进行了讨论。
[0092] 一个类似的cSR截断可溶性人类SCARA5序列可以表示为SEQ ID NO : 10。此类似 序列的人类SCARA5部分为SEQ ID NO :34。
[0093] 实施例3
[0094] 实施例3?具有SCARA5胞外部分的SCARA5 PRM。
[0095] 通过已建立的分子生物方法产生编码cSR可溶性小鼠 SCARA5的结构（SEQ ID NO : 5)的构建体，其包括在pcDNA3. l/Zeo(_)哺乳动物表达载体（Invitrogen)中的以下元素：
[0096] 1)来自TMP2蛋白的分泌信号肽（SEQ ID NO :15);
[0097] 2)用于蛋白质纯化的6-组氨酸-长标记和连接体（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0098] 3)小鼠 SCARA5残基83-491的胞外部分（对应于核苷酸247-1476) (SEQ ID NO : 19)。如图11和图12所示，作为胞外蛋白，SCARA5能够结合热灭活大肠杆菌和内化的LPS。
[0099] 一个类似的cSR可溶性人类SCARA5序列可以表示为SEQ ID N0:3。所述人类 SCARA5 序列为 SEQ ID NO :17。
[0100] 实施例4
[0101] 实施例4.具有截断的SCARA5的胞外部分的SCARA5 PRM。
[0102] 通过已建立的分子生物方法产生编码cSR可溶并截断的小鼠 SCARA5的构建体 (SEQ ID NO :6)，其包括在pcDNA3.1/Zeo(_)哺乳动物表达载体（Invitrogen)中的以下元 素：
[0103] 1)来自TMP2蛋白的分泌信号肽（SEQ ID NO :15);
[0104] 2)用于蛋白质纯化的6-组氨酸-长标记和连接体（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0105] 3)小鼠 SCARA5残基341-491的截断胞外部分（对应于核苷酸1021-1476) (SEQ ID NO :20)。如图11和图12所示，作为胞外蛋白，SCARA5能够结合热灭活大肠杆菌和内化的 LPS。
[0106] 一个类似的cSR可溶性人类SCARA5序列可以表示为SEQ ID NO :4。人类SCARA5 序列为 SEQ ID NO : 18。
[0107] 实施例5
[0108] 实施例5.所使用的cSR的表达
[0109] 采用I丐磷酸盐转染方法将质粒转染入293/EBNA细胞（Invitrogen)中。转染后第 一天，细胞以不同密度接种在IOcm组织孵育板中，第二天用硫酸博来霉素（500pg/ml)进行 筛选。两周后，采用克隆环对克隆进行挑选，并扩大克隆。通过免疫荧光染色和ELISA的重 组蛋白质表达，对克隆进行筛选。第一种方法依赖于假设有较高的表达水平，更多的蛋白还 积聚在细胞内的分泌路径上。对于ELISA，用细胞孵育上清液涂布96孔板，并且通过单克 隆抗体对抗Marco的SRCR结构域（截断MARCO-克隆）或多克隆抗体对抗SCARA5的C末 端来进行ELISA方法。对最高表达进行了扩展，并用于生产蛋白。在初始选择之后，Zeocin 选择降低至250皮克/毫升。
[0110] 实施例6
[0111] 实施例6.所用的HIS-标记的cSR在HEK-293 EBNA细胞中的制备。
