从动物提取泛素及类泛素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从动物提取泛素及类泛素的方法，包含如下步骤：首先将节肢动物、环节动物、刺胞动物、可食用鱼类或家禽的组织、皮、肉及家畜的组织、皮、肉清洗干净，得到原料；然后将原料绞碎后湿磨，得到浆液；混匀浆液，加入碳酸氢钠或氢氧化钠，搅拌、离心收集上清液；将所述上清液浓缩至原体积的1/10～1/25，得到蛋白浓缩液；加入乙醇，静置后离心收集沉淀；用Tris-Gly缓冲液溶解沉淀配成溶液，将溶液经两次过滤收集分子量在6000～14000之间的截留液，即所述泛素及类泛素。该方法生产工艺简单、成本低，能制得安全性高、营养价值好的泛素及类泛素产品。
【专利说明】从动物提取泛素及类泛素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种从动物提取泛素及类泛素的方法。
【背景技术】
[0002]泛素(Ubiquitin，Ub)是一种多肽，由76个氨基酸构成，其分子量约8.5kDa，1975年首次从小牛的胰脏中分离出来，随后在许多不同有机体和组织中被发现，泛素的氨基酸序列具有高度保守性。在真核细胞内，泛素以共价键结合到底物蛋白质的赖氨酸残基上，被4个以上泛素标记的蛋白质将被送到“垃圾处理厂”，被26S蛋白酶体识别并迅速降解。近年来，随着对泛素研究的不断深入，发现泛素不仅仅是蛋白质降解的标记，还是细胞维持对那些受组成型调节和环境刺激产生的蛋白质水平的基本调节方式，细胞内蛋白质泛素化参与细胞的多种生理过程，比如:细胞周期进程、细胞器的发生、细胞凋亡、细胞增生和分化调节、内质网蛋白质的质控、蛋白转运、炎症反应、抗原提呈和DNA修复，以及细胞应激反应等等，在各个生命活动中发挥着重要的作用。
[0003]随着越来越多的泛素蛋白被报道，各种类似泛素的修饰蛋白也不断地被发现，如:SUM0、Rubl、Apgs和ApglZ等。类泛素蛋白(Ubls)作为信号使者与类泛素共同控制着多种细胞功能，诸如细胞增殖、凋亡、细胞周期及DNA修复，与泛素在人体自我修复功能系统中扮演着重要的角色。
[0004]泛素及类泛素蛋白有着广泛的生物学功能，泛素的开发应用价值将逐渐受到重视，从泛素及类泛素的研究中寻找治疗肿瘤疾病、心脏疾病、神经疾病等多种疾病的新途径将是未来医学的趋势之一，泛素及类泛素在植物基因工程技术和提高植物抗逆性等方面的探索及应用将为未来的农业提供新的线索与方向。
[0005]自1975年泛素在小牛胰脏中分离出来，目前对泛素及类泛素的研究主要集中在作用机理方面，随着科学技术和现代的分析手段的发展，越来越多的不同种类动物中的泛素及类泛素的作用机理正在被研究，但是目前利用动物为原料提取及纯化泛素的方法存在提取工艺复杂、成本高等缺点。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种从动物提取泛素及类泛素的方法，该方法生产工艺简单、成本低，能制得安全性高、营养价值好的泛素及类泛素产品。
[0007]为此，本发明的技术方案为:
[0008]一种从动物提取泛素及类泛素的方法，包含如下步骤:
[0009]I)将节肢动物、环节动物、刺胞动物、可食用鱼类或家禽的组织、皮、肉及家畜的组织、皮、肉用水或质量浓度低于0.3%的有机酸钠盐水溶液清洗干净，得到原料；所述有机酸钠盐为十二烷基硫酸钠、聚丙烯酸钠、甲酸钠或硬脂酸钠；
[0010]2)将所述原料绞碎后进行湿磨，湿磨过程中加入质量为所述原料5~7倍的浓度为25mmol/L、pH=7.6~8.0的Tris-Gly缓冲液；湿磨后进行匀浆，得到粒度为50~150目的浆液；
[0011]3)将所述浆液在4~10°C条件下置于恒温摇床中处理5~10h，或者在4~10°C条件下搅拌I~2h，得到均匀浆液；
[0012]4)向所述均匀浆液中加入质量浓度为0.2~1.0%的碳酸氢钠或者0.1~0.5%的氢氧化钠，充分搅拌，然后离心分离收集上清液；
[0013]5)将所述上清液浓缩至原体积的1/10~1/25，得到蛋白浓缩液；
[0014]6)向所述蛋白浓缩液中加入质量浓度为95%的乙醇直至其中乙醇质量浓度为75%时停止添加，静置后离心并收集沉淀；
[0015]7)向所述沉淀中加入pH=7.6~8.0、浓度为25mmol/L的Tris-Gly缓冲液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0016]8)将步骤7)得到的溶液用截留分子量为14000的超滤膜过滤并收集滤过液；然后将所述滤过液用截留分子量为6000的超滤膜过滤并收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0017]步骤5)浓缩上清液的方法是利用孔径为0.0001~0.001 μ m的透析膜循环过滤。 [0018]所述节肢动物为蜂、蚁、蛾、家蝉、蟋蟀、蝈蝈、蜈蚣、全蝎或蝗虫；所述环节动物为蚯蚓或水蛭；所述刺胞动物为海蜇；所述家畜为猪、牛或羊；所述家禽为鸡或鸭。
[0019]所述蜂为胡蜂、黄蜂或蜜蜂；所述蚁为白蚁或蚂蚁；所述蛾为天蛾、夜蛾或螟蛾。
[0020]本发明利用动物为原料，通过磨浆、脱脂、浓缩、沉淀、超滤等步骤获得泛素及类泛素蛋白，本发明方法的优点体现在以下两点:
[0021]I)从生产工艺上看，本发明在利用醇沉之前对粗蛋白液首先进行了浓缩，提高了沉淀前粗蛋白液的浓度，提高了醇沉效率，继而提高了泛素及类泛素蛋白的提取效率，在脱脂、醇沉步骤中使用的试剂成本低廉，且在提取过程中不引进有机溶剂等有毒物质，保证了提取泛素及类泛素蛋白的安全性。
[0022]2)从获得的产品上看，生产的泛素及类泛素蛋白与普通的蛋白粉相比更有效的增加免疫功效、促进免疫细胞的增殖，提高了原料利用价值的同时获得了有更高的实用价值和经济价值产品。
【具体实施方式】
[0023]以下结合实施例对本发明的技术方案进行描述。
[0024]实施例1
[0025]以水蛭为原料提取泛素及类泛素，包括如下步骤:
[0026]I)将水蛭用水清洗，不仅除去其躯体表面的污物，也去除消化道内的污物，得到原料；
[0027]2)将所述原料绞碎后进行湿磨，湿磨过程中加入质量为所述原料7倍的浓度为25mmol/L、pH=7.6的Tris-Gly缓冲液；湿磨后进行匀浆，得到粒度为50~150目的浆液；
[0028]3)将所述浆液在10°C条件下置于恒温摇床中处理5h ；
[0029]4)向所述均匀浆液中加入质量浓度为1.0%的碳酸氢钠充分搅拌，然后利用碟式离心机进行离心分离，收集上清液；
[0030]5)将所述上清液浓缩用0.0001 μ m的透析膜循环过滤，浓缩为原体积的1/20，得到蛋白浓缩液；
[0031]6)向所述蛋白浓缩液中加入质量浓度为95%的乙醇直至其中乙醇质量浓度为75%时停止添加，静置2h,在10000/min条件下离心15min,收集沉淀；
[0032]7)向所述沉淀中加入pH=7.6、浓度为25mmol/L的Tris-Gly缓冲液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0033]8)将步骤7)得到的溶液用截留分子量为1.4万的超滤膜过滤并收集滤过液；然后将所述滤过液用截留分子量为6000的中性超滤膜过滤并收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0034]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制成胶囊或片剂:
[0035]将上述泛素及类泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。
[0036]实施例2
[0037]以蚯蚓原料提取泛素及类泛素，包括如下步骤:
[0038]I)将蚯蚓用浓度为0.29%的聚丙烯酸钠水溶液进行清洗，不仅除去其躯体表面的污物，也去除消化道内的污物，得到原料； [0039]2)将所述原料绞碎后进行湿磨，湿磨过程中加入质量为所述原料6倍的浓度为25mmol/L、pH=7.6的Tri s-Gly缓冲液；湿磨后进行匀浆，得到粒度为50~150目的浆液；
[0040]3)将所述浆液在4°C条件下置于恒温摇床中处理7h ；
[0041]4)向所述均匀浆液中加入质量浓度为0.8%的氢氧化钠充分搅拌，然后利用碟式离心机进行离心分离，收集上清液；
[0042]5)将所述上清液浓缩用0.001 μ m的透析膜循环过滤，浓缩为原体积的1/20，得到蛋白浓缩液；