[0112] 在具有Glutamax-I，并补充有10 %胎牛血清（FCS)、青霉素-链霉素（PS)和丙酮 酸钠的DMEM中（这在本文中称为正常培养基），使得所选择的细胞系（分泌His-标记的 蛋白到细胞培养基中）以单层形式生长。细胞培养基还包含用于选择的合适抗生素（保存 EBNA细胞所需的250皮克/毫升的G418、125微克/毫升zeosin、或3皮克/毫升嘌呤霉 素）以及每日添加的100皮克/毫升抗坏血酸（仅用于含胶原序列的蛋白质）。在汇合时， 收获培养基，并将细胞碎片离心出来（1000转，5分钟）。将上清液储存在4°C或-20°C直到 纯化。其中一种细胞板进一步分裂1 :4至1 :6,并在DMEM中生长至融合。
[0113] 在其它板中，所收获的培养基更换为无血清的DMEM/F-12(1 :1)，其中补充有 Glutamax-1、PS、丙酮酸钠和抗坏血酸。3天后收获无血清细胞培养基。如果可能的话，将 细胞用新鲜的无血清培养基覆盖，以进行进一步的蛋白质生产。
[0114] 实施例7
[0115] 实施例7.所用的HIS-标记的cSR的纯化
[0116] 过滤细胞培养基并注入由Talon-matrix填充并用Ix磷酸盐缓冲液（50mM磷酸 钠、150mM的氯化钠 、pH 7.0)平衡的柱中。注射后，将未结合的蛋白用含10-15mM咪唑的 2x磷酸盐缓冲液洗涤。为了洗脱带有His标记的蛋白，咪唑浓度增加至200mM。洗脱后，用 SDS-PAGE将含有有用蛋白的级分进行鉴定，收集并用PBS透析以除掉咪唑（3 X 2小时，1000 倍体积的缓冲液）。分离纯化具有血清的样品和无血清样品。
[0117] 实施例8
[0118] 实施例8.采用实施例1的cSR形成亲和介质（API)。
[0119] 在这一组实验中，Talon超流金属亲和树脂（Clontech)用作固相以制备亲和介 质。珠子的容量为5至20晕克蛋白/晕升树脂。
[0120] 对于去除细菌试验，实施例1的嵌合蛋白在2升细胞培养基（普通培养基（NM)或 无血清培养基（SF))中纯化，然后将其与Iml树脂偶联。产生两组珠子，一组使用在匪中 产生的蛋白质，而另一组使用SF中产生的蛋白质。
[0121] 用经PBS透析纯化的嵌合蛋白与珠子混合，并在+4°C下旋转过夜。结合后，在重力 作用下使悬浮液经过柱子运动而得到珠子。将珠子洗涤并悬浮在I : 1体积的PBS中。从 该悬浮液得到样品，用两种方法分析蛋白结合到珠子的量：对于洗脱的蛋白，用SDS-PAGE 和Bradford法测定染色蛋白带的密度。10 ill的珠子与SDS上样缓冲液混合后，将一定量的 珠子加样在凝胶上。在本实施例中，凝胶上有〇. 125 ill珠子。基于光密度的估计（图3)， 结合的蛋白的浓度为约8pg蛋白/ii I beads。基于Bradford测定法的标准曲线（图4)， 洗脱的蛋白的浓度分别为2. 1 (无血清）和2. 8 (正常培养基）pg/ iU珠子。对于洗脱的蛋 白质，0D595s分别为0. 178和0. 239。
[0122] 图3示出用于密度估计的SDS-PAGE。泳道1-7 (从左边起）包括标记浓度的蛋白 (BSA)，以pg/泳道为单位。标记SF的泳道用无血清培养基中的嵌合蛋白。标记匪的泳道 使用正常培养基中的嵌合蛋白。标记Std的泳道表示分子量标准。
[0123] 图4示出Bradford测定法标准曲线。标准曲线是用一式三份不同浓度的BSA、并 基于平均方程而绘制的。0D595指的是在595nm处测量的吸光度。
[0124] 实施例9
[0125] 实施例9.得自实施例8的亲和介质（API)的细菌去除能力。
[0126] 将偶联后的珠子（匪和SF)和空白对照珠子用PBS冲洗并在人血清（没有灭活的） 中孵育以平衡珠子。将珠子在+4°C旋转过夜。第二天，使四种细菌（ESBL大肠杆菌、肺炎链 球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌（MRSA)和脑膜炎奈瑟氏球菌）生长至OD = 0. 5 (?3X10exp 8CFU/ml)。将细菌稀释到人血清中浓度^ IOexp 3CFU/ml，并保持在冰上。（注："10exp n" 在本文中用于指10的n次幂）。
[0127] 对各种细菌悬液，500 ill的控制量在振荡器上37°C孵育10分钟。对所述控制进 行活性计数。
[0128] 然后将500 ill的细菌悬浮液加至5ml柱内100 ill经涂覆的珠子中，在振荡器上 +37°C下孵育10分钟。将珠子离心下来（1000转，1分钟），并且推动细菌悬浮液通过珠子 (级分1)。然后将珠子用5x200 ill的PBS、lx500 ill的PBS和2x500 ill的pH为8的含 200mM咪唑的PBS (级分2-9)洗涤。最后，将珠子重新悬浮于500 ill的PBS中（级分10)。 每个级分进行活菌计数并绘制在一条曲线上。三种珠子（NM，SF，和对照）中的每一种都进 行这样的处理。
[0129] 图5分别示出每种细菌和每组珠子的结果。一共有四排，对应于所述细菌。左边 一列提供了每个级分的活菌计数。y轴在这些图表为％应用率，100%对应于对照组的活菌 数。X轴是级分。请注意，y轴在每幅图中都不同。蓝线是对照组珠子。红线是匪组珠子。 绿线是SF组珠子。这些图中左栏基本上表明如何能够快速洗掉珠子中的细菌，这可以用于 度量嵌合蛋白质与细菌结合的紧密程度。如曲线下降到零的情况所示，大肠杆菌、葡萄球菌 和脑膜炎奈瑟氏球菌以相似的速率从珠子中洗掉，而肺炎链球菌从SF或匪珠子中除去较 慢。这可以解释为嵌合蛋白与肺炎链球菌的结合十分牢固。如图中y轴所示，对于大肠杆 菌、葡萄球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌，对照组珠子的应用％更高，这说明几乎很少的细菌被对 照组珠子杀死。
[0130] 右边一列提供在500 ill悬浮液中存活的细菌计数。在这些图中y轴是％存活率， 100%对应于在推压悬浮液经过珠子前悬浮液中所有的细菌的计数。条形代表在珠子被除 去后仍然存在的细菌的量（％)(假设对照试验的活菌计数也适用于这些悬浮液）。请注意， y轴在每幅图中都不同。对于大肠杆菌，与对照实验相比，嵌合蛋白能够从悬浮液中除去显 著更高百分比的存活细菌，而SF中培养的蛋白比匪中培养的蛋白多除去接近50%。对于 MRSA，嵌合蛋白比对照实验除去更多的细菌。对于肺炎链球菌，三组珠子之间的差异并不显 著。对于脑膜炎奈瑟氏球菌，与对照实验相比，嵌合蛋白除去更大百分比的细菌。
[0131] 实施例10
[0132] 实施例10.使用实施例2中cSR的亲和介质（API)的细菌去除能力。
[0133] 如实施例6-8所述，制备、纯化嵌合蛋白，并将其偶联至珠子。该嵌合蛋白包含具 有SCARA5锚定域的SR-A PRM。基于密度测量法，经测定结合蛋白的浓度为4. 2pg/iil珠 子；基于Bradford分析法，结合蛋白的浓度为I. 5g/ii 1珠子。如实施例9中所述进行除菌 分析。但是，在该实验中使用了 200iU经涂覆的珠子。对照珠子预先在人血清中孵育。