[0043]6)向所述蛋白浓缩液中加入质量浓度为95%的乙醇直至其中乙醇质量浓度为75%时停止添加，静置2h,在8000/min条件下离心20min,收集沉淀；
[0044]7)向所述沉淀中加入pH=7.6、浓度为25mmol/L的Tris-Gly缓冲液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0045]8)将步骤7)得到的溶液用截留分子量为1.4万的超滤膜过滤并收集滤过液；然后将所述滤过液用截留分子量为6000的中性超滤膜过滤并收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0046]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制成胶囊或片剂:
[0047]将上述泛素及类泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。
[0048]实施例3
[0049]以蜜蜂为原料提取泛素及类泛素，包括如下步骤:
[0050]I)将蜜蜂用浓度为0.1%的甲酸钠水溶液进行清洗，不仅除去其躯体表面的污物，也去除消化道内的污物，得到原料；
[0051]2)将所述原料绞碎后进行湿磨，湿磨过程中加入质量为所述原料6倍的浓度为25mmol/L、pH=8的Tris-Gly缓冲液；湿磨后进行匀浆，得到粒度为50~150目的浆液；
[0052]3)将所述浆液在6°C条件下置于恒温摇床中处理IOh ；[0053]4)向所述均匀浆液中加入质量浓度为0.2%的氢氧化钠充分搅拌，然后利用碟式离心机进行离心分离，收集上清液；
[0054]5)将所述上清液浓缩用0.0001 μ m的透析膜循环过滤，浓缩为原体积的1/15，得到蛋白浓缩液；
[0055]6)向所述蛋白浓缩液中加入质量浓度为95%的乙醇直至其中乙醇质量浓度为75%时停止添加，静置2h,在6000/min条件下离心20min,收集沉淀；
[0056]7)向所述沉淀中加入pH=8.0、浓度为25mmol/L的Tris-Gly缓冲液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0057]8)将步骤7)得到的溶液用截留分子量为1.4万的超滤膜过滤并收集滤过液；然后将所述滤过液用截留分子量为6000的中性超滤膜过滤并收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0058]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制成胶囊或片剂:
[0059]将上述泛素及类泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。
[0060]实施例4
[0061]以全蝎为原料提取泛素及类泛素，包括如下步骤:
[0062]I)将全蝎用水清洗，不仅除去其躯体表面的污物，也去除消化道内的污物，得到原料；
[0063]2)将所述原料绞碎后进行湿磨，湿磨过程中加入质量为所述原料5倍的浓度为25mmol/L、pH=8.0的Tris-Gly缓冲液；湿磨后进行匀浆，得到粒度为50~150目的浆液；
[0064]3)将所述浆液在6°C条件下搅拌lh，得到均匀浆液；
[0065]4)向所述均匀浆液中加入质量浓度为0.2%的碳酸氢钠充分搅拌，然后利用碟式离心机进行离心分离，收集上清液；
[0066]5)将所述上清液浓缩用0.0001 μ m的透析膜循环过滤，浓缩为原体积的1/20，得到蛋白浓缩液；
[0067]6)向所述蛋白浓缩液中加入质量浓度为95%的乙醇直至其中乙醇质量浓度为75%时停止添加，静置2h,在12000/min条件下离心IOmin,收集沉淀；
[0068]7)向所述沉淀中加入pH=8.0、浓度为25mmol/L的Tris-Gly缓冲液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0069]8)将步骤7)得到的溶液用截留分子量为1.4万的超滤膜过滤并收集滤过液；然后将所述滤过液用截留分子量为6000的中性超滤膜过滤并收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0070]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制成胶囊或片剂:
[0071]将上述泛素及类泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。
[0072]性能测试:
[0073](I)泛素及类泛素蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖能力试验
[0074]取实例中1、2提取的泛素及类泛素，选取小白鼠进行试验。
[0075]试验方法:将小鼠处死，无菌取脾脏，用镊子轻轻将脾磨碎，用Hank’s液洗涤两次，在lOOOr/min条件下离心IOmin收集细胞，用含血清的RPM1-1640培养液制成单个细胞悬液。调整细胞浓度为4X106个/mL。将细胞悬液加入96孔培养板中，150 μ L/孔，白对照加入不含血清的RPM1-1640培养液50 μ L，其他各组加入用不含血清的RPM1-1640培养液配置成的蛋白质溶液50 μ L，每个样品做三个平行，置于37°C、含有5%C02的CO2孵箱中培养72h。
[0076]培养结束前4h，加入XTT-PMS30 μ L/孔，培养结束后，在酶标仪上测450nm波长条件下各孔的光吸收值，以此值表示细胞增殖程度。
[0077]实验结果:下表为不同蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响。可见2~5组空白对照组相比有显著差异，实例中获取的蛋白质均能促进脾淋巴细胞的增殖，实例中获得泛素及类泛素蛋白与普通蛋白相比更加能促进脾淋巴细胞的增殖。与空白对照相比具有显著差异(P < 0.05)
[0078]
【权利要求】
1.一种从动物提取泛素及类泛素的方法，其特征在于包含如下步骤: 1)将节肢动物、环节动物、刺胞动物、可食用鱼类或家禽的组织、皮、肉及家畜的组织、皮、肉用水或质量浓度低于0.3%的有机酸钠盐水溶液清洗干净，得到原料； 2)将所述原料绞碎后进行湿磨，湿磨过程中加入质量为所述原料5~7倍的浓度为25mmol/L、pH=7.6~8.0的Tris-Gly缓冲液；湿磨后进行匀浆，得到粒度为50~150目的浆液； 3)将所述浆液在4~10°C条件下置于恒温摇床中处理5~10h，或者在4~10°C条件下搅拌I~2h，得到均匀浆液； 4)向所述均匀浆液中加入质量浓度为0.2~1.0%的碳酸氢钠或者0.1~0.5%的氢氧化钠，充分搅拌，然后离心分离收集上清液； 5)将所述上清液浓缩至原体积的1/10~1/25，得到蛋白浓缩液； 6)向所述蛋白浓缩液中加入质量浓度为95%的乙醇直至其中乙醇质量浓度为75%时停止添加，静置后离心并收集沉淀； 7)向所述沉淀中加入pH=7.6~8.0、浓度为25mmol/L的Tris-Gly缓冲液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液； 8)将步骤7)得到的溶液用截留分子量为14000的超滤膜过滤并收集滤过液；然后将所述滤过液用截留分子量为6000的超滤膜过滤并收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述有机酸钠盐为十二烷基硫酸钠、聚丙烯酸钠、甲酸钠或硬脂酸钠。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤5)中浓缩上清液的方法是利用孔径为0.0001~0.001 μ m的透析膜循环过滤。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述节肢动物为蜂、蚁、蛾、家蝉、蟋蟀、蝈蝈、蜈蚣、全蝎或蝗虫；所述环节动物为蚯蚓或水蛭；所述刺胞动物为海蜇；所述家畜为猪、牛或羊；所述家禽为鸡或鸭。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于:所述蜂为胡蜂、黄蜂或蜜蜂；所述蚁为白蚁或蚂蚁；所述蛾为天蛾、夜蛾或螟蛾。
【文档编号】C07K1/30GK103788173SQ201410071665
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】赵金梁, 赵发 申请人:天津替代医学科技有限公司