[0134] 图6分别示出每种细菌和每组珠子的结果。同样有四排，其对应于各细菌。左边 一列提供了在每个级分的活菌计数。y轴在这些图表中表示％应用率，100%对应于对照实 验中的活菌数。X轴是级分。请注意，y轴在每幅图中都不同。蓝线是对照珠子。红线是具 有嵌合蛋白的珠子。同样地，肺炎链球菌的去除比较缓慢。这可以解释为嵌合蛋白质与肺 炎链球菌的结合十分牢固。如图中y轴所示，相比葡萄球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌，对照珠子 的％应用更高，这说明几乎很少的细菌被对照珠子杀死。
[0135] 右列提供在500 ill悬浮液中存活细菌的计数。在这些图中y轴是％存活，100% 对应于在推压悬浮液经过珠子前悬浮液中所有细菌的计数。条形代表在珠子被除去后仍然 存在的细菌的量（％)(假设对照试验的活菌计数也适用于这些悬浮液）。请注意，y轴在 每幅图中都不同。对于MRSA和N. meningtidis，与对照实验相比，嵌合蛋白除去细菌的百分 比高得多。对于，大肠杆菌和肺炎链球菌，除去细菌的量大致相同。
[0136] 实施例11
[0137] 实施例11.使用实施例3中cSR的亲和介质（API)的细菌去除能力。
[0138] 如实施例6-8所述，制备、纯化嵌合蛋白质，并将其偶联至珠子。该嵌合蛋白包含 SCARA5锚定域。珠子上蛋白的浓度估计为0. 9pg/iil珠子。
[0139] 偶联的珠子和空白对照珠子被装填入具有2ml床体积基质的柱中，并用PBS洗涤。 第二天，ESBL大肠杆菌生长至OD = 0. 5 ( = 3 X IOexp 8CFU/ml)。将细菌稀释至在PBS中 的浓度为IOexp 4CFU/ml，并保持在冰上。
[0140] 活菌计数是在该悬浮液中进行并且Iml悬浮液被推压入柱中（级分1)。先用2xlml PBS洗脱（级分2和3)，以除去柱中空的缓冲体积。然后用3x300 ill含有大部分未结合细 菌的PBS洗涤珠子（级分4-6)。然后再用10x100 ill PBS洗涤（级分7-16)，其示出在经 cSR涂覆的柱中结合和/或杀死的细菌。最后用20x300 ill PBS洗涤柱（级分17-36)。最 后，将珠子重新悬浮于Iml PBS中，以获得柱中残留的活菌数量（级分37)。对每个级分得 到相应的活菌数并绘制在一条曲线上。对照珠子和经cSR涂覆的珠子也进行这样的处理。
[0141] 图7示出每组珠子的结果。左边一列提供每个级分的活菌计数。在这些图表中y 轴为菌落形成单位（CFU)/ml。X轴是级分。红线是对照珠子。绿线是具有嵌合蛋白的珠 子。具有嵌合蛋白的柱的细菌洗脱停止的更早，这说明此实验中更多的细菌被结合或者被 杀死。
[0142] 右列提供了珠子悬浮液中存活的细菌计数。在这些图中y轴是％存活率，100%对 应于在推压悬浮液经过珠子前悬浮液中所有的细菌的计数。条形代表在珠子被除去后仍然 存在的细菌的量（％ )。具有嵌合蛋白的柱中残留大肠杆菌的量稍稍高些。
[0143] 实施例12
[0144] 实施例12.使用实施例4中cSR的亲和介质（API)的细菌去除能力。
[0145] 如实施例6-8所述，制备、纯化嵌合蛋白，并将其偶联到珠子。该嵌合蛋白包含截 断SCARA5锚定域。珠子上蛋白质的浓度估计为lpg/iil珠子。
[0146] 偶联的珠子和空白对照珠子被装填入具有Iml床体积基质的柱中，并用PBS洗漆。 第二天，ESBL大肠杆菌生长至OD = 0. 5 ( = 3 X IOexp 8CFU/ml)。将细菌稀释到在PBS中 的浓度为IOexp 3CFU/ml，并保持在冰上。
[0147] 将细菌悬浮液在+37°C孵育2分钟。在实施下一步之前进行活菌计数。
[0148] 在将细菌悬浮液推压入柱中之前，先用人血清洗涤柱。然后在+37°C孵育500 ill 的细菌悬浮液2分钟，并推压入柱中。先用2x300 iU的PBS洗涤（级分1-2)，以除去柱中 空的缓冲体积。然后再用12x100 PBS (级分3-14)洗涤珠子，其显示经涂覆的柱中细菌 的结合情况。最后，将珠子重新悬浮于ImlPBS中，以得知柱中残留的活菌数量。每个级分 得到相应的活菌数，并绘制在一条曲线上。对照珠子和经嵌合蛋白涂覆的珠子也进行这样 的处理。
[0149] 图8为每组珠子的结果。左边一列提供了在每个级分的活菌计数。在这些图表中 y轴为施加浓度的％，100%对应于对照组中的活菌数。X轴是级分。红线是对照珠子的平 均数。紫线是具有嵌合蛋白的珠子的平均数。从具有重组蛋白的柱中洗脱的细菌的数量稍 高，这说明此实验中在测试柱中结合或者被杀死的细菌比对照实验中的少。
[0150] 右列提供了珠子悬浮液中存活的细菌计数。在这些图中y轴是％存活，100%对应 于在推压悬浮液经过珠子前悬浮液中所有的细菌的计数。对比左边柱中的数据，具有嵌合 蛋白的柱中残留大肠杆菌的量稍稍高些。
[0151] 实施例13
[0152] 实施例13.暴露于来自实施例1和2的流通级分的PBMC中的免疫活性。
[0153] 用实施例9和10中得到的级分处理外周血单核细胞（PBMCs)。将分离的PBMC铺 板（IOexp 5个细胞/孔），并且第二天用洗脱级分和庆大霉素处理4小时，以防止细菌生 长。收集细胞培养基，并且采用ELISA以脂多糖（LPS)作为阳性对照测定产生的TNF-a的 量。该实验表明是否是通过该柱的级分导致了 PBMCs的免疫活性。
[0154] 图9示出实施例1嵌合蛋白质的结果（PRM来自附加了 MARCO锚蛋白的MARCO)。y 轴是TNF-a的量，单位为pg/ml。绿线是对照珠子。紫线是匪珠子。蓝线是SF珠子。此 处的级分10是所有洗涤完成后留在柱上的细菌悬浮液。相比于对照珠子，cSR珠子对级分 10中的所有细菌呈现更高的激活（例如，与珠子结合），在第一级分（含游离的细菌）中的 情况也一样。保存的免疫反应表明，来自cSR柱的级分里发现大量的免疫活化分子，这与低 含量的细菌量（图5和图6)共同说明更多的细菌在这里被杀死。
[0155] 图10示出实施例2中cSR的结果（PRM来自附加了 SCARA5锚蛋白的SR-A)。绿线 是对照珠子。紫线是具有嵌合蛋白的珠子。同样的，此处的级分10是所有洗涤完成后留在 柱上的细菌悬浮液。相比于对照珠子，具有嵌合蛋白的珠子对级分10中的所有细菌呈现更 高的激活（例如，与珠子结合），在第一级分（含游离的细菌）中除了大肠杆菌外其他的情 况也一样。
[0156] 实施例14
[0157] 实施例14 :大肠杆菌和acLDL通过SCARA5的跨膜形式结合，实施例2中的cSR(具 有SCARAl SRCR结构域作为PRM的SCARA5锚），以及通过使SCARA5锚与作为PRM的SCARA2 SRCR结构域结合所制得的cSR。
[0158] 将三种蛋白全部转染到CHO细胞中并进行表达。为了进行比较，对照细胞无蛋白 表达。然后将每种细胞类型暴露于热灭活大肠杆菌和乙酰化低密度脂蛋白中，以对结合进 行测定。使用抗-SCARA5抗体来证实表达蛋白的存在。
[0159] 结果示于图11。控制细胞与所有三种材料弱结合。具有完整SCARA5的细胞与大 肠杆菌结合，并且与AcLDL弱结合。所述SCARA5/SCARA2 cSR与大肠杆菌和AcLDL两者强 结合。所述SCARA5/SCARA1 cSR也与大肠杆菌和AcLDL强结合。与受体相比，这两种cSR 呈现出比完整的SCARA5高的配体结合能力，这说明了本发明是如何改进SR的结合亲和力 的。
[0160] 实施例15
[0161] 实施例15 :细菌LPS通过SCARA5的内化。
[0162] 为了 LPS的内化，对小鼠 SCARA5转染的CHO细胞进行检测。团粒2 (Crb2)表达的 CHO细胞作为阴性对照。肌动蛋白染色（红色）表明细胞的存在。结果示于图12。标记 了 "Ab staining"的行表示成功转染和表达（抗体识别SCARA5和Crb2得到绿染色）。标 有"LPS internalization"的行显示内吞后的细胞内LPS(绿色）。这些结果第一次表明 SCARA5能够结合和内化LPS。
[0163] 实施例16
[0164] 实施例16 :嵌合受体之间对于细菌亲和性的差异
[0165] 表达并纯化序列为SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :35的嵌合受体蛋 白（API)，然后参照实施例8将其与珠子偶联（Talon?, Clontech，U. S. A.)。将不含有蛋 白的空白珠子作为对照试验。
[0166] 两种珠子都与嵌合受体偶联，并且用PBS冲洗空白对照珠子，然后在人血清（未灭 活）中+4°C孵育过夜。第二天，四种细菌（ESBL大肠杆菌、肺炎链球菌、多重耐药金黄色葡 萄球菌（MRSA)和生物素化的/热杀死的MRSA)生长至OD = 0. 5 ( ^ 3X 10exp8 CFU/ml)。 将细菌稀释至在人血清中浓度为10exp3 CFU/ml，并保持在冰上。
[0167] 对于对照实验，100 空白珠子与500 ill人血清在振荡器上37°C孵育10分钟。 此对照实验将得到一个活菌数。
[0168] 然后在5ml柱中的100 ill经涂覆的珠子中，加入500 ill细菌悬浮液，在振荡器上 37°C孵育10分钟。将珠子离心下来（1000转，1分钟），并且推压细菌悬浮液通过珠子（级 分1)。用200 ill PBS洗涤珠子5次，然后用500 ill PBS洗涤珠子1次（级分2-7)。最后， 将珠子在500 ill PBS中重新悬浮（级分8)。
[0169] SEQ ID NO :35的嵌合蛋白也被生物素化，并结合到经链霉亲和素涂覆的珠子基质 (Pierce化学公司，美国）。测试生物素化的蛋白对MRSA的抗性。
[0170] 对每个级分进行活菌计数并绘制在曲线上，并且将每个级分样品用于PBMC刺激 测定（如上所述）。分别对每个测试API进行上述所有步骤。
[0171] 表1表明，选定病原体在经过含有与不同嵌合受体蛋白偶联的珠子的柱中，活力 相对下降。从所述柱流过物所得到的菌落数用菌落计数占进入柱子之前的菌落计数的百分 比表示。整个过程中生物素、死亡的多重耐药金黄色葡萄球菌（MRSA)作为阴性对照。
[0172] 表 1
【权利要求】
1. 一种重组嵌合蛋白，包含： 来自哺乳动物清道夫受体的病原体识别模块；和锚定域。
2. 如权利要求1所述的蛋白，其在所述病原体识别模块和所述锚定域之间还包含连接 体。
3. 如权利要求2所述的蛋白，其中所述连接体是约2个至约15个氨基酸的序列。
4. 如权利要求2所述的蛋白，其中所述连接体包括至少两种不同的氨基酸。
5. 如权利要求4所述的蛋白，其中所述至少两种不同的氨基酸选自由丙氨酸、组氨酸 和甘氨酸构成的组。
6. 如权利要求1所述的蛋白，还包含亲和标记。
7. 如权利要求6所述的蛋白，其中所述亲和标记选自由血凝素、Avi标记、V5、Myc、T7、 FLAG、HSV、VSV-G，6-His、生物素和 STREP 构成的组。
8. 如权利要求1所述的蛋白，其中，所述病原体识别模块为C-末端，并且所述锚定域来 自哺乳动物清道夫受体。
9. 如权利要求8所述的蛋白，其中，所述病原体识别模块来自哺乳动物A类清道夫受 体。
10. 如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述锚定域是免疫球蛋白的Fc区。
11. 如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述锚定域来自与所述病原体识别模块不 同的哺乳动物清道夫受体。
12. 如权利要求1所述的蛋白，其中所述锚定域为来自哺乳动物A类清道夫受体的 α -螺旋卷曲螺旋结构域。
13. 如权利要求8所述的蛋白，其中的病原体识别模块是SRCR结构域、胶原结构域Ε、 富含半胱氨酸结构域、C型凝集素样结构域（CTLD)，溶酶体相关膜蛋白（LAMP)样结构域，粘 蛋白样结构域或EGF样结构域。
14. 如权利要求1所述的蛋白，还包含信号肽。
15. -种编码权利要求1所述的蛋白的核酸序列。
16. -种载体，包含编码权利要求1所述蛋白的核酸序列。
17. -种宿主细胞，包括载体，该载体含有编码权利要求1所述蛋白的核酸序列。
18. -种药物组合物，包含嵌合蛋白和药学上可接受的载体； 其中，所述嵌合蛋白包含：来自清道夫受体的病原体识别模块；和锚定域。
19. 一种亲和介质，包括固相和固定在该固相上的嵌合蛋白； 其中，所述嵌合蛋白包含：来自清道夫受体的病原体识别模块；和锚定域，所述锚定域 附着至所述固相上。
20. -种用于治疗与病原体或病原体衍生分子相关的疾病的方法，包括： 接收包括固相和固定在该固相上的嵌合蛋白的亲和介质，该嵌合蛋白包含（i)来自清 道夫受体的病原体识别模块和（ii )锚定域； 使生物样品与所述亲和介质接触，以使得所述的病原体或病原体衍生分子与所述亲和 介质结合。
21. -种用于确定受试亲和介质对病原剂的有效性的方法，包括： 接收含有所述病原剂的生物样品； 使所述生物样品与所述受试亲和介质的病原体识别模块接触；以及 检测所述病原剂和所述病原体识别模块之间结合的量。
22. 如权利要求21所述的方法，还包括将所述病原剂和所述受试亲和介质的病原体识 别模块之间结合的量与参考值对比。
23. -种用于预防或治疗与病原体或病原体衍生分子相关的疾病的药物，包含位于适 合于局部施用的载体中的嵌合蛋白。
24. -种重组嵌合蛋白，由以下组成： 信号肽； 至少一种亲和标记； 连接体； 来自哺乳动物清道夫受体的病原体识别模块；和 锚定域。
25. 如权利要求24所述的重组嵌合蛋白，其中所述病原体识别模块和锚定域来自于不 同的哺乳动物清道夫受体。
26. -种用于诊断患者是否患有与病原体或病原体衍生分子相关的疾病的方法，包 括： 接收亲和介质，该亲和介质包括固相和固定在该固相的固定空间内的嵌合蛋白，该嵌 合蛋白包含（i)来自清道夫受体的病原体识别模块和（ii )锚定域； 接收由所述患者获得的生物样品； 使所述生物样品与所述亲和介质接触，使任何病原体或病原体衍生分子结合至所述固 定空间；以及 检验所述固定空间是否存在有任何结合的病原体或病原体衍生分子。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述检验通过使任何结合的病原体或病原体衍生 分子与标记探针杂交来进行。
【文档编号】C07K14/705GK104321339SQ201380024894
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年3月12日
【发明者】卡尔·特吕格瓦松, 蒂莫·皮卡赖宁, 尤哈·奥贾拉, 约纳斯·艾克赛森 申请人:斯凯拉泰克医疗公司